KR100223381B1

KR100223381B1 - 항체 생성방법

Info

Publication number: KR100223381B1
Application number: KR1019910021837A
Authority: KR
Inventors: 페트루스게라르두스안토니우스스텐바커스
Original assignee: 에프.쥐.엠.헤르만스; 악조 엔.브이.
Priority date: 1990-11-26
Filing date: 1991-11-26
Publication date: 1999-10-15
Anticipated expiration: 2011-11-26
Also published as: NZ240748A; GR3024487T3; EP0488470B1; ES2103770T3; ATE153695T1; DE69126281T2; EP0488470A1; CA2056102A1; DE69126281D1; JPH0576383A; JP3392883B2; AU8817391A; DK0488470T3; ZA919299B; CA2056102C; AU646108B2; KR920009987A

Abstract

본 발명은 단일 클론항체를 생성하기 위한 신규의 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 B-임파구의 클론 확장 단계를 포함하며 상기 단계에 선행 또는 후행하여, 목적하는 특이성을 같는 항체를 생성하는 B-임파구의 선택단계를 포함한다. 선택된 임파구는 영구화된다. 본 발명은 그 크기에 상관없이 임의의 B-임파구를 공급원으로 사용할 수 있다.

Description

항체 생성 방법

본 발명은 단일클론 항체의 생성방법에 관한 것이다. Kohler 및 Milstein(1975)(1)에 의해 제시된 바와 같이, 단일클론 항체를 생성하기 위한 표준 방법은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 존재하에서 감작된(sensitized) 쥐(murine)의 비장세포를 쥐의 골수종 세포와 융합시키는 과정을 포함한다. 그러나 이러한 방법은 다소 비효율적이다. 통상, 이러한 경우, 2×10⁵개의 비장 세포중 단지 하나의 B-세포만이 골수종 세포와 성공적으로 융합하여 안정한 성장 하이브리도마를 생성하게 된다. 이는 세포의 99.9995%가 상실되었음을 의미하는 것이다.

PEG-유발 세포 융합방법에 대한 효율적인 대안으로서, Zimmermann 및 그 공동연구자들(1982)(2)은 전기융합방법(electrofusion)을 도입했다. 이러한 방법은, 최근 쥐 및 사람에서 기원한 항체 생성 하이브리도마를 산출하기 위하여 더많이 연구되고 있다. 상기 방법은, 교류 전기장(유전기영동 : dielectrophoresis)하에서 두 세포간의 막을 인접시킬 수 있다는 관찰에 근거한 것이다. 이어서 강도가 큰 전기장의 펄스에 잠시 노출시키면 세포막은 일시적인 투과성을 나타내게 된다. 짧은 펄스가 통과된 후 교류 전기장내의 세포는 다시 봉합된다. 세포가 봉합되어지는 동안 서로 인접한 세포사이에는 세포질 브릿지(cytoplasmic bridge)가 형성되어 세포가 서로 융합하게 된다. 전기 융합의 빈도는 1:2000 에 달하는 것으로 보고되고 있다(3).

임파절 세포 또는 말초 혈구와의 융합은 한정된 수의 하이브리도마만을 생성하거나 또는 전혀 하이브리도마를 생성해낼 수 없기 때문에, 비장 세포만이 B-세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 시험관내 면역화 또는 선택 실험으로부터도 제한된 수의 세포가 생성된다.

단일클론 항체를 생성하기 위한 또다른 방법은 Ig- 유전자에 대한 PCR 방법을 포함한다. 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 기술(4)은 소정의 DNA 단편을 시험관내에서 특이적으로 증폭시키는데 이용되어 왔다. 상기 방법은 증폭되어질 유전자의 각 말단영역에 대한 2개의 특이적 프라이머로부터 수회 반복적으로 신장되어지는 과정을 포함한다. 최근에 있어서는, 하이브리도마 세포에서 유래한 mRNA를 출발물질로서 이용하여 재배열된 면역글로불린 변이 유전자 단편을 증폭시키는 데에 상기 기술이 이용되고 있다(5). Ig 분자계의 다양성으로 인해 비보편적이고 특이적인 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 이유에서 Larrick 등(6, 7, 8)은 사람의 H쇄(heavy chain)와 L쇄(Light chain)의 공지된 리더서열 및 인간 면역글로불린 불변영역(constant region)의 N-말단부에 상응하는 서열로부터 올리고뉴클레오티드 프라이머의 축퇴(degenerate) 혼합물을 고안했다. 동일한 방법이 마우스 면역글로불린 서열에 대해서도 실시되었다(Le Boeuf 등(9)). 그 결과, 사람 또는 쥐의 임의의 면역글로불린의 H쇄 및 L쇄의 가변영역(variable region) 서열의 증폭, 서열분석 및 발현이 가능하게 되었다. 그러나 포유류세포에서 완전한 Ig 유전자를 클로닝하기 위해 이용되는 PCR 방법은 다수의 항체 생성 세포주를 생산하는데는 적합하지 않을 것이다. 이는 하이브리도마의 생성과는 달리 포유류 세포주에서의 Ig의 발현은 매우 까다롭기 때문이다. 따라서, 포유류 세포주에서 발현될 수 있는 소수의 항체만을 선택하기 위해서는 상기 항체에 대한 많은 정보가 요구된다. 비교적 간단한 이.콜리(E. coli) 발현 시스템내에서 Ig를 발현시키는 것도 가능하다. Ward 등(10)은 우수한 항원-결합 친화력을 갖는 VH 도메인(단일 도메인 항체, dAbs)의 이.콜리 내에서의 발현 및 분비에 대하여 보고하였다. Fv 단편의 이.콜리내 발현에 대한 보다 유망한 보고도 있다(11, 12). Skerra 등(11)은 이.콜리에서 발현되는 VH 및 VL이 본래의 항체와 동일한 친화력을 갖는 완전한 기능적 이량체(functional dimer. Fr)로 결합될 수 있음을 보고하였다. 후자의 두 기술은 다수의 '항체'를 생성시킬 수 있고, 그러므로 안정한 '항체'를 생산하는 박테리아 클론상에서 보다 후기의 단계에서 선별을 수행할 수 있다. 관심의 대상이 되는 항체를 추가로 조작하여 완전한 항체로 제조하거나, 또는 '항체' -HRP 접합체와 같이 목적하는 특성을 갖는 융합 단백질로 제조할 수 있다. 단일 세포로부터 Ig를 암호화하는 mRNA를 분리 및 증폭시키는 방법도 보고되었다(13, 14). 그러나, PCR 기술의 출발점은 통상 하이브리도마이며, 따라서 융합 기술에서와 동일한 문제점, 즉 비장 세포만을 사용할 수 있다는 문제점이 이 방법에서도 적용된다.

항체 생성 세포를 얻기 위한 또다른 방법은 B-세포의 클론 확장(clonal expansion)에 의한 것이다. B-세포를 클로닝할 수 있는 시스템은 주로 LPS(사람의 B-세포에 대해서는 작용하지 않으며 쥐의 B-세포에 대해서만 작용), 또는 완전한, 클로닝된 동종반응성(alloreactive) T-헬퍼 세포로의 B-세포 자극에 기초하여 왔다. 최근, Zubler 등(15, 16, 17, 18)은 사람 및/또는 쥐의 B-세포를 T-세포와 무관한 방식으로 클론 활성화할 수 있는 배양 시스템을 보고한 바 있다. 상기 시스템은 증식 및 분화 인자의 공급원으로서 사람의 T-세포/대식세포 상청액과 함께, 방사선 조사된 쥐의 돌연변이체 EL-4 흉선종 세포(EL-4/B5)를 사용하고 있다. 상기 EL-4/B5 세포는 MHC-비제한적이고 직접적인 세포-세포 상호작용을 통하여 B-세포를 활성화시킨다. 활성화 신호 자체가 분열을 촉진하지는 않지만 B-세포를 감작화하여 사람의 T-세포 상청액에 존재하는 하나(IL-2) 또는 몇개의 시토킨에 반응하게 한다. 사람의 말초혈 또는 비장에서 유래한 B-세포의 90%는 활성화되며 10일간 반응시키는 동안 평균 380개의 항체를 분비하는 세포의 단기간 클론을 생성하게 된다(15). 클론당 분비되는 평균 Ig의 양은 40ng이며 각 클론은 IgM, IgG, IgA, IgM ＋ IgG 또는 IgM ＋ IgG ＋ IgA를 생성하는데 이것은 Ig 부류의 스위치(switch)가 일어난다는 것을 보여준다.

그러나 상기 언급된 기술중 어느 것에 의해서도, 동물 또는 사람에서 연유한 임파절 또는 말초형과 같은 임의의 공급원으로부터 목적하는 특이성을 갖는 단일클론 항체를 생성하는 안정한 세포주를 얻을 수는 없다. 임파절 세포 또는 말초혈관 세포의 융합은 비장 세포와 비교하여 다른 특이성, 친화성 및 동형(isotype)을 갖는 항체를 생성하며 따라서 종래의 방법에 의해 수득되는 항체에 유용한 항체를 첨가시키는 결과를 초래한다. 또 말초혈관 세포의 융합은 하나의 실험동물에 대한 장기간에 걸친 면역반응을 연구할 수 있는 계기를 제공할 것이다.

동물에서 유래한 단일클론 항체 이외에, 사람에서 유래한 항체에 대해서도 하기 몇가지 이유때문에 관심의 대상이 되고 있다 :

(i) 치료학적인 면에서 볼 때, 사람의 항-마우스 반응으로 인해 쥐의 단일클론 항체는 환자에게 유해하게 되었다(19, 20). 사람의 단일클론 항체는 사람에서는 그 면역원성이 감소되거나 또는 나타나지 않을 것이다.

(ii) 사람의 게놈은 항체의 또다른 목록을 나타낼 수도 있으며, 이것은 결국 다른 특이성을 갖는 단일클론 항체를 생성시킬 수 있다.

(iii) 면역불임성 공여자(immunoinfertile donor), 자가면역성 질병을 가진 공여자, 또는 항-종양 항체를 갖는 공여자와 같은 개체는 관심의 대상이 되는 특이성을 갖는 항체를 생산한다.

많은 연구자들이 최근 몇 년 동안(21, 22) 사람의 단일클론 항체의 개발에 대해 발표하였으나, 사람의 단일 클론 항체의 생성에 따르는 문제점들이 현재 까지도 미해결 상태로 남아 있다. 사람의 단일클론 항체 개발에서 흔한 문제점은 면역화반응이 도덕적인 이유로 허용되지 않는다는 점이다. 결과적으로 거의 자연발생적인 항원에 대한 항체만이 분리된 사람의 임파구로부터 개발될 수 있다. 항원특이 B-임파구의 빈도수는 종종 매우 낮을 것이다. 사람 임파구를 사용한 시험관내 면역화 실험의 결과는 매우 불량하였으며 현재까지도 재현성이 없다(23, 24). 최근들어, 사람 단일클론 항체의 제조는 주로 2가지 방법으로 압축되었다 :

i) 쥐, 사람 및 쥐 × 사람 기원의 골수종 세포와 임파구의 융합 및

ii) 엡스타인-바르 바이러스(EBV)를 통한 임파구의 바이러스성 형질전환.

PEG 융합방법 고유의 낮은 융합 빈도수 이외에도, 사람의 임파구와의 융합은 최적의 융합 파트너가 아직 발견되지 않았기 때문에 제한된다. 따라서 지금까지 제조된 대부분의 사람 항체 생산성 하이브리도마는 성장 및 항체 생성면에서 불안정한 것으로 밝혀졌다. 상술한 영구화(immortalization)에 대한 낮은 빈도수와는 대조적으로, 사람 B-임파구는 EBV에 의해 매우 효율적으로 영구화된다. 그러나 이러한 시스템에서, 영구화는 주로 IgM 종류인 단일클론 항체를 생성시키는 B-세포의 서브세트에 국한된다. 게다가, EBV-형질전환체의 일부분은 성장이 불량하고 골수종 세포와 EBV-형질전환체를 융합시키려는 시도는 생성된 세포주의 안정성과 관련된 문제점으로 인해 종종 실패했다.

본 발명은 공여자(donor)로부터 B-임파구를 채취하고, 상기 B-임파구를 클론확장(clonal expansion)시키며, 생성된 임파구를 영구화시키고, 생성된 세포를 배양한후 배양 배지로부터 단일클론 항체를 분리해내는 것을 포함하는 단일클론 항체 생산방법에 관한 것이다. (전기)융합 또는 영구화를 위한 중간체로서, 세포군은 특이항체 생성세포로 농축시킬 수 있다. 따라서, 하나 내지 몇 개의 특이항체 분비 B-세포로부터 하이브리도마를 개발하는 것이 가능할 수 있다.

본 발명의 또 하나의 양태에서는, 공여자로부터 B-임파구를 채취하고, B-임파구를 클론확장시키며, 상기 확장된 세포로부터 mRNA를 분리한 후 상기 mRNA(cDNA로서)를 증폭시키고 적당한 숙주내에서 상기 cDNA를 발현시키는 것을 포함하는 단일클론 항체 생산방법을 제공한다. PCR-방법의 중간체로서 B세포를 확장시킬 수 있다. 이것은, (i) 일부 배양 상청액이 제조될 항체에 대한 정보를 보다 많이 획득하는데 이용될 것이고, (ii) 상청액은 PCR 프라이머의 정확한 세트를 선택하기 위해 Ig 종류(H＋L)를 결정하는 데에 이용될 것이며, (iii) 보다 많은 세포가 mRNA 분리에 이용될 것이기 때문에, 직접적인 PCR 방법보다 많은 잇점을 제공한다.

상기 방법은 클론 확장 및 영구화 또는 증폭 단계 이전에 항체 생성 임파구에 대한 선별 단계를 포함하는 것이 바람직하다(목적하는 특이성을 지닌 항체를 선별하는 것이 보다 바람직하다). 또한 선별 단계는 클론 확장후에도 수행할 수 있다.

본 방법의 중요한 잇점은 클론 확장과 영구화 방법의 결합, 또는 선택적으로는 클론 확장과 증폭 기술 및 재조합 DNA 방법의 결합에 있다.

클론확장 기술을 통해 하나 내지 몇 개의 B-임파구로부터 융합 또는 형질전환, 또는 mRNA의 분리를 할 수 있는 만큼 충분한 B-임파구를 제조할 수 있다. 하나로부터 5백개에 이르는 임파구를 증식시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 사용하여 항체 생성세포를 모든 가능한 임파구 공급원으로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 또다른 잇점은 항체 생성 임파구를 미리 선별한다는 점이다. 매우 잘 반응하는 개체의 경우에서도, 임파구의 소량의 분획만이 목적하는 특이성을 지닌 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 영구화 기술이 보다 효율적일 경우, 감작세포를 최적 사용하기 위해서나 전기융합, B-세포의 클론확장, 또는 단일 또는 확장된 B-세포에 대한 PCR-기술로부터 생성되는 다수의 상청액에 대한 성가신 스크리닝 작업을 피하기 위해, 항체 생성 B-세포를 미리 선택할 필요성이 있을 것이다. 패닝(panning), 로세팅(rosetting) 및 형광 활성화 세포 분류방식(FACS)과 같은 특이적 선별 기술은 널리 개시되어 있으나 선별된 세포가 융합 또는 배양에 사용될 수 있는지에 대해서는 거의 알려진 바 없다. 이러한 점에서, 최근 개발된, 비독성, 상자성(常磁性) 면역비드(immunobead)는 매우 유망한 것 같다. 상자성 비드를 사용하여 선별한 후에, 하이브리도마 세포는 비드와 세포의 분리없이 성공적으로 클로닝 및 계대배양될 수 있음이 밝혀졌다(25). 이 기술은 본 발명의 예비선별 단계로서 사용하는데 매우 적합하다. 패닝(panning)으로 불리는 예비선별 기술도 매우 유용하다. 전기융합과 함께 클론확장은 예비선별된 특이 B-세포를 융합할 수 있는 가능성을 제공한다. 따라서 특이 하이브리도마의 수치는 음성 클론의 성가신 테스트 없이도 상당히 증가될 수 있다. 결과적으로 목적하는 특성(에피토프 특이성, 친화성, 부류 및 아부류)을 지닌 항체는 매우 특수한 것을 발견할 기회를 증가시키는 다수의 항체로부터 선별할 수 있다. 전기융합과 함께 사용하는 클론확장법은 임파절, 안와천공(orbita punction) 혈액 샘플 및 시험관내 면역화 실험으로부터 획득된 소수의 임파구를 융합시키는데 사용할 수 있다. 임파절 세포의 융합은 Mirza 등의 문헌(26)에 제시되었던 것보다 항체 특이성의 범위를 보다 광범위하게 하며 감작된 특이 B-세포의 수를 증가시킬 수 있다. 면역반응은 동일한 실험용 동물에서 보다 긴 시간 동안 실시될 수 있기 때문에, 말초혈관 임파구의 융합은 부가적인 잇점을 제공한다. 활성화된 세포는 확장된 세포부피를 가진다. 전기융합에서는 보다 큰 세포가 융합되는 것이 바람직한 데, 그 이유는 이들 세포가 골수종 세포와 비교시 막 파열 전위차가 보다 작기 때문이다. 따라서 항원-자극된, 친화도가 성숙된 B-세포/혈장 세포를 융합시키는 것이 바람직하다. 이에 따른 결과로서 보다 높은 친화성을 가진 항체가 생성될 수 있다. B-세포의 클론확장과 전기융합을 결합시킴으로써 단일 B-세포로부터 하이브리도마 세포주를 생성시킬 수 있는 능력을 지닌 단일클론 항체 개발을 위한 신규 방법이 제공된다. 이런 점에서 볼 때, 상기 방법은 최소한 Ig 유전자에 대한 PCR 기술에 필적할 만하다. 또한 친화도면에서 성숙된 항체를 생성시키는 잇점이 있다. EL-4/B-세포 배양계가 종특이성이 없는 것으로 나타났기 때문에(쥐 및 사람 B-세포가 확장될 수 있음), 다른 종의 임파구도 역시 배양할 수 있을 것으로 기대된다. 전기융합법, Ig 유전자용 PCR-기술 및 이들 기술과 B-세포의 클론확장법의 결합방법은 사람 단일클론 항체의 생성시 EBV 형질전환의 선별성에 대한 문제점(주로 IgM 항체)을 피해갈 수 있다.

본 발명은 하기 실험부분에서 보다 상세히 설명될 것이다.

[실험]

[재료 및 방법]

[시약]

-동량의 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM, Gibco 074-2100)와 영양성분 혼합물 F12(HAM의 F12, Gibco 074-1700)를 혼합하고, 이 혼합물에 2500㎖/ℓ의 중탄산 나트륨(Baker), 55mg/ℓ의 피루브산 나트륨(Fluka), 2.3mg/ℓ의 2-메르캅토에탄올(Baker), 1.22mg/ℓ의 에탄올아민(Baker), 360mg/ℓ의 L-글루타민(Merck), 4.5×10^-4mg/ℓ의 나트륨 셀레나이트(Fluka), 62.5mg/ℓ의 나트륨 페니실린(Mycopharm)과 62.5mg/ℓ의 스트렙토마이신 설페이트(Serva)를 보충하여 배양배지 DMEM/HAM의 F12를 제조했다.

융합 실험에서는 상기 배지에 13.61mg/ℓ의 히포크산틴(Fluka)과 3.83mg/ℓ의 티미딘(Fluka)을 추가 보충시켰다. 이 배지는 DMEM/HAM의 F12/HT로 나타낸다.

하이브리도마의 선별단계는 사람 방광암 세포주 T24(T24CM)의 상청액과 0.4μM 아미노프테린(Flow)을 함유한 1%의 I1-6을 보충한 DMEM/HAM의 F12/HT 중에서 실시되었다.

-융합 배지 ; 280mM 이노시톨(ICN), 0.1mM 칼슘 아세테이트(Baker), 0.5mM 마그네슘 아세테이트(Baker)와 1mM 히스티딘(Fluka); 비저항: 1.11×10⁴Ωcm. 성분들을 밀리(Milli)-Q 물에 용해시킨 후, 1mM 칼슘 아세테이트와 5mM 마그네슘 아세테이트를 함유한 용액 또는 밀리-Q 물을 사용해 전도율을 90㎲/cm로 조절했다.

-프로나제(Pronase) 용액은 DMEM/HAM의 F12 중에 0.5mg/㎖의 프로나제(Calbiochem)를 용해시켜 제조했다.

-퍼콜(Percoll) 밀도 구배 배지(Pharmacia)는 9부의 퍼콜에 1.5M NaCl 1부를 가하여 등삼투성이(iso-osmotic) 되도록 했다(100% SIP). 이 등삼투성 퍼콜 원액을 배양 배지로 희석해 밀도를 낮게 조절했다.

[세포배양]

돌연변이 EL-4 흉선종 세포인 EL-4/B5(스위스연방, 제네바, Dr R. Zubler에게서 입수함)를 10% FCS (Bocknek)가 보충된 DMEM/HAM의 F12 중에서 1×10⁴내지 1×10⁶c/㎖ 사이의 세포 농도로 통상적으로 배양했다. 만일 세포가 1×10⁶c/㎖ 이상 증식하면, 세포는 그의 B-세포 자극 활성을 상실할 수 있다.

쥐 골수종 세포 NS-1 또는 제노하이브리드(xenohybrids) K6H6B5와 PAI-1이 각각 쥐 및 사람 B-세포에 대한 융합 쌍(fusion partner)으로 사용되었다. 세포는 10% FCS가 보충된 DMEM/HAM의 F12/HT 중에서 5×10⁴내지 15×10⁵세포/㎖의 세포농도로 통상적으로 배양했다. 융합 1일전, 배양물을 1:3으로 나누어 융합 당일에 로그기(log-phase)의 배양물을 얻었다.

[쥐의 비장세포 제조]

최종 면역화 이후, 마우스를 치사시키고, 그들의 비장을 제거했다. 세포를 DMEM/HAM의 F12 내로 가늘게 찢고, 덩어리는 16 게이지 니들(16 gauge needle)을 통해 부드럽게 흡기하여 파괴시켰다. 세포 현탁액은 2000N/kg에서 10분간 원심분리하고, 펠릿은 0.16M NH₄Cl 및 0.01M KHCO₃를 함유하는 용액중에 재현탁시켜 적혈구를 용해시켰다. 세포 현탁액을 다시 원심분리하고, 최종적으로 배양 배지중에 재현탁시켰다.

[말초혈액 세포의 분리]

사람 백혈구는 반 밀(Van Meal)(1985)에 의해 개시된 방법대로 등장성 덱스트란 용액중에서 적혈구를 팽창파열시켜 분리했다. 이어서 백혈구를 10% FCS가 보충된 DMEM/HAM의 F12 중에서 현탁시키고, 폴리스티렌 배양 플라스크내 37℃에서 1시간 동안 배양하여 단핵세포(monocyte)를 제거했다. 이때 항-CD2 단일클론 항체로 피복된 상자성 폴리스티렌 비드(Dynal lll.01)와 함께 2회 연속 항온배양함으로써 T-세포를 고갈시켰다. CD2 양성 세포를 완전히 고갈시키기 위해, 세정한 면역비드 및 단핵세포가 제거된 PBL을 40:1의 비율로 혼합시켰다. 비드와 세포의 혼합물을 매 10분마다 부드럽게 혼합하면서 2-4℃에서 30분간 항온배양했다. 그후 로젯형 세포(rosetted cell)는 상기 시험 튜브의 벽면에 자기 장치를 위치시키고 상청액을 제거함으로써 분리했다.

쥐의 PBL을 분리하기 위해, 안와 천공에 의해 100㎕의 혈액을 채취한 직후, 30Iu/㎖의 리튬 헤파린을 함유하는 100㎕ 인산염 완충 염수(PBS)로 희석하였다. 그후 상기 희석 혈액을 작은 모세관내 700㎕의 림포파크(Lymphopaque, Nyegaard Co 제품)상에 조심스럽게 적층시켰다. 상기 모세관은 4000N/kg에서 30분간 원심분리시킨 후, 중간기층(interphase layer)을 수거했다. 최종적으로 상기 세포를 배양배지로 2회 세척하여 혈소판을 제거했다.

[사람 T-세포/대식세포 상청액(TSN)의 제조]

새롭게 분리된 단핵세포들을 2000N/kg에서 10분간 원심분리했다. 그후 B- 및 T-세포들을 구티에레즈(Gutierrez) 등(1979)에 의해 개시된 방법의 변형법에 따라 분리했다. 펠릿은 5㎖의 100% SIP중에 재현탁시켰다. 100% SIP 층상에 10㎖의 70% SIP층과 그에 이어 25㎖의 50% SIP층을 적층시켰다. 이 구배물은 25,000N/kg에서 10분간 원심분리시켰다. 70%와 50% SIP 사이의 계면부에 남아있는 T-세포 농축 분획을 수거하고, 10% FCS가 보충된 DMEM/HAM의 F12로 2회 세척했다. 세척한 세포들은 10% FSC, 5㎍/㎖의 PHA(Wellcome)과 10ng/㎖의 PMA(sigma)가 보충된 DMEM/HAM의 F12 중에서 40-45시간 동안 자극시켰다. 최종적으로 상청액을 수거하여, 0.2㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과시킨후 -70℃에서 부분액으로 나누어 보관했다.

[EL-4/B-세포 배양물]

EL-4/B-세포 배0양물은 주블러(Zubler) 등(12-15)에 의해 개시된대로 제조했다. 간단히 설명하면, 미정제 또는 정제된 B-세포를 96-웰의 편평한 바닥을 갖는 조직배양 평판 내에서 10% FSC가 보충된 200㎕의 DMEM/HAM의 F12 중에서 조사된 (2500 RAD) 50,000 EL-4/B5-세포 및 TSN과 혼합했다. TSN의 최적량은 각 배치당 적정법에 의해 결정되었다. 통상 사람 B-세포의 최적자극을 위해서는 10% TSN이면 충분한 반면, 쥐의 B-세포에 대해서는 통상 20% TSN이 필요하다.

배양물은 5% CO₂및 100% 습도하에 37℃에서 항온배양되었다. 8일 내지 12일 사이에, 면역글로불린 생성에 대해 상청액을 시험했다.

[소형 전기융합(mini electrofusion)]

각각의 EL-4/B-세포 배양물의 내용물을 2㎖ 원심분리 튜브중에서 10⁶골수종 세포와 혼합했다. 세포는 DMEM/HAM의 F12/HT로 1회 세척함으로써 무혈청 상태로 만들었다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 37℃의 DMEM/HAM의 F12/HT 1㎖ 중에 재현탁시키고, 130㎕ 프로나제 용액을 첨가했다. 세포 현탁액을 3분간 프로나제와 함께 항온배양한 후, 200㎕의 FCS를 가해 효소 반응을 종료시켰다. 그후 세포를 융합배지로 1회 세척하고 실온에서 최종 부피 50㎕인 융합배지중에 재현탁시켰다. 완전한 세포 현탁액을 융합 챔버의 내부 공간내로 피펫팅(pipetting)했다. 상기 챔버는 퍼스펙스(perspex) 박스 내에 매립된 디스크 모양의 2개의 스테인레스 스틸 전극들로 구성되어 있다. 상기 전극들은 직경이 다양하고 0.50mm 두께를 갖는 테플론 스페이서에 의해 분리되어 있다. 상기 융합 챔버내의 세포의 정렬은 30초간 2MHz와 400V/cm의 교류 전기장에 의해 유도되었다. 그후 즉시 3kV/cm의 평방 고전기장 펄스를 10㎲동안 적용시켜 세포막을 파열시켰다. 상기 교류 전기장을 다시 30초간 적용시켜 세포를 혼합하고 멤브레인을 재봉합(resealing)시켰다. 최종적으로 융합 챔버의 내용물을 20㎖의 선별 배지에 옮기고, 96-웰 마이크로배양 평판에 도말하였다. 14일째 배양물을 하이브리도마 증식에 대해 검사하고, 상청액은 면역 글로블린이 생산되었는 지에 대해 시험했다.

[효소 면역분석법]

사람 Ig의 측정은 염소 항-사람 Ig 피복 평판과 HRP-표지된 염소 항-사람 Ig 이차 항체를 사용하여 표준 샌드위치 ELISA법으로 실시했다. 쥐의 Ig는 양의 항-마우스 항체를 이용한 유사한 ELISA법으로 측정했다. 쥐의 항-HIV 항체를 검출하기 위해, HIV 비루스 용해물로 피복된 평판을 HRP-표지된 양의 항-마우스 Ig와 함께 사용했다. 사람의 항-풍진(rubella) 항체는 염소의 항-사람 Ig를 포획 항체로 사용하고 쥐의 단일클론 항-풍진-HRP에 결합된 풍진 항원을 함께 사용하여 이중 샌드위치 ELISA법으로 검출했다.

[패닝 과정 (Panning Procedure)]

6-웰 배양 평판에 0.05M 탄산나트륨 완충액 pH 9.6 중에 1 내지 10㎍의 항원을 함유하는 용액 4㎖/웰을 가해 밤새 배양했다. 그후 상기 웰을 PBS로 세척하고, 바로 패닝 실험에 사용하거나, -20℃에서 보관했다. 패닝단계는 단핵세포가 제거된 쥐의 비장세포 또는 사람 단핵세포를 항원이 피복된 웰상에서 1 내지 2시간 동안 37℃, 5% CO₂및 100% 습도 조건하에 항온배양함으로써 실시되었다. 이와 같이 배양한 후, 부착되지 않은 세포는 PBS로 3회 연속 세척하여 부드럽게 제거했다. 항원이 결합된 특이 B-세포들은 각 웰을 1.1mM Na₂EDTA와 0.05% 트립신(Flow, cat No. 16-893-49)을 함유한 pH=7.5의 250㎕ PBS와 함께 2분간 항온배양함으로써 회수되었다. 트립신 처리는 10% FCS가 보충된 5㎖의 DMEM/HAM의 F12를 가함으로써 정지시켰다. 최종적으로 웰의 전체 표면을 파스퇴르 피펫을 사용해 상기 배지로 수세(flushing)하여 남은 부착된 B-세포들을 기계적으로 제거했다.

[결과]

- 쥐의 B-세포의 영구화(immortalization)

두가지의 독립적인 실험에서, EL-4/B-세포 배양물을 50, 10 또는 2 세포/웰의 접종 밀도로 쥐의 비장세포 또는 단핵성 말초혈구로 접종했다. 배양물의 상청액을 쥐의 B-세포의 성장을 나타내는 쥐 Ig의 존재에 대하여 시험(8-11일)했다. 표 1은 2개의 비장세포로 접종된 배양물의 약 50% 및 2개의 단핵성 말초 혈구로 접종된 배양물의 약 20%에서 B-세포가 성장되었음을 나타낸다.

12개의 배양물 각각을 NS-1 골수종 세포와 소형 전기융합시켜 B-세포 배양물에 존재하는 소수의 B-세포로부터 항체 생성 하이브리도마를 생성시킬 수 있는지를 조사했다. 표 II는 다수의 항체 생성 하이브리도마가 12개의 융합시험중 11개에서 생성되었음을 나타낸다.

본 발명자들은 항원 특이성 하이브리도마를 개발할 수 있는지에 대해 조사했다. 따라서, 비장 세포와 말초 단핵혈구를 HIV 바이러스 용해물로 면역화한 마우스로부터 분리했다. 9일후에, 배양물을 세포성장에 대해 시험하고 상청액을 ELISA에 의해 쥐의 면역글로불린과 쥐의 항-HIV에 대해 분석했다. 표 III은 Ig-생성 B-세포의 성장이 2개의 비장세포로 접종된 배양물의 52% 및 4개의 말초혈구로 접종된 배양물의 35%에서 일어났음을 나타낸다. 그러나, 어떠한 항-HIV 생성 웰도 상기 배양물에서 확인되지 않았으며, 보다 높은 접종 밀도로 접종된 배양물에서 3 및 4개의 항-HIV 생성 B-세포 클론이 각각 비장 및 PBL 배양물에서 확인되었다. 모든 항-HIV 생성 배양물 각각을 NS-1 골수종 세포와 소형 전기융합시켜 항-HIV B-세포 클론을 계속 성장하는 하이브리도마 세포주로 전환시켰다. 7개의 소형 전기융합중 5개에서, 하나 이상의 항원 특이성 하이브리도마가 생성되었다(표 IV).

2개의 비장 세포 또는 4개의 PBL로 접종된 배양물내의 B-세포 클론은 단일 B-세포로부터 발생되는 것으로 예상되었다. 그러므로, 상기 배양물들에 2개의 부가적인 소형 전기융합을 실시하여 단일 B-세포로 접종된 B-세포 배양물로부터 항체-생성 하이브리도마가 발생가능한가를 조사했다. 상기 융합에 의해 각각 45 및 75개의 Ig-생성 하이브리도마가 생성되었다(결과는 나타내지 않음).

[표 I] 쥐의 B-세포의 성장

쥐의 비장 세포 또는 말초 혈액중의 임파구를 50,000개의 방사선 조사된 EL-4/B5 헬퍼 세포 및 20%의 사람 T-세포 상청액 존재하에 96-웰 배양 평판에서 접종시켰다. 배양 상청액을 8일에서 11일가지 쥐의 Ig에 대해 시험했다.

[표 II] B-세포 배양물의 소형 전기융함

표 1에 기술된 실험에서 얻은 쥐의 B-세포 배양물을 10⁶개의 NS-1 골수종 세포와 혼합했다. 세포를 프로나제-처리시킨 후 최종적으로 융합 배지에 현탁시켰다. 융합후, 세포를 선별배지내의 96-웰 배양평판에 접종시켰다. 융합 9일후, 하이브리도마 성장에 대해 배양물을 조사하고 쥐의 Ig에 대해 상청액을 시험했다.

[표 III] EL-4/B-세포 배양물내의 항-HIV 특이성 쥐의 B-세포의 성장

쥐의 비장세포 또는 말초혈액중의 임파구를 50,000개의 방사선조사(2500 RAD)된 EL-4/B5 헬퍼 세포 및 20%의 사람 T-세포 상청액 존재하에 96-웰 배양평판에 접종시켰다. 9일후, 배양 상청액을 쥐의 Ig 또는 항-HIV 항체에 대해 시험했다.

*) n.t.= 시험하지 않음

[표 IV] 개개의 항-HIV 양성 B-세포 배양물의 소형 전기융합

표 III에 기술된 실험에서 얻은 쥐의 B-세포 배양물을 10⁶개의 NS-1 골수종 세포와 혼합했다. 세포를 프로나제-처리한 후, 최종적으로 융합 배지에 재현탁시켰다. 융합후, 세포를 선별배지내의 96-웰 배양평판에 접종시켰다. 융합 13일후 하이브리도마 성장에 대해 배양물을 조사했고 쥐의 Ig 및 항-HIV에 대해 상청액을 시험했다.

*) n.t.= 시험하지 않음

- 사람 B-세포 영구화

풍진을 앓은 병력이 있는 사람으로부터, 사람 임파구를 재료 및 방법 부분에서 기술한 대로 분리했다. FACS-분석에서는 최종 제제가 약 11%의 B-세포, 4%의 단핵구 및 1%의 T-세포를 함유하는 것으로 나타났다. 상기 세포 군집을 EL-4/B-세포 배양물의 접종에 사용했다. 배양물을 평균 90, 25, 5, 2.5 및 1개의 B-세포/웰을 각각 나타내는 850, 250, 25, 50 및 10 세포/웰로 접종시켰다. 접종 8일후, 사람 Ig을 1개의 B-세포가 접종된 43%의 배양물에서 측정했다. 어떠한 항-풍진 양성 클론도 상기 배양물에서는 검출되지 않았지만, 18개의 항-풍진 양성 클론이 보다 많은 B-세포가 접종된 배양물에서는 확인되었다(표 V). 상기 배양물들을 K6H6B5 또는 PAI-1 골수종 세포와 각각 별도로 소형 전기융합시켰다(표 VI). 모든 융합 실험에서, 다수의 하이브리도마가 생성되었다. 그러나, 단지 소수의 상기 하이브리도마만이 면역글로불린을 생산했다. 초기에는 3개의 융합에서, 항-풍진 양성 하이브리도마가 검출되었다. 하나의 융합에서, 하이브리도마를 증가시켜 안정한 항-풍진 IgG 생성 세포주로 클로닝했다. 또 다른 융합에서는, 2개의 항-풍진 IgM 하이브리도마를 생성하여 이것을 성공적으로 증가시켜 클로닝했다. 3번째의 융합으로부터 항-풍진 양성 클론은 상실되었다. 이들은 아마도 비교적 다수의 비생성 하이브리도마에 의해 과다성장된 것 같다.

[표 V] EL-4/B-세포 배양물중의 사람 항-풍진 B-세포의 성장

단핵구 및 T-세포 고갈 사람 백혈구를 50,000회 조사한 (2500 RAD) EL-4/B5 헬퍼세포 및 20% 사람 T-세포 상청액의 존재하에서 96-웰 배양평판에 접종시켰다. 8일째에, 배양 상청액을 사람 Ig 및 사람 항-풍진 항체를 시험하였다.

[표 VI] 각 사람 B-세포 배양물의 소형 전기융합

표 V에서 설명한 실험으로부터 얻은 사람 B-세포 배양물을 10⁶K6H6B5 또는 10⁶PAI-1 골수종 세포와 혼합하였다. 세포를 프로나제로 처리하고 최종적으로 융합배지에 재현탁시켰다. 융합후, 세포를 선별배지중에서 96-웰 배양평판에 접종시켰다. 융합후 15일째에, 배양물을 하이브리도마 성장여부에 대해 시험하고 사람 Ig 및 항-풍진에 대해 상청액을 시험하였다.

n.d.=측정하지 않음

[선별 실시예 1]

두 가지의 별개의 실험에서, 풍진을 앓은 병력이 있는 사람 공여자로부터 얻은 백혈구는 등장성 덱스트란 용액중에서 적혈구를 팽윤시켜서 분리하였다. 이어서, 백혈구를 폴리스티렌 배양 플라스크내에서 2시간 동안 항온배양시켜서 단핵구를 제거하였다. 그후, 3㎖의 부착되지 않은 세포 군집을 풍진 피복 웰상에서 패닝처리하였다. 이와같이 선택된 세포(세포 군집 B)를 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 다양한 세포농도로 접종시켰다. 대조예로서, 0.7㎖의 부착되지 않은 세포 군집을 항-CD2 및 항-CD16 상자성 면역비이드로 처리하여 각각 T- 및 NK-세포로부터 고갈시켰다. 이들 세포(세포 군집 A)를 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 접종시켰다. 11일째에, B-세포 배양물에 대하여 사람 항-풍진 항체와 총 사람 Ig의 존재를 시험하였다. 표 VII은 패닝처리결과 두 실험에서 항원-특이성 B-세포가 상당히 풍부하게 되었음을 나타낸다. 실험 I에서는, 항체 생산 B-세포클론 5개중 하나 이하가, 실험 II에서는 3개중 하나가 항-풍진 특이성이었다. 또한, 대부분의 항원 특이성 B-세포는 IgG 생산자인 것으로 입증되었다.

[표 VII]

사람 항-풍진

A : T-세포 및 단핵구가 감소된 백혈구(약 10%의 B-세포)

B : 풍진 피복 디쉬상에 선별된 세포

n.d = 측정되지 않음.

[선별 실시예 2]

사이토메갈로바이러스(CMV)로 면역시킨 침팬지로부터 얻은 말초혈액 임파구를 피콜-파크(Ficoll-paque)상에서 분리하였다. 이어서, 이들 임파구를 폴리스티렌 배양 플라스크내에서 2시간 동안 항온배양시켜서 단핵구를 제거하였다. 그후, 12×10⁵세포수의 비부착 세포군집을 CMV 피복 웰상에서 패닝처리하였다. 이와같이 선별된 세포(세포군집 B)를 사용하여 다양한 세포농도로 EL-4/B-세포 배양물을 접종시켰다. 대조예로서, 2.4×10⁵세포로 이루어진 비부착 세포군집을 항-CD2 및 항-CD16 상자성 면역비이드로 처리하여 T- 및 NK-세포로부터 감소시켰다. 이들 세포(세포 군집 A)를 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 접종시켰다.

9일째에, B-세포 배양물에 대하여 항-CMV 항체와 총 침팬지 Ig의 존재를 시험하였다. 표 VIII은 다수의 B-세포를 접종시켰음에도 불구하고 비선별세포(세포 군집 A)로 접종시킨 B-세포 배양물중에서는 항-CMV 양성 웰이 확인되지 않았음을 나타낸다. 이에 반해, 비교적 소량의 선별세포로 접종시킨 B-세포 배양물중에서는 2개의 항-CMV 양성 웰이 확인되었다. 이 실시예는 다른 방법들은 대단히 많은 샘플들을 선별해야 하지만 패닝처리는 소량의 항원특이성 B-세포를 가진 다수의 세포군집으로부터 항원특이성 B-세포를 선별하는데 매우 유용한 수단임을 강조하는 것이다.

[표 VIII]

침팬지 항-CMV

A : T-세포, NK-세포 및 단핵구가 감소된 단핵세포(약 80%의 B-세포)

B : CMV-피복 디쉬상에 선별된 세포

() : 클로닝 효율은 보통 25 내지 75%이다. 이 숫자들은 30%의 클로닝-효율을 기준으로 한 것이다.

n.d = 측정되지 않음.

[선별 실시예 3]

11주전에 1차 CMV 감염된 사람인 공여자로부터 얻은 말초 혈액 임파구를 Ficoll-paque상에 분리했다. 이어서, 그 임파구를 폴리스티렌 배양 플라스크내에서 밤새 항온배양하여 단핵구를 제거했다. 이어서, 비부착된 세포군집의 18×10⁵세포를 CMV-피복된 웰상에서 패닝처리하였다. 이러한 방식으로 선별된 세포(세포군집 B)를 사용하여 상이한 세포 농도의 EL-4/B-세포 배양물을 접종했다. 대조군으로, 4×10⁵단핵구-제거된 세포를 항-CD2 및 항-CD16 상자성 면역비이드로 각각 처리하여 T-세포 및 NK-세포로부터 제거되도록 하였다. 이들 세포(세포 군집 A)를 또한 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 접종했다. 9일째, B-세포 배양물을 항-CMV 항체 및 사람의 전체 Ig의 존재에 대하여 시험했다. 표 IX는 패닝이 항원-특이 B-세포를 상당량 증가시켰음을 보여준다. 패닝후, 2개의 항체 생성 B-세포 클론중 1개 이하의 클론이 항-CMV 특이적이었다. 표 IX는 또한 항원 특이 B-세포의 주요부분이 IgG 생성자라는 것을 보여준다.

[표 IX]

사람의 항-CMV

A : T-세포, NK-세포 및 단핵구 제거된 단핵세포(약 80% B 세포)

B : CMV- 피복된 디쉬상에서 선별된 세포

( ) : 클로닝-효율이 보통 25 내지 75% 임. 이 숫자들은 30%의 클리닝 효율을 기준으로 한 것임.

n.d. = 측정되지 않았음.

[선별 실시예 4]

HIV 바이러스 용해물로 면역된 마우스로부터 비장 세포를 상기와 같이 분리했다. 이어서, 이들 비장 세포를 폴리스티렌 배양 플라스크내에서 1.5시간 동안 항온배양하여 단핵구를 제거했다. 이어서, 175×10⁵개의 비부착된 세포를 HIV 바이러스 용해물 피복된 5개의 웰상에서 패닝처리하였다. 이러한 방식으로 선별된 세포(세포 군집 B)를 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 접종했다. 대조용 EL-4/B-세포 배양물을 비선별되고, 단핵구 제거된 비장세포(세포 군집 A)로 접종했다. 9일후, B-세포 배양물을 항-HIV 항체 및 쥐의 전체 Ig의 존재에 대하여 시험했다. 표 X는 비선별된 세포로 접종된 B-세포 배양물에서는 항원 특이 B-세포 클론이 확인되지 않았지만 선별된 세포로 접종된 배양물에서는 6개의 항원 특이 B-세포클론이 확인되었다는 것을 보여준다.

[표 X]

[선별 실시예 5]

사람의 ZP3에 대한 단일클론 항체를 생성시키기 위하여, 마우스들을 제조합융합-단백질 βGAL-ZP3으로 면역화 시켰다. 그렇지만 βGAL의 강한 면역성 때문에 βGAL에 대한 큰 반응이 얻어졌고, ZP3에 대한 반응은 매우 약했다. 이러한 이유로, 단지 하나의 항-ZP3 단일클론 항체가 비선별된 비장 세포와의 다량의 전기융합으로부터 생성되었다. 본 실시예에서, 대부분의 항-βGAL 생성 B-세포를 βGAL 피복된 웰상에서의 흡수에 의해 우선 제거하였다. 이어서, βGAL-ZP3 피복된 웰상에서 패닝을 수행하여 항-ZP3 생성 B-세포를 선별했다. 끝으로, 선별된 세포를 EL-4/B-세포 배양물에서 확장시키고, NS-1 골수종 세포와의 소형 전기융합에 의해 영구화하였다.

재조합 βGAL-ZP3로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 상기와 같이 분리했다. 이어서, 이러한 비장세포를 폴리스티렌 배양 플라스크내에서 1.5시간 동안 배양하여, 단핵구를 제거했다.

이어서, 17×10⁶개의 비부착된 세포를 4개의 βGAL 피복 웰상에서 37℃, 5% CO₂및 100% 습도에서 1.5 시간 동안 항온배양했다. 이러한 항온배양후, 비부착 세포를 4개의 βGAL-ZP3 피복된 웰상에서 패닝처리하였다. 이러한 방식으로, 선별된 세포(세포 군집 B)를 사용하여 EL-4/B-세포 배양물을 접종했다. 대조군 EL-4/B-세포 배양물을 비선별되고, 단핵구가 제거된 비장세포(세포 군집 A)로 접종했다.

8일째 되는날, B-세포 배양물을 항-βGAL 항체, 항-βGAL-ZP3 항체 및 쥐의 전체 Ig의 존재에 대하여 시험했다. 표 XI는 항-βGAL 생성 B-세포의 흡수에도 불구하고 여전히 다수의 항-βGAL 양성 B-세포 클론이 선별세포 가운데서 확인되었다는 것을 보여준다. 그렇지만, βGAL과 βGAL-ZP3를 판별하는 항체를 생성하는 두 개의 B-세포 배양물도 또한 확인되었다.

[표 XI]

n.t. = 시험하지 않았음.

A ; 단핵구가 제거된 마우스 마일(mile) 세포 Muly 59.

B : βGAL 피복된 웰상에 1차 제거된 βGAL-ZP3 선별된 세포.

6개의 항-βGAL 양성 B-세포 클론 및 β-GAL-ZP3와 βGAL를 구별하는 2개의 클론을 10⁶개 NS-1 세포와 소형 전기융합시켰다. 이러한 융합후 8일후, 항-βGAL 및 항-βGAL-ZP3 항체의 생성에 대해 하이브리도마 배양물을 시험하였다. 표 XII은 모든 B-세포클론은 특이 항체를 생성시키는 하이브리도마로 성공적으로 전환되었다는 것을 보여준다. 또한, 1회의 융합에서도 2가지 하이브리도마(βGAL-ZP3를 인지하는 것 및 βGAL을 인지할 수 없는 것)가 생성되었다.

[표 XII]

n.t. = 시험하지 않았음.

[논의]

제한 희석 실험결과는, EL-4/B5 헬퍼세포 및 사람 T-세포 상청액을 갖는 배양물내의 비장 및 말초 혈관에서 일어나는 쥐의 B-세포의 매우 효율적인 성장을 나타냈다. 미정제 비장 세포 군집으로부터 2개 세포만큼 적은 세포로 접종된 40 내지 60%의 배양물에서 쥐의 Ig 생성을 확인하였다. 말초혈관내의 B-세포의 낮은 %에 따라서 2배 적은 양의 Ig 생성 배양물을 쥐의 PBL로 접종된 배양물중에서 확인하였다. 1개의 B-세포로부터 생성될 것으로 예상되었던 상기 B-세포 배양물의 소형-전기융합은 항상 다수의 항체 생산 하이브리도마를 생성시켰다. 상기 방법은 쥐의 항-HIV를 생산하는 하이브리도마의 생성에 성공적으로 사용되었다. 쥐의 항-HIV 생산 B-세포는 10개 비장세포 또는 20개 PBL로 접종된 배양물내에서 확장되었다. 7가지 항-HIV 생성 배양액중 5가지는 항-HIV 생성 하이브리도마로 전환될 수 있었다. 전환되지 못한 2개는 올리고클론적으로 팽창된 B-세포 배양물내의 대부분의 비특이성 B-세포의 존재 때문일 수 있다. 그러나, 항-HIV 생성클론은 2개 비장세포 또는 4개 PBL로 접종된 클론 확장된 B-세포 배양물로부터 수득되지 않았다. 후자는 접종된 웰의 수에 관하여 사용된 미정제 세포 군집내의 항원-특이성 B-세포의 수가 낮은 것에 기인할 수 있다. 그것의 고효율 뿐만 아니라, 특히 쥐의 PBL 또는 임파절로부터의 소수의 임파구의 사용가능성에 의하여 쥐 MAb의 발생에 새로운 차원의 방법을 제공한다. 임파절 세포의 융합결과, 종래 Mirza의 다수의 문헌(1987)에서 기술된 바와 같이, 다수의 감작화된 특이성 B-세포 및 보다 광범위한 항체 특이성을 산출할 수 있다. 안와 천공에서 얻은 PBL의 융합은 단일클론 수준에서 동일한 동물내에서 장시간동안 면역반응을 검사하게 한다.

상기 B-세포 배양 시스템을 또한 사람의 B-세포(Wen 외., 1987; 쥬블러 외., 1987; 스트라우브 및 쥬블러, 1987; 쟝 외., 1990)를 확장하기 위해 사용하였듯이, 이러한 신규 방법을 사람 MAb의 개량에 사용할 수 있는지 없는지를 조사하였다. B-세포의 성장은 역시 매우 효율적인 것 같았다. 각각의 B-세포 배양물의 소형-전기융합은 비록 Ig-생성자가 단지 작은 비율일지라도, 다수의 하이브리도마를 발생시켰다.

상기의 사람 B-세포로부터 형성된 하이브리도마의 불안정성 및 제노하이브리드(xenohybrid) 융합 쌍(K6H6B5 및 PAI-1)에 기인한다. 그러나, 이것이 사실이 아니라는 몇 가지 증거가 있다. 다른 실험에서는 EBV-형질전환된 B-세포 및 제노하이브리드로부터 얻은 대부분의 하이브리도마는 3개월 이상동안 안정한 항체 생성자였다는 것을 보였다. 또한, B-세포 약 11%를 함유하는 세포 군집의 웰당 10개 세포로 접종된 B-세포 배양물의 현미경 검사는 상기 웰내의 세포성장이 Ig 생성과 전혀 관련이 없다는 것을 나타냈다. 어떤 배양물에서는 많은 세포가 성장하여 Ig 생성이 검출되지 않은 반면, 다른 배양물에서는 어떤 세포가 EL-4/B5 헬퍼세포 사이에서 거의 눈에 보이지 않았으며, 상당량의 Ig가 측정되었다. 외견상 B-세포 클론의 크기는 작고, 다른 세포는 B-세포 배양물 시스템(예; NK-세포 및 잔여 T-세포)에서 성장하였다. 이것은 많은 비생성 하이브리도마(B-세포외의 세포에서 유래한 하이브리도마)를 설명할 수 있다.

쥐의 B-세포와 비교하여 사람 B-세포에 대한 새로운 방법의 영구화 효율성이 더 낮은데도 불구하고, 18개의 항원 특이성 B-세포 클론만큼 적은 클론으로부터 2가지 상이한 사람 항-풍진(rubella) 생성 하이브리도마를 발생시켰다. 이제 소형-전기 융합으로부터 적어도 소수의 항원 특이성 하이브리도마를 보장할 수 있는 수준으로 클론 크기를 확대하기 위해서 B-세포 배양액 시스템을 최적화한다. 본원에 기술된 방법은 사람 MAb를 생성시키기 위한 매력적인 대체 방법을 제시할 수 있다. 그것의 고효율성은 종래의 하이브리도마 기술보다 우수한 방법이며, 사람 공여자로부터 유용한 소수의 임파구를 사용가능하게 한다. 그것은 또한 양성 선별 과정으로부터 남은 소수의 특이적 임파구를 처리하는 것이 가능함으로써, 복잡한 음성반응 하이브리도마의 검색(screening)을 피할 수 있다. 또한, 상기 방법에서 B-세포의 영구화는 B-세포의 서브세트에 한정되지 않으므로 EBV-형질전환 방법보다 더 많은 IgG 생성 세포주의 생성이 가능하다.

[참고문헌]

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Claims

a) 공여자(donor)로 부터 B-임파구를 수거하는 단계, b) 상기 B-임파구를 방사선 조사된 흉선종 세포로 자극하여 클론 확장(clonal expansion)시키는 단계, c) 적합한 융합짝(fusion partner)과 전기융합시켜(electrofusion) 상기 클로닝된 B-임파구를 영구화(immortalize)시키는 단계, d) 생성된 하이브리도마 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 e) 그 배양 배지로부터 단일클론 항체를 분리시키는 단계를 포함하는 단일 클론 항체의 생성 방법.
제1항에 있어서, 방사선 조사된 흉선종 세포가 방사선 조사된 쥐의 EL-4/B5 흉선종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사람의 T-세포/대식세포 상청액과 함께 방사선 조사된 쥐의 흉선종 세포를 사용하여 B-임파구를 자극하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, B-임파구의 클론 확장 단계를 먼저 실시하거나, 또는 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 B-임파구의 선별 단계이후에 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 인터류킨을 방사선 조사된 흉선종 세포와 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.