CN115029429B - 炎症相关蛋白联合在预测art治疗敏感性中的应用 - Google Patents

炎症相关蛋白联合在预测art治疗敏感性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了炎症相关蛋白联合在预测ART治疗敏感性中的应用，所述炎症相关蛋白包括CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1，经验证发现，所述炎症相关蛋白联合具有较高的准确性、敏感性和特异性，能够用于HIV‑1感染者ART治疗敏感性的准确预测中，可辅助临床医生判断HIV‑1感染者对ART治疗方案的敏感性，以实现个体化精准治疗，临床应用前景广阔。

Description

炎症相关蛋白联合在预测ART治疗敏感性中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及炎症相关蛋白联合在预测ART治疗敏感性中的应用。
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染导致的一种获得性免疫缺陷综合征（Acquire Immune Deficiency Syndrome，AIDS）。HIV病毒是一种逆转录病毒，由衣壳蛋白包围两个正向单链RNA拷贝组成，进入细胞后可以逆转录为HIV-DNA整合到宿主基因中。根据基因测序的结果，HIV病毒分为HIV-1型和HIV-2型，HIV-1型更常见、致病力更强，是全球范围内主要的致病毒株。在我国HIV-1型病毒还可以分为A、B、B′、C、D、E、F、G以及一些重组亚型，其中最为常见的是AE重组亚型。机体感染HIV病毒后，主要表现为CD4 T细胞数量不断减少、CD8 T细胞功能紊乱，继而导致机体免疫系统功能缺陷、机会性感染、肿瘤，甚至死亡。
抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral Therapy，ART）的出现在临床救治艾滋病上取得了伟大的成就，有效地ART治疗可以快速抑制HIV-1病毒复制，部分恢复HIV-1感染者的免疫功能，使得艾滋病从致死性疾病转为慢性疾病。对于长期接受ART的HIV-1感染者，ART可以明显改善患者的预后，提升患者生存时间及生活质量，使其获得与未感染人群相近的预期寿命，同时显著降低了HIV-1的传播风险。然而，与未感染人群相比，长期接受ART的HIV-1感染者免疫系统功能仍部分受损，T细胞免疫紊乱和异常的炎症反应仍然存在，且发生非艾滋病相关事件（包括肝肾疾病、心血管疾病、代谢综合征、神经认知障碍、骨质疏松和肿瘤等）的风险显著增加。分析非艾滋病相关事件风险发生的原因可知，除了传统的危险因素（年龄、吸烟、酗酒等）增加了非艾滋病相关事件的风险外，ART药物的副作用也会导致非艾滋病相关事件风险增加，例如：核苷类反转录酶抑制剂替诺福韦和蛋白酶抑制剂利托那韦影响患者的肾功能。然而，以上危险因素和抗逆转录治疗药物的副作用并不能完全解释非艾滋病相关事件的发生，更多的证据表明HIV-1感染者的多种炎症标志物高于健康对照，这可能是导致非艾滋病相关事件风险增加的显著影响增加的重要因素。
HIV-1感染者连续接受2年及以上ART后，虽然能够有效抑制HIV-1病毒复制，但仍有约15%~30%的患者CD4 T细胞计数始终小于350个/μL，即为免疫无应答者（Immunologicalnonresponder，INR）。与免疫应答者（Immunological responder，IR）相比，INR患者表现出严重的免疫功能障碍且艾滋病相关疾病和非艾滋病相关事件的发生率显著增加。然而，目前尚无有效的恢复HIV-1感染者免疫功能的治疗方案，因此，阐明INR患者免疫恢复不良的机制对于下一步寻找潜在的治疗方法至关重要。既往研究表明：HIV-1感染者的免疫功能恢复除了与基线CD4 T细胞计数、治疗时间的早晚、骨髓造血功能底下和胸腺输出减少等有关外，残留病毒复制、肠道微生物易位以及合并感染导致的异常的免疫激活和炎症反应发挥着重要作用。总之，异常的免疫激活和炎症反应不仅会造成HIV-1感染者CD4 T细胞免疫恢复不佳，而且和HIV-1感染者非艾滋病相关事件的发生密切相关，是影响患者预后的主要因素之一。有鉴于此，本研究纳入了95例HIV-1感染者、20例健康对照，通过流式细胞术检测外周血T细胞分化亚群占比及其激活耗竭标志物的表达、Olink技术检测血浆中炎症相关蛋白水平，旨在探讨HIV-1感染者外周血T细胞免疫亚群和血浆炎症相关蛋白特征及其临床意义，以期为改善HIV-1感染者预后的治疗方案提供新的线索。
发明内容
本发明的目的在于提供炎症相关蛋白联合在预测ART治疗敏感性中的应用，所述炎症相关蛋白包括CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1，所述6个炎症相关蛋白联合能够较好地区分IR组HIV-1感染者和INR组HIV-1感染者，AUC高达0.9506，敏感性和特异性分别高达0.879、0.947，可用于HIV-1感染者对ART治疗这一治疗方案敏感性的准确预测中。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了检测样本中炎症相关蛋白标志物表达水平的试剂在制备用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的产品中的应用。
进一步，所述炎症相关蛋白标志物包括CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1。
进一步，所述试剂包括检测样本中所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的试剂和/或检测样本中所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自以下组：
(1) 特异性扩增所述炎症相关蛋白标志物的引物；
(2) 特异性识别所述炎症相关蛋白标志物的探针；
(3) 特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂；
优选地，特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂包括特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
进一步，所述样本为受试者来源的血液样本。
进一步，在本发明的具体实施方式中，本发明通过对免疫应答组HIV-1感染者（IR组）和免疫无应答组HIV-1感染者（INR组）的血液样本中的CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1共6个炎症相关蛋白标志物的表达水平进行定量分析，进而对所述HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗的敏感性、预后及治疗疗效进行准确预测。
进一步，所述特异性识别炎症相关蛋白标志物（CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1）的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度均可。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率；
优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针（Taqman探针）；
更优选地，所述探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团；
最优选地，所述淬灭基团包括（但不限于）：BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、3'-BBQ-650、Atto 540Q、Atto 575Q、Atto 612Q；
最优选地，所述荧光基团包括（但不限于）：FAM（羧基荧光素，Carboxyfluorescein，绿色荧光）、FITC（异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate）、TET（四氯-6-羧基荧光素，Tetrachloro fluorescein）、HEX（六氯-6-甲基荧光素，Hexachlorofluorescein）、JOE（2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素）、罗丹明类（Rhodamine染料如R110，TAMRA、Texas Red等）、ROX、AlexaFluor染料、ATTO染料、DyLight染料、cyanine染料（如Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3b，Cy5，Cy5.5，Cy7，Cy7.5）、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料。
在一些实施方式中，本发明提供了检测样本中炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1表达水平的试剂在制备用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的产品中的应用，所述CDCP1（CUB domain containing protein 1，GeneID: 64866）、CXCL11（C-X-C motif chemokine ligand 11，Gene ID: 6373）、CST5（cystatin D，Gene ID: 1473）、TRANCE（TNF superfamily member 11，Gene ID: 8600）、CD5（CD5 molecule，Gene ID: 921）、SLAMF1（signaling lymphocytic activationmolecule family member 1，Gene ID: 6504）包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。所述CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1涵盖全长，未加工的CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1，以及源自细胞中加工的任何形式的CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1，同时涵盖CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。Gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
进一步，所述用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的产品包括试剂盒、芯片、试纸；优选地，所述试剂盒中还包含用于检测样本中所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的辅助检测试剂、所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的辅助检测试剂、所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的辅助检测仪器和/或所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的辅助检测仪器；更优选地，所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的辅助检测试剂包括（但不限于）：使所述特异性的引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，RNA提取试剂，逆转录试剂，cDNA扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品；更优选地，所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的辅助检测试剂包括（但不限于）：封闭液，抗体稀释液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品；优选地，所述芯片包括固相载体和固定在固相载体上用于检测样本中所述炎症相关蛋白标志物表达水平的试剂；更优选地，所述试剂包括针对所述炎症相关蛋白标志物的引物、寡核苷酸探针或芯片，特异性结合炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂；最优选地，所述结合剂包括特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。最优选地，所述结合剂为特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的抗体。
本发明的第二方面提供了一种用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的产品。
进一步，所述产品包括检测样本中炎症相关蛋白标志物表达水平的试剂；
优选地，所述炎症相关蛋白标志物包括CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1；
优选地，所述试剂包括检测样本中所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的试剂和/或检测样本中所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的试剂；
更优选地，所述试剂选自以下组：
(1) 特异性扩增所述炎症相关蛋白标志物的引物；
(2) 特异性识别所述炎症相关蛋白标志物的探针；
(3) 特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂；
最优选地，特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂包括特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体；
最优选地，所述产品还包括通过核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、测序技术、色谱技术、质谱技术检测所述炎症相关蛋白标志物表达水平的试剂；
最优选地，所述样本为受试者来源的血液样本。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。
进一步，在本发明的具体实施方式中，所述抗逆转录病毒治疗（AntiretroviralTherapy，ART）的方案为NRTIs + NNRTIs的治疗方案，即NRTIs类药物和NNRTIs类药物联合治疗的方案。其中，NRTIs类药物能够选择性抑制HIV反转录酶，掺入正在延长的DNA链中，抑制HIV复制；NNRTIs类药物主要作用于HIV反转录酶某位点使其失去活性。
本发明的第三方面提供了一种用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的诊断预测模型。
进一步，所述诊断预测模型包括炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1；
优选地，所述诊断预测模型采用如下回归方程计算预测值：
预测值=CDCP1+0.662×CXCL11+1.200×CST5-0.713×TRANCE-1.893×CD5+1.286×SLAMF1；
更优选地，当诊断模型预测值≤0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗敏感；当诊断模型预测值﹥0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗不敏感。
进一步，所述受试者为HIV-1感染者。
进一步，当预测值较低时，所述受试者对抗逆转录病毒治疗这一治疗方案敏感，对该受试者采用抗逆转录病毒治疗这一治疗方案可使HIV-1感染者获益。
本发明的第四方面提供了一种用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的系统或装置。
进一步，所述系统或装置包括：
(1) 数据获取模块，用于获取待测受试者样本中炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1的表达谱数据；
(2) 诊断预测模块，用于将所述数据获取模块得到的炎症相关蛋白标志物的表达谱数据作为输入数据提供给训练好的诊断预测模型，所述诊断预测模型被训练基于所述表达谱数据而对所述受试者进行预测；
(3) 预测结果获取模块，用于获取所述诊断预测模块中诊断预测模型的输出结果，得到受试者的预测结果；
优选地，所述诊断预测模型为本发明第三方面中所述的诊断预测模型；
更优选地，当诊断模型预测值≤0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗敏感；当诊断模型预测值﹥0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗不敏感。
进一步，所述受试者为HIV-1感染者。
进一步，当预测值较低时，所述受试者对抗逆转录病毒治疗这一治疗方案敏感，对该受试者采用抗逆转录病毒治疗这一治疗方案可使HIV-1感染者获益。
本发明的第五方面提供了一种计算机可读存储介质。
进一步，所述计算机可读存储介质包括存储的计算机程序，所述程序被执行时实现如下方法：
获取待测受试者样本中炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1的表达谱数据；
将获取的所述炎症相关蛋白标志物的表达谱数据作为输入数据提供给诊断预测模型；
输出受试者的预测结果；
优选地，所述诊断预测模型为本发明第三方面中所述的诊断预测模型；
更优选地，当诊断模型预测值≤0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗敏感；当诊断模型预测值﹥0.620时，则判断所述受试者对抗逆转录病毒治疗不敏感。
进一步，所述受试者为HIV-1感染者。
进一步，当预测值较低时，所述受试者对抗逆转录病毒治疗这一治疗方案敏感，对该受试者采用抗逆转录病毒治疗这一治疗方案可使HIV-1感染者获益。
本发明的第六方面提供了检测炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1表达水平的试剂在构建用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的系统或装置中的应用。
本发明的第七方面提供了检测炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1表达水平的试剂在构建计算机可读存储介质中的应用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明首次发现6个炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1联合能够较好地区分对ART治疗敏感的免疫应答组HIV-1感染者（IR组）和对ART治疗不敏感的免疫无应答HIV-1感染者（INR组），AUC高达0.9506，敏感性和特异性分别高达0.879、0.947，可用于HIV-1感染者ART治疗敏感性的准确预测中，能够辅助临床医生判断HIV-1感染者对ART治疗方案的敏感性，进而筛选出对ART治疗敏感的HIV-1感染者，以实现个体化精准治疗，本发明为临床上治疗HIV-1感染提供了新的策略和新的思路，临床应用前景广阔。
附图说明
图1为HIV-1感染者CD4 T细胞计数、CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值差异的结果图，其中，A图：CD4 T细胞计数，B图：CD8 T细胞计数，C图：CD4/CD8比值差异，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，**表示P <0.01，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图2为HIV-1感染者潜在病毒库大小差异结果图，其中，A图：HIV-DNA，B图：HIV-usRNA，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图3为T细胞分化亚群典型流式图；
图4为HIV-1感染者CD4和CD8 T细胞分化亚群占比差异结果图，其中，A图：HC、TN、IR和INR四组研究对象间CD4 T细胞分化亚群占比分析，B图：HC、TN、IR和INR四组研究对象间CD8 T细胞分化亚群占比分析。两组间比较采用MannWhitney U检验，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图5为CD4和CD8 T细胞激活耗竭标志物典型流式图；
图6为HIV-1感染者CD4和CD8 T细胞激活耗竭标志物表达差异结果图，其中，A图：CD4 T细胞上HLA-DR阳性、CD38阳性、HLA-DR和CD38双阳性以及PD-1阳性亚群占比差异，B图：CD8 T细胞上HLA-DR阳性、CD38阳性、HLA-DR和CD38双阳性以及PD-1阳性亚群占比差异。两组间比较采用Mann-Whitney U检验，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图7为TN组患者T细胞分化亚群占比和激活耗竭标志的表达与临床指标的关系图，两个参数间采用Spearman进行相关性分析，红色表示正相关，蓝色表示负相关；红色方框表示重点关注指标；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001；
图8为ART组患者T细胞分化亚群占比和激活耗竭标志的表达与临床指标的关系图，两个参数间采用Spearman进行相关性分析，红色表示正相关，蓝色表示负相关；红色方框表示重点关注指标；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001；
图9为HIV-1感染者炎症相关蛋白的总体特点结果图，其中，A图：基于炎症相关蛋白表达的t-SNE图，B图：炎症相关蛋白差异表达的韦恩图，C图：炎症相关蛋白差异表达的热图，红色表示高表达，蓝色表示低表达；
图10为炎症相关蛋白变化趋势图分类图，其中，A图：ART部分恢复炎症相关蛋白水平，但INR组患者炎症相关蛋白水平较IR组高，B图：ART不能改变炎症相关蛋白水平的变化趋势，且炎症相关蛋白水平始终升高，C图：ART不能改变炎症相关蛋白水平的变化趋势，且炎症相关蛋白水平始终降低；蓝色代表IR组患者，紫色代表INR组患者；实线代表炎症相关蛋白水平的变化，虚线代表CD4 T细胞计数的变化；
图11为与HC组相比，TN组差异表达的炎症相关蛋白间相关性分析结果图，两个参数间采用Spearman进行相关性分析，红色表示正相关，蓝色表示负相关；黑色方框表示炎症相关蛋白间高度相关；自上而下对黑色方框内的炎症相关蛋白簇分别命名为Cluster1、Cluster2、Cluster3、Cluster4、Cluster5、Cluster6、Cluster7；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001；
图12为与HC组相比，TN组患者差异表达的炎症相关蛋白水平与临床指标及T细胞激活耗竭标志物的关系图，两个参数间采用Spearman进行相关性分析，红色表示正相关，蓝色表示负相关；红色方框表示重点关注指标；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001；
图13为与HC组比较，ART组患者cluster 7中差异表达的炎症相关蛋白两组间比较采用Mann-Whitney U检验，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图14为与HC组相比，ART组患者差异表达的炎症相关蛋白水平与临床指标及T细胞激活耗竭标志物的关系，两个参数间采用Spearman进行相关性分析，红色表示正相关，蓝色表示负相关；红色方框表示重点关注指标；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001；
图15为IR组和INR组差异表达的炎症相关蛋白结果图，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001，****表示P <0.0001；
图16为单个炎症相关蛋白的ROC曲线，其中，A图：CDCP1，B图：CXCL11，C图：CST5，D图：TRANCE，E图：CD5，F图：SLAMF1；
图17为炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5联合的ROC曲线结果图；
图18为炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5联合构成的目标模型和对比模型1-对比模型3的ROC曲线结果图，其中，A图：目标模型，B图：对比模型1（7个炎症相关蛋白OPG、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE、CD5和FIT3L联合），C图：对比模型2（6个炎症相关蛋白CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE、CD5和FIT3L联合），D图：对比模型3（5个炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE和CD5联合）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例 HIV-1感染者T细胞免疫亚群和炎症相关蛋白的特征及临床意义研究、预测HIV-1感染者ART治疗敏感性相关标志物的筛选、诊断预测模型的构建与验证
1、实验材料
1.1 研究对象
本研究共入组研究对象115例，包括95例HIV-1感染者和20例健康对照者（HC）。HIV-1感染者的诊断标准按照中国艾滋病诊疗指南（2018版），排除了当前存在机会感染、HBV、HCV、肿瘤、自身免疫性疾病、垂死状态等其他严重疾病患者。HIV-1感染者依据目前是否接受ART分为TN组患者、ART的HIV-1感染者（所述ART方案为NRTIs + NNRTIs，即NRTIs类药物和NNRTIs类药物联合治疗的方案）。ART的HIV-1感染者根据免疫恢复的状态分为：（1）INR：ART时间大于2年，病毒载量始终低于检测下限（50 拷贝/mL），CD4 T细胞计数始终小于350 个/μL；（2）IR：ART时间大于2年，病毒载量始终低于检测下限（50拷贝/mL），CD4 T细胞计数大于350 个/μL。所有的入组对象均签署了知情同意书，且本研究经中国人民解放军总医院第五医学中心伦理委员会批准。入组对象的基本情况见表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：a为例数n（百分比），表中其他数据：中位数（上四分位数-下四分位数）；“—”表示没有相应数据，TN：未经治疗的HIV-1感染者；IR：免疫应答者；INR：免疫无应答者；LDL：低于检测下限。
1.2 主要实验材料
CD3-BV650（Biolegend公司，美国）、CD8-BUV737（BD Bioscience公司，美国）、CD27-BV421（Biolegend公司，美国）、CCR7-BB700（BD Bioscience公司，美国）、CD45RA-BV711（Biolegend公司，美国）、HLA-DR-BV605（Biolegend 公司，美国）、CD38-PE-Cy7（Biolegend公司，美国）、CD69-BUV695（BD Bioscience 公司，美国）、PD-1-BV510（Biolegend公司，美国）、Zombie NIR™ Fixable Viability Kit（Biolegend公司，美国）、CD3/CD4/CD8/CD45 组合抗体（BD Bioscience公司，美国）、HIV-1荧光定量RT-PCR检测试剂盒（杭州博日科技有限公司，中国）、DNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）、QIAamp DNA BloodMini Kit（广州海力特生物科技有限公司，中国）、组织细胞总RNA小量提取试剂盒（MAGEN，中国）、CA HIV-1 RNA 定量检测试剂盒（广州海力特生物科技有限公司，中国）、人淋巴细胞分离液（天津美德太平洋生物科技公司，中国）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，中国）、红细胞裂解液（BD Bioscience公司，美国）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）（北京兰杰科技有限公司，美国）、蛋白酶 K（Sigma公司，美国）、血细胞计数板（Sigma公司，美国）、封口膜（Parafilm公司，美国）、EDTA 抗凝真空采血管（规格：3 mL、6 mL、10 mL，）（BD Bioscience公司，美国）、蝶翼静脉采血针（BD Bioscience 公司，美国）、1.5 mL无DNA酶/RNA酶，无热源EP管（Axygen公司，美国）、2 mL可立外旋冻存管（Corning公司，美国）、离心管（规格：15 mL、50 mL）（Corning公司，美国）、巴氏吸管（Biologix生物科技公司，中国）、流式细胞管（BD Bioscience公司，美国）、移液管（移液管：2 mL、10 mL）（Corning公司，美国）、细胞培养板（规格：6孔、12孔、24孔、96孔）（Corning公司，美国）、无菌移液器枪头（规格：10 μL、200 μL、1 mL）（Axygen公司，美国）。
2、实验方法
2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离（密度梯度离心法）
（1）提前准备好实验所需物品：酒精灯、移液枪、无菌移液器枪头、巴氏吸管、移液管、离心管、EP管、淋巴分离液、PBS等；
（2）在生物安全柜内放入提前准备好的实验所需物品，打开紫外灯消毒30 min；
（3）将装有适量外周血的抗凝管在配平后放入离心机中，按照2000 rmp/min，升9降9，离心10 min；
（4）待离心结束后，缓慢的将抗凝管放入生物安全柜内，吸取上层血浆至EP管中，并将装有血浆的EP管放入-80℃超低温冰箱保存；
（5）用等量PBS稀释抗凝管中剩下部分并混合均匀，将稀释后的液体按照体积1:1缓慢加入装有淋巴分离液的离心管中，该步骤注意防止冲破淋巴分离液层；
（6）将离心管放入离心机中，按照2500 rmp/min，升4降1，离心20 min；
（7）待离心结束后，缓慢的将离心管放入生物安全柜中，此时，离心管中的液体分成四层，用巴氏吸管将第二层白膜层吸入新的离心管中，用PBS稀释至10 mL，盖上盖子后上下导致混匀；
（8）将新的离心管放入离心机中，按照1800 rmp/min，升9降9，离心8 min；
（9）待离心结束后，去除上清液，即可得到分离好的PBMC。
2.2 细胞计数
（1）提前准备好实验所需物品：细胞计数板、溶血素、PBS、封口膜、移液枪、移液器枪头、显微镜；
（2）将分离好的 PBMC，根据预计细胞数用适当体积的PBS重悬，PBS的体积为V；
（3）在封口膜上取一定体积重悬后的PBMC用溶血素稀释，记录稀释的倍数。稀释的目的是防止显微镜下细胞过多，难以计数；
（4）将上一步稀释好的 PBMC，用移液枪取10 μL置于计数板，显微镜下数两个大格中所包含的细胞，记为N；
（5）根据PBS的体积、稀释的倍数、显微镜下的细胞数计算细胞数。
细胞数=𝑁/2×𝑉×稀释的倍数×104；
2.3 细胞冻存
（1）将分离好的PBMC（1000万细胞为例）用500 μL A液（胎牛血清）重悬，然后缓慢加入500 μL B液，边加边晃动，然后用移液枪进一步混匀，防止B液中有机溶剂对细胞的损伤；
（2）将混匀后的1 mL的PBMC悬液移入1.5 mL的冻存管中，并在冻存管上标注编号、姓名、细胞数、日期等；
（3）将标注好的冻存管移入程序降温盒，连同程序降温盒置于-80℃超低温冰箱，24小时后移入液氮罐中，使其在液氮罐内长期保存。
2.4 细胞复苏
（1）将提前准备的细胞培养液从4℃冰箱中置于室温中复温；
（2）打开水浴锅，将温度设置为37℃；
（3）待水浴锅达到37℃，从液氮罐中取出需要复苏的冻存细胞，放入降温盒中快速转移至37℃水浴锅中；
（4）在水浴锅中一边轻微摆动一边观察融化情况；
（5）待细胞融化后，用移液枪将冻存管中的液体快速移入10 mL离心管中，并快速加入细胞培养液至10 mL，混匀；
（6）将混匀后的离心管放入离心机中，1500 rmp/min，升9降9，离心5 min；
（7）待离心结束后，移除上清液，根据实验目的选择合适的液体将细胞重悬并且进行细胞计数。
2.5 流式细胞表面染色
（1）将复苏后的细胞用 PBS 重悬，将细胞浓度调整为每100 μL PBS中有100万细胞；
（2）取100 μL细胞悬液置于流式细胞管中，首先加入死活染料，4℃避光孵育30min；
（3）待30 min后，在每个流式管中加入1 mL FACS液，涡旋机混合均匀后置于离心机中，1500 rmp/min，离心5 min；
（4）待离心结束后，去除上清液，在细胞沉淀中加入100 μL PBS重悬，混合均匀后按照实验要求加入相应的表面抗体，同样4℃避光孵育30 min；
（5）重复步骤（3），离心结束后，去除上清液，并加入300 μL PBS混匀后，尽快上机检测。
2.6 全血流式细胞染色（CD4和CD8 T细胞计数）
（1）取100 μL全血置于流式细胞管中，加入CD3/CD4/CD8/CD45组合抗体20 μL，并且4℃避光孵育30 min；
（2）待30 min后，加入1 mL的红细胞裂解液，使其充分混匀后避光室温反应30min；
（3）再向流式细胞管中加入1 mL的PBS，使其充分混匀，然后放入离心机中，1500rmp/min，离心5 min；
（4）离心结束后，弃上清液加入300 μL的PBS混匀，尽快上机检测。
2.7 血浆病毒载量HIV-1 RNA核酸检测
（1）首先将对照品和样本从-80℃超低温冰箱中取出置于室温中复温解冻；
（2）根据样本的数量配制PCR反应液，每个反应PCR MIX 25 μL，Mn2+ 2.5 μL，HIVProbe Mix 2.5 μL，混合后分装到PCR反应管中；
（3）根据试剂盒说明书提取血浆中的HIV-RNA；将适量提取好的HIV-RNA，对照品及标准品加入分装好的反应管中；
（4）按照设置好的PCR反应程序，进行上机检测，PCR反应程序如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（5）对检测结果进行分析，并且判定结果的有效性。
2.8 细胞相关的HIV -1 DNA、RNA检测
（1）将分离好的PBMC取100万后平均分成两份，一份用于检测HIV-1DNA，另一份用于检测HIV-1 RNA；
（2）在样本中加入DNA/RNA提取试剂盒中的裂解液，56℃孵育裂解，再加入结合液聚集，然后通过过滤柱吸附样本中的DNA/RNA（提取RNA的过程中，接下来还需要用DNA消化酶去除DNA）；
（3）用试剂盒中洗涤液重复洗涤两次后，获得样本中细胞相关的DNA/RNA；
（4）根据定量检测试剂盒说明书，运用试剂盒和实时荧光定量PCR仪检测细胞相关的HIV -1 DNA/RNA。
2.9 Olink靶向炎症相关蛋白的检测
（1）配制好孵育液（A探针抗体试剂40 μL+B探针抗体40 μL+孵育稳定剂40 μL+孵育溶液280 μL），按照反向移液法在PCR 8联管试管中逐个加入47 μL的孵育液；
（2）将8联管中的孵育液按照反向移液法加入96孔板中，并且将其标记为孵育板；
（3）吸取1 μL的样品加入到孵育板中，并用封板膜密封，离心机室温400 g离心1min混匀，放入4℃冰箱孵育过夜；
（4）取出孵育板置于室温下恢复温度，然后室温400 g离心1 min，并且打开实时定量PCR仪备用；
（5）配置好延伸液（PCR聚合酶22 μL+PEA反应酶55 μL+PEA溶液1100 μL+高纯水9385 μL）并混匀，并且在5 min内加入孵育板；
（6）用封板膜将孵育板密封，并且离心涡旋混匀，室温400 g离心1 min；
（7）按照设置好的PEA程序置于PCR仪中延伸，PEA程序如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（8）按照产品说明预先处理96.96 Dynamic ArrayTM Integrated FluidicCircuit（IFC）芯片，解冻引物板，并且配制检测混合液：PCR聚合酶3.1 μL+检测反应酶7.8μL+高纯水230 μL+检测溶液550 μL，并且离心涡旋混匀，在PCR 8联管试管中逐个加入95 μL的检测混合液；
（9）将8联管中的检测混合液加入新的96孔板中，并且将其标记为样品板；
（10）取出PCR仪中的孵育板，涡旋离心混匀后，按照正向移液法吸取2.8 μL混合液置于样品板中；
（11）样品板采用封板膜密封，室温400 g离心1 min混匀；
（12）从引物板中取5 μL引物加入IFC芯片左边空格中，从样品板中取5 μL的样品加入IFC芯片右边空格中；
（13）将IFC芯片放入机器中，根据仪器说明，进行检测。
2.10 试剂配置
（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）的配制
Figure DEST_PATH_IMAGE007
按照上述要求用电子秤取适量溶剂放入量杯中，然后边加入蒸馏水边搅拌，使溶质完全溶解，确保最终的溶液为10 L且PH值在7.2~7.4之间。最后将溶液分装在小玻璃瓶中，高压灭菌，待冷却后即可使用。
（2）细胞冻存液的配制
首先将胎牛血清解冻后放入56℃水浴锅灭活30 min，A液为灭活后的胎牛血清，B液为80%的胎牛血清+20%的DMSO，配制过程中遵循无菌原则，配制完成后用封口膜将离心管密封并放入-4℃冰箱中备用。
（3）细胞培养基的配制
1%的青霉素-链霉素溶液（双抗）+10%的灭活胎牛血清+89%的RPMI-1640培养基。在超净台中，遵循无菌原则，按照上述比例在离心管中配制细胞培养基，并用封口膜密封离心管放入4℃冰箱备用。
3、统计学方法
应用FlowJo-V10 进行流式数据分析，其中UMAP图采用FlowAI插件检查数据质量、Downsample 插件选取相同的细胞数、UMAP 插件进行降维分析。SPSS20.0、GraphPad Prism8.0、R语言4.0.5进行统计分析和作图。以中位数（上四分位数，下四分位数）描述定量资料。多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两组间比较采用 Mann-Whitney U检验，二分类变量采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关检验，单因素分析和多因素分析采用Logistic回归。P<0.05表示差异具有统计学意义。
4、实验结果
4.1 HIV-1感染者T细胞激活耗竭特点及其与临床指标的关系
4.1.1 HIV-1感染者组间临床指标差异
本研究首先比较了四组研究对象间临床参数的差异，包括CD4 T细胞计数、CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值。结果表明：HIV-1感染后，与HC组相比，TN组CD4 T细胞计数（中位数768个/μL vs 392个/μL，P=0.0002）、CD4/CD8比值（中位数1.09 vs 0.40，P<0.0001）显著降低，CD8 T细胞计数有增加的趋势（中位数622个/μL vs 1043个/μL，P=0.0696）；ART后，与HC组相比，IR组CD4 T细胞计数和CD8 T细胞计数水平相似，CD4/CD8比值（中位数0.82 vs1.09，P=0.0093）较低，而INR组CD4 T细胞计数（中位数196个/μL vs 768个/μL，P<0.0001）和CD4/CD8比值（中位数0.34 vs 1.09，P<0.0001）较低；与IR组相比，INR组CD4 T细胞计数（中位数196个/μL vs 656个/μL，P<0.0001）、CD8 T细胞计数（中位数608个/μL vs 922个/μL，P=0.0031）、CD4/CD8比值显著降低（中位数0.34 vs 0.82，P<0.0001）（如图1A-图1C所示）。该研究结果与前期其他团队研究结果相似，表明HIV-1感染使机体CD4 T细胞计数、CD4/CD8比值显著降低，CD8 T细胞增加，有效地ART仅能部分恢复CD4和CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值，INR组患者体内CD4和CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值仍较HC组低。
HIV-1病毒库是目前HIV-1治愈的主要障碍，低病毒库与HIV-1感染者良好预后以及治疗中断病毒反弹时间有关。HIV-DNA和HIV未剪切RNA（unspliced RNA，usRNA）表示潜在的HIV-1病毒库大小。因此，本研究比较了两者经ART后患者中的差异，研究发现：无论是细胞内的HIV-DNA，还是细胞内的HIV-usRNA，IR组都较INR组患者低（中位数2.84 vs 中位数3.28，P <0.001；中位数2.57 vs 中位数3.19，P <0.0001），表明与INR组相比，IR组患者病毒库更小（如图2A-图2B所示）。
4.1.2 HIV-1感染者T细胞分化亚群比较
对PBMC进行流式抗体染色，采用流式细胞术进行检测分析，根据CD45RA、CD27和CCR7对T细胞进行分群，分为幼稚T（Naïve T，TN）细胞：CD45RA+CD27+CCR7+；效应T（EffectorT，TE）/终末分化T（Terminally Differentiated T，TTD）细胞：CD45RA+CD27-CCR7-；中央记忆T（Central Memory T，TCM）细胞：CD45RA-CD27+CCR7+；移行记忆T（Transitional Memory T，TTM）细胞：CD45RA-CD27+CCR7-；效应记忆T（Effector Memory T，TEM）细胞：CD45RA-CD27-CCR7-（如图3所示）。
根据流式结果可得：与HC组相比，TN组患者CD8+TN细胞亚群占比显著降低，CD4+TEM和CD8+TEM细胞亚群占比显著升高；ART后，与HC组相比，IR组患者CD8+TN细胞亚群占比仍低、CD4+TEM和CD8+TEM细胞亚群占比无显著差异，INR组患者CD4+TN和CD8+TN细胞亚群占比均显著降低、CD4+TEM和CD8+TEM细胞亚群占比均显著升高；与IR组患者相比，INR组患者CD4+TN和CD8+TN细胞亚群占比显著降低、CD4+TEM和CD8+TEM细胞亚群占比显著升高。由以上分析可得，HIV-1感染使患者CD4和CD8 T细胞分化亚群占比显著紊乱，ART不能完全恢复CD4和CD8 T细胞分化亚群分布，尤其是INR组患者细胞亚群分布（如图4A-图4B所示）。
4.1.3 HIV-1感染者CD4和CD8 T细胞激活、耗竭标志物差异
HIV-1感染使机体处于免疫激活状态。通过流式细胞术检测研究对象CD4和CD8 T细胞激活标志物（HLA-DR和CD38）、耗竭标志物（PD-1）的表达差异（典型流式图如图5所示），进而分析HC，TN，IR，INR四组患者激活耗竭标志物的表达差异。
分析结果显示：HIV-1感染后，与HC组相比，TN组患者CD4和CD8 T细胞上HLA-DR阳性、CD38阳性、HLA-DR和CD38双阳性、以及PD-1阳性细胞亚群占比显著升高；ART后，与TN组相比，IR组和INR组患者CD4和CD8 T细胞上HLA-DR阳性、CD38阳性、HLA-DR和CD38双阳性、以及PD-1阳性细胞亚群占比降低或者有降低趋势；与HC组相比，IR组患者CD4和CD8 T细胞上HLA-DR阳性、HLA-DR和CD38双阳性的细胞占比升高，INR组患者CD4和CD8 T细胞上HLA-DR阳性、HLA-DR和CD38双阳性、PD-1阳性的细胞占比显著升高；与IR组相比，INR组患者CD4 T细胞上HLA-DR阳性、CD38阳性、HLA-DR和CD38双阳性、PD-1阳性的细胞占比显著升高，CD8 T细胞上PD-1阳性的细胞占比显著升高。由以上分析可得，HIV-1感染使机体CD4和CD8 T细胞分化亚群激活耗竭标志物显著升高；ART后，IR组和INR组患者激活耗竭标志物部分恢复，但INR组患者CD4 T细胞上PD-1的表达较TN组患者仍高（如图6所示）。
4.1.4 HIV-1感染者T细胞分化亚群占比和激活耗竭标志物的表达与临床指标的关系
由上述分析可得，HIV-1感染显著改变了CD4和CD8 T细胞分化亚群占比及其激活耗竭标志物的表达，ART后不能完全恢复至正常水平。但是其与临床指标的关系尚不清楚。因此发明人对CD4和CD8 T细胞分化亚群占比和激活耗竭标志物的表达与临床指标进行了相关性分析：在TN组患者中，主要的临床指标包括CD4 T细胞计数、CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值和HIV-1病毒载量。通过临床相关性分析表明：在TN组患者中，CD4+TN细胞亚群占比与CD4 T细胞计数和CD4/CD8比值显著正相关；HLADR+CD38+CD4 T细胞亚群占比与CD4 T细胞计数显著负相关；PD-1+CD4 T细胞占比与CD4 T细胞计数显著负相关，与HIV-1病毒载量显著正相关（如图7所示）。基于以上的分析结果可得：与疾病进展密切相关的指标主要是CD4+TN细胞亚群占比；CD4+TN细胞亚群占比越高，CD4 T细胞计数和CD4/CD8细胞比值越高。与HIV-1病毒载量密切相关的指标主要是PD-1+CD4 T 细胞占比；PD-1+CD4 T细胞占比越高，病毒载量越高。
在ART组（包括IR组和INR组）患者中，主要的临床指标包括CD4 T细胞计数、CD8 T细胞计数、CD4/CD8比值、细胞相关的HIV-DNA和细胞相关的未剪切HIV-RNA。临床相关性分析的结果表明：在ART后的患者中，TN细胞亚群占比与CD4 T细胞计数和CD4/CD8比值显著正相关；HLA-DR+CD38+CD8 T细胞亚群占比与CD4 T细胞计数显著负相关；PD-1+CD4 T细胞亚群占比与CD4 T细胞计数和CD4/CD8比值显著负相关，与HIV-DNA和HIV-RNA显著正相关（如图8所示 。基于以上分析结果可得：与疾病进展密切相关的指标主要是CD4+TN、CD8+TN、PD-1+CD4T细胞亚群；CD4+TN和CD8+TN细胞亚群占比越高，CD4 T细胞计数、CD4/CD8比值越大，患者的免疫恢复越好；PD-1+CD4 T细胞亚群占比越高，CD4 T细胞计数和CD4/CD8比值越低，HIV-1病毒库越大，患者的免疫恢复越差。
4.2 HIV-1感染者炎症相关蛋白特点及其与临床指标、T细胞激活耗竭标志物的关系
4.2.1 HIV-1感染者炎症相关蛋白的总体特点
HIV-1感染使机体处于异常的免疫激活和炎症反应，本研究详细分析了HIV-1感染者的免疫激活和耗竭特点，接下来本研究通过Olink技术检测92种炎症相关蛋白的表达，分析HIV-1感染导致的炎症反应特点。分析结果显示：基于炎症相关蛋白的表达通过t-SNE降维分析可以很好的区分HC组、TN组、ART组（IR组和INR组）患者，但ART后IR组和INR组患者不能完全区分（如图9A所示）。通过韦恩图展示炎症相关蛋白间的交互关系：与HC组相比，TN组患者差异表达41种炎症相关蛋白，IR组患者差异表达26种炎症相关蛋白，INR组患者差异表达34种炎症相关蛋白；其中，TN组和INR组中共同差异表达的炎症相关蛋白25种，TN组和CR组中共同差异表达的炎症相关蛋白19种（如图9B所示）。最后以热图的形式比较了四组研究对象间差异表达的炎症相关蛋白，并对这些炎症相关蛋白进行了聚类发现：与HC组相比，TN组患者的炎症相关蛋白图谱明显改变；ART后，IR组和INR组患者的炎症相关蛋白图谱部分恢复（如图9C所示）。基于以上分析可得，HIV-1感染导致机体炎症相关蛋白显著改变，ART不能完全恢复炎症相关蛋白的改变。
对于上述炎症相关蛋白的变化进行简单的归纳总结，具有特征性变化的主要是以下三类：第一类是HIV-1感染后，炎症相关蛋白水平升高，ART降低了炎症相关蛋白水平，且INR组患者的炎症相关蛋白水平较IR组高，例如：CDCP1、SLAMF1、IL18、IL18R1、CXCL11、CXCL9、CXCL10、CSF1（如图10A所示）；第二类是HIV-1感染后，炎症相关蛋白水平升高，经ART后炎症相关蛋白水平仍缓慢升高，且INR组患者的炎症相关蛋白水平较IR组患者高，例如CCL25，CCL20（如图10B所示）；第三类是HIV-1感染后，炎症相关蛋白水平缓慢降低，经ART后炎症相关蛋白水平仍缓慢降低，例如：TWEAK、CXCL1、CXCL5、CXCL3、NT3（如图10C所示）。
4.2.2 HIV-1感染者炎症相关蛋白间的关系
与HC组相比，TN组差异表达的41种炎症相关蛋白进行相关性矩阵分析，结果显示：可以将炎症相关蛋白分为7个cluster。自上而下分别命名为cluster 1~cluster 7（如图11所示）。同时结合图9C分析可得，HIV-1感染使得cluster 1、cluster 4、cluster 5中的炎症相关蛋白水平降低，cluster 6、cluster 7（除CST5外）中的炎症相关蛋白水平升高。
4.2.3 HIV-1感染者炎症相关蛋白水平与临床指标及T细胞激活耗竭标志物的关系
对TN组患者炎症相关蛋白水平进行临床相关性分析，结果显示：cluster 7中的炎症相关蛋白与疾病进展密切相关。且CD4 T细胞计数 cluster 7中的炎症相关蛋白CXCL11、CCL19、IL12B、CCL23、CXCL10、CSF1水平负相关；CD4/CD8比值与cluster 7中的炎症相关蛋白CXCL11、CCL23、CSF1水平负相关；病毒载量与cluster 7中的CXCL11、CXCL9、CCL19、IL12B、IL10、CSF1水平正相关；CD4+TN和CD8+TN细胞比例与cluster 7中的CXCL11、CXCL9、IL18、CCL19、IL12B、IL10、TNF、CCL23、CXCL10、TNFRSF9、CSF1水平负相关；HLA-DR+CD38+CD4T细胞比例与cluster 7中的CXCL11、CXCL9、IL18R1、CXCL10水平正相关；HLA-DR+CD38+CD8 T细胞比例与cluster 7中的CXCL11、CXCL9、IL15RA、IL12B、CCL23、CXCL10水平正相关；PD-1+CD4 T细胞比例与cluster 7中的CXCL11、CXCL9、IL18、CCL19、IL15RA、IL18R1、IL12B、IL10、TNF、CCL23、CXCL10、TNFRSF9、CSF1水平正相关；PD-1+CD8 T细胞比例与cluster 7中的TNFRSF9水平正相关。（如图12所示）。综上所述，在TN组患者中影响疾病进展的炎症相关蛋白主要聚集在Cluster7中，主要包括CXCL11、CXCL9、IL18、CCL19、IL12B、CCL23、CXCL10、CSF1等。
分析ART对于HIV-1感染者cluster 7中炎症相关蛋白的作用。与HC组比较，ART组（IR组和/或INR组）患者cluster7中炎症相关蛋白CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1、CST5、CDCP1和IL18水平仍异常（如图13所示）。
同时对与HC组相比，ART组（IR组和/或INR组）差异表达的炎症相关蛋白进行临床相关性分析，结果显示：主要是cluster 7中的经ART仍异常的炎症相关蛋白与疾病进展密切相关。其中CD4 T细胞计数与cluster 7中炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CXCL9、CST5、IL18、SLAMF1水平负相关，CD4/CD8比值与cluster7中炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、IL18、SLAMF1水平负相关，CD4+TN和CD8+TN细胞比例与cluster7中炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、IL18、SLAMF1水平负相关，HLA-DR+CD38+CD8 T细胞比例与cluster7中炎症相关蛋白CDCP1、CXCL9水平正相关，PD-1+CD4 T细胞比例与cluster7中炎症相关蛋白CDCP1、IL18水平正相关。此外，HIV-1病毒库大小主要与IL7、AXIN1、TNFSF14、TRANCE、SIRT2、CD40、CASP8、ST1A1、STAMBP水平负相关（如图14所示）。综上所述，在ART组患者中与疾病进展最为密切的炎症相关蛋白主要是CXCL11、CXCL9、IL18。其中炎症相关蛋白CXCL11、CXCL9在ART前后均与疾病进展具有较好的相关性。
4.3 HIV-1免疫无应答者炎症相关蛋白标志物
4.3.1 IR组和INR组间差异表达的炎症相关蛋白
ART后的HIV-1感染者根据免疫恢复的状态分为IR组和INR组，IR组患者免疫恢复相对好，INR组患者免疫恢复相对差。本研究通过检测HIV-1感染者炎症相关蛋白，快速区分IR组患者和INR组患者，判断患者的免疫恢复状态。因此，发明人筛选出IR组与INR组间差异表达的炎症相关蛋白，分别是CDCP1、CXCL11、SLAMF1、FIT3L、TRANCE、CD5、CST5、OPG、uPA（如图15所示）。与HC组相比，TN组患者CDCP1、CXCL11、SLAMF1、FIT3L显著升高或者有升高的趋势；经ART后，与TN组相比，IR组患者这些炎症相关蛋白水平显著降低，INR组患者这些炎症相关蛋白水平无显著改变、甚至升高，且INR组患者这些炎症相关蛋白水平较IR组高（如图15A所示）。TRANCE、CD5水平在TN组患者中较HC组研究对象高，ART后，IR组和INR组患者中这两种炎症相关蛋白水平较TN组患者显著降低，且INR组患者中这两种炎症相关蛋白水平较IR组患者低；此外，CST5、OPG、uPA水平在INR组患者中显著高于IR组患者（如图15B所示）。总之，ART后HIV-1感染者的炎症相关蛋白水平的恢复情况显著不同，INR组和IR组患者中有9种炎症相关蛋白表达具有统计学差异。
4.3.2 多种炎症相关蛋白联合区分IR组和INR组患者
对IR组和INR组患者差异表达的9种炎症相关蛋白进行单因素回归分析，结果显示：除uPA之外，炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、SLAMF1、FIT3L、TRANCE、CD5、CST5、OPG均可区分IR组和INR组患者。ROC曲线分析表明CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1曲线下面积（Area under curve，AUC）分别是0.757、0.693、0.711、0.713、0.722、0.679（如图16A-图16F所示）。对上述单因素回归分析的炎症相关蛋白进行多因素回归分析和留一法交叉验证，表明6个炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1联合构成的目标模型能够较好地区分IR组和INR组患者，AUC高达0.9506（如图17所示），敏感性和特异性分别高达0.879、0.947（见表2）。总之，本研究发现一组炎症相关蛋白的组合可以较好的区分IR组和INR组患者，可用于HIV-1感染者ART治疗敏感性的准确预测中，并进一步用于临床上辅助医生判断HIV-1感染者对ART治疗的敏感性或反应性，以指导临床医生选择有效的治疗方案，实现精准的个体化治疗，临床应用前景广阔。
所述预测HIV-1感染者ART治疗敏感性的诊断预测模型如下：
预测值=CDCP1+0.662×CXCL11+1.200×CST5-0.713×TRANCE-1.893×CD5+1.286×SLAMF1；
其中，CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1表示所述待测受试者血液样本中CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1的表达水平。
表2 目标模型（CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1联合）对预测HIV-1感染者ART治疗敏感性的诊断效能结果统计
Figure DEST_PATH_IMAGE008
为了进一步验证所述由6个炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5和SLAMF1联合构成的目标模型对预测HIV-1感染者ART治疗敏感性的诊断效能，本研究同时构建了由7个炎症相关蛋白OPG、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE、CD5和FIT3L构成的对比模型1，由6个炎症相关蛋白CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE、CD5和FIT3L构成的对比模型2，由5个炎症相关蛋白CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE和CD5构成的对比模型3，结果表明本发明构建的由6个炎症相关蛋白联合构成的目标模型的AUC显著高于对比模型1、对比模型2、对比模型3（如图18A-图18D所示），也即进一步证明了本发明构建的由6个炎症相关蛋白联合构成的目标模型能够较好的区分IR组和INR组患者，可用于HIV-1感染者ART治疗敏感性的准确预测中。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测样本中炎症相关蛋白标志物表达水平的试剂在制备用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的产品中的应用，其特征在于，所述炎症相关蛋白标志物包括CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测样本中所述炎症相关蛋白标志物mRNA表达水平的试剂和/或检测样本中所述炎症相关蛋白标志物蛋白表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自以下组：
(1) 特异性扩增所述炎症相关蛋白标志物的引物；
(2) 特异性识别所述炎症相关蛋白标志物的探针；
(3) 特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的结合剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结合剂包括特异性结合所述炎症相关蛋白标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述样本为受试者来源的血液样本。
6.检测炎症相关蛋白标志物CDCP1、CXCL11、CST5、TRANCE、CD5、SLAMF1表达水平的试剂在构建用于预测HIV-1感染者对抗逆转录病毒治疗敏感性的系统或装置中的应用。
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