JPH04505547A - 細胞混合物から特定の細胞を単離するための多段アフィニティー法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞混合物から特定の細胞を単離 するための多段アフィニティー法 発明の分野 本発明は、ｍ胞混合物から特定の生物学的細胞を単離するための多段、陽性選択 方法に関する。陽性選択は、精製すべき細胞集団に高い親和性を有するアフイ斗 ティー表面とａｍを接触させることによって達成される。

発明の背景 細胞分離技術は、癌療法、自己免疫疾患の治療および診断法の改良に重要な適用 可能性を有するものである。

たとえば細胞の親和性を利用する手段は、特定の細胞膜る体外治療に使用できる 。

細胞のアフィニティー分離とは、細胞膜上の分子または構造に特異的な親和性を 有するリガンドを用いて特定の細胞膜集団を支持体表面上に結合させる方法をい う。

その膜分子または構造をもたない細胞は支持体表面に結合せず、分離すべき集団 から除去できる。細胞アフィニティー法は、このような方法がＷｉｇｚｅｌｆら によって１９６９年に報告されて以来ＣＷｉｇｚｅｌｌ　＆　Ａｎｄｅｒｓｏｎ 　（１９６９）、Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１２９：　２３）　、広く使用されてきた。

アフィニティー分離法は、混合物から細胞膜集団を除去するためにも、また混合 物から特定の集団を陽性選択するためにも、共通して使用される。除去方法は、 結合した細胞を単に廃棄すれば所望の細胞が後に残るのであるから、はるかに簡 単である。陽性選択は、所望の細胞を支持体に結合させ、それに障害を与えるこ となく取り出さなければならないこと、また望ましくない細胞が一部アフィニテ ィー表面に非特異的に結合し、収集した所望の細胞を汚染することの両者により 、はるかに困難である。

アフィニティー細胞除去法にはある種の重要な適用が見出されている。研究書違 は、様々な細胞膜集団の混合物を糸紐的に分離することにより、研究用の特定の 細胞膜集団を調製している。たとえばＴｒｅｌｅａｖａｎら（Ｔｒｅｌｅａ−ｖ ａｎら：　１９８４、Ｌａｎｃｅｔ　１　：　７Ｏ−７３）は、抗体被覆磁性ビ ーズによる多重分離を用いて骨髄グレバレーシ■ン中の神経芽腫を約１０’のフ ァクターまで減少させることができると報告されている。

陽性選択法の２つの実例が、Ｂｅｒｅｎｓｏｎら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

れる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎらは、ビオチン化抗体を標的細胞に結合させ、これをア ビジン被覆ビーズを充填したカラムに通すことにより、初期濃度は７％であった ヒ訃骨髄細胞集団の６４％を終濃度７３％で回収している。Ｇａｕｄｅｒｎａ、 ｃｋらは、Ｔｍ胞のある種の亜集団の収集に抗体被覆磁性ビーズを使用している 。初期濃度は３０％であったが、陽性選択された集団は９６％であったという。

収率は記載されていない。これらの純度は、幹細胞移植や細胞生物学的または免 疫学的研究のための亜集団の調製のような、多くの魅力的な応用には十分ではな い。

細胞の反復接触が混合物からの細胞の除去に効果的なことは明らかにされている が、亜集団の陽性選択のための細胞の反復接触はこれまで報告されていない。こ れは、アフィニティー細胞結合の機構の理論から多段操作に利点は予測できない ので驚くべきことではない（Ｈｅｒｔｚう＝１９８５、　ＢｉｏＬｅｃｈ、　ａ ｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、、　２７：　６０３〜６１２．　Ｂｅ１ｌら＝１９８４、 旧ｏｐｈｙｓ、　Ｊ、、　４５；　Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、　１９７８．　Ｉｎｔｌ 、　Ｒｅｖ。

Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、　５３　：　６５〜１４４）。細胞をさらに高い収率で、ま たさらに高い純度での回収を可能にすることの要求は未解決のままである。

発明の要約 細胞のアフィニティー分離の従来の理論（Ｈｅｒｔｚら：前出；Ｂｅ１ｌら：前 出；　Ｇｒｉｎｎｅｌｌ　：前出）に反して、免疫リガンドに対する細胞結合は 可逆性である。免疫リガンドへの細胞結合の可逆性が、多段アフィニティー過程 を用いる混合物からの特異的な細胞亜集団の効率的な除去および精製を可能にす る。これらの方法は、従来報告されている方法の成績を効率の点で凌駕するもの である。

本発明によれば、特定の生物学的細胞が、細胞混合物から陽性選択法によって得 られ、この方法によれば現在の方法よりも高い細胞純度および高い細胞回収率の 両者が達成される。本発明は多段接触を使用する。細胞混合物を所望または標的 細胞集団と高いアフィニティーを有する表面と接触させる。アフィニティー表面 には標的細胞と高いアフィニティーをもつ固定化リガンドが含まれる。付着細胞 はアフィニティー表面から除去し、ついで同一の標的細胞に対して高いアフィニ ティーをもつ第二のアフィニティ一表面に、第二段階で暴露させる。段数は所望 の細胞純度が達成されるまで増加させる。細胞収率は各段階での非付着細胞をそ れぞれの付加段階で新たなアフィニティー表面に再暴露することによって上昇さ せる。

別法として、この方法は、ある段階での非付着細胞を前段のアフィニティー表面 に再暴露する向流抽出法を用いて行うこともできる。

図面の簡単な説明 本発明の利点および特徴は以下の記述からさらに、明白になろう。記述中、 第１図は、細胞の陽性選択のための本発明の多段アフィニティー分離法の構成図 であり、 第２図は、第１図の各段階に使用できる結合リガンド入り容器の模式図であり、 第３図は、第１図の任意の段階用の表面を提供する、リガンドで被覆された磁性 粒子の模式図であり、第４図は、本発明による向流アフィニティー細胞分画法の 構成図であり、 第５図は、多段向流細胞分離系の模式図であり、第６図は、多段バッチ型細胞分 離系の模式図である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は、所望の細胞亜集団に特異的なアフィニティーをもつ固定化リガンドで 被覆した表面に細胞を反復接触させることにより、細胞混合物から高純度の細胞 分画を調製するためのアフィニティー分離法である。本明細書において用いられ る細胞の語は、原核生物および真核生物を包含する任意の起源の生物学的細胞を 意味する。

とくに強調すれば、ウィルス、マイコプラズマおよび一般的粒子を含めた非細胞 粒子もこの定義に包含され、本発明のアフィニティー分離法を用いて精製できる 。

本発明の多投アフィニティー細胞分離法または多段陽性細胞選択法は第゛１図に ブロック構成図の形で示す。ブロック１０．１２および１４はそれぞれアフィニ ティー接触表面１６．１８および２０を有するアフィニティー細胞分離デバイス である。これらのデバイス１０．１２および１４には、本技術分野ではよく知ら れているように、ビーズカラム、ペトリ皿、磁性ビーズ、繊維アレー、多孔膜、 中空繊維、ローラー瓶、エマルジョン、スラリー等が包含される。

デバイスの表面１６．１８および２０は、この目的に有用なことが知られている 任意の材料、たとえばゲル（たとえば５ｅｐｈａｒｏｓｅ）、ポリマー（たとえ ばポリアクリレート、ポリエステル、ポリアルデヒド、ポリイミド、ポリビニル ピロリドン、ポリアラミド、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、セルロジッ ク、イオノマーおよびフルオロポリマー）、蛋白質、脂質、界面活性剤、ガラス およびセラミックから形成される。デバイスの表面、たとえば第２図に例示する ようなポリスチレン容器２２の底部は固定化リガンド２４によって被覆される。

固定化リガンド２４は、単離が望まれる細胞集団に対してアフィニティーを有す る。細胞分離デバイス１０．１２および１４はそれぞれ同種でも異種でもよく、 各段階に２個またはそれ以上設けられてもよい。

細胞接触表面はリガンド２４で被覆され、それが特異的なアフィニティーで細胞 を結合する。固定化リガンドはたとえば細胞表面上の特異的抗原を認識する抗体 分子であってもよい、固定化リガンドはまた、特異的リガンド分子、たとえば精 °製すべき細胞表面上の受容体またはリガンド結合分子によって結合されるレク チン、染料または受容体リガンドであってもよい。アフィニティーリガンドはま た、たとえばビオチン、アビジン、プロティンＡ１酵素、酵素基質または受容体 であってもよい。リガンドとリガンド結合分子のサンドイッチまたは組合せを使 用することもできる。たとえば、担Ｔ３細胞は、Ｔ３に特異的なマウスモノクロ ーナル抗体と、マウス免疫グロブリンに特異的な固定化固体、すなわちマウス抗 −Ｔ３抗体を朋いることにより捕捉される。リガンドとりガント結合分子の相互 作用を促進するために、分子スペーサーまたはブリッジを使用することもできる 。多段分離過程の各工程または各段階に用いるアフィニティーリガンドは同種で も異種でもよい。

アフィニティーリガンドは、よく知られた任意の方法で細胞接触表面に結合でき る。たとえば、物理的吸着、化学的共有結合、物理的捕捉、疎水性相互作用また はファンデルワールス相互作用が用いられる。固体支持体への蛋白質の付着に関 する現在の技術は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏ−ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎ ｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔ、Ｃ，Ｊ、　Ｇｒｉｂｎａｕ。

Ｊ、Ｖｉｓｓｅｎ　＆　Ｒ，ＪＪ、Ｎ１ｖａｎｄ＠ｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１ ９８２にまとめられている。

メジウムとしては細胞、リガンドまたはリガンド結合分子に有害でない任意の適 当なメジウムが用いられる。

通常用いられるメジウムには、ハンクスの平衡塩類溶液、ＲＰＩＪ［１６４０、 す゛ン酸緩衝食塩溶液、イーグルもしくはダルベツコの最少必須培地が包含され る。他の通常メジウムおよび添加物は、Ａ＋＋＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）　Ｃａｔａｌ ｃＰｇｕａ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉ−ｄｏｍａｓ、 　５版、１９８５．２６３−２７３頁に記載されている。

本発明の方法には、第１図に示すように、分離すべき所望の細胞を含有する細胞 混合物を第一のメジウム中に加え、細胞を表面１６に接触させ、その上のりガン トに所望の細胞を結合させる工程を包含する。残念ながら、一部の望ましくない 細胞も付着する。表面リガンドに付着しない細胞は新たなメジウムで表面から洗 い落とし、捨てる。アフィニティー表面１６に結合または付着しｔ；細胞はアフ ィニティー表面から除去する。細胞はよく知られた任意の方法で、たとえば掻取 り、振盪、流体剪断、溶出緩衝液の利用または自然の脱蒼によって除去される。

これらの除去された細胞は新たなメジウムに再懸濁し、第二のデバイス１２に導 入される。

除去された細胞混合物は、第二のデバイス１２中のアフィニティーリガンド含有 表面１８と接触させる。アフィニティー表面と接触後、結合しない細胞を洗い流 し、結合した細胞を表面１８から除去する。除去した細胞を新たなメジウムに再 懸濁し、第三のデバイス１４に導入する。第三のデバイスのアフィニティー表面 ２０に接触させたのち、結合しない細胞を再び洗い落とし、結合した細胞を除去 すると精製された細胞が得られる。この陽性選択および陽性に選択されｈ細胞の 溶出過程は所望の程度の純度および収率を達成するのに必要な回数だけ反復する ことができる。

最も筒車な形式では、本発明の方法は、精製すべき細胞集団に特異的な分子マー カーを認識する適当なリガンド（抗体）で被覆されたペトリ皿を使用する。細胞 混合物をその底部に沈着させ、抗体で被覆した皿の表面に結合させる。ついで非 付着細胞を洗い流す。付着細胞は掻取り、掻取られて遊離した細胞は新たなメジ ウムに再懸濁する。再懸濁された細胞を次に新ｔ；な、抗体で被覆された皿に注 ぎ、この操作を、付着細胞が所望の純度に達するまで反復する。

別法として、本発明の方法では、第３図に示すように、リガンド２８を磁性粒子 ３０上に既知の方法で固定化することができる。粒子は、リガンドおよび分離す べき細胞に適した液体メジウム３６中に取り、容器３２に入れる。分離すべき細 胞を磁性粒子３０と混合して、その上のリガンド２８に結合させたのち、磁石３ ４を容器の側部に沿った位置に移動させる。これで、所望の細胞が付着した粒子 ３０が容器３２の側壁に確保されるので、非付着細胞とメジウムを捨て、確保さ れた粒子を完全に洗浄する。この容器に新鮮なメジウムを再び充填し、磁石を除 いて（または電源を切って）、粒子を遊離させる。所望の細胞を自然脱着によっ て粒子から放出させる。放出された細胞を集め、第二の容器（第１図にはブロッ ク１０としてのほかは示されていない）に、“新たなメジウムおよびリガンド被 覆磁性粒子とともに導入する。上述の操作を反復して、さらに細胞の純度を増加 させる。

所望の精製細胞集団の収率もしくは回収率は多段陽性選択を多段除去と組合せた 向流処理法を用いることにより上昇させることができる。第４図は、細胞の精製 のための向流多段陽性選択法を模式的に示した図である。ブロック４０．４２， ４４．４６および４８は、アフィニティー接触表面５０をもつアフィニティー細 胞分離デバイスであり、デバイス、表面はともに上述のタイプのものである。バ ・Ｚチ型の細胞分離デバイスはそれぞれが同種でも異種タイプでもよく、計２（ ｉまたはそれ以上の数のデバイスを設けることができる。第４図には５個のデバ イスが例示されている。

アフィニティー表面は上述したのと同じ種類のリガンドで被覆され、これが精製 すべき細胞集団を特異的なアフィニティーで結合する。バッチ型の操作では、数 個のデバイス４０〜４８の操作は前述した場合と同じである。アフィニティー表 面５０から除去された陽性選択細胞は、ライン５２で示されるように、それぞれ 連鎖の下方に移動され、４０〜４８のひとつのデバイス内の別の接触表面５０に 導かれる。各場合とも、選択されたまたは所望の細胞は新たなメジウム中に加え 、新しい表面５０と接触させる。各使用後に、特定のデバイス４０〜４８は除去 して新たなデバイスで置換してもよく、またさらに好ましくは新たなアフィニテ ィー表面をデバイス内に配置する。

逆に、各デバイス４０〜４８からメジウムとともに除去された非結合細胞は、ｗ ｃ４図の模式図で上方に、ライン５４で示されるように移動される。洗浄液５６ は下役のデバイス４８から導入される。精製された細胞はデバイス４８から除去 される。枯渇された細胞混合物は上段のデバイス４０からライン５８によって除 去される。分離すべき細胞はライン６０によって示すように、中段のデバイスに 導入される。

すなわち、バッチ法の例示的適用においては、分離すべき細胞はデバイス４４の 混合物中を通過させる。デバイス４４内でアフィニティー表面５０と接触したの ち、非結合細胞は洗浄ライン５４からメジウムにより除去され、デバイス４２に 導入されてそのアフィニティー表面５０と接触させる。結合細胞はデバイス４４ 内のアフィニティー表面５０から除去され、メジウム中に再懸濁され、デバイス ４６に適用され、そのアフィニティー表面５０と接触する。次に、デバイス４２ からの非結合細胞は、液流５４を介してデバイス４０に適用され、そのアフィニ ティー表面５０に接触し、結合した細胞は再懸濁され、デバイス４４に適用され てそのアフィニティー表面５０に接触する。デバイス４０からの非結合細胞は排 出口を通過して枯渇細胞混合物となる。

一方、デバイス４０に結合した細胞はメジウム中に再懸濁され、デバイス４２に 適用され、そのアフィニティー表面５０に接触する。所望の収率に応じて、デバ イス４２の結合細胞は再懸濁され、デバイス４４、ついでデバイス４６のように 適用されていく。

一方、デバイス４６で表面５０に結合しない細胞は洗浄ライン５４によって除去 され、デバイス４４に導入され、そのアフィニティー表面５０に接触する。逆に 、結合した細胞はデバイス４６のアフィニティー表面から除去され、メジウム中 に再懸濁され、デバイス４８に適用され、アフィニティー表面５０に接触する。

デバイス４８の非結合細胞は液流５４を介してデバイス４６に適用され、そのア フィニティー表面５０に接触する。デバイス４８の結合細胞はデバイス４８のア フィニティー表面５０から除去され、前述のような高度に精製された高収率の細 胞として排出口に至る。所望に応じてさらに細胞収率を上げるためにはバッチサ イクルを数段連続することもできる。

向流バッチ操作では、各段階において反復操作が要求される。それぞれの細胞の 適用および致来後には、各段階の洗浄と適当な接触表面の再供給を行う必要があ る。

以上述べたバッチ操作法によれば高度に純粋な所望の細胞が、同時に高収率で得 られる。

同種の向流法は、第５図に示すような、適当な材料たとえばガラスの縦型に配置 されたカラム９０のような連続流動デバイスを用い、メジウムを底部に近い導入 口９２から導入し、頂部に近い排出口９４から取り出すことによって実施できる 。細胞混合物は、メジウム導入部と排出部の間の注入口からカラムに導入する。

表面がアフィニティーリガンドでｉ覆された、メジウムまたは細胞よりも密度の 大きい粒子によって与えられるような適当な表面を、カラムの頂部９６に導入し 、カラム９０内を徐々に下方に沈降させて、メジウムとともに上昇する細胞と接 触させる。粒子に結合した細胞はカラム内をそれらが粒子から脱着するまで下方 に引っ張られる。非特異的に結合した細胞は、アフィニティーリガンドによって 特異的に結合されｔ；細胞よりも速やかに脱着する。バルブ９８を通ってカラム の底部から運び出されるまで長く粒子に結合した細胞は、排出口１００から排出 される。粒子が徐々に沈降し、特異的に結合する細胞が結合し、脱着し、２回以 上再結合するのに十分な時間カラム内に滞留すれば（１時間またはそれ以上）、 このデバイスは効率的な多段向流細胞分離デバイスである。メジウムと粒子は適 当に選択されねばならない。浮揚性の粒子を用いる場合には、メジウムの流れの 方向を切り替え、粒子はカラムの底部から導入する。

さらに他の方法では、第６図に示すようなバッチ型の方法を採用することもでき る。この模式図には、以上述べた任意の型の複数個のアフィニティー表面が、参 照番号８０，８２，８４．８６８よび８８として示されている。各アフィニティ ー表面は、その特定の段階に関連するメジウムを保持する、ある型の床部または 容器である段階として示されている。表面は、その間の交換が調整される２個お よび３個の表面の段階または集合として群分けされる。

細胞混合物は、矢印８１によって示されるように、第一段階８０に導入される。

第一段階のアフィニティー表面８０との接触後、数字ＩＮで示された非結合細胞 は第二段階の上方表面８２に移送され、導入される。結合細胞はアフィニティー 表面８０から除去され、ラインＩＡで示されるように第二段階の下方アフィニテ ィー表面８２に移送される。

上方段階８２からの非結合細胞は第三段階の上方アフィニティー表面８４へ通過 する。結合細胞は上方表面８２から除去され、ライン２人で示されるように、中 間アフィニティー表面８４へ運ばれる。下方アフィニティー表面８２からの非結 合細胞は同様に、ライン３Ｎで示されるように、中間アフィニティー表面８４へ 運ばれる。最後に結合した細胞は下方表面８２から途去され、矢印３Ａで示され るように、下方アフィニティー表面８４上に運ばれる。

上方第三段階アフィニティー表面８４からの非結合細胞はライン４Ｎで示される ように廃棄される。同じ段階からの結合細胞は、ライン４Ａによって示されるよ うに除去され、第四段階の上方アフィニティー表面８６に導入される。同様に、 中間第三段階表面８４からの非結合細胞は、ライン５Ｎで示されるように、上方 第四段階アフィニティー表面８６に運ばれる。結合細胞は中間アフィニティー表 面８４から途去され、ライン５Ａで示されるように、下方第四段階アフィニティ ー表面８６へ運ばれる。このサイクルを完結するには、下方第三段階アフィニテ ィー表面８４からの非結合細胞はライン６Ｎを介して下方第四段階アフィニティ ー−面８６へ運ばれ、一方、下方第三段階アフィニティー表面８４上の結合細胞 はライン６Ａによって示されるように収集デバイスに運ばれ、ここで高純度の所 望の細胞が収集される。この連鎖自体が所望の収率を達成するために反復される 。すなわち、表面８６からの非結合細胞はライン７Ｎまたは８Ｎを介して、図に 示すように以後の段階の適当な表面８８へ運ばれる。結合細胞はライン７Ａまた は８Ａを介して、図に示すような以後の段階の適当な表面８８へ運ばれる。第五 段階下方表面８８はラインＩＩＡで示すように高純度の細胞を与え、一方、廃棄 メジウムへのライン９Ｎ経路では所望の細胞は枯渇している。

実施例　１ 培養皿表面への抗体の付着 培養皿の表面への抗体の結合には以下の操作を使用した。ヤギ抗−ラットＩｇＭ 抗体を０．１μ９／Ｃ１１２の濃度で、以下の操作により、ポリスチレン組織培 養皿に固定化した。

カルボジイミド溶液（０，１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，８，１ｒＩＡＩ２あた りカルボジイミド塩酸塩０．０５９）０．３ｍ１２および０．１Ｍ酢酸ナトリウ ム、ｐＨ４、８，１ｒａＱあたり０．９６μ９のヤギ抗−ラットＩｇＭ含有液０ ．３ｍｆｆを、３５ｍｍ培養皿ウニルそれぞれに加えた。この培養皿を振盪しな がら、２５℃で６０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ　３　ｒａＱで３ 回洗浄した。

第二のまたは捕捉抗体は３μｇ／ｒｎＱの濃度でＰＢ５３ｍＩ２として各培養皿 に加えた。再び培養皿を撹拌せずに、室温で１時間インキュベートした。過剰の 抗体はＰＢＳ３ｍｆｆｉで２回、１％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＣＳＸＧｉｂｃ ｏ）含有ＰＢＳで１回すすいで除去した。プレート上の残った蛋白質結合部位は ＰＢ５３ｍｒｌ中０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を培養皿に加えて遮断 または抑制した。ついで培養皿を撹拌せずに室温で３０分間インキュベートした 。最後に培養皿をＰＢ５３ｍρで３回すすいだ。ある場合りこは、第二の抗体と して、マウス免疫グロブリンに特異的な１８７．１と命名された抗体を用いた（ Ｊｏｈｎ　ＭｃＫｅａｒｎ、　Ｅ、１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄａＮｅｍｏｕｒｓ 　ａｒ＋ｄ　Ｃｏｒａｐａｎｙ、　Ｇｌｅｎｏｌｄｅｎ、　ＰＡから入手）、別 の場合には、７Ｄ４と命名されたマウス免疫グロブリンヲ使用した。

実施例　２ 多段バンニング 多段パンニングによるアフィニティー細胞選択の例を以下に示す。この場合の精 製すべき標的細胞であるマウスＣＴＬＬ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　＃ＰＩＢ−２１４）をヒトＨＵＴ−１０ ２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ−ｃｔｉｏ ｎ　＃　ＰＩＢ−１６２）と、標的ＣＴＬＬｍ胞の濃度が１０％になるように混 合した。ポリスチレン組織培養皿を、ＣＴＬＬ細胞の表面に存在するＩＬ２受容 体に特異的なＩｇＭモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で被覆した。このｍＡｂは７ Ｄ４と命名されていて、Ｔｏｍ　Ｗａｌｄｍａｎ、　ＮＣＩ、　Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ、　ＭＤから入手した。抗体は、実施例１に示した操作を用いてポリスチレン 表面に付着させた。′ ＣＴＬＬおよびＨＵＴ細胞は、ｌ　５ｍＱの遠沈管中１１００Ｏｘで１０分間遠 心分離して収集した。メジウムを傾瀉し、ついで細胞を１５％胎仔ウシ血清（Ｆ ｅ２）含有１ｓｃｏｖｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁した。懸濁した細胞を次 に、ｍＡｂ　７Ｄ４含有含有ジトリ注ぎ、２２℃で１時間インキュベートした。

ベトリ皿の表面をＰＢＳですすいで非付着細胞を除去した。付着しり細胞はＰｖ Ｃスクレーバーでベトリ皿の表面から掻取り、１５％ＦＢＳ含有１ｓｃｏｖｅ培 地に再懸濁しｔ；。再懸濁した付着細胞をついで、同じ抗−ＩＬ２受容体ｍＡｂ （７Ｄ４）で同様に被覆した、新たなペトリ皿に注いだ。洗浄して非付着細胞を 除去したのち、付着細胞を再び掻取って除去した。掻取られた細胞を再懸濁し、 第三の抗−ＩＬ２受容体ｍＡｂ　７Ｄ４含有含有ジトリ捕捉させｔ；。再び非付 着細胞をすすいで除去した。

付着細胞を掻取って除去し、再懸濁し、流動細胞計測法および限界希釈法の両者 で分析した。流動細胞計算法では、付着細胞の９９％以上がＣＴＬＬ細胞である ことを示し、一方、限界希釈法ではＨｔｌＴとＣＴＬＬ細胞の比は１：２００で あることを示した（ＣＴＬＬ細胞９９．５％）。限界希釈法は、Ｉｎ２を含まな いメジウムを含む９６−ウェルプレートの各ウェルに様々な数の付着細胞を含有 するように付着細胞を希釈して実施した。このような条件下では、夾雑したＨＵ Ｔ細胞は生育できるが、一方、ＣＴＬＬ標的細胞は生育にＩｎ２を必要とするの で増殖できない（Ｇｉｌｌｉｓ　＆　Ｓｍ１ｔｈ：　１９７７゜Ｎａｔｕｒｅ、 　２６８　：　１５４−１５６）　、最初１００個の細胞を含有したウェルの半 数で生育が認められた。すなわち、限界希釈法では、１００個の細胞（ＨＵＴ＋ 　ＣＴＬＬ）につき約０．５個のＨＵＴ細胞の存在が認められた。すなわち、三 役アフィニティー細胞選択またはパンニング操作では、標的ＣＴＬＬ細胞の１０ ％から９９．５％への濃縮を生じた。この三段バンニング操作の収率は１４％で あった。

実施例　３ マウス肺臓ホモジネートから表面に免疫グロブリンをもつ肺臓細胞のアフィニテ ィー選択 細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスの肺臓から得られた。細胞は肺臓をステンレス鋼スク リーンを通し、スクリーンヲＰＢＳですすいで懸濁させた。細胞の凝集体は綿布 を通して懸濁液を濾過することにより除去した。細胞を洗浄し、１５％ＦＣ５含 有１ｓｃｏｖｅ培地に濃度が１０６細胞／ｍＱになるように再懸濁した。

分離の第一段階では、実施例１に上述したような固定化抗体を含む皿に細胞を２ 　Ｘ　１０’ｍ胞／ｃｍ”の濃度で加え、４°Ｃで１時間インキュベートした。

非付着細胞は１％ＦＣＳ含有ＰＢＳ　３ｍＱで８回すすぎ流した。付着細胞を掻 取り、１５％ＦＣＳ含有冷１５ｃｏｖｅ培地に再懸濁した。分離の第二段階では 、除去した細胞を、新たな培養皿に３ＸＩＯ’細胞／ｃｒｔｒ”加え、４℃に１ 時間放置した。非付着細胞を上述のようにして洗い流し、付着細胞は掻取り、１ ５％ＦＣ５含有１ｓｃｏｖｅ培地に再懸濁した。

得られた細胞あ純度は、精製細胞をフルオレスセイン標識１８７．１　ｍＡｂで 染色し、蛍光を０ｒｔｈｏ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ流動細胞計測計で測定して調べた 。出発混合物は３９％１８Ｌ１陽性であったが、精製細胞は９９％以上の１８７ −１陽性を示した。

実施例　４ 夾雑する細菌からのＣＴＬＬ細胞の精製例外的な応用として、細菌が夾雑した細 胞培養液から、細菌を含まない細胞を単離した。ひとつの実験では、５ＸＩＯ’ ／＋ｉＱのＢａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓを１０’／　ｒｎＱ　ＣＴＬＬ培 養液に室温で加えた。ＣＴＬＬ細胞はｍＡｂ　７Ｄ４で被覆した培養グレート上 ３段階の陽性細胞選択を用いて単離した。ｍＡｂ７Ｄ４は実施例１に記載したよ うにして培養プレートに付着させた。実施例２に記載したように３段陽性選択操 作を実施した。３段陽性選択操作後に得られた付着細胞について、限界希釈法を 用い、夾雑した細菌の存在を分析しｔ；。ウェルあたり１００個に希釈したアフ ィニティー精製ＣＴＬＬ細胞は正常によく生育し、細菌を含まなかった。

ＣＴＬＬ細胞の初期濃度は０．２％であったが、この処理によす少なくとも９８ ．８％に上昇した。これは哺乳動物細胞の細菌を含まない培養液の新しい調製法 を提供するものである。

実施例　５ 多段粒子法 Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋら（前出）によって用いられた磁性粒子はアフィニティー −胞分離に有用である。しかしながら、多段法を用いることにより、その効率は 著しく改善された。

径４．５μの磁性ポリスチレン粒子（Ｄｙｎａｌ　Ｍ−４５０）を、マウスＩＬ ２受容体に特異的なｍＡｂ　７Ｄ４で、以下の操作により１０７個の磁性粒子と １．０μｇ／ｃｒｓ”のｍＡｂ　７Ｄ４をＰＢＳ　ＬｒｎＱに加えて（面積ｃｍ ”は磁性粒子が固体の球体であると仮定して表面積を計算する）被覆した。混合 物を２５°Ｃで２時間インキュベートし、頻回に混合した。磁性粒子は、粒子を 磁石で保持させることにより、ＰＢＳ　１ｍｆｆで２回洗浄した。ＰＢＳ　１ｍ Ｑ中ＢＳＡ　２　ｒｒｒｇ／　ｃｍ”を磁性粒子に加えた。サンプルを再懸濁粒 子に混合し、ついで２５℃で３０分インキュベートした。磁性粒子は、粒子を磁 石で保持させることにより、ＰＢＳ各１＋！ａで２回洗浄した。粒子は１５％Ｆ ＢＳ含有ｌ５ｃｏｖｅ培地に、１０７粒子／ｍＱの濃度で懸濁させた。

１０％ＣＴＬＬ細胞（精製すべき標的細胞）と９０％ＨＵＴ−１０２細胞のそれ ぞれｌ　Ｏ’　／　ｍ　Ｑおよび１０’／ｍα濃度での混合物を７Ｄ４被覆磁性 粒子に加え、室温で２０分間インキュベートした。粒子と付着した細胞を磁石で 保持させて、非付着細胞を洗浄した。

付着細胞を室温で２時間放置して粒子から自然脱著によって除去した。脱著した 細胞を集め、新たなｍＡｂ被覆粒子とともに室温で２０分間再懸濁した。

精製された付着細胞を、限界希釈法および流動細胞計測法で分析した。流動細胞 計測法ではＣＴＬＬ細胞９９％以上を示し、一方、限界希釈法ではＣＴＬＬ細胞 の純度は９９．９７％以上を示した。

実施例　６ 向流方法 実施例５に上述した多段法ではきわめて高純度が達成されたが収率は低い。多段 陽性選択を多段除去と組合せることにより、高純度と高収率の両者を達成するこ とがテキる。１０％ＣＴＩ、Ｌ細胞を９０％Ｈ［ｌＴ−１０２１ｍ胞を、１５％ 　ＦＢＳ含有１ｓｃｏｖｅ培地中、それぞれ濃度が１０″／ｒｔｒＱおよび１０ ’／ｍ（２になるように混合した。この混合物を、実施例１に記載したように培 養皿の底部に適当なｍＡｂ捕捉試薬を付着したペトリ皿に注ぎ、室温で１時間イ ンキュベートした。

非付着細胞はメジウムに再懸濁し、新たなｍＡｂ被覆被覆性いだ。両培養皿から の付着細胞を掻取り、再懸濁し、ついで第三のｍＡｂ被覆被覆性いだ。最終の付 着細胞を除去し、流動細胞計測法および限界希釈法で分析した。第一の培養皿へ の付着体は５８％ＣＴＬＬ細胞を含み、収率は５０％、第一の培養皿の非付着細 胞は２％ＣＴＬＬ細胞を含み、収率は約５０％であった。第二の培養皿からの付 着体は１５％ＣＴＬＬ細胞を含み収率は６０％であった。第三の培養皿からの付 着体は８０％のＣＴＬＬ細胞を含み、総数率は４０％であった。向流処理を行わ ない相当する２段過程ではＣＴＬＬ純度８６％、収率２５％が得られた。

精製細胞 枯渇細胞混合物 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２６２９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）所望の細胞に高いアフイニティーを有するリガンドがその上に固定化されて いる複数個の表面を用い、第一のメジウム中の細胞混合物から所望の細胞を分離 することにより所望の細胞の高純度分画を得るアフィニティー法において、 （ａ）細胞混合物を第一のメジウムとともに表面のひとつと接触させて所望の細 胞の一部をその表面に結合させ、 （ｂ）非結合細胞と第一のメジウムを結合細胞から分離し、 （ｃ）結合した細胞を上記表面から除去して第二のメジウムに再懸濁させ、 （ｄ）表面の異なるひとつと第二のメジウムを接触させて上述の除去した細胞の 一部をその表面に結合させ、 （８）非結合細胞と第二のメジウムを上述の異なる表面から分離し、 （ｆ）工程（ｄ）の結合細胞を異なる表面から除去して所望細胞の高純度の分画 を与える各工程からなる方法。 ２）工程（ｆ）の除去細胞を第三のメジウムに再懸濁し、工程（ｆ）の除去細胞 と第三の表面を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を反復する付加工程を包含する請 求項１記載の方法。 ３）表面はそれぞれ異なる容器の底部である請求項２記載の方法。 ４）表面はそれぞれ異なる容器の底部である請求項１記載の方法。 ５）表面は磁性粒子の表面であり、非結合細胞およびメジウムはそれから磁性粒 子を分離することによって結合細胞から分離し、結合細胞は磁性粒子から脱着さ せ、脱着した細胞を異なるメジウム中に新たなリガンド固定化磁性粒子とともに 再懸濁する請求項２記載の方法。 ６）表面は磁性粒子の表面であり、非待合細胞およびメジウムはそれから磁性粒 子を分離することによって結合細胞から分離し、結合細胞は磁性粒子から脱着さ せ、脱着した細胞を異なるメジウム中に新たなリガンド固定化磁性粒子とともに 再懸濁する請求項１記載の方法。 ７）各接触工程からの非結合および結合細胞の両者を別個に再懸濁し、結合分画 中の望ましくない細胞の数および非結合分画中の所望の細胞の数が予め定められ た低値に到達するまで向流様式で付加的なアフィニティー被覆表面との接触を行 う請求項１記載の方法。 ８）各接触工程からの非結合および結合細胞の両者を別個に再懸濁し、結合分画 中の望ましくない細胞の数および非結合分画中の所望の細胞の数が予め定められ た底値に到達するまで向流様式で付加的なアフィニティ−被覆表面との接触を行 う請求項２記載の方法。 ９）表面はローラー瓶の内壁である請求項２記載の方法。 １０）表面はローラー瓶の内壁である請求項１記載の方法。 １１）所望の細胞に対してそれぞれ異なるアフイニティーを有する異なるリガン ドがそれぞれの表面上に固定化されている請求項１記載の方法。 １２）所望の細胞に高いアフィニティーを有するリガンドがその上に固定化され ている複数個の表面を用い、第一のメジウム中の細胞混合物から所望の細胞を分 離することにより所望の細胞の高純度の分画を得るアフィニティー法において、 メジウムを第一の意味で流動させ、表面を提供する粒子をメジウム中に導入し、 粒子は第一の意味と逆の第二の意味で移動するようなメジウムに対する比重を有 し、細胞混合物は流動するメジウムの中間部分に導入し、メジウムの流れの下流 末端で望ましくない細胞とメジウムを排出させ、メジウムの流れの上流末端で粒 子とそれに結合した所望の細胞を排出させる 各工程からなる方法。 １３）粒子はメジウムより大きい密度をもち、流液は上方に流される請求項１２ 記載の方法。 １４）粒子はメジウムより小さい密度をもち、流液は下方に流される請求項１２ 記載の方法。 １５）所望の細胞に高いアフィニティーを有するリガンドがその上に固定化され ている複数個の表面を用い、第一のメジウム中の細胞混合物から所望の細胞を分 離することにより所望の細胞の高純度分画を得るアフィニティー法において、 （ａ）細胞混合物を第一のメジウムとともに表面のひとつと接触させて所望の細 胞の一部をその表面に結合させ、 （ｂ）第一の表面からの非結合細胞を第二の表面と接触させ、 （ｃ）第一の表面からの結合細胞を第三の表面と接触させ、 （ｅ）第二の表面からの結合細胞と第三の表面からの非結合細胞を第五の表面に 接触させ、 （ｆ）第三の表面からの結合細胞を第六の表面に接触させ、 （ｈ）第五の表面からの結合細胞と第六の表面からの非結合細胞を第七の表面に 接触させ、 （ｉ）第七の表面からの結合細胞を第八の表面と接触させ、ついで （ｊ）第六および第八の表面からの結合細胞を除去して、高純度、高収率の所望 の細胞を得る方法。