ES2207831T3 - Uso de compuestos que unen una dipeptidasa citoplasmatica para la potenciacion de la repuesta inmune. - Google Patents

Uso de compuestos que unen una dipeptidasa citoplasmatica para la potenciacion de la repuesta inmune.

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ES2207831T3 ES98920101T ES98920101T ES2207831T3 ES 2207831 T3 ES2207831 T3 ES 2207831T3 ES 98920101 T ES98920101 T ES 98920101T ES 98920101 T ES98920101 T ES 98920101T ES 2207831 T3 ES2207831 T3 ES 2207831T3
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Abstract

Procedimiento para la estimulación y proliferación de células T que tienen actividad citoplásmica pos-prolildipeptidasa; el procedimiento supone por una parte contactar las células T con un compuesto orgánico en concentración menor de 10{sup,-8} M, en la que el compuesto se caracteriza porque: (a) es capaz de cruzar la membrana de las células T para entrar en el citoplasma, (b) su fijación a la actividad dipeptidasa en una concentración inferior a 10{sup,-8}M, y así (c) estimular la proliferación de las células T a esa concentración.

Description

Uso de compuestos que unen una dipeptidasa citoplasmática para la potenciación de la respuesta inmune.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere al tratamiento de infecciones víricas usando compuestos orgánicos que interactúan con las enzimas de las células T.
Uno de los marcadores clásicos del SIDA plenamente desarrollado, resultante de la infección prolongada con VIH-1, es una supresión severa de las células T CD4^{+}, que son un componente clave del sistema inmune. Se han realizado intentos de aumentar el número de CD4^{+} de pacientes de SIDA, y algunos de estos esfuerzos, especialmente el tratamiento con inhibidores de la proteasa, han conocido un éxito considerable. Otros enfoques, por ejemplo la estimulación de la respuesta inmune mediante vacunación con péptidos víricos, han tenido menos éxito. Las razones para la supresión de CD4^{+} en el SIDA, y la resistencia de las células CD4^{+} a su estimulación mediante algunas terapias, no se comprenden plenamente.
Compendio de la invención
Los autores de la invención han descubierto que el estado de activación de células T humanas puede verse afectado por compuestos que interactúan con una actividad de una post-prolil dipeptidasa citoplasmática que tiene similitudes, aunque es distinta, a la serina proteasa CD26 de células T unida a membrana. Los compuestos útiles en la invención son inhibidores de esta actividad que está involucrada, en células T normales de individuos sanos, en la protección de células T contra la apoptosis o muerte celular programada. Por lo tanto, en elevadas concentraciones los inhibidores adelantan la muerte de las células T inhibiendo la enzima protectora. Se ha descubierto, sorprendentemente, que a bajas concentraciones los inhibidores presentan un efecto paradójico: son estimuladores potentes de la actividad de células T en individuos infectados con VIH. Las concentraciones de inhibidor que inducen esta respuesta estimuladora de células T son muy bajas (en el orden de 10^{-8}-10^{-12} M) y, por tanto, los inhibidores pueden ser usados con efectos secundarios mínimos, incluso si, en dosis más elevadas, los inhibidores fueran tóxicos.
La hipótesis de los autores de la invención es que la resistencia a la activación total observada en células T de individuos infectados con VIH implica un bloqueo en la actividad enzimática citoplasmática comentada anteriormente. Se cree que este bloqueo de la activación, incluyendo la actividad citoplasmática, impide la diferenciación en células efectoras de células T de individuos infectados por el VIH, conduciendo finalmente a la muerte de las células T.
Por lo tanto, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto que se caracteriza por:
(a)
unir a la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo presente en el citoplasma de células de Jurkat; y
(b)
estar formulado para su administración a un paciente de tal manera que su concentración en la sangre del mencionado paciente no exceda de 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para estimular la proliferación de células T en un paciente humano que sufre un estado patológico caracterizado por la incapacidad de las células T del mencionado paciente de responder con normalidad a los estímulos que inducen la proliferación de células T.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de un compuesto que se caracteriza por:
(a)
ser capaz de atravesar la membrana de células T para penetrar en el citoplasma;
(b)
unirse a la actividad de la dipeptidasa citoplasmática que escinde post-prolilo en una concentración inferior a 10^{-8}M;
(c)
estimular la proliferación de las mencionadas células T a la mencionada concentración; y
(d)
estar formulado para su administración a un paciente de tal manera que su concentración en la sangre del mencionado paciente no sea superior a 10^{-8}M.
en la elaboración de un medicamento para estimular la proliferación de células T en un paciente humano que sufre un estado patológico caracterizado por la incapacidad de las células T del mencionado paciente de responder con normalidad a los estímulos que inducen la proliferación de células T.
En sus aspectos más específicos, la invención se refiere al uso de un compuesto orgánico que se caracteriza por:
(a)
inhibir la actividad de la dipeptidasa citoplasmática que escinde post-prolilo de las células T a una concentración superior a 10^{-3}M;
(b)
interactuar con la mencionada actividad de la dipeptidasa en una concentración inferior a 10^{-8}M, aumentando la capacidad de la mencionada actividad para inhibir la apoptosis de células T del mencionado paciente;
(c)
ser capaz de atravesar la membrana de las células T del mencionado paciente para penetrar en el citoplasma; y
(d)
estar formulado para su administración a un paciente de tal manera que su concentración en la sangre del mencionado paciente no exceda de 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para tratar un paciente infectado por VIH.
En otro aspecto más específico de la presente invención se proporciona el uso de un compuesto, que se caracteriza por:
(a)
inhibir la actividad de la dipeptidasa post-prolilo citoplasmática de células T a una concentración aproximada de 10^{-5}M;
(b)
interactuar con la mencionada actividad de la dipeptidasa a una concentración inferior a 10^{-8}M, aumentando la capacidad de la mencionada actividad para inhibir la apoptosis de las células T del mencionado paciente;
(c)
ser capaz de atravesar la membrana de las células T del mencionado paciente para penetrar en el citoplasma de células T; y
(d)
estar formulado para su administración, de tal manera que su concentración en la sangre de un paciente no exceda de 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para tratar una infección vírica en un paciente.
Los pacientes pueden ser tratados con estos medicamentos. Todas las referencias a métodos de tratamiento de la invención deben, por lo tanto, interpretarse conforme a ella.
Por lo tanto, la invención muestra el uso de un compuesto en la elaboración de un medicamento para estimular la proliferación de células T de un paciente humano que sufre un estado patológico enfermedad caracterizado por la incapacidad de las células T del paciente de responder con normalidad a los estímulos que inducen la proliferación de células T; el uso implica el contacto de las células T con un compuesto orgánico a una concentración inferior a 10^{-8}M, en que el compuesto se caracteriza por unirse a la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo presente en el citoplasma de células T humanas, por ejemplo células CD4^{+} o células de Jurkat.
El tratamiento conforme a la invención puede ser in vitro o in vivo. En la terapia in vivo, el compuesto de la invención que interactúa con la enzima es administrable de tal manera que la concentración en la sangre del paciente (por ejemplo, un paciente infectado por VIH) sea inferior a 10^{-11}. Los compuestos pueden también utilizarse in vitro a bajas concentraciones para estimular la proliferación de células T no infectadas y beneficiosas, tales como células CD4^{+} y CTL's. En esta realización, las PBMC se aíslan de un paciente y se incuban con una concentración inferior a 10^{-8} M del compuesto para lograr una proliferación de células T, que se pueden entonces volver a infundir en el paciente.
Se cree que la administración de bajas concentraciones de los inhibidores de la invención pueden tener un efecto alostérico tal que la enzima citoplasmática de células T, que es una enzima multimérica (p. ej. subunidad múltiple), presente una afinidad incrementada de la enzima hacia sus ligandos o substrato naturales, permitiendo que la célula T, previamente bloqueada, prosiga hasta su total activación y consecuente supervivencia, proliferación y producción de interleuquina-2. La estimulación de la respuesta inmune de las células T en pacientes infectados por el VIH, según la invención, produce un incremento en el número de células con efecto inmune, que pueden combatir tanto el propio VIH como otros agentes patógenos oportunistas.
El tratamiento conforme a la invención tiene las ventajas de su especificidad y baja toxicidad, no sólo debido a las bajas concentraciones del inhibidor que se puede utilizar, sino también porque, en las células T de pacientes no infectados con un virus tal como el VIH, los inhibidores no tienen ningún efecto discernible. Además, el tratamiento conforme a la invención presenta la ventaja de no requerir necesariamente la manipulación in vitro de las células T de pacientes infectados por VIH. Además, no se requiere inmunización, y el tratamiento será efectivo incluso en los casos en los que las proteínas del VIH hayan mutado, dado que la terapia se dirige sobre una enzima celular. El hecho de que, en células T tratadas in vitro conforme a la invención, no se observe ningún incremento en el nivel de la proteína p24 del VIH, indica probablemente que las células T que están infectadas con el VIH no se estimulan con el tratamiento a bajas dosis de inhibidor de la invención.
La invención también permite la inmunización de pacientes infectados por el VIH con, p. ej., péptidos de VIH. En circunstancias normales, tales pacientes no pueden ser vacunados debido al defecto en la vía de estimulación de la célula T. El uso de inhibidores en bajas dosis como adyuvantes puede hacer a las células T sensibles a la vacunación con antígenos de VIH, en particular péptidos.
El tratamiento de pacientes infectados por el VIH con dosis bajas de inhibidoresconforme a la invención puede también aumentar la actividad de otros fármacos contra el SIDA, en particular de los inhibidores de la proteasa. Los autores de la invención han descubierto que el tratamiento conforme a la invención no consigue, generalmente, un aumento en el número de CD4^{+} en pacientes cuyo número de CD4^{+} es ya muy bajo, es decir, alrededor de 400. En tales pacientes, el número de CD4^{+} puede aumentarse por encima de este nivel usando inhibidores de la proteasa conocidos, y las recientemente generadas células CD4^{+}, que resultan de este tratamiento son particularmente susceptibles a los efectos estimulatorios del tratamiento conforme a la invención, lo que conduce a una combinación óptima de terapia contra el SIDA. Los fármacos se administran, preferiblemente, por vía oral.
La administración a dosis bajas de inhibidores de la invención puede también utilizarse para producir un efecto adyuvante en individuos VIH negativos, que tienen que inmunizarse con péptidos u otros antígenos víricos: este modo de vacunación puede utilizarse para la profilaxis contra el VIH, así como contra otros agentes patógenos víricos. Generalmente, han sido difíciles de conseguir mediante inmunización con péptidos respuestas representativas de linfocito T citolítico ("CTL"), tanto in vitro como in vivo. La invención debería hacer posible la producción de respuestas de CTL a péptidos víricos significativas, p. ej. péptidos de la gripe, VIH, virus del papiloma humano y péptidos del herpes. Este efecto adyuvante puede también utilizarse para estimular respuestas de CTL a antígenos de péptido de otros agentes patógenos, p. ej. bacterias patógenas tales como E. coli toxigénica, y protozoos patógenos tales como los agentes patógenos que son los agentes causantes de la malaria o la disentería amebiana. Los compuestos, cuando se utilizan como adyuvantes, se administran preferiblemente por vía oral.
La invención proporciona un uso nuevo y altamente ventajoso para potenciar la respuesta inmune tanto en los pacientes infectados como en los no infectados por el VIH, empleando concentraciones extremadamente bajas de inhibidores que, a estas concentraciones, presentan un efecto paradójico (es decir actúan como moléculas estimuladoras más que inhibidoras, como harían a concentraciones más elevadas). Las concentraciones muy bajas empleadas conforme a la invención permiten el tratamiento con toxicidad y reacciones secundarias mínimas. La especificidad del tratamiento de la invención también impide efectos adversos tales como los que se observan, por ejemplo en el tratamiento con compuestos estimuladores de la respuesta inmune tales como la interleuquina-2.
Otras características y ventajas de la invención se evidencian en la descripción detallada de la misma que sigue, y en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un par de gráficos que muestran el efecto estimulador de linfocitos del tratamiento de la invención sobre las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) de pacientes infectados y no infectados por el VIH. La Fig. 1A muestra el efecto del compuesto sobre la proliferación de célula T in vitro para PBMC de un individuo VIH-1^{+} y la Fig. 1B muestra el efecto del compuesto sobre la proliferación de célula T in vitro en PBMC de un individuo VIH-1^{-}. Cada una de las Figs. 1A y 1B ilustra un experimento representativo de un total de diez experimentos.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra los efectos estimuladores de células T de dos compuestos inhibidores utilizados conforme a la invención (fecha del experimento: 9/3/95; Nº. de identificación del paciente: 1655185; recuento de anticuerpos CD4: 760; y número de células/pocillo: 0,4 x 10^{6}).
La Fig. 3 es un gráfico que muestra el efecto estimulador del tratamiento conforme a la invención en linfocitos de pacientes infectados por el VIH, comparado con el tratamiento utilizando dos compuestos de control (fecha del experimento: 15/3/95; Nº de identificación del paciente: 1227604; recuento de anticuerpos CD4: 230; número de células/pocillo: 0,16 x 10^{6}; y ½ de la superficie de una placa de 96 pocillos).
La Fig. 4 es un gráfico que muestra el efecto estimulador del tratamiento conforme a la invención en linfocitos de pacientes infectados por el VIH, comparado con el tratamiento utilizando dos compuestos de control (fecha del experimento 23/3/95; Nº de identificación del paciente: 1586496; recuento de anticuerpos CD4: 830; número de células/pocillo: 0,4 x 10^{6}).
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra un efecto estimulador de un inhibidor conforme a la invención en PBMC in vitro, que muestra la correlación con el recuento de CD4^{+}. Los datos están representados como el logaritmo decimal del índice de estimulación (eje vertical) frente al logaritmo decimal del recuento de CD4 del paciente (eje horizontal) (71 pacientes en total; P=<0,0001:RR=2,04(1,5-2,9)).
La Fig. 6 es un histograma que demuestra que un inhibidor conforme a la invención induce una apoptosis dosis-dependiente en células T en reposo(estas dosis son superiores a las dosis extremadamente bajas utilizadas conforme a la invención). Células CD19+B y células T CD4+/CD8+ se aislaron (>90% y >97% de pureza, respectivamente). Las células se incubaron entonces durante una noche en presencia o ausencia de VBBP (10^{-4}M o 10^{-6}M). La cantidad de muertes inducidas por el tratamiento con VPB se determinó mediante análisis de citometría de flujo 7AAD. Los datos representan el porcentaje medio de muertes en muestras duplicadas.
La Fig. 7 es un histograma que demuestra que un inhibidor conforme a la invención induce, a dosis más elevadas que en la invención, una apoptosis dosis-dependiente tanto en las poblaciones de CD26^{+} como en las de CD26^{-} de las PMBC. Se encontró que las poblaciones de CD26^{+} y CD26^{-} de las PBMC eran igualmente susceptibles a la muerte inducida por el inhibidor DPPIV. Las PBMC se marcaron con el anticuerpo monoclonal anti CD26 4 EL, y luego se clasificaron en poblaciones de CD26^{+} y CD26^{-} utilizando una citometría de flujo facstar plus dual lasar. Las células que expresaron el nivel más elevado (5%) de CD26 y las células que expresaron el nivel más bajo de CD26 (el último 10%) se aislaron como las poblaciones de CD26' y CD26^{-}, respectivamente. La pureza de las poblaciones, como se examinó mediante la tinción con el anticuerpo monoclonal anti CD26 134-2C2, es >90%. Las poblaciones de CD26^{+} y CD26^{-} se cultivaron a lo largo de una noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de VBP. El número de muertes inducidas por el tratamiento con VBP se determinó mediante análisis de citometría de flujo 7AAD. Los datos representan la media de muertes en muestras duplicadas +/- SD.
La Fig. 8 es un gráfico que muestra que un inhibidor de CD26 (val-boroPro) inhibió también la enzima citoplasmática.
La Fig. 9 es un gráfico que muestra el efecto estimulador del tratamiento conforme a la invención en linfocitos de pacientes infectados por el VIH, comparado con el tratamiento utilizando dos compuesto de control. Las fluoroolefinas no inducían una muerte celular. Las PBMC se cultivaron a lo largo de una noche en presencia o en ausencia de inhibidores DPPIV L125, una fluoroolefina que contiene inhibidor de la Npeptidal Oacil hidroxilamina o VBP. El número de muertes inducidas se determinó mediante análisis de citometría de flujo 7AAD. Los datos representan el porcentaje medio de muertes en muestras duplicadas.
Descripción detallada Compuestos terapéuticos
Conforme a la invención, puede utilizarse cualquier compuesto orgánico que muestre las siguientes propiedades: (1) ser capaz de atravesar la membrana de células T humanas para alcanzar el citoplasma en donde el compuesto puede (2) interactuar con la dipeptidasa citoplasmática presente en las células T, para (3) estimular la activación/proliferación de células T (y más preferiblemente células CD4 o CTLs) a concentraciones inferiores a 10^{-8}M.
Más adelante se describe un método simple de rastreo para la identificación de componentes que, conforme a la invención, son candidatos a componentes terapéuticos.
Preparación de substrato y enzima
La primera etapa es proporcionar una preparación de enzima citoplasmática. La preparación no necesita ser una muestra de enzima pura; un extracto citoplasmático bruto es suficiente para rastrear componentes en cuanto a la actividad deseada. El extracto puede prepararse a partir de cualquier línea celular de células T humanas que sea CD26^{-} negativa; un ejemplo de una línea celular adecuada de este tipo es la línea celular de Jurkat disponible comercialmente.
Un extracto celular adecuado que contenga enzima puede preparase como sigue. Primero, se cultivan células de Jurkat (10^{6}-10^{11} células) y se obtiene un sedimento celular por centrifugación. El sedimento celular se almacena en estado congelado.
Para su uso en el ensayo, el sedimento congelado se descongela mediante la adición de tampón de lisis gélido en una cantidad de, aproximadamente, 1 ml por cada 10^{8} células. El material licuado se homogeneiza con diez golpes de un homogeneizador Dounce, y luego se clarifica mediante centrifugación a 1.500 g. El sobrenadante se extrae (y reserva), y el sedimento de 1500 g se resuspende en tampón de lisis y se homogeneiza con diez golpes de un homogeneizador Dounce. La clarificación se lleva a cabo de nuevo mediante centrifugación a 1.500 g, 4ºC.
Los sobrenadantes a 1.500 g se combinan entonces, y se añade AEDT 5 mM. El líquido resultante se centrifuga a 75.000 g a 4ºC durante veinte minutos, y el sobrenadante se separa entonces y centrifuga a 175.000 g a 4ºC durante 60 minutos. El sobrenadante resultante, que contiene el extracto citosólico, es la preparación con actividad DPPV utilizada en el ensayo, descrito más adelante, para compuestos terapéuticos candidatos de la invención.
El ensayo se basa en la observación de los autores de la invención de que la enzima citoplasmática de células T de interés es una serina proteasa que escinde post-prolilo. Por ello, se escogieron como substrato informador un compuesto que contiene prolina en la penúltima posición; puede utilizarse cualquiera de una serie de substratos que cumplen este requisito. En el ensayo descrito aquí, se empleó un ensayo de ruptura fluorescente utilizando el substrato Ala-ProAFC. Alternativamente, se puede llevar a cabo un ensayo colorimétrico utilizando como substrato Gly-Pro-pNA. La elección del aminoácido terminal no es crítica, dado que el substrato contiene un grupo amino terminal libre.
En el ensayo que los autores llevaron a cabo, éstos emplearon un espectrofotómetro de fluorescencia para la excitación a 400 nm y emisión a 505 nm. El espectrofotómetro se calibró para una intensidad de fluorescencia de 0,000= HEPES 10 mM, pH 7,4; e intensidad de fluorescencia de 1.000= HEPES 10 mM, AFC 1\muM.
Para llevar a cabo el ensayo, se diluyen entre 10 y 100 \mul del extracto de enzima anterior hasta 1 ml con HEPES 10 mM, pH 7,4, que contiene Ala-ProAFC 10 mM. Al menos una muestra de substrato/extracto se ensaya sin el compuesto de ensayo, para proporcionar un patrón de comparación con la muestra de ensayo.
En las muestras de ensayo, se ensayan múltiples muestras que contienen concentraciones variables hasta llegar a 10^{-8} M. La muestra (con o sin el compuesto de ensayo) se coloca en una cubeta, y se introduce en un espectrofotómetro de fluorescencia. La actividad enzimática se mide como la acumulación de intensidad de fluorescencia (es decir producto de escisión del substrato) a lo largo del tiempo (1 min). Se identifica un compuesto como un inhibidor si la fluorescencia acumulativa decrece como resultado de la presencia del compuesto de inhibición.
Una vez que se ha identificado un compuesto como un inhibidor enzimático, como se ha descrito anteriormente, los ensayos posteriores se llevan a cabo para determinar si el compuesto es capaz de moverse a través de la membrana de células T hasta el citoplasma; este es un ensayo que puede llevarse a cabo usado técnicas bien conocidas.
Si se desea, se pueden llevar a cabo ensayos in vitro adicionales utilizando compuestos candidatos de la invención, con anterioridad a su uso in vivo. Un ensayo de este tipo emplea el compuesto candidato a una concentración muy baja, en un ensayo diseñado para determinar si el compuesto puede, a bajas concentraciones, estimular la proliferación in vitro de PBMC de pacientes infectados por el VIH. Como se muestra en los datos de la Fig. 4, la estimulación puede medirse mediante, p. ej, la incorporación de un nucleótido marcado.
Los compuestos pueden también ensayarse en dosis más elevadas para determinar si muestran el efecto opuesto a la proliferación, como anteriormente, es decir apoptosis dosis-dependiente causada por la inhibición de la enzima, como en los experimentos de la Fig. 6.
Compuestos candidatos
Como se ha comentado anteriormente, los compuestos que son potencialmente capaces de la inducción de apoptosis a dosis elevadas y de inducción de la proliferación a dosis bajas son aquellos que, a dosis normales o elevadas, inhiben la dipeptidasa citoplasmática de células T, y pueden atravesar la membrana de células T hacia el citoplasma de células T, donde ocurre la interacción con la enzima. Los compuestos, por lo tanto, deben ser compuestos orgánicos que tengan un grupo amino libre en el extremo amino, una prolina o un análogo a la prolina en la penúltima posición; y un sitio de unión de la enzima que emule el sitio de escisión post-prolilo de la dipeptidasa citoplasmática.
Se puede rastrear y utilizar conforme a la invención un cierto número de clases de compuestos conocidos. Una de estas clases son los inhibidores de CD26 (es decir DPPIV), incluidos los descritos en Bachovchin et al., Patente de EE.UU nº 4.935.493. En la patente 4.935.493 se describen compuestos que tienen la estructura:
1
en las que cada uno de D_{1} y D_{2}, independientemente, son un grupo hidroxilo o un grupo que es capaz de hidrolizarse y formar un grupo hidroxilo en solución acuosa a pH fisiológico; y X contiene un aminoácido o un péptido que emula el sitio de substrato reconocido por una enzima de escisión del post-prolilo.
Los compuestos en la patente 4.935.493 son inhibidores de CD26, y son también inhibidores candidatos de la invención. Tal como se ha comentado anteriormente, debido a las bajas concentraciones de compuestos utilizados conforme a la invención, es aceptable utilizar, en la invención, un compuesto que interactúa no solamente con la enzima citoplasmática, sino también con CD26.
La clase de compuestos descrita en la patente 4.935.493 también se comenta y ejemplifica en Takacs et al., solicitud de patente de EE.UU nº. de serie 04/923.337, correspondiente a la solicitud PCT Nº W094/03055. En esta solicitud, una de las familias de moléculas en la patente 4.935.493 se describe como la de "moléculas Xaa-boroPro", ejemplificada por Ala-boroPro, Pro-boroPro y Gly-boroPro. Todas estas moléculas Xaa-boroPro son candidatas para su uso en los métodos de la presente invención. Dos de estos compuestos se utilizan en algunos de los ejemplos descritos más adelante: esos compuestos son Lys-boroPro ("KPB") y Val-boroPo ("VBP").
Ejemplo 1
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron, mediante métodos normalizados, de individuos infectados por el VIH. Dosificaciones variables de KBP o VBP se pusieron en contacto in vitro con las PBMC, y la estimulación de la proliferación se midió mediante incorporación de ^{3}H timidina (ppm). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Fig. 1: dosis muy bajas de Val-boroPro y Lys-boroPro estimularon la proliferación de las PBMC de pacientes infectados por el VIH, pero no la de las PBMC de pacientes no infectados.
Como se muestra en la Fig. 1, ninguna concentración del inhibidor de la enzima boroPro afectó a las PBMC de individuos no infectados. El inhibidor, a concentraciones moderadas, tampoco causó proliferación de las PBMC de individuos infectados por el VIH, pero causó una marcada proliferación a concentraciones muy bajas (10^{-9} y 10^{-10}M). Estos resultados concuerdan con la hipótesis de los autores de la invención comentada anteriormente, de que, a bajas concentraciones, estos inhibidores de enzima exhiben un efecto paradójico: más que inhibir la enzima citoplasmática de la célula T que controla la apoptosis, interactúan con dicha encima de un modo que bloquea la inactivación y provoca la proliferación de células T.
Resultados concordantes se muestran en la Fig. 2, un histograma que muestra que bajas dosis de Lys-boroPro y Val-boroPro causan una proliferación de las PBMC de pacientes infectados por el VIH, mientras que dosis más elevadas (10^{-4}M) no tienen este efecto.
Los mismos resultados se muestran en las Figs. 3, 4, 9 y 10 que también presentan datos para dos compuestos de control OKT3, y PHA, ambos mitógenos no específicos.
En referencia a la Fig. 5, los datos se presentan en una forma que muestra que concentraciones bajas de los inhibidores de la invención tienen poco efecto en las PBMC de pacientes infectados por el VIH, cuyos recuentos de CD4^{+} son inferiores a aproximadamente 400 (la indicación clínica del SIDA). En la gráfica de la Fig. 5, el logaritmo decimal del índice de estimulación (el eje vertical) se representa frente al logaritmo decimal del recuento de CD4^{+} de los pacientes; como se muestra, en recuentos superiores a 400 hay una estimulación de la proliferación especialmente significativa.
La Fig. 6 es un gráfico que demuestra que las células T purificadas son altamente sensibles a los inhibidores de la dipeptidasa citoplasmática de células T en concentraciones moderadas. Células CD19^{+}B y células T CD4^{+}/CD8^{+} se aislaron hasta una pureza elevada y se incubaron a lo largo de una noche en Val-boroPro. La cantidad de muertes celulares se determinó mediante análisis de citometría de flujo 7AAD. Los datos representan el % de muerte celular en las muestras duplicadas. Estos datos son congruentes con la hipótesis de los autores de la invención de que los inhibidores, en concentraciones moderadas, inhiben una enzima citoplasmática que normalmente protege contra la apoptosis.
La Fig. 7 presenta datos que demuestran que las PBMC CD26^{+} y CD26^{-} son igualmente susceptibles a la muerte inducida por el inhibidor de la enzima citoplasmática de células T, en los casos en los que el inhibidor se administra en concentraciones desmedidas. Poblaciones de CD26^{+} y CD26^{-} se incubaron a lo largo de una noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Val-boroPro. La cantidad de muertes celulares se determinó mediante análisis de citometría de flujo 7AAD. Los datos representan el % medio de muertes en muestras duplicadas. Estos datos indican que la enzima citoplasmática de células T que inhibe la apoptosis está presente tanto en las células T CD26^{+} como CD26^{-}.
La Fig. 8 presenta datos que muestran los efectos de un inhibidor útil en la invención, Val-boroPro. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando dos preparaciones: DPPIV purificada (es decir CD26), y extracto citoplasmático de célula T de Jurkat, descrito anteriormente (las células de Jurkat contienen la enzima citoplasmática de células T, pero no portan CD26 sobre sus superficies). Estas preparaciones se incubaron con diversas concentraciones de Val-boroPro, y la actividad enzimática se determinó midiendo la acumulación del producto de escisión fluorescente 7-amino-4-trifluorometilcoumarina (AFC) liberado del substrato Ala-ProAFC por escisión enzimática. Val-boroPro inhibió tanto la enzima DPPIV como la enzima citoplasmática de células T en la preparación de Jurkat.
Otras realizaciones se incluyen en las reivindicaciones siguientes.

Claims (19)

1. Uso de un compuesto que se caracteriza por:
(a)
unir a la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo presente en el citoplasma de células de Jurkat; y
(b)
estar formulado para su administración a un paciente, de tal manera que su concentración en la sangre de dicho paciente no exceda de 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para estimular la proliferación de células T de un paciente humano que sufre un estado patológico caracterizado por la incapacidad de las células T del mencionado paciente de responder con normalidad a los estímulos que inducen la proliferación de células T.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el mencionado estado de enfermedad está causado por la infección por VIH.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el mencionado compuesto se caracteriza, además, por inhibir, a una concentración de 10^{-4}M, la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo citoplasmático encontrada en células T de Jurkat.
4. El uso de la reivindicación 3, en donde el mencionado compuesto se caracteriza, además, por unirse, a una concentración de 10^{-8}M, a la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo cioplasmático de células T CD4^{+} de pacientes infectados por el VIH.
5. El uso de la reivindicación 1, en donde el mencionado medicamento es para el tratamiento de un paciente infectado por VIH, y el mencionado compuesto es para su administración a dicho paciente para lograr una concentración del mencionado compuesto en la sangre inferior a 10^{-10}M.
6. El uso de la reivindicación 5, en donde el mencionado compuesto se caracteriza, además, por ser capaz de atravesar la membrana de células T CD4^{+} humanas para penetrar en el citoplasma.
7. Uso de un compuesto, que se caracteriza por:
(a) ser capaz de atravesar la membrana de células T para penetrar en el citoplasma;
(b) unirse a la actividad de la dipeptidasa citoplasmática que escinde post- prolilo en una concentración inferior a 10^{-8}M;
(c) estimular la proliferación de las mencionadas células T a la mencionada concentración; y
(d) estar formulado para su administración a un paciente de tal manera que su concentración en la sangre de dicho paciente no exceda de 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para estimular la proliferación de las células T en un paciente humano que sufre un estado patológico caracterizado por la incapacidad de las células T del mencionado paciente de responder con normalidad a los estímulos que inducen la proliferación de células T.
8. El uso de la reivindicación 7, en donde las mencionadas células T son células CD4^{+}.
9. El uso de la reivindicación 8, en donde el mencionado compuesto mejora la capacidad de las mencionadas células T CD4^{+} de proliferar en respuesta a la estimulación antigénica.
10. El uso de la reivindicación 1, en donde el mencionado compuesto es un inhibidor de la serina proteasa.
11. El uso de la reivindicación 1, en donde el mencionado compuesto es para su administración a un paciente infectado por el VIH.
12. El uso de la reivindicación 10, en donde el mencionado inhibidor de la serina proteasa tiene un sitio de escisión o de unión que emula el sitio de escisión de la post-prolina serina proteasa.
13. Un método para ensayar un compuesto en cuanto a su actividad de inhibición de enzimas, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a)
proporcionar un extracto citoplasmático de células T sin CD26 en sus superficies, que contiene actividad de dipeptidasa para la escisión de post-prolilo;
(b)
poner el mencionado extracto en contacto con un substrato informador de serina proteasa con la mencionada actividad de dipeptidasa, y con el compuesto mencionado; y
(c)
determinar si el mencionado compuesto inhibe la escisión del mencionado substrato informador.
14. Uso de un compuesto orgánico, que se caracteriza por:
(a)
inhibir la actividad de la dipeptidasa que escinde post-prolilo citoplasmático de células T a una concentración superior a 10^{-3}M;
(b)
interactuar con la mencionada actividad de la dipeptidasa a una concentración inferior a 10^{-8}M, mejorando la capacidad de la mencionada actividad para inhibir la apoptosis de células T del mencionado paciente;
(c)
ser capaz de atravesar la membrana de células T del mencionado paciente para penetrar en el citoplasma; y
(d)
estar formulada para su administración a un paciente, de tal manera que su concentración en la sangre de dicho paciente no sea superior a 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para tratar a un paciente infectado por el VIH.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que el recuento de CD4^{+} del mencionado paciente es superior a 400.
16. El uso de la reivindicación 14, en donde el mencionado compuesto es para administración en unión con un agente terapéutico que aumenta el recuento de CD4^{+} en pacientes infectados por el VIH.
17. Uso de un compuesto, caracterizado por:
(a)
inhibir la actividad de la dipeptidasa de post-prolilo citoplasmática de células T a una concentración de aproximadamente 10^{-5}M;
(b)
interactuar con la mencionada actividad de la dipeptidasa a una concentración inferior a 10^{-8}M, mejorando la capacidad de la mencionada actividad para inhibir la apoptosis de células T del mencionado paciente;
(c)
ser capaz de atravesar la membrana de células T del mencionado paciente para penetrar en el citoplasma de células T; y
(d)
estar formulada para su administración, de tal manera que su concentración en la sangre de un paciente no sea superior a 10^{-8}M,
en la elaboración de un medicamento para tratar una infección vírica en un paciente.
18. El uso de la reivindicación 11, en donde el mencionado virus es el VIH.
19. El uso de la reivindicación 17, en donde el compuesto es administrable por vía oral.
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