JP2024501151A - 細胞療法のために単離された細胞の治療効率を高めるための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、養子細胞移入療法などの細胞療法に使用するための単離された細胞の治療効率を増強するための方法に関し、前記方法は、細胞療法の治療効率に有益である低発現ｍｉＲＮＡを、細胞療法の治療効率を阻害するタンパク質コード遺伝子又は非コード遺伝子のいずれかの活性に発現される遺伝子座に挿入することによる方法であり、前者の発現を誘導する一方で後者の発現を破壊することによる方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
２０２０年１２月１日出願の米国仮特許出願第６３／１１９，７０８号に対して利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。

本開示は、養子細胞移入療法などの細胞療法において使用するための単離された細胞の治療効率を高めるための方法に関する。

天然に存在する、あるいは遺伝的に再指向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）された腫瘍反応性Ｔ細胞の養子移入は、進行した血液悪性腫瘍及び固形がんの患者に対する免疫療法として、及び一般的な細胞療法として、最も成功した治療法の一つである。この治療法は、従来の治療に不応性の転移を有する患者のかなりの割合に、完全かつ持続的な応答をもたらすことが可能である。養子細胞移入（ＡＣＴ：ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）法は、腫瘍特異的抗原の標的性を高めるために特異的Ｔ細胞（自家又は同種のいずれか）を改変し、及び／又は混合リンパ球集団から腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する。がん免疫療法に用いられる３種のＡＣＴの種類には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｔ細胞、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｔ細胞が挙げられる（１）。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は一次Ｔ細胞から作製され、一次Ｔ細胞は、単離及び増殖後に、特定の腫瘍関連抗原を認識する細胞外の一本鎖抗体ドメイン（ｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞受容体及び共刺激受容体による細胞内シグナル伝達ドメインとが結合した合成ＣＡＲ受容体を発現するように操作される（２）。このような改変により、ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識及びクリアランスは、従来のＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の結合ではなく、ＣＡＲ分子に依存するため、腫瘍細胞におけるＨＬＡの低発現に起因する免疫逃避を克服することができる（３）。現在、ほとんどのＣＡＲ細胞は、血液細胞を標的とするのに適したＣＡＲ－Ｔ（ＣＤ８＋）細胞である。しかしながら、固形腫瘍を対象とした臨床試験では、ＣＡＲ－Ｔ細胞が主流ではなく、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞など他のプラットフォームが採用されている（４）。

Ｔｈａｎｉｎｄｒａｔａｒｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８２ （２０２０） １０１９３４ Ｗｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１５ Ｏｃｔｏｂｅｒ １６； ３５０（６２５８） Ｗｅｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （２０１９） １２：６２ ＪＸら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ （２０１９） １８ （１１）： ８２１-８２２ Ａｂｒｅｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ３１９ （２０２０） ２４６-２６１

血液腫瘍領域でのＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床アウトカムは問題にされていないが、その活性化はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ：ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び神経毒性などの重篤な副作用と関連している。さらに、液性腫瘍から固形腫瘍へのこれらの治療法の移行は、少なくとも部分的には、細胞遺伝子発現に対する環境効果に起因するＣＡＲ－Ｔ細胞活性を著しく低下させる腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ－ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ＴＭＥ）の物理的障壁及び免疫抑制効果によって妨げられてきた。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性の低下、Ｔ細胞の疲弊及びアネルギーもまた時間の経過と共によく見られる。したがって、（特に固形腫瘍における）ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性及び効率、並びにＡＣＴ全般に関する大きな課題をなお克服する必要がある（５）。

概要
本明細書は、ＡＣＴを媒介する療法などの細胞療法において使用するために、単離された細胞の遺伝子発現を改変するための遺伝子編集技術（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＧＥＴ）の適用について記載する。

図１は、通常発現が乏しいか、又は非発現であり、高発現が望まれる「良い」ｍｉＲＮＡを、発現が停止の対象である「悪い」ｍｉＲＮＡの転写的に活性な（活発な）遺伝子座に挿入するために単一の編集イベントが使用される、記載のＧＥＴを介する方法の一実施形態を示す。この編集イベントのアウトカムは、「良い」ｍｉＲＮＡが、２つの調節性領域下の２つの遺伝子座：発現が低い状態から全くない状態である元の遺伝子座、及び「悪い」ｍｉＲＮＡの転写活性が高い遺伝子座（ここでは「悪い」ｍｉＲＮＡの発現が高く、それに特有のパターンに従う）で発現することである。この同一の編集イベントによって、この「悪い」ｍｉＲＮＡの発現は停止する。 図２は、図１に描かれた単一の編集イベントの別の実施形態を示しており、ここでは破壊対象の「悪い」配列はタンパク質コード遺伝子である（図では免疫チェックポイント遺伝子配列として例示されている）。この編集イベントのアウトカムは、２つの調節性領域の下の２つの遺伝子座：指向性発現（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が低い元の遺伝子座、及び指向性発現が高い「悪い」タンパク質をコードする遺伝子座、で「良い」ｍｉＲＮＡが発現することである。この「悪い」タンパク質の発現は停止する。 図３は、二重の編集イベントを使用して、２つのＲＮＡコード配列の位置及び転写制御をスイッチするアプローチを示す。二重の編集のアウトカムは、「良い」ｍｉＲＮＡが、指向性発現が高い「悪い」ｍｉＲＮＡの遺伝子座である、一方の遺伝子座で発現することである。この「悪い」ｍｉＲＮＡは、指向性発現の低い「良い」ｍｉＲＮＡの遺伝子座で発現される。 図４は、ＰＭＡ又はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）によるＴ細胞活性化の結果を示す。Ａ：ＰＭＡ／イオノマイシン（ｌｏｎｏｍｙｃｉｎ）又はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）のいずれかでの７２時間の活性化の後の細胞生存率のフローサイトメトリー測定（ＳＳＣ－Ａチャンネル対ＦＳＣ－Ａチャンネル）；Ｂ：抗ＣＤ２５抗体（ヒト）、フィコエリトリン（ＰＥ）によるＣＤ２５染色のフローサイトメトリー解析を使用するＴ細胞活性化の評価。ＣＤ２５はＴ細胞活性化マーカーである。 Ｃ：別の実験におけるＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）を介した活性化後のＴ細胞活性化の程度の動力学を測定した。すべてのチャートについてＸ軸とＹ軸との値域（Ｘ ａｎｄ Ｙ ａｘｉｓ ｖａｌｕｅ ｒｅｎｇｅ）が表示される。 図５は、ＮＡＬＭ－６細胞によるＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を示す。Ａ：ＮＧＦＲ染色（ＮＧＦＲ－ 神経成長因子受容体タンパク質由来の細胞外スペーサーであり、ＣＡＲに融合される）対 ＦＳＣ－Ａにより測定したＣＤ１９－ＣＡＲ保有Ｔ細胞の割合。染色は細胞活性化前に行った。Ｂ：抗ＣＤ２５抗体（ヒト）、ＰＥによるＣＤ２５染色（Ｔ細胞活性化マーカー）のフローサイトメトリー解析を用いたＣＡＲ－Ｔ及びＴ細胞の活性化の評価。染色は、ＣＤ１９表面タンパク質を保有するＢ細胞前駆体白血病細胞株であるＮＡＬＭ－６細胞と１：１の割合［ＣＤ１９－ＣＡＲ １０，０００個とＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＋）１０，０００個］で共培養することによりＴ細胞を活性化した後２４、４８、７２時間に行った。 Ｃ：ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴ細胞と標的ＮＡＬＭ－６細胞との共培養後２４、４８、７２時間でのＮＡＬＭ－６細胞の殺傷の測定によるＴ細胞機能の評価。ＮＡＬＭ－６細胞の測定は、ＣＤ１９の染色とＣＤ１９陽性細胞のＦＡＣＳ定量とによって行った。 図６は、活性化Ｔ細胞におけるｍｉＲＮＡ鎖（５ｐ及び３ｐ）発現の倍数変化を示す。ｍｉｒ－２３ａ（パネルＡ）、ｍｉｒ－３１（パネルＢ）、及びｍｉｒ－２８（パネルＣ）のそれぞれの指示されたｍｉＲＮＡ鎖の相対量を、２４時間、４８時間、７２時間の活性化後に示した。Ｔ細胞はＩｍｍｕｎｏｌ（商標）によって活性化した。活性化Ｔ細胞の割合はＣＤ２５の染色によって決定され、活性化２４時間後、４８時間後、７２時間後にはそれぞれ６１％、６７％、８７％であった。データは２＾－ΔΔＣｔ値で示されている：内因性参照遺伝子（ＲＮＵ６Ｂ）に対して正規化し、未治療（非活性）対照に対して相対化した、ｍｉＲ鎖発現の倍数変化。 図７は、ＣＡＳ９－ＣＲＩＳＰＲを介したｈｓａ－ｍｉｒ－３１及びｈｓａ－ｍｉｒ－２３ａのノックアウト用のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計のスキームを示す。ｈｓａ－ｍｉｒ－３１部位及びｈｓａ－ｍｉｒ－２３ａ部位に対するゲノムＤＮＡ上のｇＲＮＡの位置を示す（配列番号：１０、ヌクレオチド９３～１９０；及び配列番号：１４、ヌクレオチド９７～１９２に対応する）。ＰＡＭ：プロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫システムにおいてＣａｓ９ヌクレアーゼが標的とするＤＮＡ配列の直後に続く２～６塩基対のＤＮＡ配列）；ｇＲＮＡ：ガイドＲＮＡ（ここで、及び全体を通して、ｓｇＲＮＡ（単鎖ガイドＲＮＡ）と互換的に使用）－Ｃａｓ９タンパク質結合に必要な足場ｔｒａｃｒＲＮＡ（足場領域）配列に融合したカスタム設計の短いｃｒＲＮＡ（標的特異的）配列の両方を含有する単一のＲＮＡ分子。 図８は、最適化されたｍｉｒ－３１ノックアウト（ＫＯ）のためのｇＲＮＡ対の評価を示す。Ａ：ｐｒｅ－ｍｉｒ－３１（配列番号：１０のヌクレオチド８５～１９０に対応する）の配列にわたるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）位置のスキーム。それぞれのｇＲＮＡ対に起因する欠失の期待される長さが示されている。矢印はｇＲＮＡの位置を示す。ｐｒｅ－ｍｉｒ配列には下線が引かれ、ＰＡＭモチーフは濃淡の異なるフォントで描かれている。Ｂ：各ｇＲＮＡ対（１＋３、１＋４、２＋３、２＋４）によってガイドされた切除部位に隣接するプライマーによるＰＣＲ増幅の結果。ＣＣＲ５：ＣＣＲ５の無関係のゲノム領域を標的とするｇＲＮＡ対でヌクレオフェクションした細胞から抽出したＤＮＡ由来の増幅産物を示す陰性対照。ＵＴ（未治療）：非ヌクレオフェクション細胞から抽出したＤＮＡ由来の増幅産物。 図９は、ｍｉｒ－３１のＫＯ効率を評価するためのＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）ミスマッチ検出アッセイの結果を示す。Ａ：図５のパネルＢに記載したＰＣＲ増幅産物をＴ７Ｅ１分析にかけた。Ｔ７エンドヌクレアーゼ１存在下での結果（＋Ｔ７Ｅ１）を左のパネルに、対照反応のもの（－Ｔ７Ｅ１）を右のパネルに示す。使用したｇＲＮＡ対は各パネルの上に示し、観察された編集効率（％）は左パネルの下に示す。ＵＴ（未治療）：ＤＮＡ抽出した非ヌクレオフェクション細胞由来の増幅産物のＴ７Ｅ１治療。Ｂ：ｇＲＮＡ ２＋３（配列番号：４１）を用いたｍｉｒ－３１ ＫＯによって生成した編集領域の配列解析。編集の成功率を示す（１００％）。 図１０は、ｍｉｒ－２３ａのＫＯ効率を評価するためのＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）ミスマッチ検出アッセイの結果を示す。表示のｇＲＮＡ対（１＋２、１＋３、４＋２、４＋３）のいずれかを用いてｍｉｒ－２３ａのＫＯを編集したＴ細胞から抽出したＤＮＡに対して行ったＴ７Ｅ１ミスマッチ検出アッセイ（＋Ｔ７Ｅ１）の結果。非ヌクレオフェクション細胞から抽出したＤＮＡに由来する増幅産物を対照とした（ＵＴ－未治療）。Ａ：各ｇＲＮＡ対（１＋２、１＋３、４＋２、４＋３）がガイドする切除部位に隣接するプライマーでＰＣＲ増幅することにより生成したＰＣＲ産物をＴ７Ｅ１切除にかけた（＋Ｔ７Ｅ１）。観察された編集効率（％）を下部に示す。Ｂ：対照として、パネルＡと同じＰＣＲ産物はＴ７Ｅ１切除にかけなかった（－Ｔ７Ｅ１）。観察された編集効率（％）を下部に示す。Ｃ：ｇＲＮＡ １＋３を用いたｍｉｒ－２３ａのＫＯによって生成した編集領域の配列解析。編集の成功率を示す（７７％）（完全配列は配列番号：４２に対応）。Ｄ：ｇＲＮＡ ４＋３を用いたｍｉｒ－２３ａのＫＯによって生成した編集領域の配列解析。編集の成功率を示す（９１．９％）（完全は配列番号：４３に対応）。 図１１は、ｍｉｒ－３１－ＫＯ後のＴ細胞活性化を示す。Ｔ細胞は採取後すぐにＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）で活性化した（第１の活性化）。活性化（増殖）したＴ細胞は、ｍｉｒ－３１のＫＯについて編集した後、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）によって再活性化した（第２の活性化）。Ｔ細胞活性化の評価は、抗ＣＤ２５抗体（ヒト）、ＰＥによるＣＤ２５染色のフローサイトメトリー解析を用いて行った。上部パネルは非編集（ＵＴ＝未治療）Ｔ細胞の第１（中央パネル）と第２（右パネル）の活性化の程度（ＣＤ２５染色）を示す。右のパネルは未染色対照である。下部パネルは、第１の活性化、それぞれ表示のｇＲＮＡガイド対によるｍｉｒ－３１編集媒介性ＫＯ、及び再活性化の後のＴ細胞の活性化（第２の活性化）の程度を示す。ｓｇＲＮＡ－ＣＣＲ５：非ｍｉｒ－３１標的化ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５を標的化）でヌクレオフェクションしたＴ細胞の再活性化の結果。 図１２は、編集媒介性ＫＯ（切除）後のｍｉｒ－３１及びｍｉｒ－２３ａの発現を示す。ｍｉｒ－３１－５ｐ鎖（パネルＡ）及びｍｉｒ－２３ａ－５ｐ鎖（パネルＢ）の発現レベルは、これらのｍｉｒの編集媒介性ＫＯ及び編集細胞の（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）による）再活性化の後のＴ細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。データは２＾－ΔΔＣｔ値で示されている：内因性参照遺伝子（ＲＮＵ６Ｂ）に対して正規化し、非関連ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５を標的とする）で編集した対照Ｔ細胞におけるレベルに相対化した、ミラー鎖発現の倍数変化。ＵＴ（未治療）：対照の非編集Ｔ細胞におけるｍｉｒ発現；ｓｇＲＮＡ－ＣＣＲ５：非関連ｇＲＮＡ（ＣＣＲ５を標的）で編集した対照Ｔ細胞におけるｍｉｒ－３１発現。 図１３は、ｍｉｒ－３１ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８のＫＩ（ノックイン）の検証を示す。Ａ：ｍｉｒ－３１上流領域とｍｉｒ－２８挿入ＤＮＡとの間の接合部位を様々なアニーリング温度でＰＣＲによって増幅し、最適なアニーリング温度を決定した。同じ接合プライマーを、ｍｉｒ－２３ａ－ＫＯであるがｍｉｒ－２８ ＫＩを受けていない（ＵＴ＝未治療）対照Ｔ細胞から抽出したテンプレート（鋳型）ＤＮＡのＰＣＲに用いた。Ｂ：ｄｄＰＣＲは、ｍｉｒ－２８ ＫＩ Ｔ細胞（ＫＩ）又は非ｍｉｒ－２８－ＫＩ Ｔ細胞（ＵＴ）において、接合プライマー又は共通プライマー（すべてのＤＮＡの鋳型に共通するｍｉｒ－３１部位より上流の領域を増幅するもの）のいずれかを用いて行った。グラフは、共通領域又は接合領域のいずれかが増幅された場合に、ｄｄＰＣＲによって検出されたμＬあたりのコピー数（青い点）を表している。置換効率を計算するには、接合領域のコピー／μＬを、それぞれの試料の共通領域のコピー／μＬで割ることで計算する。得られたパーセンテージ（７％）は、置換効率を示している。 図１４は、ｍｉｒ－２３－ＫＯ／ｍｉｒ－２８ＫＩ Ｔ細胞におけるｍｉｒ－２３ａ及びｍｉｒ－２８の発現を示す。ｍｉｒ－２３ａ鎖及びｍｉｒ－２８鎖の発現は、ｍｉｒ－２３ａ ＫＯ後のＴ細胞（ｍｉｒ－２３ ＫＯ）、及びｍｉｒ－２３ａ ＫＯとｍｉｒ－２３ａ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８のＫＩとの両方を行った後のＴ細胞（ｍｉｒ－２３ ＫＯ＋ｍｉｒ－２８ ＫＩ）においてＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。両細胞集団は、ヌクレオフェクション（編集）後５日にＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）によって６時間再活性化した。データは２＾－ΔΔＣｔ値で示される：内因性参照遺伝子（ＲＮＵ６Ｂ）で正規化し、かつＡＡＶＳＩを標的とする無関係なｓｇＲＮＡで編集され、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）修復鋳型を共送達した再活性化Ｔ細胞におけるレベルに対して相対化した、ｍｉＲ鎖発現の倍数変化である。 図１５は、ｍｉｒ－２３－ＫＯ／ｍｉｒ－２８ＫＩ Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊に関連する遺伝子の発現を示す。編集したｍｉｒ－２３ａ－ＫＯ／ｍｉｒ－２８－ＫＩ Ｔ細胞にてＲＴ－ｑＰＣＲによって指示の遺伝子の発現を測定した。これらのＴ細胞は、ヌクレオフェクション（編集）後５日に照射ＰＢＭＣ（Ａ）又はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）（Ｂ）のいずれかで再活性化させ、再活性化４８時間後に採取した。データは２＾－ΔΔＣｔ値で示される：内因性参照遺伝子で正規化し、かつＡＡＶＳＩを標的とする無関係なｓｇＲＮＡで編集し、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）修復鋳型を共送達した再活性化Ｔ細胞におけるレベルに対して相対化した、遺伝子発現の倍数変化。ｍｉｒ－２３ ＫＯ／ｍｉｒ－２８ ＫＩ：ｍｉｒ－２３ａをｍｉｒ－２８で置換したＴ細胞；ＵＴ－未治療：無関係のｓｇＲＮＡで編集した対照Ｔ細胞。

ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート））、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ））、あるいはＺＦＮ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ））の適用などのＧＥＴは、新規の、内在性、かつ高発現のＲＮＡを産生し、及び／又は機能不全のＲＮＡを停止するようなＲＮＡをコードするＤＮＡ領域の編集において非常に強力なツールを提供する。本開示は、特定のＡＣＴの状況、例えば、がん標的との接触時、及びそれによる活性化時にＴ細胞の活性に影響を与えるＲＮＡの発現を改変することによってＣＡＲ－Ｔ細胞の効率を増強させることなどにおけるこれらの技術の使用に関する。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、ｍｉＲＮＡなどの選択的なタンパク質コードＲＮＡ及び非コードＲＮＡの発現パターンを改変することに関する。

本明細書に記載の方法は、血液細胞関連疾患、自己免疫疾患、及びがんの治療のために、造血幹細胞、それらの共通リンパ球前駆細胞、共通骨髄前駆細胞、及びそれらのより発達した（すなわち、単能性の）継代細胞の型の治療効率をｅｘ ｖｉｖｏで増強するための治療手段としてＧＥＴを利用する。本明細書に記載の方法によって改変できる細胞は、主にＴ細胞又はＣＡＲ Ｔ細胞であるが、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、及びそれらの継代の細胞型も含まれる。本明細書に記載の同様の方法は、肝臓の疾患の治療のために肝細胞などの実質細胞を改変する。本明細書で記載されるとおり、前述の細胞型に加え、あらゆる種類の多能性細胞が改変され得ることが理解されよう。さらに、特定の実施形態では、特定の対象に使用する細胞は自家細胞であるが、他の実施形態では、細胞は同種細胞である。本明細書に記載の同様の方法には、例えば肝細胞又は膵ｂ細胞などの実質細胞又は内分泌細胞を移入用に改変するために用いることができる。

本方法は、ＡＣＴ療法などのＴ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの免疫療法のひとつの主な欠点に対処するものである。がん細胞との遭遇によってＴ細胞が活性化された後、がん細胞がＴ細胞の作用を抑制しようとする一環として、遺伝子発現パターン、特にｍｉＲＮＡなどの非タンパク質コードＲＮＡの遺伝子発現パターンに変化が起こることが知られている。その結果、「悪い」ｍｉＲＮＡ（Ｔ細胞の治療作用にとって有害なもの）はアップレギュレートされ、「良い」ｍｉＲＮＡ（Ｔ細胞の治療作用にとって有益なもの）はダウンレギュレートされ、結果として、Ｔ細胞のアネルギー、寛容、及び疲弊などの機能不全状態が生じる。本記載の方法は、ＧＥＴを利用して、「悪い」遺伝子の発現を阻害しながら同時に、「良い」遺伝子の発現を増加させることで、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性に対するこれらの阻害作用をブロックする新規のアプローチを記載しており、－例えばｍｉＲＮＡなどのタンパク質コード遺伝子であれ、タンパク質非コードコード遺伝子であれ、細胞療法に利用される他の種類の細胞で使用するために同様に増殖させることができる。さらに、特定の実施形態では、記載の方法による細胞の増強は、細胞療法用の細胞を製造するさらなる工程に先行することが理解されよう。

特定の実施形態では、ＧＥＴは、望ましい（「良い」）ｍｉＲＮＡをアップレギュレートし同時に、望ましくない（「悪い」）ｍｉＲＮＡを停止又はダウンレギュレートするために、Ｔ細胞などのｅｘ ｖｉｖｏ細胞の遺伝子座を編集するために使用される。

一実施形態では、「悪い」ｍｉＲＮＡの活発（活性）に転写される部位（ａｃｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｉｔｅ）に「良い」ｍｉＲＮＡを導入するように単一のｍｉＲＮＡ遺伝子座を編集することを含む。この編集イベントによって、「悪い」ｍｉＲＮＡ調節性要素の制御下で発現するようになった「良い」ｍｉＲＮＡはアップレギュレートされ、一方で「悪い」ｍｉＲＮＡは停止される。

別の実施形態では、「悪い」遺伝子の活発に転写される部位に「良い」ｍｉＲＮＡを導入するように単一のコード遺伝子座を編集することを含む。この編集イベントによって、活性な「悪い」遺伝子調節性要素の制御下で発現するようになった「良い」ｍｉＲＮＡはアップレギュレートされ、一方で、「悪い」遺伝子は、例えばそのオープンリーディングフレームを破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）することによって、停止される。

別の実施形態では、記載の方法は、コード配列の相互交換を生じるための２つの遺伝子座の編集に関する。悪いｍｉＲＮＡを良いｍｉＲＮＡに置換するのと並行して、悪いｍｉＲＮＡの基礎活性を維持するために、良いｍｉＲＮＡの内因性遺伝子座に悪いｍｉＲＮＡを導入する。特定の実施形態では、記載の方法は、単一の対の遺伝子 －１つは「悪い」遺伝子、もう１つは「良い」遺伝子－ を含む単一の遺伝子座における編集イベントによって、単一の「悪い」遺伝子をノックダウンすることを包含する。他の実施形態では、単一又は複数の異なる「良い」遺伝子のノックインを伴い、「悪い」遺伝子の複数の遺伝子座における、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を含む複数の遺伝子ノックダウン編集イベントが包含される。

上記及びその他の目的、特徴、及び利点は、添付の図を参照しながら進む以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

記載の配列の簡単な説明
本明細書で提供される核酸及び配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されているとおりに、ヌクレオチド塩基の標準的な文字の略号を用いて示されている。各核酸配列の片方の鎖のみが示されているが、相補鎖はこの表示された鎖に対する参照によって含まれるものと理解される。配列リストは、３２８７＿２＿２＿ｓｅｑｌｉｓｔ＿ＳＴ２５という名前のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、２０２１年１１月３０日に作成され、約１０．８ＫＢであり、参照により本明細書に援用される。この配列リストでは、以下が示される：
配列番号：１は、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８１ａ－１のｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８１ａ－１のゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：３は、ｈｓａ－ｍｉｒ－２８のｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、ｈｓａ－ｍｉｒ－２８のゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：５は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９のｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９のゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：７は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａのｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：８は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａのゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：９は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１のｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１のゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：１１は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１のｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１のゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：１３は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａのｐｒｅ－ｍｉｒ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号：１４は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａのゲノム領域のヌクレオチド配列である。
配列番号：１５～１８は、ｍｉｒ－３１を標的とするｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号：１９～２２は、ｍｉｒ－２３を標的とするｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号：２３は、ｍｉＲ－２３遺伝子座へのｍｉＲ－２８の挿入に使用される一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）のヌクレオチド配列である。
配列番号：２４は、ｍｉＲ－３１遺伝子座へのｍｉＲ－２８の挿入に使用される一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）のヌクレオチド配列である。
配列番号：２５及び２６は、Ｔ７Ｅ１アッセイにおけるｍｉＲ－２３のフォワード及びリバースの増幅プライマーである。
配列番号：２７及び２８は、Ｔ７Ｅ１アッセイにおけるｍｉＲ－３１のフォワード及びリバースの増幅プライマーである。
配列番号：２９及び３０は、ｍｉＲ－３１（共通領域）のフォワード及びリバースのｄｄＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：３１及び３２は、ｍｉＲ－３１（接合領域）のフォワード及びリバースのｄｄＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：３３及び３４は、ＬＡＧ－３のフォワード及びリバースのＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：３５及び３６は、ＴＩＭ３のフォワード及びリバースのＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：３７及び３８は、ＰＤ１のフォワード及びリバースのＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：３９及び４０は、ＢＬＩＭＰ－１のフォワード及びリバースのＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のプライマーである。
配列番号：４１は、ｇＲＮＡ ２＋３を用いたｍｉｒ－３１ ＫＯによって生成した編集領域の配列決定解析である。
配列番号：４２は、ｇＲＮＡ １＋３を用いたｍｉｒ－２３ａ ＫＯによって生成した編集領域の配列決定解析である。
配列番号：４３は、ｇＲＮＡ ４＋３を用いたｍｉｒ－２３ａ ＫＯによって生成した編集領域の配列決定解析である。

詳細な説明
Ｉ．用語
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形の参照語を含む。同様に、「又は」という用語は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、「及び」を含むことを意図している。本開示の実施又は試験には、本明細書に記載したものと類似又は同等の方法及び材料を用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。「ｅ．ｇ．（例えば）」という略語は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために用いられる。したがって、「ｅ．ｇ．」という略語は、「ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ（例えば）」という用語と同義である。

矛盾が生じた場合は、用語の説明を含む本明細書が優先される。さらに、すべての材料、方法、実施例は例示的であり、限定を意図するものではない。

異常：正常な特性からの逸脱。正常な特性は、対照、集団の標準などに見出すことができる。例えば、異常な状態ががんのような疾患状態である場合、正常な特性のいくつかの適切なソースとしては、該疾患に罹患していない個体、非がん組織試料、又は腫瘍内若しくは腫瘍間質内若しくはその周辺など、疾患微小環境にさらされていない免疫細胞若しくは免疫前駆細胞の集団などが挙げられる。

養子細胞移入（Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＡＣＴ）：治療活性を有する細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで改変した後に対象に移入することを含む治療法。特定の実施形態では、ＡＣＴに使用される細胞は、治療される対象に由来し、対象から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏで改変され、増殖した後、該対象に戻される（投与される）。特定の実施形態において、ＡＣＴ法は、腫瘍特異的抗原の標的化を増強するために、特異的Ｔ細胞（自家又は同種のいずれか）を改変することを含む。がん免疫療法に用いられる３種類のＡＣＴには、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が含まれ、いずれも本明細書に記載の方法に従って改変することができる。

発現変化（Ａｌｔｅｒｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：正常対象又は対照対象における同じ生物学的分子の発現から逸脱する、対象、又は対象からの生物学的試料における生物学的分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はタンパク質）の発現。生物学的分子の発現変化は、腫瘍環境でのＴ細胞のｍｉＲ－２３の発現変化など、疾患と関連している可能性がある。発現は、増加又は減少するような様式で変化させることができる。ＲＮＡ又はタンパク質の発現における指向性のある変化は、治療効率と関連する可能性がある。記載の方法の特定の実施形態において、例えば、腫瘍抗原によるＴ細胞の活性化後にＴ細胞で通常ダウンレギュレートされる（抗腫瘍応答の減少につながる）ｍｉＲＮＡの発現は、このｍｉＲＮＡを、例えば腫瘍抗原によるＴ細胞の活性化後にＴ細胞で通常アップレギュレートされる（同じく抗腫瘍応答の減少につながる）ｍｉＲＮＡ又はタンパク質コード遺伝子の遺伝子座に配置した後に、増大する。

増幅：核酸に関して使用される場合、試料又は検体中の核酸分子のコピー数を増加させる任意の技術。

動物：生きている多細胞脊椎生物、例えば、哺乳類及び鳥類が含まれるカテゴリー。哺乳類という用語には、ヒト及び非ヒトの哺乳類の両方が含まれる。同様に、対象という用語には、ヒト、非ヒトの霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどのヒト及び獣医学的対象の両方が含まれる。本方法において使用する細胞の集団は、あらゆる動物から採取した試料、又はその試料に由来する試料とすることができる。

生物学的試料：生物から直接又は間接的に得られ得る任意の試料。生物学的試料には、様々な液体、組織、及び細胞を含み、例えば、全血、血漿、血清、涙液、粘液、唾液、尿、胸水、髄液、胃液、汗、精液、膣分泌液、喀痰、潰瘍及び／又はその他の表面発疹由来の液体、水疱、膿瘍、組織、細胞（線維芽細胞、末梢血単核球、筋肉細胞など）、小器官（ミトコンドリアなど）、臓器、及び／又は組織、細胞（線維芽細胞、末梢血単核球、筋肉細胞など）、小器官（ミトコンドリアなど）、又は臓器の抽出物が挙げられる。本明細書に記載の方法は、腫瘍試料を含む任意の適切な生物学的試料の細胞又はそれに由来する細胞を利用することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、末梢血単核球などの血液試料由来の細胞に対して実施される。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象から摘出された固形腫瘍に由来するＴ細胞に対して実施される。

がん：新形成の産物は新生物（腫瘍又はがん）であり、過剰な細胞分裂の結果生じる組織の異常増殖である。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる。周囲の組織に浸潤し、及び／又は転移することが可能な腫瘍は「悪性」と呼ばれる。新形成は増殖性疾患の一例である。「がん細胞」とは、腫瘍から単離された細胞又は細胞株など、新生物性の細胞である。本明細書に記載の方法は、特定の実施形態では血液腫瘍であり、他の実施形態では固形腫瘍である、がんに対するＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞の治療の（すなわち、免疫学的な）効率を高めるために、使用することができる。

血液腫瘍の例には、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、及び骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄球性、骨髄単球性の白血病及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行性及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、及び脊髄形成異常症が挙げられる。

肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵がん、乳がん、肺がん（小細胞肺がん、及び非小細胞肺がんなど）、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、メラノーマ、及び中枢神経系腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、血管内皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など）が挙げられる。

化学療法剤：異常な細胞増殖又は過形成を特徴とする疾患の治療において治療上有用な薬剤。このような疾患には、がん、自己免疫疾患、並びに乾癬などの過形成を特徴とする疾患が含まれる。当業者であれば、化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、以下を参照：Ｓｌａｐａｋ及びＫｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１４編；Ｐｅｒｒｙら，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７ Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ 第２編，（著作権）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ（編）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，第２編 Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ ＨＪ（編）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第４編 Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３）。化学療法剤の例としては、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（商標））、及びブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（商標））などのＩＣＬ誘導剤が挙げられる。本明細書で使用されるとおりの化学療法剤は、抗体、ペプチド、及び核酸などの生物学的薬剤を含む、がんの治療において治療的に有用な任意の薬剤である。記載の方法の特定の実施形態において、細胞治療用に改変した細胞は、１つ又は複数の化学療法剤を含む治療レジメンの一部として使用することができる。このような薬剤は、改変細胞の投与前、投与中、投与後に投与することができる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞：対象から単離され、かつ所望の標的受容体を発現するように改変されたＴ細胞。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特定のがん種など、免疫療法クリアランスのために特定の細胞を標的するように設計することが可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法では、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｍｉＲＮＡの遺伝子座及びそれに関連する発現が改変される。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）：ＤＮＡ遺伝子座であり、元々は原核生物で同定されたものであり、複数の短い塩基配列の直接反復を含む。原核生物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子及び特別に設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む必要な要素を細胞にトランスフェクションすることによって、生物ゲノムを任意の所望の位置で切断及び改変できる、遺伝子編集技術として使用するために適応されてきた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いたゲノム編集に使用する組成物の調製方法は、国際特許公開（ＷＯ）第２０１３／１７６７７２号及び（ＷＯ）第２０１４／０１８４２３号に詳細に記載されている。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ又は複数の要素の発現を駆動する１つ又は複数のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が１つ又は複数の標的部位にてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向するように標的細胞に導入される。ＣＲＩＳＰＲ技術を使って、本明細書に記載のｍｉＲＮＡなど特異的なＤＮＡ配列を標的とするために、使用者は標的配列を含む短いＤＮＡ断片をガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入することができる。このｓｇＲＮＡ発現プラスミドには、標的配列（約２０ヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一形態（足場（スキャフォールド））、並びに適切なプロモーター及び真核細胞での適切なプロセシングに必要な要素が含有されている。このようなベクターは市販されている。多くのシステムは、カスタムな相補的オリゴに依存しており、これはアニーリングされて、二本鎖ＤＮＡを形成し、次いでｓｇＲＮＡ発現プラスミドにクローン化される。トランスフェクトされた細胞内で、同じ又は別々のプラスミドからｓｇＲＮＡと適切なＣａｓ酵素とを共発現させることで、所望の標的部位にて一本鎖又は二本鎖の切断が（Ｃａｓ酵素の活性によって）起こる。

対照：試料との比較に適切な標準物質、例えば本明細書に記載のマイクロＲＮＡ編集プロセスを経ていない細胞又は細胞集団。

効率（ｅｆｆｉｃａｃｙ）：免疫細胞などの細胞を含む薬剤が、所望の治療効果を誘発又は提供する能力を指す。効率とはまた、本明細書に記載された改変細胞を含む治療薬剤の強度又は有効性も指す。本明細書で使用されるとおり、「効率を高める（増強する）」とは、改変細胞の治療作用を増大させることを意味する。例えば、薬剤が改変細胞である場合、「効率を高める（増強する）」とは、腫瘍細胞などの標的細胞を殺傷する薬剤の能力を増大させることを意味することが可能である。効率の増強には、標的細胞毒性を実際に示す必要はない。むしろ、本明細書に記載されているとおり、記載された改変細胞の効率は、細胞毒性効果を増大させると予測できる遺伝子発現パターンの変化の結果、増強される。

化合物の有効量：治療対象において所望の効果を得るのに十分な化合物の量。化合物の有効量を単回投与で投与することもでき、又は治療期間中に数回に分けて、例えば毎日投与することもできる。しかしながら、化合物の有効量は、適用される化合物、治療される対象、苦痛の重症度及び種類、及び化合物の投与様式に依存するであろう。

コードする（Ｅｎｃｏｄｅ）：ポリヌクレオチドは、その天然の状態において、又は当業者によく知られている方法によって操作される際に、転写及び／又は翻訳されて、ポリペプチド又はその断片のｍＲＮＡを産生することができる場合にポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補体であり、そこからコード配列を推測することができる。タンパク質を生成するために翻訳されるｍＲＮＡは「コード（ｃｏｄｉｎｇ）」ＲＮＡである。本明細書に記載されるｍｉＲＮＡなどの非コードＲＮＡは、タンパク質には翻訳されないが、しかし、このようなｍｉＲＮＡの発現又は阻害は、タンパク質の発現に下流の作用をもたらす。

増殖する（Ｅｘｐａｎｄ）：細胞分裂によって細胞培養中の細胞の数又はその量が増加することによるプロセスを指す。同様に、「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」又は「増殖した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」という用語もこのプロセスを指す。用語「ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ（増殖する）」、「ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（増殖）」又は「ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ（増殖した）」は、用語「ｅｘｐａｎｄ」、「ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」又は「ｅｘｐａｎｄｅｄ」と互換的に使用され得る。記載の方法で使用する細胞培養技術は、特に指定がない限り、当技術分野で一般的なものである。

発現制御配列：作動可能に連結された異種核酸配列の発現、例えばマイクロＲＮＡの発現、を調節する核酸配列。発現制御配列が核酸配列の転写、及び必要に応じて翻訳を制御及び調節する場合、発現制御配列が核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前に位置する開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び停止コドンが含まれる。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に影響を与えうる成分を含むことを意図しており、かつ例えばリーダー配列及び融合パートナー配列などの、その存在が有利な追加の成分もまた含むことができる。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。プロモーターとは、転写を指向するのに十分な最小配列のことである。また、プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞型特異的、組織特異的に制御可能に、又は外部シグナル若しくは薬剤によって誘導可能にするのに十分なプロモーター要素も含まれ、このような要素は、遺伝子の５’領域又は３’領域に位置することができる。特定の実施形態では、記載の方法のｍｉＲＮＡは、通常の遺伝子座とは異なる発現制御配列の転写制御下に置かれる。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２８の発現はｍｉＲ－２３発現制御配列の制御下に置かれる。

遺伝子／ゲノム／ゲノム編集技術（ＧＥＴ：Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：標的（すなわち特定の位置の）核酸配列を欠失、改変、置換、又は挿入することによる遺伝子工学的方法。本明細書に記載の方法は、任意のＧＥＴを利用して、特定のｍｉＲＮＡコード配列を非天然遺伝子座に挿入し、それにより、その遺伝子座の転写制御下になるようにする。ＧＥＴの特に非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及び三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、テールクランプペプチド核酸などの三重鎖形成分子の使用が挙げられ、これらはすべて当技術分野で知られている。

異種：通常（すなわち、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：ＷＴ）配列において）、第２の配列の隣に検出されない配列の種類。一実施形態では、この配列は、ウイルス又は生物など、第２の配列とは異なる遺伝子源に由来する。

免疫応答：刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、又は単球などの免疫系細胞の応答。一実施形態では、この応答は、白血病由来の抗原など、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋（細胞傷害性）応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。

免疫療法：腫瘍細胞の表面に発現するなど、標的抗原の存在に対して、あるいはその存在に応答して、免疫応答を引き起こす方法。細胞媒介性免疫応答に基づく免疫療法には、特定の抗原決定因子を産生する細胞に対する細胞媒介性応答の生成又は提供が含まれる。ＣＡＴ Ｔ細胞介在療法などのＡＣＴ免疫療法は、がん免疫学（ｉｍｍｕｎｏｏｎｃｏｌｏｇｙ）とも呼ばれる。

単離：「単離（単離された）」生物学的成分（核酸、タンパク質、細胞（又は細胞の複数／集団）、組織、又はオルガネラなど）とは、その成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分、例えば、他の組織、細胞、他の染色体ＤＮＡ及び染色体外ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オルガネラなど、から実質的に分離又は精製されたものである。「単離（単離された）」核酸及びタンパク質には、標準的な精製方法で精製された核酸及びタンパク質が含まれる。この用語にはまた、宿主細胞内での組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸も包含される。

遺伝子座（Ｌｏｃｕｓ）：染色体配列又は染色体外配列上の遺伝子又は特定のＤＮＡ配列の遺伝的位置。遺伝子座は、ある実施形態では、特定のヌクレオチド配列の位置を記述するために使用することができ、他の実施形態では、特定のコード（又は非コード）配列、及びそれに関連する発現制御配列を記述するために使用することができるように、より高い精度、又はより低い精度で記述することができる。本明細書の記載のとおり、ｍｉＲＮＡコード配列を新しい遺伝子座に配置すると、新しい遺伝子座の制御下にその転写が置かれることになる。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：１８～２４ヌクレオチド長の短い一本鎖ＲＮＡ分子。転写された非コードＲＮＡの長い前駆体分子から細胞内で内因的に産生されるｍｉＲＮＡは、翻訳を阻害することができ、又は標的核酸に相補的又は相補的に近いハイブリダイゼーションを通じて標的ｍＲＮＡの切断を指向することができる。

オリゴヌクレオチド：約６～約３００ヌクレオチド長の天然ホスホジエステル結合によって結合した複数の結合ヌクレオチド。オリゴヌクレオチド類似体とは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然には存在しない部位を持つ部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなど、糖部分又は糖間結合の変化などの天然に存在しない部分を含むことができる。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、ＲＮＡ又はＤＮＡに結合することができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子が含まれる。特定のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、最大約２００ヌクレオチド長の直鎖配列、例えば、少なくとも６塩基、例えば少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００塩基長、あるいはさらに２００塩基長、あるいは約６～約５０塩基、例えば約１０～２５塩基、例えば１２、１５、２０塩基である配列（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）を含むことができる。

作動可能に連結される：第１の核酸配列が第２の核酸配列と作動可能に連結されるとは、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に配置される場合である。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、かつ２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合に同じリーディングフレーム内で連続している。記載の方法の特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡの遺伝的位置が変更され、それにより、「移動した」ｍｉＲＮＡがその元の遺伝子座とは異なる発現制御配列に作動可能に連結されるようにする。

疾患の予防又は治療：疾患の予防とは、例えば、冠動脈疾患を有する人の心筋梗塞の発症を抑制すること、又は新生物を有する対象の腫瘍の進行又は転移を抑制することなど、疾患の完全発症を抑制することを指す。治療とは、病気又は病的状態が発症し始めた後に、その徴候又は症状を改善する治療的介入を指す。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）：転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする核酸構築物（複数可）を用いたＧＥＴ方法。ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様の全体的なアーキテクチャを有するが、主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬエフェクタータンパク質に由来しているという点である。特異的な核酸に結合するようにＴＡＬを工学的に操作する方法は、Ｃｅｒｍａｋ，ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１－１１（２０１１）に記載されている。米国公開出願第２０１１／０１４５９４０号は、ＴＡＬエフェクター及びそれを用いてＤＮＡを改変する方法、並びにＴＡＬＥ結合ドメインの一般的な設計原則を記載している。

標的配列：標的配列とは、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相補性がある、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体（例えば、モルホリノ）がハイブリダイズできるｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、又はＲＮＡの部分である。記載の方法で使用するためのＧＥＴ方法は、記載されたコードＲＮＡ配列又は非コードｍｉＲＮＡ配列の除去及び／又は挿入を指向するように、特異的な標的配列を認識するオリゴヌクレオチドを利用する。

Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｎ ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＺＦＮ）：ＧＥＴ技術は、ＤＮＡの二本鎖切断をもたらす細胞機構を利用する。特定の実施形態では、ＧＥＴにＺＦＮシステムを使用して、それにより、設計されたＺＦＮがコード核酸プラスミドから発現し、所望の配列を特異的に標的とすることができる。遺伝子編集のためのＺＦＮシステムを設計するためのツールは、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｓ．ｏｒｇ）でオンラインで入手可能である。

ＩＩ．いくつかの実施形態の簡単な概要
本明細書では、細胞治療のために単離された細胞を改変するための方法であって、培養液中の複数の単離された細胞を提供すること；及びこの複数の細胞において、第１のＲＮＡコード配列を含む第１の遺伝子座に、第２のＲＮＡコード配列を挿入し、それによって前記第２のＲＮＡコード配列を前記第１の遺伝子座の転写調節性配列に作動可能に連結すること、及び第１の遺伝子座を破壊すること、による前記方法が記載される。記載の方法において、第１の遺伝子座に第２のＲＮＡコード配列を挿入することは、第１のＲＮＡコード配列の発現を、その配列を破壊又は置換することによってのいずれかで（又は第１の配列が除去される先行工程に引き続いて）消失させ、かつ第１の遺伝子座にて転写を開始するのに十分な条件下で、第１の遺伝子座の第２のＲＮＡコード配列の発現が誘導されるのに対して、第１の遺伝子座の発現は排除される。記載の方法において、記載の破壊／挿入は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の適用を含むがこれらに限定されない利用可能なＧＥＴ方法から選択される遺伝子編集技術（ＧＥＴ）、又は遺伝子配列を改変するための任意の他の類似技術によって実施される。

特定の実施形態において、本方法は、第１のＲＮＡコード配列の遺伝子座への第２のＲＮＡコード配列の挿入に加えて、第２のＲＮＡコード配列を含む第２の遺伝子座に、第１のＲＮＡコード配列を挿入し、それにより第１のＲＮＡコード配列を第２の遺伝子座の転写調節性配列に作動可能に連結することを含み、かつここで第２の遺伝子座にて転写を阻害するのに十分な条件下で、第２の遺伝子座における第１のＲＮＡコード配列の発現を阻害する。

この単一編集の実施形態と二重編集の実施形態との両方は、ＲＮＡコード配列の位置の入れ替え（スイッチング）を伴い、本明細書ではこれを「キャスリング（ｃａｓｔｌｉｎｇ）」法とも呼ぶ。

記載の方法の第１のＲＮＡコード配列は、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡコード配列などの非タンパク質コード配列であり得る。他の実施形態では、第１のＲＮＡコード配列はタンパク質コード配列であり得る。記載の方法の第２のＲＮＡコード配列は、ｍｉＲＮＡコード配列などの非タンパク質コード配列であり得る。

特定の実施形態では、単離された細胞は間葉系幹細胞又はその継代（骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ）、筋細胞（筋肉細胞）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（骨髄脂肪組織及び肝細胞様細胞を生じる脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ）））、あるいは赤血球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、若しくはマスト細胞などの多能性造血幹細胞又はその継代である。なおさらなる実施形態において、単離された細胞は、天然Ｔ細胞、誘導化制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。

特定の実施形態では、単離された細胞は、肝細胞などの実質細胞、又は膵ｂ細胞などの内分泌細胞である。

本明細書で記載されるとおり、前述の細胞の種類に加え、あらゆる種類の多能性細胞が改変され得ることが理解されよう。さらに、特定の実施形態では、特定の対象に使用する細胞は自家細胞であるが、他の実施形態では、この細胞は同種細胞である。

本明細書にはまた、養子細胞移入療法のためのリンパ球又は骨髄性細胞の治療効率を高めるための方法であって：培養液中の複数の単離されたリンパ球を提供すること；及び単離されたリンパ球に、阻害性免疫チェックポイント遺伝子などのタンパク質コード遺伝子を含む活発に転写される遺伝子座にて、又は免疫療法の効率の低下に関連するｍｉＲＮＡなどの非タンパク質コードＲＮＡ（「悪い」遺伝子）をコードする活発に転写される遺伝子座にて、高発現が免疫療法の効率を増大させると期待されるｍｉＲＮＡコード配列などのＲＮＡコード配列（「良い」遺伝子）を挿入し、それによって「悪い」遺伝子の発現を消失させ、「良い」遺伝子の発現を増強することによる、前記方法が記載され、ここで前記挿入は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む利用可能な方法から選択される遺伝子編集技術（Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって実行される。

特定の実施形態において、タンパク質コード遺伝子は、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）；及び／又はＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）；及び／又はＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３）などのような阻害性免疫チェックポイント遺伝子であるが、これらに限定されない。

ＩＩＩ．細胞治療の増強のための遺伝子編集技術（ＧＥＴ）を介するＲＮＡ工学
本明細書では、細胞療法を最適化かつ増強するために、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ発現などのＲＮＡ発現を改変するための、ＧＥＴを介するゲノム工学の応用について記載する。

記載の方法の一般的な実施形態では、ＧＥＴを介するゲノム工学は、これらに限定されないがＡＣＴ又は細胞移入療法などの細胞療法に使用するために、単離された細胞における２つ以上の標的遺伝子の発現を同時に改変するために利用される。ＧＥＴを使用して、過小発現が細胞治療の性能に負の影響を及ぼす目的の非コードＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）コード配列が、選択された配列（「第２のＲＮＡコード配列」）とは異なり、かつその高発現もまた同じ種類の細胞治療の性能に負の影響を及ぼす、転写活性のある遺伝子座（「第１の遺伝子座」）に挿入される。このような挿入は、第２のＲＮＡコード配列の発現を第１の遺伝子座の転写制御配列に作動可能に連結すると同時に、第１の遺伝子座における内因性遺伝子（コード又は非コード）の発現を消失させる。したがって、第１の遺伝子座で転写を開始するのに十分な条件下で、第２のＲＮＡコード配列が発現することになる。

上記の単一編集の実施形態は図１に示されており、ここでは、第１の遺伝子座で活性発現するｍｉＲＮＡコード配列は（例示的に「悪い」遺伝子として）「悪い」ｍｉＲＮＡと表示され、かつ第２の遺伝子座で低発現のｍｉＲＮＡコード配列は（例示的に「良い」遺伝子として）「良い」ｍｉＲＮＡと表示されている。図１に示すとおり、ＧＥＴを介する遺伝子編集は、第１の遺伝子座にて「良い」ｍｉＲＮＡのコピーを挿入して、「悪い」ｍｉＲＮＡのコード配列を破壊又は置換するために用いられる。このような置換の結果、「良い」ｍｉＲＮＡは「悪い」ｍｉＲＮＡの発現パターンを獲得し、これは「悪い」ｍｉＲＮＡをアップレギュレートする条件下（疾患状態など）でこれがアップレギュレーションされることによって証明され、同時に「悪い」ｍｉＲＮＡの発現（その発現は細胞治療の機能性を限定する）を消失させる。「良い」ｍｉＲＮＡはまた、発現が低いままである元の遺伝子座でも発現する。したがって、編集アプローチの最終的なアウトカムは、「悪い」ｍｉＲＮＡ発現の消失と同時に「良い」ｍｉＲＮＡ発現の活性化という二重のアウトカムとなり、どちらも細胞治療の効率の改善につながる。

図３に示される記載の方法のさらに一般的な実施形態では、第２のＲＮＡコード配列（図３の「良い」ｍｉＲＮＡ」）のコピーが第１の遺伝子座の調節制御下で発現し、かつ第１のＲＮＡコード配列（図３の「悪い」ｍｉＲＮＡ」）のコピーが、第２の遺伝子座の調節制御下で発現されるように、２つのＧＥＴ媒介性編集プロセスが実施される。この図で「疾患状態」と呼ばれる特定の環境条件下で、第２のＲＮＡコード配列の発現が誘導又は増強されると同時に、第１のＲＮＡコード配列の発現は基底レベルにまで阻害又は抑制されるであろう。ｍｉＲＮＡが果たす多様かつ相互に関連した調節的役割を考えると、このように「悪いｍｉＲＮＡ」の発現を基底レベルに維持することは、（その発現を完全に消失されることとは対照的に）有益である可能性がある。

図１と同様に、図２は、「良い」ｍｉＲＮＡによる「悪い」タンパク質コード遺伝子と表示された第１の遺伝子座の内在性遺伝子のＧＥＴを介する破壊を示している。このような置換により、「良い」ｍｉＲＮＡの発現が増加し、「悪い」タンパク質コードｍＲＮＡの発現がノックダウンされる結果となり、この２つにより、より良好な細胞療法の効率がもたらされる。「良い」ｍｉＲＮＡはまた、本来の遺伝子座でも発現され、そこでは指向性発現は低いままである。特定の実施形態において、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍の効率を低下させる「悪い」遺伝子は、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４などのこれらに限定されないが、阻害性免疫チェックポイント遺伝子の群から選択することができる。したがって、図２に記載の編集プロセスの後に、腫瘍環境に応答してＴ細胞がアップレギュレートされることが可能な活性は、低下するか、あるいはさらに消失することになるであろう。

本明細書に記載される方法において使用され得る遺伝子編集技術（Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、並びに当該技術分野において公知の任意の他の利用可能な遺伝子編集方法から選択されるが、これらに限定されない。

ｍｉＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の３’－非翻訳領域に主に位置する部分的相補的部位に結合することで、ｍＲＮＡの分解及び／又は翻訳の阻害を制御することを介して遺伝子発現を負に調節する低分子非コードＲＮＡの一群である。ｍｉＲＮＡは、ヒトのタンパク質コード遺伝子の６０％を超える翻訳を調節していると推定され、それによって細胞周期制御、細胞増殖と分化、アポトーシス、胚発生などを含む複数の生物学的プロセスの調節に関与している。ｍｉＲＮＡは、特定の経路内の複数の分子、又は集結経路及び生物学的プロセスでの多様なタンパク質を標的とする能力のために強力な細胞調節因子といえる。このように、ｍｉＲＮＡはそれらの異なる構成要素を累積的あるいは協調的に阻害することによって、生物学的ネットワークを強力に調節することができる。あるいは別として、正及び負の調節性成分を標的とすることにより、特定のシグナル伝達経路を微調整し得る。このことは、ｍｉＲＮＡの異常発現が、これらの重要なプロセスに比例的に影響を及ぼすはずであり、その結果、様々な病理学的、かつ時には悪性のアウトカムをもたらすはずであることを意味している。実際、ｍｉＲＮＡはヒトの疾患の発症、進行、及び治療反応において重要な役割を有するとして同定されてきた（６～９）。

例えば、統合失調症、パーキンソン病、及びアルツハイマー病のような神経変性疾患、免疫関連疾患、線維症、及び心疾患などの複数のヒトの疾患において、特定のｍｉＲＮＡの発現の変化（あるものはアップレギュレートされ、あるものはダウンレギュレートされる変化）が報告されている。しかしながら、数多くの同定されているｍｉＲＮＡ疾患のうち、がん疾患におけるｍｉＲＮＡの関与が最も高頻度である。リンパ腫、乳がん、肺がん、甲状腺乳頭癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、膵臓腫瘍、下垂体腺腫、子宮頸がん、脳腫瘍、前立腺がん、腎臓がん及び膀胱がん、及び大腸がんでは、腫瘍と正常組織との間でｍｉＲＮＡの発現の違いが確認されている。これらの観察結果は、ｍｉＲＮＡの多くが、がんに関連するゲノム領域によりコードされているという知見によって支持されており、ｍｉＲＮＡはがん遺伝子として、あるいは逆に腫瘍形成において重要な機能を持つ腫瘍抑制因子として作用し得るという見解を強めている（７、８、１０～１２）。

ｍｉＲＮＡ遺伝子はイントロン、エクソン、又は非翻訳ゲノム領域に位置する。一部のｍｉＲＮＡは、ポリシストロン転写産物中にクラスター化され、したがって、それらの発現が協調的に調節可能であるものもあれば、一方で、他のものは、組織特異的かつ発生段階特異的な様式で発現するものもある（６）。ｍｉＲＮＡはその遺伝子座から、最初にＲＮＡポリメラーゼＩＩによって長い一次転写産物として転写され、核内でＲＮＡｓｅ ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａによって約７０ヌクレオチドの前駆体にプロセシングされる。前駆体－ｍｉＲＮＡはその後、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ及びエクスポーチン５によって細胞質に輸送され、さらにＤｉｃｅｒタンパク質複合体によって不完全な２２ｍｅｒのｍｉＲＮＡ二重鎖にプロセシングされる（１３）。

マイクロＲＮＡの発現を制御するいくつかのメカニズムは、ヒトの疾患で変化し得る。これらには、プロモーターＣｐＧ島の過剰メチル化、ＲＮＡ修飾、及びヒストン修飾などのエピジェネティックな変化、あるいは突然変異、増幅、又は欠失などの遺伝子変化が含まれ、これらは主要なｍｉＲＮＡ転写産物の産生、生合成プロセス、及び／又はｍＲＮＡ標的との相互作用に影響を与える可能性がある（１２）。

ヒトの疾患におけるこれらの重要な役割に照らし、ｍｉＲＮＡは治療介入のための魅力的な標的である。ｍｉＲＮＡのエピジェネティック／遺伝的なサイレンシングを逆転させるために追求されてきた分子的アプローチには、合成ｍｉＲＮＡミミック又は発現ベクターにコードされたｍｉＲＮＡの直接投与、あるいはデシタビン又は５－アザシチジンなどの脱メチル化剤によるｍｉＲＮＡのエピジェネティックなサイレンシングの逆転が含まれる。アンチセンスｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチド（アンチｍｉＲ、又はアンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ））、小さなアンチｍｉＲ（全ｍｉＲＮＡファミリーの特定のシード領域を標的とする）、ｍｉＲＮＡスポンジ、ブロックミル（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡを標的とする小分子（ＳＭＩＲ）などｍｉＲＮＡの機能をブロックするような、及びエクソソーム中の細胞外ｍｉＲＮＡをブロックするような、他の分子的アプローチが採用されてきた（１４）。しかしながら、現在のｍｉＲＮＡベースの合成オリゴヌクレオチド治療薬は、ヌクレアーゼによる分解、腎クリアランス、毛細血管内皮を通過できないこと、標的細胞による非効果的なエンドサイトーシス、非効果的なエンドソーム放出、血液から毛細血管内皮を介する標的組織への製剤化されたＲＮＡベースの薬剤の放出、及び宿主免疫反応の誘導などの合成オリゴヌクレオチド薬剤に関連する問題を克服する必要がなお存在する。発現ベクターによって送達される場合、その危険性及び欠点は遺伝子治療に典型的なものである：サイレントゲノム領域への挿入によって導入遺伝子の発現が妨げられること、あるいは、組み込み部位近傍の宿主遺伝子の破壊／活性化により安全性に余波がもたらされる可能性があることである。

細胞療法の増強
本明細書に記載の方法は、限定されないが、抗がんＴ細胞媒介免疫療法などのＡＣＴ療法を含む細胞療法に使用するために、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞を改変するＧＥＴ法を利用する。特定の実施形態では、単離された細胞は間葉系幹細胞とすることができる。別の実施形態では、記載の方法で使用するための単離された細胞は、多能性造血幹細胞、又は複数の多分化能を有するその継代、又は単能性であるそのさらなる継代であり得る。特定の実施形態では、このような造血「継代細胞」は、赤血球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、又はマスト細胞であり得る。他の特定の実施形態では、Ｔリンパ球は、天然Ｔ細胞、誘導化制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ヘルパーＴ細胞、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であり得る。

特定の実施形態では、記載の方法で使用するための単離された細胞は、肝細胞などの実質細胞である。

特定の実施形態において、記載の方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いるようなＴ細胞療法において、選択されたｍｉＲＮＡの発現を調節するために採用される。活性化時に、Ｔ細胞は細胞成長、増殖、及びエフェクター機能をサポートするために、全般的な遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現のリモデリングを受ける。しかしながら、抗原刺激の性質、期間、及び設定の変化は、ｍｉＲＮＡ及び遺伝子の発現パターンが変化する結果となり得、それに続いて、アネルギー、寛容、及び／又は疲弊などのＴ細胞の機能不全の状態が生じ得る。以下に示すとおり、本明細書で記載するＧＥＴを介したｍｉＲＮＡ工学を用いれば、ｍｉＲＮＡの発現パターンを変化させ、ひいてはｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子の発現パターンを変化させることができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効率の低下を克服することが可能である。

ＡＣＴベースの療法でｍｉＲＮＡ工学を使用するためのさらなる標的Ｔ細胞は、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）である。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫反応の終りに向けてＴ細胞介在性免疫を停止させ、自己反応性Ｔ細胞を抑制する役割を果たすため、免疫寛容の維持に極めて重要である。これらの細胞は、免疫機能障害を引き起こす慢性炎症性自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）では低頻度で発生する（１５）。本明細書で記載のＧＥＴを介するｍｉＲＮＡ工学を用いれば、ＳＬＥ患者から単離したＴｒｅｇを増殖させ、この自己免疫抑制活性を高めることが可能になるであろう。

本明細書に記載の方法は、ＧＥＴを介するｍｉＲＮＡ工学を適用して、ｍｉＲＮＡなどのＴ細胞機能に負の影響を与える遺伝子をダウンレギュレートすると同時に、一方で正の影響を与える遺伝子をアップレギュレートする。

記載されたキャスリング法は、アップレギュレートされた有害なｍｉＲＮＡをダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡのコピーと置換することにより、同時の所望の「良い」ｍｉＲＮＡのアップレギュレーションと望ましくない「悪い」ｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションとを可能にし、その結果、所望のｍｉＲＮＡの高い発現レベルを確実にし、かつ有害なｍｉＲＮＡを停止することができる（例示的な実施形態については図１を参照）。同様に、「悪い」ｍｉＲＮＡのレベルを低く保つために、相互交換が行われることもある。このような方法では、有害なｍｉＲＮＡを所望のｍｉＲＮＡに置換するのと並行して、所望のｍｉＲＮＡを有害なｍｉＲＮＡに置換する（例示的な実施形態については図３を参照）。

なおさらなる実施形態では、所望の「良い」ｍｉＲＮＡが、「ノックイン」編集によって、ｅｘ ｖｉｖｏにてＴ細胞の望ましくない「悪い」遺伝子（例えば、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４などの阻害性免疫チェックポイント遺伝子）のコード領域に挿入され、その結果、ノックダウンされた遺伝子の抑制効果が排除されると同時に、ｍｉＲＮＡに関連した正の効果が得られる。この実施形態を図２に示す。遺伝子のコード領域にｍｉＲＮＡをノックインする場合、Ｄｒｏｓｈａプロセッシング部位及び転写終結シグナルなどの適切なシグナル配列の共挿入を確実にする必要がある（１６、１７）。

前述のとおり、記載の方法は、特定の実施形態において、治療効率の低下に関連する１つ又は複数のｍｉＲＮＡコード配列の発現を、治療効率の増加又は正常な治療効率に関連する１つ又は複数のｍｉＲＮＡコード配列に置換することによって、ＡＣＴ療法の効率を高めるために使用することができる。この遺伝的「スイッチング」は、本明細書では「キャスリング」とも呼ばれ、ＡＣＴプロセスのｅｘ ｖｉｖｏの任意の段階で実施することができる。特定の実施形態において、単離されたＴ細胞集団が本明細書に記載されるとおり遺伝子的に編集されるように［例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）］、さらなる改変（例えば、キメラ抗原を発現するための工学的操作）の前に、又は他の編集媒介改変（例えば、キメラ抗原を発現するための工学的操作）の後に編集されるように、ＡＣＴの手順は変更される。他の実施形態では、それを必要とする対象に投与するように「準備される」リンパ球の集団を、本方法に従って編集し、再増殖し、次いで患者に提供する。

Ｔ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現工学
特定の実施形態において、記載の方法は、Ｔ細胞の疲弊及び／又はアネルギーを緩和し、その持続性を延長し、及び／又は固形腫瘍の根絶におけるその効率を改善するために採用され得る。

一実施形態では、記載の方法は、前臨床研究及び臨床研究においてＴ細胞の疲弊を減少させることができることが知られているＣＡＲ－Ｔ細胞療法とチェックポイント阻害療法との組み合わせなど、現在使用されているＣＡＲ－Ｔ細胞との戦略及び組み合わせを採用することができる。

現在のチェックポイント阻害アプローチには、ＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせた阻害性免疫チェックポイント標的に対する抗体を使用すること、Ｔ細胞自体によりこれらの抗体を産生及び分泌させること、免疫チェックポイント遺伝子を阻害する合成オリゴヌクレオチドによりｅｘ ｖｉｖｏでＣＡＲ－Ｔ細胞を治療すること、又はＣＡＲ－Ｔ細胞内の免疫チェックポイント遺伝子のＧＥＴ媒介性ノックダウンを代替的に使用することが含まれる（５）。

Ｔ細胞ゲノムのＧＥＴを介した改変に対する記載の方法は、特定のｍｉＲＮＡの発現をアップレギュレートする一方で、他の望ましくないｍｉＲＮＡ又は他の非コードＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害するであろう。

以下の項目では、例示的なｍｉＲＮＡについて記載し、記載の方法を用いてｍｉＲＮＡの発現を、Ｔ細胞療法の効率を増大するように変化させることができる。しかしながら、このリストは単なる例示であり、当業者であれば、Ｔ細胞の効率に同様に影響を与えると同定されるｍｉＲＮＡであれば、いずれも使用できることが理解されよう。同様に、以下にリストされる例示的に「悪い」遺伝子はｍｉＲＮＡであるが、Ｔ細胞の効率に有害なコードＲＮＡ又は非コードＲＮＡをコードする任意の核酸は記載した方法を用いて破壊又は置換を受けることが可能である。

Ｔ細胞療法の効率に正の効果を有する「良い」ｍｉＲＮＡ
これらのｍｉＲＮＡの発現は、活発に転写される「悪い」ｍｉＲＮＡ／コード遺伝子領域への編集を介した挿入によって増大されることになる。

ｍｉＲ－１８１ａ
特定の実施形態では、養子移入された腫瘍特異的Ｔ細胞の改善により、ＴＣＲシグナル伝達の閾値を調節して、Ｔ細胞の活性化及び機能を増強する。ｍｉＲ－１８１ａなどの複数のｍｉＲＮＡは、主要な阻害性ホスファターゼを標的とすることで、ＴＣＲシグナル伝達に影響を与えることが分かっている。

特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８１ａは、複数のセリン／スレオニン及びチロシンのホスファターゼを同時に標的とするようにアップレギュレートされる。これはまた、ＤＵＳＰ５（二重特異性ホスファターゼ５（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ５））、ＤＵＳＰ６（二重特異性ホスファターゼ６）、ＰＴＰＮ１１（プロテインチロシンホスファターゼ非受容体１１型（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｎｏｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １１））、及びＰＴＰＮ２２（プロテインチロシンホスファターゼ非受容体２２型）を阻害することにより、ＬＣＫ（ＬＣＫがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ）及びＥＲＫ（ＭＡＰＫ１－分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１）の活性を増強することもできる。この活性は中枢及び末梢のＴ細胞寛容を支配している。さらに、Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１８１ａの過剰発現は、同族抗原に対するＴＣＲ感受性を増加させ、かつＴＣＲトリガー時の細胞内カルシウム流（ｃａｌｃｉｕｍ ｆｌｕｘ）を増強し、その結果、ＩＬ－２がより顕著に放出され、このＩＬ－２は他の活性の中でもＴ細胞のエフェクターＴ細胞への分化とメモリーＴ細胞への分化とを促進する。したがって、ｍｉＲ－１８１ａの発現を高めるように操作されたＴ細胞は、活性化特性を高めることが期待される（４５、４６）。

ｈｓａ－ｍｉｒ－１８１ａ－１配列は以下のとおり公開されている。本明細書で言及したすべてのマイクロＲＮＡ配列は、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇでオンラインで見ることができる。

太字の配列は、成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）及び３ｐ鎖（右）を表す。

小文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

ｍｉＲ－２８
別の実施形態では、Ｔ細胞は、ｍｉＲ－２８の発現が増加されているようにＧＥＴによって工学操作される。メラノーマから抽出された疲弊ＰＤ－１＋Ｔ細胞では、ｍｉＲ－２８の発現が約３０％ダウンレギュレートされていることが報告されている。ｍｉＲ－２８は、それぞれの３’ＵＴＲに結合することにより、Ｔ細胞における免疫チェックポイント分子ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＢＴＬＡの発現を阻害する。実験的には、ｍｉＲ－２８ミミックの添加は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の分泌を回復させることによって、ＰＤ－１＋Ｔ細胞の疲弊した表現型を、少なくとも部分的に、変換することができる。がん患者において、ＴＩＭ－３抗体の投与により、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による増殖及びサイトカイン産生が増加する。ＴＩＭ－３の前臨床研究では、これは腫瘍浸潤リンパ球にＰＤ－１と共に発現していることが示されており、これら２つのタンパク質を標的とした組み合わせ療法は、Ｔ細胞を介した抗腫瘍応答を増大することが可能である。近年、複数の抗ＰＤ－１剤及び抗ＰＤ－Ｌ１剤が開発されており、がん免疫療法において、記載の工学操作したＴ細胞と共に使用することができる。例えば、ペムブロリズマブは２０１４年にメラノーマの治療薬として初めてＦＤＡに承認されたＰＤ－１阻害薬である。また、アテゾリズマブはＰＤ－Ｌ１に対する完全ヒト化ＩｇＧ１抗体であり、尿路上皮がん及び非小細胞肺がんの治療薬として２０１６年にＦＤＡの承認を受けている。さらに、アベルマブ及びデュルバルマブは、完全ヒト化ＩｇＧ１抗体であり、メルケル細胞癌、尿路上皮癌、及び非小細胞肺癌の治療に対してＦＤＡの承認を受けている（１８）。総合すると、ｍｉＲ－２８は、Ｔ細胞の終期状態をメモリー細胞に逆転させ、かつ炎症促進性サイトカインを分泌するＴ細胞の能力を回復させるのに重要な役割を果たしている可能性がある（１９）。上記の活性剤はすべて、記載された組み合わせ療法に使用可能である。

ｈｓａ－ｍｉｒ－２８の配列は以下のとおり公開されている：
太字の配列は、成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）及び３ｐ鎖（右）を表す。

小文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

ｍｉＲ－１４９－３ｐ
さらなる実施形態では、Ｔ細胞はｍｉＲ－１４９－３ｐの発現が増強されるように工学的に操作される。ｍｉＲ－１４９－３ｐは、乳がん細胞の存在下で、阻害性受容体を減少させ、かつサイトカイン分泌を促進することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊を逆転させることが示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞をｍｉＲ－１４９－３ｐミミックで治療すると、アポトーシスが減少し、Ｔ細胞の疲弊のｍＲＮＡマーカーの変化が弱小化され、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、及びＦｏｘｐ１をコードするｍＲＮＡがダウンレギュレートされた。同時に、Ｔ細胞の増殖、及びＴ細胞の活性化の増大を示すエフェクターサイトカイン（ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の分泌がｍｉＲ－１４９－３ｐミミック治療の後にアップレギュレートした。さらに、ｍｉＲ－１４９－３ｐミミックによる治療は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の標的４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞を殺傷する能力を促進した。総合すると、これらのデータは、ｍｉＲ－１４９－３ｐはＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を逆転させ、これが乳がんにおける可能な抗腫瘍免疫治療薬となることを明らかにした（２０）。ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９配列は以下のとおり公開されている：
太字の配列は成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）と３ｐ鎖（右）を表す。

小文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

Ｔ細胞療法の効率に負の影響を有する「悪い」ｍｉＲＮＡ
Ｔ細胞免疫応答を負に調節する活性に発現されるｍｉＲＮＡに拮抗することは、Ｔ細胞の適応性（ｆｉｔｎｅｓｓ）及び抗腫瘍機能を高めるための代替的アプローチである。したがって、Ｔ細胞におけるこのようなｍｉＲＮＡのゲノム遺伝子座は、「良い」ｍｉＲＮＡの挿入を介したＧＥＴ媒介性ノックダウンの標的である。

ｍｉＲ－１４６ａ
一実施形態では、ｍｉｒ１４６ａの発現を消失又は阻害することができる。ｍｉＲ１４６ａは、ＮＦ－Ｂシグナル伝達の主要な抑制因子であり、エフェクター応答を減衰させるためにＴ細胞の活性化に応答してアップレギュレートされる。ｍｉｒ１４６ａノックアウト（ＫＯ）マウスは免疫寛容を失うことが示されている。Ｔ細胞のｍｉＲ１４６ａに対する拮抗は、養子移入された細胞のＮＦ－Ｂ活性を増大し、かつ抗腫瘍応答の効力を潜在的に高めることが期待される（２１）。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞におけるｍｉＲ１４６ａのＧＥＴ媒介性の欠失又は抑制は、Ｔ細胞の効率を高めるであろう。

ｈｓａ－ｍｉｒ－１４６ａの配列は以下のように公開されている：
太字の配列は成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）と３ｐ鎖（右）を表す。

小文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

ｍｉＲ－３１
別の実施形態では、Ｔ細胞はｍｉＲ－３１の発現が減少又は停止するように工学的に操作される。ｍｉＲ－３１の産生は、Ｔ細胞系が一部のがん及び慢性感染症を制御できない原因である、免疫疲弊表現型の発現における重要なイベントである可能性が実証された。マウスでのｍｉＲ－３１のノックアウトにより、疲弊表現型の発生が妨害された。ＬＣＭＶでの慢性感染に応答して、ｍｉＲ－３１欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞は、疲弊マーカーのレベルの低下を表し、細胞毒素及びサイトカインの産生を含むエフェクター細胞の特徴を保持する。Ｔ細胞にのみｍｉＲ－３１の発現を欠くマウスは、慢性感染に関連する萎縮から保護され、ウイルス力価が低く保持された。ｍｉＲ－３１の過剰発現細胞では、インターフェロンシグナル伝達に関与するＩｆｎａ２、Ｉｒｆ３、及びＩｒｆ７の発現が増加していた。さらに、同じ細胞では６８個のｍｉＲ－３１標的遺伝子の発現が減少しており、これにはインターフェロンのシグナル伝達作用をダウンレギュレートするメディエーターであるＰｐｐ６ｃが含まれていた（２２～２４）。これらの知見を総合すると、ｍｉＲ－３１の活性に対向することがチェックポイント阻害療法に代替するアプローチであることが示唆される。

ｈｓａ－ｍｉｒ－３１の配列は以下のとおり公開されている：
太字の配列は成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）と３ｐ鎖（右）を表す。

小文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

ｍｉＲ－２１
別の実施形態では、ＧＥＴはｍｉＲ－２１の発現が減少したＴ細胞を工学的に操作するために用いられる。Ｃａｒｉｓｓｉｍｉらは、メモリーＴリンパ球がナイーブＴリンパ球に比べて高レベルのｍｉＲ－２１を発現すること、そしてナイーブＴ細胞のＴＣＲのエンゲージメント時にｍｉＲ－２１の発現が誘導されることを示した。活性化誘導性のｍｉＲ－２１のアップレギュレーションは、分化Ｔ細胞のトランスクリプトームをメモリーＴ細胞から炎症性エフェクターＴ細胞へと偏らせる。このようなトランスクリプトームの偏りはまた、ｍｉＲ－２１の発現が増加している高齢の個体のＴ細胞応答に特徴的であり、これはｍｉＲ－２１に対して拮抗することによって逆転する。

ｍｉＲ－２１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞においてｍｉＲ－２１の標的が同定され、シグナル伝達に関与する遺伝子を含むことが判明した。Ｊｕｒｋａｔ細胞でｍｉＲ－２１を過剰発現させると、ＴＣＲシグナル伝達が減衰され、その結果、より低下したＥＲＫリン酸化、ＡＰ－１活性化、ＣＤ６９（増殖に関与）の発現がもたらされた。一方、ｍｉＲ－２１活性が損なわれた初代ヒトリンパ球は、ＣＤ６９、ＯＸ４０、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７の発現解析によって評価されるとおり、ＩＦＮ－γ産生が増強し、かつＴＣＲのエンゲージメントに応答してより強い活性を示した。初代Ｔリンパ球の内因性タンパク質の細胞内染色により、リンパ球活性化の３つの主要な調節因子（ＰＬＥＫＨＡ１、ＣＸＣＲ４、ＧＮＡＱ）が新規のｍｉＲ－２１標的であることが確認された。これらの結果は、ｍｉＲ－２１がＴリンパ球におけるシグナル伝達の負の調節因子であることを示唆している（２５）。総合すると、これらのデータは、Ｔ細胞におけるｍｉＲ－２１のアップレギュレーション又は活性を抑制することで、効果的な細胞傷害応答を行う能力を向上し得ることを示唆している（２６）。

ｈｓａ－ｍｉｒ－２１の配列は以下のとおり公開されている：
太字の配列は成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）と３ｐ鎖（右）を表す。

小文字はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

ｍｉＲ－２３ａ
Ｔ細胞における効果的なメモリー生成は、病原体又は腫瘍のクリアランスを必要とする。持続的な抗原曝露はＣＤ８＋Ｔ細胞の「疲弊」を誘導し、ＰＤ－１（プログラム細胞死１）、ＬＡＧ－３、及びＣＴＬＡ－４を含む阻害性受容体のアップレギュレーションを特徴とし、増殖能、エフェクター機能、及び細胞生存率の低下を伴う。Ｔ細胞の疲弊を逆転させると、既存の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が解放可能になり、がん細胞を攻撃し、かつ殺傷することができることが明らかになっている。ｍｉＲ－２３ａは、ＣＴＬ（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球）の細胞毒性及びエフェクター細胞の分化を促進する転写因子ＢＬＩＭＰ－１の強力な機能抑制因子として同定された。進行肺がん患者のコホートにおいて、ｍｉＲ－２３ａは腫瘍浸潤ＣＴＬにおいてアップレギュレートされ、その発現は患者のＣＴＬの抗腫瘍能の低下と相関していた。腫瘍由来ＴＧＦ－βは、ｍｉＲ－２３ａを上昇させ、かつＢＬＩＭＰ－１をダウンレギュレートすることによって、ＣＴＬ免疫機能を直接抑制することが実証された。ヒトＣＴＬにおけるｍｉＲ－２３ａの機能的ブロックは、グランザイムＢの発現を増強し、かつｍｉＲ－２３ａが阻害される少数の腫瘍特異的ＣＴＬによる免疫療法は、腫瘍が樹立したマウスにおいて、腫瘍の進行を強固に妨げた。総合すると、これらの所見は、ｍｉＲ－２３ａの発現を停止させることで、養子細胞移入腫瘍免疫療法でしばしば観察されるＣＴＬの免疫抑制を防ぐことが期待されることを示している（２２、２７）。

ｈｓａ－ｍｉｒ－２３ａの配列は以下のように公開されている：
太字の配列は成熟ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖（左）と３ｐ鎖（右）を表す。

小文字はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ隣接ゲノム配列を表し、大文字は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を表し、太字は成熟ｍｉＲＮＡの鎖を表す。

Ｔ細胞の治療効率に負の作用を有する「悪い」遺伝子
阻害性免疫チェックポイント遺伝子
Ｔ細胞は、感染症及びがんに関連した持続的な抗原及び／又は炎症性シグナルに曝露される。例えば、固形腫瘍の場合、その微小環境は、有効なＴ細胞活性にとって特に敵対的で、Ｔ細胞の侵入に対する障壁をもたらし、ＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命を縮め（１）、かつエフェクター機能を低下させる内在的及び外在的な阻害性メカニズムを有している。これらの条件が重なると、Ｔ細胞の「疲弊」と呼ばれる状態をもたらす（２８）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の性能及び持続性を向上させるために、これまでいくつかのアプローチが採用されてきたが、そのうちの一部は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、あるいはそれらに対応するリガンドなどの免疫チェックポイント標的（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔａｒｇｅｔ：ＩＣＴ）の抑制を目的としている。例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－１に対する分泌抗体（Ｆａｂ領域）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（２９）、あるいはＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４阻害性受容体をコードする遺伝子が破壊されたＣＡＲ－Ｔ細胞がある。別のアプローチは、ＣＤ２８共刺激分子の細胞質シグナル伝達ドメインと融合した細胞外ドメインとしてＰＤ－１受容体の切断型を持つキメラスイッチ受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｗｉｔｃｈ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＳＲ）を介して、ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４の阻害性シグナルを活性化シグナルに変換することからなる（５）。

記載の方法の特定の実施形態では、ＧＥＴ媒介遺伝子編集は、ｍｉＲＮＡコード配列などのＲＮＡコード配列を、ＩＣＴのコード配列などのタンパク質コード配列に挿入するために使用される。特定の実施形態において、記載の方法は、Ｔ細胞機能に正の影響を及ぼすｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－２８、又はｍｉＲ－１４９－３ｐ）のＧＥＴ媒介ノックインによるＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、又はＬＡＧ－３のノックダウンを含む。

全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）治療のためのＴｒｅｇ細胞におけるｍｉＲ－１４６ａのアップレギュレーション及びｍｉＲ－１７のダウンレギュレーション
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の末梢血白血球における１５６個のｍｉＲＮＡのプロファイリングから、自然免疫の負の調節因子であるｍｉＲ－１４６ａを含む複数のマイクロＲＮＡの差次的発現が明らかになった。さらに解析の結果、ｍｉＲ－１４６ａの過小発現は、ＳＬＥ患者の臨床的疾患活性及びインターフェロン（ＩＦＮ）スコアと負の相関があることが示された。注目すべきは、ｍｉＲ－１４６ａの過剰発現は、内因性ｍｉＲ－１４６ａの阻害は増大させながら、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）におけるＩ型ＩＦＮの誘導を減少させたことである。さらに、ｍｉＲ－１４６ａは、Ｉ型ＩＦＮの下流のトランス活性化を直接抑制し、かつさらに重要なことに、患者のＰＢＭＣにｍｉＲ－１４６ａを導入すると、Ｉ型ＩＦＮ経路の協調的活性化が緩和された（３０）。分子レベルでは、ｍｉＲ－１４６ａは、デクチン－１／チロシンプロテインキナーゼＳＹＫ／ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を阻害することにより、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのβグルカン誘導性の産生を抑制することが示された（３１）。これはまた、ｍｉＲ－１４６ａがＩＲＡＫ１遺伝子（インターロイキン１受容体関連キナーゼ１）を直接標的とすることも示された。ＩＲＡＫ１は、転写因子ＮＦ－カッパＢのＩＬ１誘導性アップレギュレーションに部分的に関与している。したがって、ｍｉＲ－１４６ａはＩＲＡＫ１の発現をダウンレギュレートさせ得、それにより、炎症性シグナルの活性化及び炎症促進性サイトカインの分泌を阻害し得ると結論が出された。さらに、ｍｉＲ－１４６ａのダウンレギュレーションは、炎症促進性サイトカインの分泌に対する負の作用を排除し得、これにより、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのレベルの増大をもたらし、それによってＳＬＥの発症を促進する可能性が示唆された（３２）。

ループス患者におけるＩＦＮ経路の負の調節因子としてのｍｉＲ－１４６ａの重要な役割を考慮すると、記載の方法のさらなる実施形態には、ＳＬＥ患者における治療的介入のためのＧＥＴ媒介遺伝子編集が含まれる。ｍｉＲ－１４６ａの発現は、負のフィードバック様式でＮＦ－κＢによって調節される。２つのＮＦ－κＢ結合部位は、ｍｉＲ－１４６ａのプロモーターの３’セグメントにおいて、転写開始位置に対して－４８１位から＋２１位のヌクレオチド位置と同定した（３３）。したがって、特定の実施形態では、ＳＬＥ患者の造血幹細胞においてその活性を増強するように、このｍｉＲ－１４６ａの位置づけされたプロモーターを編集することができ、あるいは別のプロモーターの調節下でｍｉＲ－１４６ａの追加のコピーを導入することができる。

同様の実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は遺伝子編集の標的細胞として提供される。Ｌｕらは、ｍｉＲ－１４６ａがＴｒｅｇ細胞で広く発現しているｍｉＲＮＡの一つであることを報告し、それがＴｒｅｇの機能に重要であることを示した。実際、ｍｉＲ－１４６ａの欠損により、Ｔｒｅｇ細胞の数は増加するが機能は低下し、その結果、免疫寛容が破壊されリンパ球が大量に活性化し、かついくつかの臓器で組織浸潤が起こった（３４）。反対に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＲ－１７の過剰発現は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性の低下をもたらし、さらに、ｍｉＲ－１７の異所性発現は、エフェクターサイトカイン遺伝子の脱抑制を介して、Ｔｒｅｇ細胞にエフェクターＴ細胞様特性を付与した。ｍｉＲ－１７をブロックすると、Ｔ－ｒｅｇ抑制活性が増強される結果となった。ｍｉＲ－１７の発現は、ＩＬ－６（ＳＬＥ患者で高発現する炎症促進性サイトカイン）の存在下でＴ－ｒｅｇ細胞を増加し、かつその発現は、Ｅｏｓの発現を負に調節し、このＥｏｓは、Ｔ－ｒｅｇ細胞の転写シグネチャー及び特徴的な抑制性表現型を決定するようにＴ－ｒｅｇ細胞の転写因子Ｆｏｘｐ３と協働する共調節分子である。このように、ｍｉＲ－１７は、Ｅｏｓ及び可能性な追加のＦｏｘｐ３共調節因子を標的とすることを介してＴｒｅｇ細胞を制御する強力な層を提供する（３５）。

本方法で使用できるＴｒｅｇを増殖させるメカニズムは２つあり、１つは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ２８の抗体を使用したｅｘ ｖｉｖｏ増殖の使用を含むものであり、もう１つはトランスフォーミング増殖因子β単独、又はオールトランスレチノイン酸、ラパマイシンとの組み合わせ、又はラパマイシン単独の使用を介した通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ）のＴｒｅｇへの変換を含むものである。いったん増殖したＴｒｅｇは、ｍｉｒ－１７の遺伝子座にｍｉＲ－１４６ａのコピーを挿入し、発現を破壊することによって、ｍｉＲ－１４６ａを過剰発現するように（ＧＥＴを用いて）遺伝子操作することができる。そして、このような遺伝子操作されたＴｒｅｇは、単独療法として、あるいは、例えば低用量ＩＬ－２療法などの他の療法と組み合わせて、ＳＬＥの治療に用いることができる。インターロイキン２（ＩＬ－２）の後天的な欠乏及びそれに関連した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）恒常性の外乱がＳＬＥの病因に重要な役割を果たしていることが観察された。低用量ＩＬ－２療法は活性ＳＬＥ患者のＴｒｅｇ恒常性を回復させることが示され、現在、臨床試験でその臨床的効率が評価されている（３７）。

ＳＬＥの治療のための記載の方法を使用するさらなる実施形態では、Ｂ細胞はＧＥＴ媒介遺伝子編集によって改変された細胞の標的である。Ｂ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法など、腫瘍学分野で発展している治療法にとって魅力的な標的であり、Ｂ細胞を標的にすることが有益であることが証明されている。マウスモデルでは、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＳＬＥの可能な治療薬として指摘されており、生存期間の延長及び標的臓器の温存を示す結果を伴う。したがって、ＣＡＲ及びＢ細胞の抗原受容体などのキメラ免疫受容体を発現するＴｒｅｇを用いることは、特異的Ｔ細胞コンジュゲートとの結合により、正常細胞を直接保護する結果となり得る。したがって、このようなＣＡＲ－Ｔｒｅｇはまた、免疫抑制性機能を高めるように、過剰発現したｍｉＲ－１４６ａ／ダウンレギュレートしたｍｉｒ－１７も含むことができる。

肝細胞におけるＧＥＴを介したｍｉＲＮＡ工学
他の実施形態では、ＧＥＴを介するｍｉＲＮＡベースの治療薬は、衰弱性慢性疾患の治療に、以下の場合に使用される：（ａ）ＧＥＴを介した遺伝子編集のｅｘ－ｖｉｖｏ適用を可能にするために、標的細胞を単離、増殖、及び関連臓器に再導入する能力がある場合、及び（ｂ）臓器細胞の一部のみを置換するにもかかわらず、所望の効果を得るために、分泌タンパク質をコードする遺伝子を標的とする能力がある場合。

特定の実施形態では、このような治療に使用できる細胞は、例えば肝細胞などの実質細胞である。肝細胞移入は、肝疾患患者を治療するための代替手段であり、２０年を超える臨床適用及び臨床研究によって、その効率及び安全性が実証されてきた。さらに、幹細胞由来肝細胞などの追加の細胞ソースも試験されている（３８、３９）。

一実施形態では、ＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９：前駆体タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）の標的化は、ＧＥＴ媒介編集によって達成される。ＰＣＳＫ９は分泌タンパク質であり、主に肝臓で生成され、ＬＤＬ－Ｃ（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：低密度リポタンパク質コレステロール）の恒常性の調節に重要な役割を果たす。ＰＣＳＫ９は低密度リポタンパク質粒子（ＬＤＬ）の受容体に結合し、これは通常、細胞外液中で、１粒子あたり３，０００～６，０００個の脂肪分子（コレステロールを含む）を輸送する。ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）は肝臓及び他の細胞膜に存在し、細胞外液からＬＤＬ粒子を細胞内に結合かつ取り込み、その結果、ＬＤＬ粒子濃度を低下させる。ＰＣＳＫ９がブロックされる場合、より多くのＬＤＬＲが再利用され、細胞外液からＬＤＬ粒子を除去するために細胞表面に存在するようになる。それ故、ＰＣＳＫ９をブロックすることにより血中ＬＤＬ粒子濃度を低下させることができる（４０、４１）。

一実施形態において、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－１９１、及び／又はｍｉＲ－２２４の発現を増加させることは、ＰＣＳＫ９の３’－ＵＴＲと直接相互作用し、その発現をダウンレギュレートし得る。ＨｅｐＧ２細胞株でこれらのｍｉＲＮＡを過剰発現させると、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルは有意に減少し、このことから、ｍｉＲ－１９１、ｍｉＲ－２２２、及びｍｉＲ－２２４は、ＬＤＬＲ分解及び細胞内ＬＤＬ取り込みに重要な役割を持つＰＣＳＫ９を標的とすることにより、脂質及びコレステロール代謝に重要な役割を果たし、かつ高コレステロール血症及びＣＶＤ（心血管疾患）などの病態の発症に関与している可能性が示された。したがって、ｍｉＲ－１９１、ｍｉＲ－２２２、及び／又はｍｉＲ－２２４は、肝細胞におけるＧＥＴ編集を介したアップレギュレーションに使用できる可能性がある。しかしながら、ｍｉＲ－１９１は様々な疾患及びがんの種類の発症に密接に関連しているようであり、自然免疫応答にも関与している可能性がある。さらに、最近の研究では、その阻害ががんの表現型の逆転につながることが実証された（４２）。ｍｉＲ－２２４は肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）患者では高い血漿レベルを示すことが観察されており、したがって腫瘍進行のエフェクターとして疑うことが可能である。一方で、ｍｉＲ－２２２の血漿レベルは、対照群と比較してＨＣＣ群で有意に低かった（４３）。さらに、ｍｉｒ－２２２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＭＨ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ：マウス初代肝細胞）の増殖を調節する重要な因子として同定されており、したがってｍｉｒ－２２２は移入肝細胞におけるアップレギュレーションの候補として妥当であると考えられる（４４）。

別の実施形態では、ＧＥＴ媒介編集を使用してｍｉｒ－２７の発現を阻害することができ、ｍｉｒ－２７ａは、ＰＣＳＫ９レベルを３倍の増加に誘導し、肝臓ＬＤＬ受容体のレベルを４０％直接減少させる。ｍｉＲ－２７ａの阻害により、ＬＤＬ受容体のレベルが７０％増加する。ｍｉＲ－２７ａは、ＬＤＬＲ経路の重要な役割を担う遺伝子ＬＲＰ６及びＬＤＬＲＡＰ１を標的とする。したがって、特定の実施形態では、ｍｉＲ－２７ａの阻害は高コレステロール血症の治療に使用され、スタチンの代替となり得る。別の実施形態では、ｍｉＲ－２７ａをｍｉＲ－２２２で置換することによって達成され、これは、ＰＣＳＫ９レベルを低下させると同時にＬＤＬＲレベルを上昇させることにつながり得るため、高コレステロール血症のより効率的な治療となるであろう。

以下の実施例は、特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載の特定の特徴又は実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１：一般的な方法
Ｔ細胞の活性化
ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ４７８ Ｔ細胞活性化因子（５ｕＬ／１×１０^６；ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＩＬ－２（１００Ｕ／ｕＬ；Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）を用いて解凍後４時間にＰＢＭＣを活性化し、２×１０^６細胞／ｍＬの濃度に保った。

ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化
ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を駆動するために、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＋）細胞と共に共培養した。ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞は実験前にあらかじめ選別せず、バルク集団として（ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞との混合として）使用し、ＣＤ１９－ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合は、ＣＤ１９－ＣＡＲ構築物と同時に平行して存在するＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１－（ＬＮＧＦＲ）－ＡＰＣクローンＲＥＡ６５８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の染色によって間接的に評価した。実験では、１０，０００個のＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞を１０，０００個のＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した。

Ｔ細胞のヌクレオフェクション
活性化後３日目に、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）及びＥ０１１５プログラムを用いて、１×１０^６個のＰＢＭＣを４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）でエレクトロポレーションした。切除実験では、選択した遺伝子（ｍｉＲ－３１又はｍｉＲ－２３）を標的とする各ｓｇＲＮＡ（１１２．５ｐｍｏｌ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）をＣａｓ９タンパク質（３０ｐｍｏｌ、ＩＤＴ）と別々に室温で１０分間インキュベートし、各個々のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成させた。インキュベーション時間の終了後、この２つの別々の反応液をプールした。ヌクレオフェクション溶液は、ヌクレオフェクションの前に混合物全体を細胞に加える直前に加えた。置換実験では、同じ手順に従ったが、この場合、ヌクレオフェクション溶液の直前に、１００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ（ＩＤＴ）をＲＮＰ混合物に加えた。エレクトロポレーション後、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ；Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）を添加した完全ＲＰＭＩ培地を用いて細胞を回収し、その後、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）で培養した。５日後、細胞を２つのウェルに分けた。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ ｇＤＮＡ抽出キット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造元の手順に従ってゲノムＤＮＡを抽出するため、一方のウェルを直ちに採取した。得られたＤＮＡを４０ｕＬのヌクレアーゼフリー水に懸濁した。２つ目のウェルの細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔを用いて再活性化し、活性化後６時間又は３日間にｍｉＲＮＡを採取して、ｍｉＲＮＡ－２３又はｍｉＲＮＡ－３１の発現レベルを確認した。活性化後６時間に採取した試料はＣＡＳＴＬＩＮＧ（登録商標）の効率を評価するために使用し、活性化後３日間に採取した試料はｍｉＲＮＡのノックアウトの程度を推定するために使用した。ｍｉＲＮＡはｍｉＲＶａｎａキット（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて抽出した。細胞を回収し、３００Ｇで５分間ペレット化した。このペレットを１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを注意深く除去した後、メーカーの指示に従って、最終容量５０ｕＬのＲＮＡｓｅフリー水で溶出することにより、全ｍｉＲＮＡ抽出物を得た。遺伝子編集に使用したオリゴヌクレオチドの標的配列は以下のとおりであった：

斜体で示した配列は、各標的につき組み合わせて使用した際、最良の性能のｓｇＲＮＡであった。これらの配列は、さらなるＣＡＳＴＬＩＮＧ（登録商標）最適化工程に使用した。ｓｇＲＮＡには、安定性の目的でＳｙｎｔｈｅｇｏの標準的な修飾が含まれている。これらは以下のとおりである：最初の３個と最後の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル；及び最初の３個と最後の２個のヌクレオチド間に３’－ホスホロチオエート結合。

上記のｓｓＯＤＮ配列：
斜体：ホモロジーアーム、左及び右
非斜体：ｍｉＲ－２８配列

ｍｉＲＮＡの逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＴ）及びｑＰＣＲ
ｍｉＲＮＡ標的はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ）し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（カタログ番号：４４２７９７５）の手順に従ってＲＴ－ｑＰＣＲを行った。

全メッセンジャーＲＮＡ抽出、ＲＴ及びＲＴ－ｑＰＣＲ
ＰＤＣＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及びＢＬＩＭＰ－１の遺伝子の発現レベルを測定するために、第２の活性化（Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔを用いるか、又は照射ＰＢＭＣと共培養することを介するかのいずれか）の後４８時間に採取した細胞の全ｍＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元の抽出法に従って抽出した。全ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉｔｅｃｈ ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。専用プライマー（表１参照）及びＬｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて製造元の手順に従って、全ｃＤＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲの投入量（インプット）として使用した。

遺伝子編集アッセイ（Ｔ７Ｅ１、ＤＥＣＯＤＲ、ｄｄＰＣＲ）
標的部位で使用したヌクレアーゼの切断効率を評価するために、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１、ＮＥＢ）アッセイを製造元の推奨に従って使用した。ゲノムＤＮＡを単離した後（上記参照）、目的の遺伝子座を指定のプライマー（表１参照）とＨｉ－Ｆｉ Ｈｏｔ－Ｓｔａｒｔ Ｑ５ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）とを用いたＰＣＲで増幅した。２．５μＬのＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動によって分析して正しい増幅サイズを確認し、ＰＣＲ反応物の残りはＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。得られたアンプリコンを２７μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出した。次いで、３ｕＬのＮＥＢ２緩衝液（１０倍）を精製した反応液と混合し、混合物全体を最大９５℃で、１０分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷却して鎖を再アニーリングした。濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、ヌクレアーゼフリー水を使用して、最終濃度１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２の全容積１２μｌ中で１μｌのＴ７Ｅ１を用いて１００ｎｇのＤＮＡを消化させた。その後、反応液をウォーターバスで３７℃で、３０分間インキュベートした。反応は１．２μｌのゲルローディング色素（ＮＥＢ）を加えることにより停止させ、切断効率を評価するために２％アガロースゲルで分析した。定量化のために、切断バンドの強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計算した。ヌクレアーゼの切断を示すＩｎｄｅｌ変異の割合は、切断バンドの強度と、切断されていないバンドと切断バンドとの両方の強度の合計との比を用いて計算される。

正確な切除を確認するために、Ｔ７Ｅ１アッセイに用いたのと同じＰＣＲプライマー（ｍｉｒ２３についてはＩＤ番号６２１９及びＩＤ番号６２２０、ｍｉｒ３１についてはＩＤ番号６２１５及びＩＤ番号６２１６）を用いて、対応する標的領域を増幅した。得られたアンプリコンはサンガー法で配列決定を行った。得られた配列決定ファイル（．ａｂ１）は、ＰＣＲアンプリコン内の最大５００ｂｐの挿入変異及び欠失変異を同定できるオンラインツール「ＤＥＣＯＤＲ」（ｄｅｃｏｄｒ．ｏｒｇからオンラインで利用可能）にアップロードした。

置換（すなわち「キャスリング」）効率を調べるために、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）ベースのアッセイを設計した。このアッセイでは、プライマー対が編集領域（共通領域と呼ばれる）の外側に結合し、第２のプライマー対は置換が発生した場合にのみ結合する。表１に示すプライマー（ＩＤ番号６２１７及びＩＤ番号６４１２）を用いて、ｍｉＲＮＡ－３１の共通領域を増幅した。ｄｄＰＣＲはＱＸ２００（商標）ｄｄＰＣＲ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ 番号１８６４０３４（Ｂｉｏｒａｄ）を用い、メーカーの推奨に従い実行し、Ｔｍ値は５８．７℃に設定した。

実施例２：ｍｉＲＮＡの置換のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の樹立及び特性評価
この実施例では、ｍｉＲＮＡの「キャスリング」を実証するためのＣＡＲ－Ｔ細胞の樹立について記載する。

様々な刺激を用いた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の活性化及びＴ細胞の増殖／活性化の評価
凍結ＰＢＭＣを４時間かけて解凍した後、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）／イオノマイシン［ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）］、又はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子）のいずれかを使用して、７２時間かけて活性化した。活性化後、細胞を、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞ＣＤ２５活性化マーカーについて分析した。図４に示すとおり、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いた活性化では、より高い活性化の程度（生存細胞の９３％がＣＤ２５＋）が得られ、一方で、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）では７９％の細胞の活性化が誘導された（図４、パネルＢ）。しかしながら、ＰＭＡ／イオノマイシン処理では実質的な細胞死（生存細胞３０％）を引き起こしたのに対し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）処理後は６３％の細胞が生存していた（図４、パネルＡ）。これらの結果を踏まえ、以後の実験ではＴ細胞活性化法としてＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）処理を選択した。

ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）を介したＴ細胞活性化の動力学を、活性化後２４時間、４８時間、７２時間におけるＣＤ２５活性化マーカーの染色によって評価したところ、２４時間後の６１％の活性化の程度から７２時間後の８７％のピークに増大することが示された（図４、パネルＣ）。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の活性化
ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣｌａｕｄｉｏ Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ博士（フライブルク（Ｆｒｅｉｇｕｒｇ）大学）の研究室で作製された。ＣＤ１９－ＣＡＲは、ＰＧＫプロモーターによって発現が駆動されるレンチウイルス導入によって統合した。細胞集団中のＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は、ＮＧＦＲ染色（ＣＡＲに融合した細胞外スペーサーで、神経成長因子受容体タンパク質に由来する）によって測定し、４５％と測定した（図５、パネルＡ）。その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ１９表面タンパク質を保有するＢ細胞前駆白血病細胞株である標的ＮＡＬＭ－６細胞と１：１の割合［ＣＤ１９－ＣＡＲ１０，０００個とＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＋）１０，０００個］で共培養することにより活性化した。ＮＡＬＭ－６細胞によって誘導されたＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の程度を、非ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化と比較し、ＣＤ２５の染色によって測定した。図５のパネルＢに示すとおり、ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、非ＣＡＲ Ｔ細胞集団（共培養の２４時間、４８時間、７２時間の後でそれぞれ３３％、３３％、２０％の活性化細胞）と比較して、ＮＡＬＭ－６細胞によってより高い程度まで活性化する（共培養の２４時間、４８時間、７２時間の後でそれぞれ７３％、６２％、５１％の活性化細胞）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化のピークは、ＮＡＬＭ－６標的細胞との共培養後２４時間であり、それ以降の時点では活性化レベルの低下が観察された。

共培養したＮＡＬＭ－６細胞に対する活性化ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害機能を、標的ＮＡＬＭ－６細胞の表面マーカーであるＣＤ１９抗原の染色によって測定した。生存ＮＡＬＭ－６細胞の量は、共培養後の２４時間、４８時間、７２時間に、それぞれ初期数の２７％、２１％、３０％であった。ＮＡＬＭ－６細胞をナイーブ非ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養すると、細胞数は中程度に減少する結果となり、２４時間後では５１％、４８時間後では５４％であったが、７２時間後では減少は観察されなかった（図５、パネルＣ）。これらの結果は、ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的特異性、及びＮＡＬＭ－６細胞の増殖を制御する能力を実証する。

Ｔ細胞活性化時の選択されたｍｉＲＮＡ発現レベルの動力学
ＲＮＡを、活性化Ｔ細胞から（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）により）小分子ＲＮＡを単離するように設計されるｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。上記の各ｍｉＲＮＡ鎖の相対量は、鎖特異的ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた逆転写－ｑＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により定量した。

ｍｉＲＮＡ鎖の発現レベルは、ΔΔＣｔ法を用いて計算した：各ｍｉＲＮＡ鎖の測定された発現レベルを、内因性参照遺伝子ＲＮＵ６Ｂの発現レベルに対して正規化した。非活性化細胞（未治療対照）の正規化発現値に対する活性化細胞の正規化発現値間の比（倍率変化（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ））を計算し、ｍｉＲＮＡ発現の倍率変化（２＾－ΔΔＣｔ値）を表した。

３種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２８）すべてにおいて、３ｐ鎖の倍率変化は５ｐ鎖のレベルの倍率変化に比べて小さく、これはおそらく５ｐ鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされた後、急速に分解されるためであろう。活性化Ｔ細胞におけるｍｉｒ－２３ａ－５ｐ及びｍｉｒ－３１－５ｐ鎖のレベルは、すべての測定時点において、非活性化Ｔ細胞におけるレベルと比較して、それぞれ約８倍及び１７倍上昇しており（図６、パネルＡ、Ｂ上段パネル）、一方で、ｍｉｒ－２８－５ｐは、Ｔ細胞活性化の２４時間ではわずかに上昇（４倍）しているが、Ｔ細胞活性化のピークである７２時間ではベースラインレベルまで減少している（図３－Ｃ、上段パネル）。これらの結果は、ｍｉｒ－２３ａとｍｉｒ－３１との両方がＴ細胞活性化によってアップレギュレートする一方で、ｍｉｒ－２８の両鎖のレベルはＴ細胞活性化のピークにてベースラインレベルにあるという見解を強めるものである。このような発現パターンが、これらのｍｉＲを遺伝子編集媒介性キャスリングに適したものにしている。

実施例３：ＣＲＩＳＰＲ媒介性のｍｉＲＮＡノックアウト
この実施例は、ｐｒｅ－ｍｉｒ３１とｐｒｅ－ｍｉｒ２３ａとをノックアウトする遺伝子編集システムの確立を示しており、この両者の発現はＴ細胞抗がん効率の低下と関連することが示された。

ｐｒｅ－ｍｉｒ３１及びｐｒｅ－ｍｉｒ２３ａの編集媒介性ノックアウトのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計及び選択
ｍｉＲＮＡのｍｉｒ－３１及びｍｉｒ－２３ａの編集媒介性ノックアウト（ＫＯ）を最適化するために、４種のｇＲＮＡを設計した（図７）。Ｔ細胞におけるそれぞれのｍｉＲＮＡのＫＯを、４対のｓｇＲＮＡ（下記の表２を参照、配列は実施例１に記載）のそれぞれを用いて以下のとおり試験した：ＰＢＭＣＳをＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）で７２時間かけて活性化し、各ＫＯ実験用に１×１０^６細胞に分注した。この各細胞アリコートを、１対のｓｇＲＮＡ（各０．７５ｐｍｏｌ）及び３ｕｇのＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクション（特定の電圧及び試薬を適用することで、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を細胞内に導入することができるエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法）にかけた。ヌクレオフェクション後５日目に細胞の半分をゲノムＤＮＡ抽出と配列解析のために採取し、残りの半分は７日後のさらなる再活性化のために培養液中に維持した。

編集されたＴ細胞から抽出されたＤＮＡは、それぞれのｇＲＮＡ対が指向する切除部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ増幅にかけられた。図８に示すように、期待される欠失サイズがそれぞれのｇＲＮＡ対で達成された。

編集細胞から抽出したＤＮＡのさらなる解析には、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）ミスマッチ検出アッセイが用いられた。これは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９システムなどの部位特異的ヌクレアーゼの活性を評価するために広く用いられている方法である。このアッセイの原理は、欠失部位に隣接するプライマーを用いた標的領域のＰＣＲ増幅と、その後のＰＣＲ産物の変性と再アニールからなる。この過程で、非欠失断片と欠失断片の混合物を含む二重鎖、及び一方の鎖が欠失し、他方の鎖が欠失しない二重鎖が形成される結果となる。後者の二重鎖には、バルジと呼ばれる対になっていないヌクレオチドの領域が含有される。エンドヌクレアーゼＴ７Ｅ１を加えると、バルジが切断され、その結果、欠失した分子が検出される。

Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）ミスマッチ検出アッセイの結果（図６－Ａ）、４つのｇＲＮＡ対すべて、特に２＋３対で高いｍｉｒ－３１編集効率が示された。ｇＲＮＡ ２＋３でヌクレオフェクションした細胞から得られたＰＣＲ産物を配列解析にかけたところ、予想された５２ヌクレオチドの欠失が確認された（図９、パネルＢ）。

同様の方法で、４つのｇＲＮＡ対をｍｉｒ－２３ａの編集を介したＫＯについて評価した。試験したすべてのｓｇＲＮＡ対は、期待される欠失サイズを生成し、ｍｉＲＮＡ－２３ ＫＯの編集効率が高いことを示した（図１０、パネルＡ及びＢ）。ｇＲＮＡ １＋３及び４＋３でヌクレオフェクションした細胞から得られたＰＣＲ産物について配列解析による検証を行ったところ、それぞれ７１ヌクレオチド及び６５ヌクレオチドという期待される欠失サイズが確認された（図１０、パネルＣ及びＤ）。

実施例４：編集したＫＯ－Ｔ細胞の特性評価
この実施例では、実施例３に示されるとおり、ｍｉＲＮＡ－２３及びｍｉＲＮＡ－３１がノックアウトされたＴ細胞の特性評価が示される。

編集したＴ細胞の再活性化能力の評価
それぞれのｇＲＮＡ対でヌクレオフェクションを行うことによって、ｍｉｒ－３１－ＫＯ後のＴ細胞の再活性化能力を評価した。上記のとおり編集した細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）で活性化し、７２時間後に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５で染色した後、フローサイトメトリーにより活性化の程度を測定した。図１１に示すとおり、編集した細胞は８０％まで再活性化できる。

編集を介したＫＯ後のｍｉＲＮＡ発現の評価
ｍｉｒ－３１－５ｐとｍｉｒ－２３ａ－５ｐ鎖の発現は、ｍｉｒ－３１とｍｉｒ－２３ａの編集を介したＫＯの後、ＣＡＳ９とｇＲＮＡ ２＋３と２＋４とをそれぞれ用いて、上記のようにＴ細胞でＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した。ヌクレオフェクション後５日目に細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）で再活性化し、再活性化後７２時間に細胞からＲＮＡを抽出し、ｍｉｒ鎖のＲＴ－ｑＰＣＲ定量にかけた。図１２に示すとおり、ＫＯ Ｔ細胞ではｍｉｒ－３１－５ｐとｍｉｒ２３ａ－５ｐとの両鎖の発現は検出されないが、非編集Ｔ細胞（未治療＝ＵＴ）とＣＣＲ５を標的とする非関連ｇＲＮＡで編集したＴ細胞の陰性対照では、両方の５ｐ ｍｉｒ鎖の発現は明らかである。

実施例５：キャスリング－ＫＯ部位へのマイクロＲＮＡのノックイン
この実施例では、望ましくないマイクロＲＮＡコード配列が、望ましいマイクロＲＮＡコード配列の遺伝子座で置換されるという、キャスリングコンセプトを証明する。

ｍｉｒ－３１ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８ ＤＮＡセグメントのノックイン（ＫＩ）
ｍｉｒ－３１－ＫＯのＴ細胞において、ｍｉｒ－３１の部位にｍｉｒ－２８をＫＩするためのドナーとして、ｐｒｅ－ｍｉｒ－２８の配列を持つ一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（８６ヌクレオチド長）を用いた。ｍｉｒ－３１ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８配列のＫＩは、ｍｉｒ－３１の上流領域とｍｉｒ－２８挿入の接合部位のＰＣＲ増幅を用いて検証した（図１３、パネルＡ）。ｍｉｒ－２８のＫＩ効率を測定するために、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を行った。ｄｄＰＣＲは、水－オイルエマルジョン液滴技術に基づくデジタルＰＣＲを行うための方法である。試料は２０，０００個の液滴に分画され、個々の液滴で鋳型分子のＰＣＲ増幅が行われる。次に陽性液滴を数え、正確で絶対的な標的の定量を得る。ｄｄＰＣＲは、上記と同じ接合プライマーを用いて行った（ＫＩ陽性イベントを表す）。対照として、ＫＩ及びＫＯの鋳型の両方に共通する領域であるｍｉｒ－３１部位より上流の領域を増幅して、全ＤＮＡ試料の測定基準とした（図１３、パネルＢ）。ｍｉｒ－３１ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８ ＫＩの計算された効率は７％であった。

ｍｉｒ－２３ａ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８ ＤＮＡセグメントのノックイン（ＫＩ）
ｍｉｒ－２３ａ ＫＯ部位へのｍｉｒ－２８の編集媒介性ＫＩを行い、ヌクレオフェクション後５日目にＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔを用いてヌクレオフェクションしたＴ細胞を再活性化した。活性化後６時間に細胞からＲＮＡを抽出し、編集媒介性ｍｉＲの置換を検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲにより両ｍｉｒ鎖の発現レベルを測定した。図１４に示すとおり、両方の細胞集団で両方のｍｉｒ－２３ａ鎖の発現はほとんど検出されず、これはｍｉｒ－２３ａ ＫＯの効率が高いことを示している。活性化されたｍｉｒ－２３ａ ＫＯ細胞ではｍｉｒ－２８鎖の発現は検出されなかったが、活性化されたｍｉｒ２３ａ－ＫＯ／ｍｉｒ－２８－ＫＩ Ｔ細胞では発現が上昇し、これにより編集媒介性ｍｉｒ－２３ａのｍｉｒ－２８による置換が成功したことが確認された（図１４）。

Ｔ細胞における編集媒介性ｍｉＲ置換（キャスリング）の機能性を評価するために、Ｔ細胞疲弊に関連し、かつ編集されたｍｉＲ（ｍｉｒ－２３－ａ及びｍｉｒ－２８）によって調節される遺伝子の発現を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）又は照射ＰＢＭＣ（照射ＰＢＭＣは、Ｔ細胞の活性化及び増殖を刺激するため、抗ＣＤ３抗体と組み合わせて抗原提示細胞として使用するのに理想的である）によって、該編集細胞の（ヌクレオフェクション後５日目の）再活性化の後４８時間に、ＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。図１５に示すとおり、ｍｉｒ－２８によって調節されている免疫チェックポイント遺伝子ＰＤ１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３のレベルは、非編集活性化Ｔ細胞でのレベルと比較して、活性化ｍｉｒ－２３ａ－ＫＯ／ｍｉｒ２８－ＫＩ Ｔ細胞では約５０％低い。一方、ｍｉｒ－２３ａによって調節されているＢＬＩＭＰ－１のレベルは、活性化されたｍｉｒ－２３ａ－ＫＯ／ｍｉｒ２８－ＫＩ Ｔ細胞では、非編集活性化Ｔ細胞でのレベルと比較してアップレギュレートされている（１．５～２．５倍）。転写抑制因子ＢＬＩＭＰ－１は、長寿命のセントラルメモリー（ＣＭ）Ｔ細胞ではなく、短寿命の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）へのＴ細胞の終末分化を促進することが知られている。したがって、ＢＬＩＭＰ－１のアップレギュレーションは、このＫＯ／ＫＩ Ｔ細胞が正常なＴ細胞とは対照的に免疫活性を増加させるであろうことを示している。

まとめると、本明細書で示された結果は、（例示的なタンパク質コード配列として）Ｔ細胞機能に有害な作用と有するｍｉＲを有益な作用と有するｍｉＲＮＡに置換することによって、Ｔ細胞における免疫チェックポイント遺伝子の発現に影響を与えることが可能であることを示している。

開示された本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、示された実施形態は本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって本発明者らは、これらの請求項の範囲及び精神に含まれるすべてのものを発明として主張する。

Claims (18)

1. 細胞療法のために単離された細胞を改変するための方法であって、前記方法は：
   培養液中の複数の単離された細胞を提供する工程；及び
   前記複数の単離された細胞において、発現が細胞療法の効率に有害である第１のＲＮＡコード配列を含む第１の活発に転写される遺伝子座に、発現が細胞療法の効率に有益である第２のＲＮＡコード配列を挿入し、それにより前記第２のＲＮＡコード配列を前記第１の遺伝子座の転写調節性配列に作動可能に連結する工程、
   を含み、
   前記第２のＲＮＡコード配列を前記第１の遺伝子座に挿入することにより、前記第１のＲＮＡコード配列の発現を消失させ、かつ前記第１のＲＮＡコード配列を破壊又は置換するか、又は前記第１のＲＮＡコード配列は、前記第２のＲＮＡコード配列を挿入する前に切除され、
   前記第２のＲＮＡコード配列は、ｍｉＲＮＡコード配列であり、
   前記第２のＲＮＡコード配列の挿入、及び任意に前記第１のＲＮＡコード配列の切除は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から選択される遺伝子編集技術によって行われ、かつ
   前記第１の遺伝子座における転写を開始するのに十分な条件下で、前記第１の遺伝子座での前記第２のＲＮＡコード配列の発現が誘導される、
   前記方法。
2. 前記方法は、前記第２のＲＮＡコード配列を含む第２の遺伝子座に、前記第１のＲＮＡコード配列を挿入し、それにより前記第１のＲＮＡコード配列を前記第２の遺伝子座の転写調節性配列に作動可能に連結することをさらに含み、
   前記第２の遺伝子座における転写を阻害するのに十分な条件下で、前記第２の遺伝子座での前記第１のＲＮＡコード配列の発現が阻害される、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記第１のＲＮＡコード配列は、ｍｉＲＮＡコード配列又はタンパク質コード配列である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記単離された細胞は、多能性造血幹細胞若しくはその継代、又は間葉系幹細胞若しくはその継代である、請求項３に記載の方法。
5. 前記単離された細胞は、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、又はマスト細胞である、請求項４に記載の方法。
6. 前記Ｔリンパ球は、天然Ｔ細胞、誘導化制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項５に記載の方法。
7. 前記単離された細胞は、実質細胞である、請求項３に記載の方法。
8. 前記実質細胞は、肝細胞である、請求項７に記載の方法。
9. 前記第２のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－２８、及び／又はｍｉＲ－１４９－３ｐからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
10. 前記第１のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－２１、及び／又はｍｉＲ－２３ａからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
11. 前記単離された細胞は、制御性Ｔ細胞であり、前記第２のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａであり、かつ前記第１のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１７である、請求項６に記載の方法。
12. 前記第２のＲＮＡは、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－１９１、及び／又はｍｉＲ－２２４である、請求項８に記載の方法。
13. 前記第１のＲＮＡは、ｍｉＲ－２７ａである、請求項８に記載の方法。
14. 前記第２のＲＮＡは、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－１９１、又はｍｉＲ－２２４である、請求項１３に記載の方法。
15. 養子細胞移入のためのリンパ球の治療効率を高めるための方法であって、前記方法は：
    培養液中の複数の単離されたリンパ球を提供する工程；及び
    前記単離されたリンパ球に、タンパク質コード遺伝子又は第１のｍｉＲＮＡコード配列を含む遺伝子座にて、第２のｍｉＲＮＡコード配列を挿入し、それにより、前記タンパク質コード遺伝子又はｍｉＲＮＡコード配列の発現を破壊する工程、
    を含み、
    前記挿入は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から選択される遺伝子編集技術によって行われ、かつ
    前記第２のｍｉＲＮＡコード配列の挿入により、前記タンパク質コード遺伝子の発現を消失させるか、又は前記第１のｍｉＲＮＡコード配列の発現を消失させる、
    前記方法。
16. 前記タンパク質コード遺伝子は、阻害性免疫チェックポイント遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第２のｍｉＲＮＡコード配列は、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－２８、又はｍｉＲ－１４９－３ｐである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記第２のｍｉＲＮＡコード配列を挿入する前に、前記第１のｍｉＲＮＡコード配列を遺伝子編集技術により切除する、請求項１５に記載の方法。