CN1403588A - Hiv－1蛋白酶elisa检测方法及用于多靶位筛选hiv－1抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人类免疫缺陷病毒复制酶ELISA检测方法及其在HIV－1抑制剂筛选中的应用，该方法首次采用我国分离的HIV－1C/B型重组病毒pol基因，以pMAL－c2载体构建我国HIV－1蛋白酶重组质粒pMAL－c2－PR，表达可溶性HIV蛋白酶，进行一步纯化，并以所获得的HIV－1蛋白酶建立ELISA活性检测方法，该方法简便易行，以此可筛选出作用不同的单一或多靶位HIV－1抑制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及人类免疫缺陷病毒复制酶ELISA检测方法及其在HIV-1抑制剂筛选中的应用。
技术背景：
艾滋病自1981年发现以来在全世界传播，死亡率高，成为现代瘟疫。我国自1985年发现第1例病人，至今已有85万感染者。每年以30％速度增长，严重危害人类健康。寻找防治药物以扼制流行是刻不容缓的任务。免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的病原，其基因结构，复制周期和感染机制等已被阐明。HIV-pol基因表达的3种复制酶：HIV逆转录酶(HIV RT)，蛋白酶(HIV PR)和整合酶(HIV IN)是病毒复制繁殖的关键酶。
以HIV-1逆转录酶和蛋白酶复制酶为靶位已成功地发展了10种逆转录酶抑制剂和6种蛋白酶抑制剂作为治疗艾滋病的药物。HIV整合酶的抑制剂也在临床试验中，目前尚未批准成药物。由于这些药物作用靶位和结构类型单一，虽能抑制病毒复制，但病毒极易产生耐药性和交叉耐药性。联合应用现有的两种酶抑制剂或用其复方进行高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，可提高疗效，控制病情发展，延长生命，但不能清除病毒，病人仍不能免于死亡，且价格昂贵，毒副作用大，难于普及推广。
联合应用HIV的3种复制酶的筛选方法，进行高通量筛选，将为寻找多靶位作用于HIV复制酶的新型抗艾滋病病毒药物开辟道路。发明要点：
本发明联合应用HIV的3种复制酶(即HIV-1逆转录酶，HIV-1整合酶，HIV-1蛋白酶)的筛选方法，进行高通量筛选HIV-1抑制剂。除现有的HIV逆转录酶3H掺入法和新引进建立的整合酶ELISA检测法可以适用外，现用的HIV蛋白酶抑制制剂高压液相(HPLC)检测方法：技术复杂，周期长。最近国外所用的荧光检测法需要荧光检测仪特殊设备，一般实验室不具备。为此本发明建立我国HIV-1病毒株的蛋白酶ELISA检测法，以用于高通量筛选HIV-1抑制剂。
本发明的重点在于首次采用我国分离的HIV-1C/B型重组病毒的pol基因，以pMAL-c2载体构建我国HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR，表达可溶性HIV-蛋白酶，一步纯化，建立ELISA快速检测方法。
本发明的另一种点在于首次联合应用我国HIV蛋白酶ELISA检测方法与现有的HIV-1逆转录酶3H掺入法和HIV-1整合酶ELISA法进行3种HIV-1复制酶多靶位筛选，可筛出作用不同的单一或多靶位的HIV-1抑制剂，为发展多靶位作用的抗HIV新药奠定了基础。
本发明的又一重点在于联合HIV-1三种复制酶检测方法筛选HIV-1复制抑制剂：发现对HIV-1三种复制酶有广谱抑制作用的化合物9833、黄芩甙元钠、丹参提取物CEH、CEHL和中药提取物ELB1，有进一步开发价值。
本发明的再一重点在于应用HIV-1三种复制酶检测方法，可以研究有效化合物的构效关系，示踪中约分离提取的单一成分，探索药物作用机制以及测定动物体内约物血清动态。技术方案：
本发明的技术方案可通过以下实施例加以说明，但不以此限制本发明。实施例1：我国C/B重组HIV-1病毒蛋白酶表达质粒HIV-1pMAL-c2-PR的构建
质粒pC54-pol-T(HIV-1 CN54C/B重组毒株pol全长基因插入Teasy载体)：由我国卫生部艾滋病预防与控制中心邵一鸣教授惠增。载体pMALTM-c2：购自Biolabs公司。HIV-1 CN54毒株是从我国新疆HIV感染者体内分离的HIV-1C/B型重组株，它在Genbank中的序列号及名称为AF286226，HIV-1，97CN001。引物设计：因考虑利用pMAL-c2表达载体的多克隆酶切位点EcoR I和BamH I位点，结合HIV-1 CN54蛋白酶基因序列设计引物为上游引物(Primer 3)：5′-ACT GAA TTC CCT CAA ATC ACT CTT-3′下游引物(Primer 2)：5′-GCC GGA TCC TTA AAA ATT TAA AGT GCA ACC AAG-3′重组HIV-1蛋白酶表达载体pMAL-c2-PR的克隆(图1)
1)PCR扩增HIV-PR片段并纯化：以含有HIV-1 pol基因的质粒pC54-pol-T为模板，用Primer2和Primer3为引物进行PCR反应，同时做空白对照，DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，与DNA分子对照表明，可扩增出目的片段(约300bp)(图2)。
2)EcoR I和BamH I双酶切质粒pMAL-c2及PCR产物，并纯化。
3)连接。
4)转化大肠杆菌DH5α。
5)筛选及鉴定阳性克隆
a)监白斑筛选，挑取白斑进行下一步验证。
b)限制性内切酶双酶切鉴定：用EcoR I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察可以看见pMAL-c2-PR可切出两条带分别与pMAL-c2空载体(6.6kb)及蛋白酶基因(297bp)大小完全一致，说明此pMAL-c2-PR载体有外源蛋白酶基因的插入(图3)。
c)PCR鉴定：分别以pC54-pol-T，pMAL-c2-PR为模板及Primer2和Primer3为物进行PCR反应，(同时设空白对照)，DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示两种模板均可扩增出目的条带，说明pMAL-c2-PR载体有外源蛋白酶基因的插入(图2)。
d)阳性克隆的测序分析：利用pMAL-c2的通用引物M13/PUC Sequencing Primer(-47)，在上海生工用ABI PRISM 377-96测序仪进行测序，利用DNASTAR分析软件进行分析，序列与在基因Bank中查到的HIV-1 CN54的蛋白酶基因完全一致(图4)，说明pMAL-c2-PR载体外源蛋白酶基因的插入正确。实施例2：HIV-1蛋白酶的表达
1)、将pMAL-c2-PR转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落于LB+氨苄青霉素(Amp)的培养基中培养过夜，次日1/100扩增于1000ml LB+Amp培养基中，37℃培养至A600为0.5-0.6时，加入终浓度为0.3mmol/L IPTG；
2)、37℃继续培养6小时，5000×g离心20分钟收集菌体，称量菌体湿重，以g/ml的比例为1/10重悬于预冷的裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)中；
3)、-20℃冷冻过夜，取出冻存的菌体于冰水浴中融化，超声波破碎仪裂解细胞；
4)、9000×g离心30分钟，收集上清，用裂解缓冲液1∶5稀释。以1ml/min的流速上样到Amylose树脂柱；
5)、用含有10mmol/L麦芽糖的缓冲液洗脱，部分收集仪收集洗脱液，收集合并目的蛋白峰，对透析缓冲液(20mml/LMES pH6.0，40％甘油，1mmol/LDTT)透析过夜，浓缩蛋白。-70℃冻存；
6)、SDS-PAGE电泳验证蛋白酶的表达(图5)，从图中可见转化了pMAL-c2-PR的菌体诱导后在分子量约53 000位置可见一明显蛋白条带，而且主要在可溶性胞质部分，未诱导菌未见此蛋白的表达。对图中第三条带(表达的总蛋白)用gelpro凝胶分析软件进行分析(图6)，第2峰为目的蛋白峰，占菌体含量的15.1％。与标准蛋白质分子量对照测得该条带的分子量大致为53 273，与计算所得的N端融合有MBP的HIV-1蛋白酶分子量符合。
7)、纯化后的蛋白用Bradford法(考马斯亮蓝G-250染色法)定量蛋白质，纯化的HIV-1融合蛋白酶的浓度为0.15mmol/L，每升培养液最终可纯化出34mgHIV-1融合蛋白酶。实施例3：HIV-1蛋白酶ELISA检测方法底物Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin(分子量1558.13)为美联(西安)
生物科技有限公司合成。
ELISA活性检测方法：
1)在96孔板中，每孔加入1μl 10×反应缓冲液(0.5mol/L磷酸钠缓冲液，2mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT)，1μl 860μmol/L的底物，1μl双蒸馏水(DDW)或二甲基亚砜(DMSO)(根据所测药物的溶剂情况选择)或待测样品，7μl HIV-1蛋白酶，同时设不加酶的空白对照，混匀，37℃反应60分钟；
2)每孔加入2倍体积的DMSO混匀，终止反应，每孔取出4μl到一块新板中，向每孔加入6μl碘乙酸钠，混匀，37℃反应45分钟；
3)每孔加入5μl 2mg/ml的地高新-3-氧-甲羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酸酯(Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxy-succinimide ester，Dig-NHS)，混匀，37℃反应50分钟，标记切割的蛋白氨基端；
4)每孔加入15μl 0.5mol/L的甘氨酸(pH8.5)混匀，37℃反应60分钟中断标记反应；
5)从上述反应混合液中取10μl加入链亲和素标记的96孔板中，同时加入90μl Buffer W(50mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.5，0.01％ NP 40)，混匀，室温放置60分钟，将底物结合到酶标板上；
6)300μl Buffer W洗板一次，300μl TBS(25mmol/L Tris缓冲液，pH7.4)洗板一次，每孔加入100μl 1×阻断剂，室温放置50分钟；
7)300μl TBS洗板3次，每孔加入100μl抗地高辛抗体Fab片段，室温1hr；
8)300μl TBS洗板3次，每孔加入200μl显色底物(6.7mmol/L pNPP，0.1mol/L NaHCO3pH9.5，2mmol/L MgCl2)；
9)显色30分钟后加入50μl 1N NaOH终止反应，酶标仪405nm测A值。重组HIV-1蛋白酶活性的验证
为了确定表达的重组HIV-1蛋白酶是否具有同天然蛋白酶一致的活性，用经典的HPLC方法检测了重组酶的活性和动力学。底物为合成的11肽，包含了HIV-1 P17-P24的切割所必须的位点，序列为Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin，其中Tyr-Pro键为HIV-1蛋白酶特异性水解的肽键。11肽底物的保留时间约为13分钟，被HIV-1蛋白酶切割成的2个小肽(6肽及5肽)可在HPLC上看见两个新增的峰，保留时间分别约为8.9和10.5分钟。随着作用时间的延长或是酶量的增加，两个产物峰的峰面积逐步增加，而底物峰的峰面积逐步减少，90分钟内产物的量与时间呈直线关系(图7)。不同底物浓度时检测酶活性做双倒数图(图8)，Km值为0.114±0.034mmol/L，与文献报道的Km值(0.05-7mmol/L)有一致性[Biochem Biophy Res Com 1989，159(2)，420-425；Biochemistry.1994，33：9351-9357]，说明表达的重组HIV-1蛋白酶具有特异性切割底物的功能和正确的动力学特点，可用于酶活性以及抑制剂的研究。ELISA方法酶反应时间曲线的测定
在不同的重组HIV-1蛋白酶浓度0，6，3，1.5μmol/L，不同反应时间30，60，90，120分钟时检测底物的A405值，以反应时间为横坐标，产物的A405为纵坐标做反应时间曲线(图9)，在60分钟内均呈现直线反应，因此选择最佳反应时间为60分钟。ELISA方法的酶量反应速度曲线
选择反应时间为60分钟，以1g酶浓度为横坐标，产物A405为纵坐标，作图(图10)，酶浓度在3μmol/L以下与速度呈线性关系。ELISA方法检测HIV-1蛋白酶活性的稳定性重现性评价在最佳反应条件时(50mmol/L PBS pH 6.4，0.2M NaCl，1mmol/L EDTA，1mM DTT，3μmol/L蛋白酶，37℃反应60分钟)进行重复实验，同批实验重复10次，平均P/N值为3.38±0.157，批内变异系数为4.64％；不同的10批重复实验，平均P/N值为3.61±0.1998，批间变异系数为5.54％(表1)。说明此方法结果稳定，重现性好，可用于抑制剂的研究。
表1：ELISA方法重现性稳定性评价
P/N 平均 标准差 变异
P/N 系数
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
比值 (s) (CV％
0
(x) )批内 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.38 0.157 4.64In a lot 12 29 60 41 45 48 56 25 22 46批间 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.61 0.1998 5.54Among 91 89 34 29 61 57 58 59 8 47the lotsELISA方法用于抑制剂研究的特异性
选用2个已知的的蛋白酶抑制剂Saquinavir和Indinavir为阳性对照，以及HIV逆转录酶抑制剂PFA，膜融合抑制剂T-20作为阴性对照，用ELISA方法检测其活性，结果Saquinavir和Indinavir对HIV-1蛋白酶的IC50分别为1.869±0.24nmol/L和3.695±0.5nmol/L，与文献报道一致[Drugs，1996，51(5)：701-712.]。而PFA和T-20均不能抑制蛋白酶，验证了ELISA方法检测HIV-1蛋白酶活性的特异性。ELISA与HPLC方法对比，证明ELISA方法用于酶活性及抑制剂研究的可靠性ELISA方法与HPLC法测定HIV-1蛋白酶Km值的比较
在确定的最佳ELISA酶反应条件下，3μmol/L蛋白酶，37℃反应60分钟，测定不同底物浓度下产物生成速度，作双倒数图，直线回归(图11)。Km值为0.0819±0.04mmol/L，与HPLC方法的Km值(0.114±0.034mmol/L)有可比性。说明ELISA方法同HJPLC方法一样完全能正确反应酶的动力学。
比较ELISA方法和HPLC方法检测已知HIV-1蛋白酶抑制剂Saquinavir和Indinavir的符合性：
分别用ELISA和HPLC方法检测Saquinavir和Indinavir对HIV-1蛋白酶的抑制作用，ELISA方法测得的IC50与HPLC方法测得的IC50的比较基本平行(表2)。
表2：saquinavir和indinavir对HIV-1 PR活性的ELISA和HPLC方法比较
实施例4：三种HIV-1复制酶活性检测方法联合应用HIV-1蛋白酶PR的制备和药物抑制试验(见本发明第一部分)HIV-1逆转录酶RT约物抑制实验：引进HIV-1 RTp66/51质粒(美国哈佛大学R.T.D’Aguila惠赠)，本所在大肠杆菌中表达，纯化。用3H掺入法测定酶活性(A.A.C.，1988，5，684；中国医学科学院学报，1990，12(6)，391-395。)HIV-1整合酶IN的制备和约物抑制试验
| IC50 | HPLC | ELISA |
| Saquinavir | 3.215±2.21nmol/L | 1.869±0.24nmol/L |
| Indinavir | 2.89±1.82nmol/L | 3.695±0.5nmol/L |
引进HIV-1整合酶质粒(美国NIH NIDDK的Robert Craigie博士赠送)。在大肠杆菌中表达，整合酶融合蛋白。经镍熬合柱亲和层析纯化后，建立ELISA检测方法(1994，Nucleicacids Research，22(6)，1121-1122；2002，中华实验和临床病毒学杂志，16(2)，119。)。实施例5：广谱抑制三种HIV-1复制酶的物质9833：中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所王琳教授合成(图12)，黄芩甙元钠盐：中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所刘大宽付教授合成。丹参提取物：CEH由美国Johns Hopkins大学黄周汝吉教授提供，CEHL本所新抗一室李宝
义脱色。猫眼草提取物：ELB1本所李建农提取。萘醌类化合物9833，黄芩甙元衍生物BCLE-Na及中约粗提物(CEH，CEHL，ELB1)对3种或2种复制酶有抑制活性，结果见表3。
表3.对HIV-1 RT，IN和PR有抑制活性的化合物，中药成分及其衍生物有效物质 半数抑制浓度(IC50)
HIV-1 RT HIV-I IN HIV-1 PR9833 (mmol/L) 0.081±0.0088 0.0372±0.00928 0.0096±0.0019BCLE-Na(μg/ml) 31.39±8.49 4.18±0.59 16.72±3.36CEH (μg/ml) 6.34±6.30 10.38±0.71 19.00±4.21CEHL (μg/ml) 2.23±0.78 7.45±0.15 4.29±2.21ELB1 (μg/ml) 14.14±7.87 20.22±1.72实施例6：化合物构效关系的研究萘醌类化合物NQ-1对HIV-1整合酶活性低，结构改变后，NQ-2新衍生物9833(图12)对HIV-逆转录酶(HIV-1-RT)，蛋白酶(HIV-1-PR)和整合酶(HIV-IN)三种酶的抑制作用均bi比其母体强，结果见表4-1。
表4-1 萘醌类化合物对HIV-1 RT，-1N和-PR的抑制活性化合物 半数抑制浓度(IC50mmol/L)
HIV-1 RT HIV-1IN HIV-1PRNQ-1 0.169±0.0087 ＞1.899 0.055±0.0064NQ-2 0.474±0.0028 0.0785±0.00045 0.048±0.00469833 0.081±0.0088 0.0372±0.00928 0.0096±0.0019黄酮类化合物的抑制作用
黄芩甙元(BCLE)及其衍生物黄芩甙元钠盐(BCLE-Na)，对HIV-1-IN的抑制作用较强，BCLE对HIV-1蛋白酶效果较差，但BCLE-Na对HIV-PR也有一定的抑制作用(表4-2)。
表4-2黄芩甙元及其衍生物对HIV-1 RT，-IN和-PR的活性
实施例7：示踪中药或生物药物成分分离中约的提取分离
| 化合物 | IC50(μg/ml) | ||
| HIV-1 RT | HIV-1 IN | HIV-1 PR | |
| BCLE-Na | 31.39±8.49 | 4.18±0.59 | 16.72±3.36 |
| 黄芩甙元 | 24.55±8.10 | 11.77±4.22 | 110.98±15.58 |
用HIV-1复制酶方法对中约提取分离物进行示踪测活，发现单参粗提物CEH和CEHL对三种复制酶均具有较强的抑制作用，丹参其它不同分离提取物对HIV-1三种复制酶有不同抑制活性(表5)。
表5中药丹参不同提取分离物对HIV-1 RT，-IN和-PR的活性结果丹参提取物 IC50(μg/ml)
HIV-1 RT HIV-1 IN HIV-1 PRCEH 6.34±6.30 10.38±0.71 19.0±4.20CEHL 2.23±0.78 7.45±0.15 4.29±2.21AK1240 11.68±10.22 6.23±0.86 11.31±1.22QIN8 65.25±1.22 8.96±6.87 113.8±16.4QIN9 20.61±0.39 5.87±2.90 116.08±21.09QIN10 6.11±0.11 4.48±0 87.15±14.88QIN11 35.01±0.07 3.585±0.33 39.78±8.9QIN12 73.19±0.17 9.76±0.13 139.31±26.35实施例8：HIV-1复制酶抑制剂作用机制的研究HIV-1整合酶ELISA分步方法检测药物作用性质方法文献(1994，Nucleic acids Research，22(6)，1121-1122)NQ-1和9833及CEHL的作用性质：
化合物NQ-2和9833主要抑制HIV-1整合酶的链转移活性，但9833的分步活性结果对装配和链转移均有较强的抑制作用，比NQ-2强10-45倍。CEHL主要抑制HIV-1整合酶的链转移活性，IC50为1.14μg/ml(表6)。
表6：萘醌类抑制剂，CEHL对HIV-1 IN的分步活性化合物 IC50
总活性 过程 装配 链转移NQ-2 78.5±0.45μM 96.97±15.21μM 168±98μM 49.8±3.6μM9833 37.2±9.28μM 8.48±0.71μM 6.9±0.054μM 1.1±0.073μMCEHL 8.17±2.26μg/ml 10.79±1.71μg/ml 15.82±4.97μg/ml 1.14±0.2μg/ml实施例9：用HIV-RT抑制法检测药物在小鼠体内血清活性动态
中约丹参提取物CEH，口服剂量20g/kg；腹腔注射剂量0.7g/kg；AZT口服剂量10mg/kg。实验方法：小鼠口服或腹腔注射CEH，或口服AZT后，分别于0分钟，30分钟、1小时、2小时、4小时取血，分离血清，56度30分钟灭活后，进行HIV-逆转录酶抑制实验。结果：正常小鼠血清对HIV-1逆转录酶有非特异抑制作用，稀释75倍后抑制作用下降。小鼠给约后不同时间取的血清，为清除小鼠血清非特异抑制作用，稀释75倍后测定HIV-RT的抑制作用。结果小鼠腹腔注射CEH0.7g/kg一次后，30分钟至2小时都可检出明显的抑制作用(p＜0.01)，血约浓度2小时达高峰，4小时下降(表7，图13)。小鼠口服CEH20g/kg，30分钟及1小时后血清有活性(p＜0.05)，2小时后下降至正常血清水平(图13)，说明CEH腹腔注射吸收优于口服约100倍左右。
阳性对照药AZT在体外实验对HIV-1 RT无抑制作用，在小鼠体内磷酸化为3磷酸活性化合物。小鼠口服10mg/kg一次，30分钟至4小时血清中都可检出对HIV-1 RT的抑制作用，30分钟最高，逐步下降(表7，图13)。
表7：CEH和AZT小鼠体内血清活性动态
发明效果：
| 药物 | 血清HIV-1 RT-抑制％ | |||
| 30min | 1hr | 2hr | 4hr | |
| CEH，ip，0.7g/kg×1 | 57.86 | 54.94 | 60.25 | 21.77 |
| CEH，po，20g/kg×1 | 19.89 | 19.85 | 11.65 | 12.06 |
| AZT，po，10mg/kg×1 | 36.56 | 31.91 | 25.89 | 23.64 |
| 正常小鼠血清 | 10.5 | |||
本发明首次采用我国分离的HIV-1C/B别重组病毒的pol基因，以pMAL-c2载体构建我国HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR，表达可溶性HIV-1蛋白酶，一步纯化获得纯HIV-1蛋白酶。而国际上报道的HIV蛋白酶大多是以包涵体形式表达[J Biol Chem 1988 Oct15；263(29)：14617-14620；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989，86：1841-1845；Biochemistry.1990，29：264-269；Eur.J.Bioche.1991，199：361-369；Biochem Molecu Bio Inter.1995，35(4)：899-912；Appl Biochem Biotechnol.1996，61：97107；Appl Microbiol Biotechnol.1997，47：241-245.]，需经变性、复性之后再纯化，技术繁琐，周期长，酶活易损失。本发明酶制备方法较为简便易行，在此基础上建立了ELISA快速检测方法；首次联合应用我国HIV-1蛋白酶ELISA检测方法与现有的HIV-1逆转录酶3H掺入法和HIV-1整合酶ELISA法进行三种复制酶多靶位筛选，可筛出作用不同的单一或多靶位的HIV-1抑制剂，为发展多靶位作用的抗HIV新药奠定了基础；联合三种复制酶检测法筛出了对HIV-1三种复制酶有广谱抑制作用的化合物9833、黄芩甙元钠、丹参提取物CEH、CEHL、和中药提取物ELBI，有进一步开发的价值。
附图说明：图1：表达载体pMAL-c2-PR的构建图谱示意图图2：PCR扩增及验证1：pc54-pol-T作为模板2：pMAL-c2-PR作为模板3：空白对照4：DNA ladder 2000图3：pMAL-c2-PR的限制性内切酶酶切验证1：DNA ladder 15 0002：DNA ladder 20003：pMAL-c2/EcoR I4：pMAL-c2/EcoR I+BamH I5：pMAL-c2-PR/EcoR I6：pMAL-c2-PR/EcoR I+BamH I图4 pMAL-c2-PR的测序验证图5：SDS-PAGE电泳验证HIV-1蛋白酶的表达和纯化1：pMAL-c2-PR转化菌未诱导总蛋白2：低分子量蛋白质标准3：pMAL-c2-PR转化菌IPTG诱导总蛋白4：pMAL-c2-PR转化菌IPTG诱导可溶性胞质部分5：pMAL-c2-PR转化菌IPTG诱导包涵体6：不与amylose柱结合部分7，8：纯化后的HIV-1蛋白酶图6 Gelpro凝胶分析软件分析HIV-1蛋白酶的表达图7 HPLC方法测定重组HIV-1蛋白酶活性从上到下曲线的反应时间分别为0，20，40，60分钟图8：HPLC方法测定HIV-1重组蛋白酶的Km值的双倒数图图9：ELISA方法HIV-1蛋白酶的反应时间曲线图10：ELISA方法测定HIV-1蛋白酶的反应速度曲线图11 ELISA方法测定HIV-1蛋白酶的Km值的双倒数图图12：萘醌类化合物的结构NQ-1：R1＝R2＝R3＝R4＝HNQ-2：R1＝R2＝OH，R3＝R4＝H9833：R1＝R2＝OH，R3＝R4＝SO3K图13 CEH在小鼠体内抗HIV-1 RT血清动态
序列表<110>中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所陈鸿珊，郭志敏<120>我国HIV-1蛋白酶ELISA检测方法及用于多靶位筛选抗HIV-1抑制剂<160>1<210>1<211>297<212>DNA<213>逆转录病毒科，慢病毒属(Retroviridae，Lentivirus)<220><221>mat_peptide<222>(1)...(297)<400>1cctcaaatca ctctttggca acgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 60gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagacctgaa tttgccaggg 120aaatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgaa 180cagataccca tagaaatttg cggacacaaa gctataggta cagtattagt aggacctaca 240cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagcttg gttgcacttt aaatttt 297
Claims (6)
1.我国HIV-1蛋白酶ELISA检测方法，其特征是首次采用我国分离的HIV-1C/B型重组病毒的pol基因，以pMAL-c2载体构建我国HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR，表达可溶性HIV蛋白酶，进行一步纯化，并以所获得的HIV-1蛋白酶建立ELISA活性检测方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR的构建是以含有HIV-1pol基因的质粒pC54-pol-T为模板，设计含有pMAL-c2表达载体的多克隆酶切位点EcOR I和BamH I的上游引物：5′-ACT GAA TTC CCTCAA ATC ACT CTT-3′及下游引物：5′-GCC GGA TCC TTA AAA ATT TAA AGT GCA ACC AAG-3′，经PCR反应，获得HIV-1蛋白酶基因片段，插入pMAL-c2表达载体相应酶切位点，获得HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是可溶性HIV蛋白酶的表达是将所构建的HIV-1蛋白酶重组质粒pMAL-c2-PR转化到大肠杆菌DH5α，转化子在LB+氨苄青霉素(Amp)的培养基中培养，并经IPTG诱导，获得HIV-1蛋白酶的表达。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶的一步纯化是将含有HIV-1蛋白酶表达质粒的大肠杆菌菌体悬于预冷的裂解缓冲液，冷冻过夜，融化、超声破碎细胞，离心，上清液上Amylose树脂柱用含麦芽糖的缓冲液洗脱，透析、浓缩，获得纯化的HIV-1蛋白酶。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶是以Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin为底物所建立的ELISA方法检测其活性的。
6.HIV-1蛋白酶ELISA检测方法在联合HIV-1逆转录酶3H掺入法和HIV-1整合酶ELISA法进行三种HIV-1复制酶单一或多靶位筛选HIV-抑制剂、研究有效化合物的构效关系、示踪中草药分离提取的单一成分、探索药物作用机制和测定动物体内药物血清动态中的应用。
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