KR20150140679A - 항원-특이적 b 세포를 확인하고 단리시키고, 원하는 항원에 대한 항체를 생성하기 위한 프로토콜 - Google Patents
항원-특이적 b 세포를 확인하고 단리시키고, 원하는 항원에 대한 항체를 생성하기 위한 프로토콜 Download PDFInfo
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Abstract
항원-특이적 항체 분비 및 항체 형성 세포, 예컨대 항원-특이적 B 세포를 확인하는 방법, 및 이 세포에 의해 생성된 항체의 항원-특이적 항체 서열을 클로닝하는 방법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 항원-특이적 B 세포에 대해 B 세포를 농후화하는 단계, 항원-특이적 B 세포를 배양하여 클론성 B 세포 집단을 생성하는 단계, 단일 항원-특이적 항체를 생성하는 클론성 B 세포를 검출하는 단계, 임의로 기능적 활성에 대해 클론성 B 세포 집단을 스크리닝하는 단계, 세포를 염색하고 분류하여 항원-특이적 B 세포를 단리하는 단계, 항원-특이적 항체 서열을 코딩하는 핵산을 서열분석하는 단계, 서열을 발현시켜 항체를 생성하는 단계, 항체를 단리하는 단계 및 항원 인식에 대해 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 항원-특이적 항체 분비 및 항체 형성 세포의 농후화 및 선택의 개선을 제공하고, 이것은 항원-특이적 항체의 회수를 증대시킨다.
Description
관련출원 개시
본원은 발명의 명칭이 "항원-특이적 B 세포를 확인하고 단리시키고 원하는 항원에 대한 항체를 생성하기 위한 프로토콜(PROTOCOL FOR IDENTIFYING AND ISOLATING ANTIGEN-SPECIFIC B CELLS AND PRODUCING ANTIBODIES TO DESIRED ANTIGENS)"(그 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)인 2013년 3월 15일자에 출원된 미국 가출원 제61/791,471호의 이익을 주장한다.
본원은 이의 개시내용의 일부로서 크기가 3,647 바이트인 "43257o3813.txt"(2014년 2월 28일 생성)의 파일명(그 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)으로 포함된 생물학적 서열 목록을 포함한다.
기술분야
본 발명은 항체 분비 및 항체 형성 세포, 특히 토끼 항원-특이적 B 세포를 확인하는 방법, 및 이 세포에 의해 생성된 항체의 항원-특이적 서열을 클로닝하는 방법, 및 이 항체 서열의 변이체, 특히 이 항체 서열의 인간화 및 키메라 버전을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 대상 방법은 인간 및 바이러스 폴리펩타이드와 같은 상이한 항원, 및 비교적 비면역원성이고/이거나 몇몇 다른 B 세포 선택 방법을 이용하여 고품질의 항체를 생성하기 어려운, 작은 펩타이드 및 다른 항원에 대한 고품질의 항체를 유도시키도록 이용될 수 있다.
특정한 항원을 표적화하는 항체를 생성하는 B 림프구의 단리에 기초한 단일클론 항체를 생성하기 위한 방법이 공지되어 있다. 이 방법은 일반적으로, 정제된 항원(또는 항원들)에 결합하는 B 림프구를 확인하고 단리시키기 위한, 이 항원 또는 항원의 혼합물의 용도에 따라 달라진다. 항체 형성 세포(antibody-forming cell: AFC) 또는 항원에 특이적인 표면-수용체를 발현하는 B 림프구를 선택하기 위한, 항원 또는 항원의 혼합물의 용도에 의존하는 방법은 세포를 단리하도록(이후 보통 클론으로 증식됨) 항원 코팅된 자석 비드(Lagerkvist et al., 1995), 또는 형광색소 표지된 항원 및 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell-sorting: FACS)(Weitkamp et al., 2003)를 사용하는 것을 포함한다. 이후, 단일클론 항체는 예를 들어 하이브리도마를 생성시키는 융합에 의해(Steenbakkers et al., 1993) 또는 (예를 들어, RT-PCR을 이용하여) 항체 가변 구역을 코딩하는 유전자의 클로닝에 의해(Lagerkvist et al., 1995; Wang & Stollar, 2000; Weitkamp et al., 2003) 이 클론으로부터 생성된다.
대안적으로, 항원 커플링된 적혈구에 의해 용혈성 플라크 검정을 이용하는 것을 포함하는, 특정한 항원에 특이적인 항체를 분비하는 개별 세포를 확인하기 위한 방법이 기재되어 있고, 이후에 항체 가변 구역을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 RT-PCR과 같은 기법을 이용할 수 있다(Babcook et al., 1996; 미국 특허 제5,627,052호 (1997) Schrader, J. W.).
본 발명은 원하는 항원에 특이적인 항체(예를 들어, 항원-특이적 B 세포)를 분비하고 항체 형성 세포로부터 ASC 또는 ASC의 클론을 생성하는 높은 가능성을 갖는 항체 분비 세포(antibody-secreting cell: ASC)를 확인하고, 이 ASC에 의해 분비된 원하는 항원에 특이적인 항체의 가변 경쇄 구역 및/또는 가변 중쇄 구역을 코딩하는 항원-특이적 항체 가변 서열을 클로닝하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 항원-특이적 ASC의 농후화; 항원 인식에 대한 1차 스크리닝 단계; 및 ASC, 바람직하게는 항원-특이적 B 세포의 수율을 개선하기 위해, ASC 염색 및 분류와 조합된, 기능적 특성에 대한 임의의 스크리닝을 포함한다. 상기 방법은 항체를 만드는 임의의 종으로부터의 단일클론 항체의 생성에 적용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 토끼 또는 인간 B 세포를 사용하여 수행된다.
본 발명은 항원-특이적 항체(즉, 항원-특이적 B 세포)를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (ⅰ) 관심 대상 항원에 면역화되거나 자연히 노출된 숙주로부터 B 세포를 얻는 단계; (ⅱ) 상기 B 세포의 분획을 농후화하여 항원-특이적 B 세포의 농후화된 집단(즉, 농후화 전의 B 세포 분획에 비해 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 생성하는 B 세포를 더 높은 백분율로 함유함)을 얻는 단계; (ⅲ) 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단의 형성을 선호하는 배양 조건 하에 상기 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단으로부터 하나 이상의 분획을 분리하여 배양하는 단계; (ⅳ) 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단을 검출하여, 하나 이상의 항원-특이적 B 세포를 확인하는 단계; (ⅴ) 임의로, 단계 (ⅳ)에서 확인된 클론성 항원-특이적 B 세포 집단을 스크리닝하여 적어도 하나의 원하는 기능적 특성을 보유하는 항원-특이적 항체를 생성하는 B 세포를 확인하는 단계; (ⅵ) 임의로, 상이한 클론성 B 세포 배양물로부터 얻은(예를 들어, 상이한 배양 웰에 함유된) 항원-특이적 B 세포를 혼주(pooling)하는 단계; (ⅶ) 단계 (ⅳ) 후에 또는 상기 임의의 단계 (ⅴ) 또는 임의의 단계 (ⅵ) 후에 얻은 항원-특이적 B 세포를 염색된 B 세포의 양성 및/또는 음성 선택을 수월하게 하는 라벨에 의해 염색하는 단계; 및 (ⅷ) 염색된 항원-특이적 B 세포를 분류하여 단일 항원-특이적 B 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 상기 개시된 바대로, 몇몇 실시형태에서, 농후화 절차를 2시간 또는 3시간 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법을 이용하여 확인된 항원-특이적 B 세포에 의해 발현된 항체의 가변 경쇄 구역 및/또는 가변 중쇄 구역을 코딩하는 항원-특이적 항체 가변 서열을 클로닝하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 클로닝하는 방법은 상기 단계 (ⅰ) 내지 단계 (ⅷ), 및 (ⅸ) 분류된 B 세포를 분류된 B 세포에 의해 발현된 항원-특이적 항체 가변 서열의 증폭을 수월하게 하는 역전사 중합효소 사슬 반응(reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR) 반응 배지에 위치시키는 단계; (ⅹ) 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 증폭된 핵산을 서열분석하는 단계; (xi) 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 증폭된 핵산 또는 이의 변이체를 발현시켜 항체 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및 (xⅱ) 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 숙주는 기니아 피그, 토끼, 마우스, 래트, 비인간 원시류 또는 인간이다. 바람직하게는, 숙주는 토끼이다. B 세포는 면역화 후 약 20일 내지 약 90일에 숙주로부터 얻어질 수 있고, 바람직하게는 B 세포는 면역화 후 약 50일 내지 약 60일에 숙주로부터 얻어진다.
다른 실시형태에서, 단계 (ⅰ)는 혈액으로부터 비장, 림프절, 골수 및 말초 혈액 단핵 세포로부터 선택되는 적어도 하나의 공급원으로부터 B 세포를 수확하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단계 (ⅰ)는 비장, 림프절, 골수, 말초 혈액 단핵 세포 및 혈액으로부터 선택되는 하나 초과의 공급원으로부터 B 세포를 수확하고, 하나 초과의 공급원으로부터 상기 B 세포를 혼주하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 숙주로부터의 혈청에 존재하는 항원-특이적 항체(즉, 항원에 특이적으로 결합하는 항체) 및/또는 중화 항체(즉, 수용체 또는 리간드와 같은 결합 파트너에 대한 항원의 결합을 중화시키거나 저해시키고/시키거나, 항원의 적어도 하나의 생물학적 활성을 중화시키거나 저해하는 항체)의 역가를 확립하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 농후화 단계 (ⅱ)는 고체 기질, 바람직하게는 자석 비드 또는 지지체, 바람직하게는 칼럼에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원을 사용한 항원-특이적 B 세포의 친화도 정제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 고체 기질 또는 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원은 바이오티닐화되고 스트렙타비딘, 아비딘 또는 뉴트라비딘을 통해 상기 기질 또는 지지체에 부착된다.
특정한 실시형태에서, 농후화 단계 (ⅱ)는 (1) B 세포를 바이오틴 표지 항원과 조합하는 단계; (2) 임의로, B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 세척하는 단계; (3) 스트렙타비딘 비드를 (1) 또는 (2)의 B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물에 도입하는 단계; (4) 칼럼 위로 스트렙타비딘 비드/B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 통과시키는 단계; 및 (5) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 대안적으로, 농후화 단계 (ⅱ)는 (1) 바이오틴 표지 항원을 스트렙타비딘 비드와 조합하는 단계; (2) 칼럼 위로 바이오틴 표지 항원/스트렙타비딘 비드 조성물을 통과시키는 단계; (3) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 바이오틴 표지 항원 코팅된 비드를 용리시키는 단계; (4) B 세포를 코팅된 비드와 조합하는 단계; (5) 칼럼 위로 B 세포와 코팅된 비드의 혼합물을 통과시키는 단계; 및 (6) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 농후화 방법, 또는 방법 둘 다의 조합은 적어도 1회 반복되어 추가의 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 농후화 단계 (ⅱ)는 항원-특이적 B 세포의 백분율을 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1,000배 또는 적어도 10,000배 농후화시킨다. 다른 실시형태에서, 농후화된 B 세포 집단에서의 항원-특이적 B 세포의 백분율은 적어도 1%, 5% 또는 10%이다.
일 실시형태에서, 농후화된 항원-특이적 B 세포는 공급 세포, 바람직하게는 조사된 EL4 세포를 포함하는 배지에서 배양된다. 배지는 활성화된 T 세포 조건 배지를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 농후화된 B 세포는 약 1% 내지 약 5%의 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지(TSN)를 포함하는 배지에서 배양된다. 예시적인 실시형태에서, TSN은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Seeber et al., "A Robust High Throughput Platform to Generate Functional Recombinant Monoclonal Antibodies Using Rabbit B Cells from Peripheral Blood," PLoS ONE 9(2): e86184] 및 공보 EP 0488470 A1(특히 문단 0046)(이들 각각은 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 것에 의해 생성될 수 있다.
배양을 적어도 약 1일 내지 9일, 2일 내지 8일, 3일 내지 7일, 4일 내지 6일 또는 5일 내지 7일 동안 수행할 수 있다. 바람직하게는, 배양을 약 5일 내지 7일 동안 수행한다.
일 실시형태에서, 농후화된 B 세포는 적어도 1개, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 농후화된 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양된다. 다른 실시형태에서, 각각의 웰은 약 50개 내지 약 100개의 농후화된 B 세포, 약 25개 내지 약 50개의 농후화된 B 세포 또는 약 10개 내지 약 25개의 농후화된 B 세포를 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 약 1개 내지 약 200개의 농후화된 항원-특이적 B 세포는 다중웰 플레이트의 각각의 웰에서 조사된 EL4 세포 및 T 세포 상청액(TSN)과 조합된다.
일 실시형태에서, 항원 인식 검출 단계 (ⅳ)는 배양된 농후화된 B 세포로부터 상청액을 제거하는 단계 및 상기 상청액을 평가하여 항원-반응성 상청액을 함유하는 다중웰 플레이트에서 개별적인 웰을 확인함으로써 항원-특이적 B 세포를 함유하는 웰을 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상청액은 ELISA에 의해 평가된다. 일 실시형태에서, ELISA 스크린으로부터의 항원-반응성 상청액은 또 다른 플레이트로 전달되고, 동결 배지는 오리지널 배양 플레이트에 첨가된다. 특정한 실시형태에서, 상청액은 약 2일 내지 약 7일 동안 농후화된 B 세포를 배양한 후 항원-특이적 IgG 생성 및 전체 IgG 생성에 대해 평가된다. 전체 IgG 생성에 대한 검정은 (1) 플레이트를 항-종 Fab, 바람직하게는 항-토끼 Fab에 의해 코팅함으로써; (2) 배양된 B 세포로부터의 상청액을 플레이트에 첨가함으로써; 그리고 (3) 상청액에서 전체 IgG를 항-종 IgG, 바람직하게는 항-토끼 IgG에 의해 검출함으로써 수행될 수 있다. 부가적으로, 항원-특이적 IgG 생성에 대한 검정은 (1) 플레이트를 비표지된 항원에 의해 코팅하거나 스트렙타비딘 플레이트를 바이오틴 표지 항원에 의해 코팅함으로써; (2) 배양된 B 세포로부터의 상청액을 플레이트에 첨가함으로써; 그리고 (3) 상청액에서 항원-특이적 IgG를 항-종 IgG, 바람직하게는 항-토끼 IgG에 의해 검출함으로써 수행될 수 있다. 다중웰 플레이트에서 항원-특이적 웰 대 전체 IgG 웰의 비율은 B 세포 농후화 및 항체 분비 세포의 클론성과 상관될 수 있다.
일 실시형태에서, 임의의 기능적 활성 스크리닝 단계 (ⅴ)는 항원-특이적 기능적 검정을 이용하여 항원-반응성 상청액을 평가하여 적어도 하나의 원하는 기능적 특성을 갖는 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 웰을 확인하는 단계를 포함한다. 특히, 임의의 기능적 활성 스크리닝 단계 (ⅴ)는 단계 (ⅳ)에서 확인된 항원-특이적 B 세포를 스크리닝하여 결합 파트너에 결합하는 항원의 효현작용 또는 길항작용; 특이적 표적 세포 유형의 증식의 유도 또는 저해; 표적 세포의 용해의 유도 또는 저해; 또는 항원을 포함하는 생물학적 경로의 유도 또는 저해를 나타내는 항원-특이적 항체를 생성하는 B 세포를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 기능적 활성 스크리닝 단계는 T1165 세포의 증식의 유도 또는 저해; TF1 세포의 증식의 유도 또는 저해; SK-N-MC 세포에서의 cAMP 생성의 유도 또는 저해; 또는 PCSK9/LDLR 상호작용의 저해에 대해 항원-특이적 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 하나 이상의 냉동 및 저장 단계는 하나 이상의 방법 단계에 개재할 수 있다.
일 실시형태에서, 염색 단계 (ⅶ)는 음성 항원-특이적 B 선택 방법을 수월하게 한다. 음성 항원-특이적 B 선택은 B 세포를 조사된 EL4 세포를 염색하는 제1 라벨(바람직하게는, 제1 라벨은 Thy1.2임) 및 죽은 세포를 염색하는 제2 라벨(바람직하게는, 제2 라벨은 요오드화프로피듐(Propidium iodide: PI)임)에 의해 염색함으로써 수행된다. 음성 선택에 대한 염색 후에, 상기 방법은, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 면역자기 세포 분류(MACS)를 이용하여 수행되는, 유동세포계수법을 이용하여 모든 생육성 비-EL4 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 염색 단계 (ⅶ)는 양성 항원-특이적 B 선택 방법을 수월하게 한다. 양성 항원-특이적 B 선택은 종-특이적 B 세포를 염색하는 제1 라벨(바람직하게는, 제1 라벨은 항-토끼 IgG임) 및 죽은 세포를 염색하는 제2 라벨(바람직하게는, 제2 라벨은 요오드화프로피듐(PI)임)에 의해 염색함으로써 수행된다. 양성 선택에 대한 염색 후에, 상기 방법은, 바람직하게는 FACS 또는 MACS를 이용하여 수행되는, 유동세포계수법을 이용하여 모든 생육성 종-특이적 B 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 분류 단계 (ⅷ)는 세포를 예를 들어 FACS를 이용하여 (후속하는 임의의 증폭 및 클로닝에 대해) RT-PCR 반응 배지로 직접적으로 분류하는 단계를 포함할 수 있다.
부가적으로, 분류 단계 (ⅷ)는 분류된 염색된 B 세포를 임의로 게이팅(gating)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 임의의 게이팅 단계는 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는 생육성 비-EL4 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 임의의 게이팅 단계는 예를 들어 자가형광 수준과 관련이 없는 FSC/SSC 물리적 게이트를 작성함으로써 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는 분류된 생육성 종-특이적 B 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 임의의 게이팅 단계는, 염색된 샘플에 대한 기준으로서 비염색된 세포의 자가형광에 기초하여 게이트를 구축하는 단계를 포함할 수 있는, 세포 염색에 기초하여 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
분류 단계를 단일 웰 분류 방법 또는 혼주된 분류 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 혼주된 분류 방법을 위해, 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 상이한 개별적인 웰은 염색 및 세포 분류 전에 조합된다. 일 실시형태에서, 유사한 친화도 및/또는 원하는 기능적 특성을 갖는 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 상이한 개별적인 웰은 염색 및 분류 전에 조합된다. 다중웰 플레이트로부터의 100개 초과의 상이한 '양성' 웰(즉, 원하는 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 것으로 확인됨)은 혼주된 분류를 위해 조합될 수 있다. 바람직하게는, 약 2개 내지 약 10개의 상이한 개별적인 웰; 약 10개 내지 약 50개의 상이한 개별적인 웰; 또는 약 50개 내지 약 150개의 상이한 개별적인 웰의 항원-특이적 B 세포는 혼주된 분류를 위해 조합된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 세포, 예컨대 효모, 박테리아, 식물, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포에서 항체 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는 서열분석되고 증폭된 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 발현 단계 (xi)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 재조합 세포는 이배체 효모, 예컨대 피치아(Pichia)이다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA), 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunoadsorbent assay: ELISA), 면역침강, 형광 면역검정, 웨스턴 블롯, 표면 플라스몬 공명(비아코어(BIAcore)(등록상표)) 분석 또는 또 다른 항원 인식 검정을 이용하여 (예를 들어, 항원-특이적 B 세포로부터 단리된 항체의 항원-특이적 가변 서열을 코딩하는 서열분석되고 증폭된 핵산의 재조합 발현으로부터 생긴) 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함하는 결정 단계 (xⅱ)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 재조합 항체 폴리펩타이드의 항원 결합 특이성은 ELISA 검정을 이용하여 결정된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 분류된 세포 집단이, 바람직하게는 B 세포를 조사된 EL4 세포를 염색하는 제1 라벨 및 죽은 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는 음성 항원-특이적 B 선택을 이용하여, 바람직하게는 유동세포계수법에 의해 얻은, 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는, 기재된 B 세포 선택 방법에 따라 생성된 주로 생육성 비-EL4 세포의 분류된 집단을 추가로 포함하고, 제1 라벨은 바람직하게는 Thy1.2이고, 제2 라벨은 바람직하게는 요오드화프로피듐(PI)이다. 이 분류된 세포는 바람직하게는 원하는 항원, 특히 항원에 대해 특이적인 항체가 가능하게는 인간 치료에서 사용하기에 적합한 항원에 고친화도 항체를 분비하는 B 세포를 포함할 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 집단이, 종-특이적 B 세포를 염색하는 제1 라벨 및 죽은 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는 양성 항원-특이적 B 선택을 이용하여, 바람직하게는 유동세포계수법에 의해 얻은, 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는, 기재된 B 세포 선택 방법에 따라 생성된 생육성 종-특이적 B 세포의 분류된 집단을 추가로 포함하고, 제1 라벨은 바람직하게는 항-토끼 IgG이고, 제2 라벨은 바람직하게는 요오드화프로피듐(PI)이다. 이 분류된 세포는 또한 바람직하게는 원하는 항원, 특히 항원에 대해 특이적인 항체가 가능하게는 인간 치료에서 사용하기에 적합한 항원에 고친화도 항체를 분비하는 B 세포를 포함할 것이다.
도 1은 수확된 B 세포의 농후화가 항원-특이적 B 세포의 확인을 개선한다는 것을 나타낸다. 농후화된 B 세포 배양물로부터의 6개 중 5개의 IgG 생성 웰이, 비클론성 B 세포 배양물로부터의 30개 중 3개의 IgG 생성 웰과 비교하여, 항원-특이성을 나타낸다.
도 2는 B 세포 분류 동안 최종 FSC/SSC 게이트를 사용하여 수집된, (주요 세포 집단과 비교하여) 더 큰 덜 과립형인 표현형을 갖는 항원-특이적 B 세포의 하위집단을 나타낸다.
도 3은 비항원 특이적 B 세포의 세포 분류 배제를 통해 얻은 항원-특이적 B 세포를 나타낸다. 염색된 대부분의 세포는 비생육성 및/또는 조사된 공급 세포(Thy1.2+ 및/또는 PI+)이었다. 생육성인 비조사된 B 세포(PI- 및/또는 Thy1.2-)를 선택하고 최종 FSC/SSC 게이트로 처리하여, RT-PCR 마스터 혼합물로 분류된, 원하는 물리적 표현형을 갖는 세포의 하위집단을 얻었다.
도 4는 세포 분류 동안 양성 항원-특이적 B 세포 선택을 나타낸다. 전체 B 세포 집단의 작은 분획은 IgG 양성이다. 생육성 IgG 양성 B 세포(PI- 및 토끼 IgG+)를 선택하고 최종 FSC/SSC 게이트로 처리하여, RT-PCR 마스터 혼합물로 분류된, 원하는 물리적 표현형을 갖는 세포의 하위집단을 얻었다.
도 5는 음성 선택된 항원-특이적 B 세포의 FSC/SSC 게이팅된 하위집단이 평균 증폭 성공보다 우수하다는 것을 나타낸다. 88개 중 26개의 FSC/SSC 게이팅된 Thy1.2-/PI- B 세포는, (최종 FSC/SSC 게이트가 없는) 88개 중 1개의 Thy1.2-/PI- B 세포와 비교하여, 원하는 암플리콘 크기를 갖는다.
도 6은 2개의 항-PCSK9 항체(Ab1 및 Ab2)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 7은 LDL 유입 검정에서 2개의 항-PCSK9 항체(Ab1 및 Ab2)의 기능성을 도시한 것이다.
도 8은 2개의 항-CGRP 항체(Ab3 및 Ab4)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 9는 2개의 항-표적 1 항체(Ab5 및 Ab6)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 10은 2개의 항-NGF 항체(Ab7 및 Ab8)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 11은 TF1 증식 검정에서 2개의 항-NGF 항체(Ab7 및 Ab7)의 기능성을 도시한 것이다.
도 12는 2개의 항-표적 2 항체(Ab9 및 Ab10)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 13은 HTRF 검정에서 2개의 항-표적 2 항체(Ab9 및 Ab10)의 결합 친화도의 기능성을 도시한 것이다.
도 14는 ELISA에 의해 결정된 2개의 항-표적 3 항체(Ab11 및 Ab12)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 15a 내지 도 15c는 본 발명의 항체 선택 방법론을 수행하기 위한 2개의 예시적인 수단을 예시하는 흐름도를 제공한다.
도 2는 B 세포 분류 동안 최종 FSC/SSC 게이트를 사용하여 수집된, (주요 세포 집단과 비교하여) 더 큰 덜 과립형인 표현형을 갖는 항원-특이적 B 세포의 하위집단을 나타낸다.
도 3은 비항원 특이적 B 세포의 세포 분류 배제를 통해 얻은 항원-특이적 B 세포를 나타낸다. 염색된 대부분의 세포는 비생육성 및/또는 조사된 공급 세포(Thy1.2+ 및/또는 PI+)이었다. 생육성인 비조사된 B 세포(PI- 및/또는 Thy1.2-)를 선택하고 최종 FSC/SSC 게이트로 처리하여, RT-PCR 마스터 혼합물로 분류된, 원하는 물리적 표현형을 갖는 세포의 하위집단을 얻었다.
도 4는 세포 분류 동안 양성 항원-특이적 B 세포 선택을 나타낸다. 전체 B 세포 집단의 작은 분획은 IgG 양성이다. 생육성 IgG 양성 B 세포(PI- 및 토끼 IgG+)를 선택하고 최종 FSC/SSC 게이트로 처리하여, RT-PCR 마스터 혼합물로 분류된, 원하는 물리적 표현형을 갖는 세포의 하위집단을 얻었다.
도 5는 음성 선택된 항원-특이적 B 세포의 FSC/SSC 게이팅된 하위집단이 평균 증폭 성공보다 우수하다는 것을 나타낸다. 88개 중 26개의 FSC/SSC 게이팅된 Thy1.2-/PI- B 세포는, (최종 FSC/SSC 게이트가 없는) 88개 중 1개의 Thy1.2-/PI- B 세포와 비교하여, 원하는 암플리콘 크기를 갖는다.
도 6은 2개의 항-PCSK9 항체(Ab1 및 Ab2)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 7은 LDL 유입 검정에서 2개의 항-PCSK9 항체(Ab1 및 Ab2)의 기능성을 도시한 것이다.
도 8은 2개의 항-CGRP 항체(Ab3 및 Ab4)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 9는 2개의 항-표적 1 항체(Ab5 및 Ab6)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 10은 2개의 항-NGF 항체(Ab7 및 Ab8)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 11은 TF1 증식 검정에서 2개의 항-NGF 항체(Ab7 및 Ab7)의 기능성을 도시한 것이다.
도 12는 2개의 항-표적 2 항체(Ab9 및 Ab10)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 13은 HTRF 검정에서 2개의 항-표적 2 항체(Ab9 및 Ab10)의 결합 친화도의 기능성을 도시한 것이다.
도 14는 ELISA에 의해 결정된 2개의 항-표적 3 항체(Ab11 및 Ab12)의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 15a 내지 도 15c는 본 발명의 항체 선택 방법론을 수행하기 위한 2개의 예시적인 수단을 예시하는 흐름도를 제공한다.
본 발명은 항체 분비 및 항체 형성 세포, 특히 토끼 항원-특이적 B 세포를 확인하는 방법, 및 이 세포에 의해 생성된 항체의 항원-특이적 서열, 예를 들어 VH 및/또는 VL 구역을 클로닝하는 방법을 제공한다. 하기 기재되고 예시된 바대로, 이들 방법은 조합하여, 순차적으로, 각각 또는 정기적으로 사용될 수 있는 일련의 농후화, 배양, 검출, 스크리닝, 단리, 염색, 분류, 증폭, 서열분석, 발현 및 결정 단계를 함유한다. 바람직하게는, 이들 방법은, 원하는 항원에 특이적인 단일클론 항체, 또는 이러한 항체 또는 이의 변이체에 상응하는 핵산 서열을 생성하도록 사용될 수 있는, 적어도 하나의 항원-특이적 B 세포를 확인하기 위해 사용된다.
본 발명의 방법에서, 항체는 농후화 단계, 항원-특이적 B 세포의 클론성 집단을 생성시키는 배양 단계, 항원 인식 검정을 이용하여 항원-특이적 B 세포의 확인을 발생시키는 검출 단계, 원하는 기능적 특성을 갖는 항원-특이적 항체를 생성하는 항원-특이적 B 세포를 확인하기 위한 임의의 스크리닝 시험, 염색된 세포의 양성 또는 음성 선택을 위한 염색 단계 및 단일 항원-특이적 B 세포를 얻기 위한 분류 단계 후에 선택된다.
상기 방법은 하나 이상의 단리된 항원-특이적 세포로부터 선택된 항체 또는 이의 부분을 서열분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 서열분석 방법은 이용될 수 있고, 중쇄, 경쇄, 가변 구역(들) 및/또는 상보성 결정 구역(들)(complementarity determining region: CDR)을 서열분석하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 농후화 단계, 배양 단계 및 서열분석 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 항원-특이적 B 세포(즉, 항원-특이적 항체를 발현함)를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(ⅰ) 관심 대상 항원에 면역화되거나 자연히 노출된 숙주로부터 B 세포를 얻는 단계;
(ⅱ) 상기 B 세포의 분획을 농후화하여 항원-특이적 B 세포의 농후화된 집단을 얻는 단계(상기 집단은 농후화 전의 B 세포 분획에 비해 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 생성하는 B 세포를 더 높은 백분율로 함유함);
(ⅲ) 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단의 형성을 선호하는 배양 조건 하에 상기 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단으로부터 하나 이상의 분획을 분리하여 배양하는 단계;
(ⅳ) 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단을 검출하여, 하나 이상의 항원-특이적 B 세포를 확인하는 단계;
(ⅴ) 임의로, 단계 (ⅳ)에서 확인된 클론성 항원-특이적 B 세포 집단을 스크리닝하여 적어도 하나의 원하는 기능적 특성을 보유하는 항원-특이적 항체를 생성하는 B 세포를 확인하는 단계;
(ⅵ) 임의로, 상이한 클론성 B 세포 배양물로부터 얻은 항원-특이적 B 세포를 혼주하는 단계;
(ⅶ) 단계 (ⅳ) 후에 또는 상기 임의의 단계 (ⅴ) 또는 임의의 단계 (ⅵ) 후에 얻은 항원-특이적 B 세포를 염색된 B 세포의 양성 및/또는 음성 선택을 수월하게 하는 라벨에 의해 염색하는 단계; 및
(ⅷ) 염색된 항원-특이적 B 세포를 분류하고 분류된 염색된 B 세포를 임의로 게이팅하여 단일 항원-특이적 B 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
게다가, 상기 방법은,
(ⅸ) 분류된 B 세포를 분류된 B 세포에 의해 발현된 항원-특이적 항체 가변 서열의 증폭을 수월하게 하는 역전사 중합효소 사슬 반응(RT-PCR) 반응 배지에 위치시키는 단계;
(ⅹ) 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 증폭된 핵산을 서열분석하는 단계;
(xi) 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 증폭된 핵산 또는 이의 변이체를 발현시켜 항체 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
(xⅱ) 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정하는 단계
에 의해 가변 경쇄 구역 및/또는 가변 중쇄 구역을 코딩하는 항원-특이적 항체 가변 서열을 클로닝하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 B 세포 선택 프로토콜은, 원하는 표적 항원에 특이적인, 항체 분비 B 세포 및 단일클론 항체를 얻는 다른 방법에 비해 다수의 고유 이점을 갖는다. 이들 이점은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
첫째로, 이 선택 절차가 원하는 항원, 예컨대 PCSK9, CGRP, 표적 1, NGF 또는 표적 2와 이용될 때, 상기 방법은 항체의 실질적으로 포괄적 보체인 것으로 보이는 것(즉, 항원의 다양한 상이한 에피토프에 결합하는 항체)을 생성할 수 있는 항원-특이적 B 세포를 재현 가능하게 생성시킨다는 것이 발견되었다. 이론에 제한됨이 없이, 포괄적 보체가 초기 B 세포 회수 전에 수행되는 항원 농후화 단계에 기인하는 것으로 가정된다. 게다가, 이들 특성이 특정한 항체의 에피토프 특이성에 따라 변할 수 있으므로, 이 이점은 상이한 특성을 갖는 항체의 단리 및 선택을 허용한다.
둘째로, 본 발명의 B 세포 선택 프로토콜이, 비교적 높은 결합 친화도(즉, 피코몰 항원 결합 친화도에 가까움)로 원하는 항원에 일반적으로 결합하는 단일 단일클론 항체를 분비하는, 단일 B 세포 또는 이의 자손을 함유하는 클론성 B 세포 배양물을 재현 가능하게 생성시킨다는 것이 발견되었다. 반대로, 사전의 항체 선택 방법은 비교적 아주 적은 고친화도 항체를 생성시키는 경향이 있고, 따라서 치료학적 가능성을 갖는 항체를 단리하기 위해 광범위한 스크리닝 절차를 요한다. 이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 프로토콜이 숙주의 생체내 B 세포 면역화(1차 면역화), 이어서 제2 실험실내 B 세포 자극(2차 항원 프라이밍 단계)(항원 표적에 특이적인 단일 고친화도 단일클론 항체를 분비하는 회수된 클론성 B 세포의 능력 및 경향을 증대시킬 수 있음) 둘 다를 발생시키는 것으로 가정된다.
셋째로, 본 발명의 B 세포 선택 프로토콜이 평균적으로 높은 품질을 갖는, 즉 원하는 표적에 매우 선택적(항원 특이적)이고/이거나, 원하는 기능적 특성을 발현하는, IgG를 생성하는 농후화된 B 세포를 재현 가능하게 생성시킨다는 것이 (PSCK9, CGRP, 표적 1, NGF 및 표적 2 특이적 B 세포에 의해 본 명세서에서 관찰되는 것처럼) 관찰되었다. 상기에 부분적으로 기초하여, 본 발명의 방법에 의해 회수된 항원-농후화된 B 세포는 상기 기재된 바와 같은 에피토프 특이성의 원하는 완전 보체를 생성시킬 수 있는 B 세포를 함유하는 것으로 생각된다.
넷째로, 본 발명의 B 세포 선택 프로토콜은, 심지어 작은 항원, 즉 100개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개 내지 50개의 길이의 아미노산의 펩타이드와 사용될 때, 펩타이드와 같은 작은 항원에 대한 단일 고친화도 항체를 분비하는 클론성 B 세포 배양을 재현 가능하게 생성시킨다는 것이 관찰되었다. 작은 펩타이드에 대한 고친화도 항체를 생성하는 것이 일반적으로 쾌 어렵고 노동 집약적이며 때때로 심지어 실행 가능하지 않으므로, 이것은 매우 놀랍다. 따라서, 본 발명은 원하는 펩타이드 표적, 예를 들어 바이러스, 박테리아 또는 자가항원 펩타이드에 대한 치료학적 항체를 생성시켜, 매우 구별되는 결합 특성을 갖는 단일클론 항체를 생성시키거나, 심지어 상이한 펩타이드 표적, 예를 들어 상이한 바이러스 균주에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 생성시키도록, 사용될 수 있다. 이 이점은 원하는 원자가를 갖는 치료학적 또는 예방학적 백신, 예컨대 상이한 HPV 균주에 대한 보호 면역을 유도하는 HPV 백신의 생성의 상황에서 특히 유용할 수 있다.
다섯째로, 본 발명의 B 세포 선택 프로토콜은, 특히 토끼로부터 유래한 B 세포와 사용될 때, 내인성 인간 면역글로불린(아미노산 수준에서 대략 90% 유사)에 매우 유사하고, 인간 면역글로불린에 매우 유사한 길이를 보유한 CDR을 함유하고, 따라서 잠재적인 면역원성 문제를 제거하기 위해 서열 변형을 요하지 않거나 적게 필요한(통상적으로 기껏해야 CDR 및/또는 프레임워크 잔기가 오직 약간 모 항체 서열에서 변형될 수 있음), 항원-특이적 항체 서열을 재현 가능하게 생성하는 경향이 있다. 특히, 바람직하게는 재조합 항체는 항원 인식에 필요한 숙주(토끼) CDR1 및 CDR2 잔기, 및 전체 CDR3을 오직 포함할 것이다. 이에 의해, 본 발명의 B 세포 및 항체 선택 프로토콜에 따라 생성된 회수된 항체 서열의 높은 항원 결합 친화도는 심지어 인간화에 의해 온전하거나 실질적으로 온전하다.
종합하면, 본 발명의 방법은 이전에 공지된 더 효과적인 프로토콜의 사용에 의해 더 명확한 에피토프에 더 높은 결합 친화도를 나타내는 항체를 생성하도록 사용될 수 있다.
항체 분비 세포의 획득
본 명세서에 개시된 방법은 면역화된 숙주로부터 면역 세포 함유 세포 집단을 획득하는 단계를 포함한다. 면역화된 숙주로부터 면역 세포 함유 세포 집단을 획득하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 일반적으로 숙주에 대한 면역 반응을 유도하는 단계 및 숙주로부터 세포를 수확하여 하나 이상의 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 상기 반응은 원하는 항원에 대해 숙주를 면역화함으로써 유발될 수 있다. 대안적으로, 이러한 면역 세포의 공급원으로서 사용된 숙주는 원하는 항원, 예컨대 특정한 병원균, 예컨대 박테리아 또는 바이러스에 의해 감염된 개체에 자연히 노출될 수 있거나, 대안적으로 개인이 이환된 암에 대한 특이적 항체 반응을 개시한다.
숙주 동물은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 기니아 피그, 토끼, 마우스, 래트, 비인간 원시류, 인간 및 다른 포유동물 및 설치류, 닭, 소, 돼지, 염소 및 양을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 숙주는 포유동물; 더 바람직하게는 토끼, 마우스, 래트 또는 인간; 가장 바람직하게는, 토끼이다. 항원에 노출될 때, 숙주는 항원에 대한 선천성 면역 반응의 일부로서 항체를 생성한다. 언급된 바대로, 면역 반응은 질환의 결과로서 자연히 발생할 수 있거나, 항원에 의한 면역화에 의해 유도될 수 있다. 면역화는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 면역 반응을 증대시키는 물질, 예컨대 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬번트(Freund's adjuvant)와 함께 또는 이것 없이, 항원의 하나 이상의 주사에 의해 수행된다. 생체내 숙주 동물을 면역화하는 것에 대안으로서, 상기 방법은 실험실내 숙주 세포 배양물의 면역화 또는 DNA 면역화를 포함할 수 있다.
(예를 들어, 혈청 항체 검출에 의해 측정된) 면역 반응에 대한 시간을 허용한 후, 숙주 동물 세포를 수확하여 하나 이상의 면역 세포 함유 세포 집단을 얻는다. 수확된 세포 집단은 바람직하게는 비장, 림프절, 골수, 혈액 및/또는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 중 적어도 하나로부터 유래한다. 세포를 하나 초과의 공급원으로부터 수확하고 혼주할 수 있다. 소정의 공급원은 소정의 항원에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 비장, 림프절 및 전혈은 PCSK9, CGRP, 표적 1, NGF 및 표적 2에 바람직하다. 이후, 숙주 동물의 혈청에 존재하는 항원-특이적 및/또는 중화 항체의 역가를 결정할 수 있다.
세포 집단을 면역화 후 약 20일 내지 약 90일에, 또는 이것 내의 증분에, 바람직하게는 약 50일 내지 약 60일에 수확한다. 수확된 세포 집단 및/또는 이로부터의 단일 세포 현탁액을 항체 선택을 위해 농후화하고/하거나, 스크리닝하고/하거나, 배양할 수 있다. 수확된 세포 집단 내의 항원-특이적 세포의 빈도는 보통 약 1% 내지 약 5%, 또는 이것 내의 증분이다.
본원에 걸쳐, 용어 "증분"은 예를 들어 가장 가까운 10, 1, 0.1, 0.01 등으로 다양한 정도의 정확도의 숫자 값을 한정하도록 사용된다. 증분은 임의의 측정 가능한 정도의 정확도로 올림될 수 있고, 증분은 범위의 양측에서 동일한 정도의 정확도로 올림될 필요가 없다. 예를 들어, 1 내지 100의 범위 또는 이것 내의 증분은 20 내지 80, 5 내지 50, 및 0.4 내지 98과 같은 범위를 포함한다. 범위가 100 미만의 범위와 같이 말단 개방될 때, 이것 내의 증분은 100과 측정 가능한 한계 사이의 증분을 의미한다. 온도와 같은 숫자가 0에 의해 제한되지 않는 한, 예를 들어 100 미만, 또는 이것 내의 증분은 0 내지 100, 또는 이것 내의 증분을 의미한다.
항체 분비 세포의
농후화
본 발명은 단일 항체를 생성하는 B 세포를 단리하는 기존의 방법에 대한 개선을 제공한다. 특히, 상기 방법은 숙주로부터 얻은 B 세포를 농후화하여 B 세포의 농후화된 집단을 얻는 것을 포함하는 농후화 단계 (ⅱ)를 포함한다. 농후화 단계의 결과로서, 후속하는 배양 단계는 더 적은 세포를 요하고, 예를 들어 다중웰 조직 배양 플레이트 내의 개별적인 웰은 더 낮은 B 세포 배양 농도로 시딩될 수 있고, 원하는 성공률을 여전히 성취한다. 예를 들어, 아주 적은 약 10개 또는 약 25개의 농후화된 B 세포를 후속하여 다중웰 플레이트의 각각의 웰에서 배양할 수 있고, 항원-특이적 항체를 여전히 생성한다.
항체가 항원-특이적 세포의 낮은 빈도를 갖는 세포 집단으로부터 생성된 이전의 기법과 반대로, 본 발명은 항원-특이적 세포의 높은 빈도 중에서 항체 선택을 허용한다. 항체 선택 전에 농후화 단계가 이용될 수 있으므로, 항체 생성에 사용된, 대부분의 세포, 바람직하게는 실질적으로 모든 세포는 항원-특이적이다. 항원 특이성의 빈도가 증가한 세포의 집단으로부터 항체를 생성함으로써, 항체의 분량 및 다양성이 증가한다.
B 세포의 농후화된 집단은 농후화 전의 B 세포 샘플에 비해 더 높은 백분율의 항원-특이적 B 세포, 즉 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 생성하는 세포를 함유한다. 일 실시형태에서, 농후화된 B 세포 집단에서의 항원-특이적 B 세포의 백분율은 적어도 1%, 5% 또는 10%이다.
농후화 단계는 임의의 선택 단계(들), 예를 들어 세포 집단으로부터 특정한 B 세포를 선택하는 단계 및/또는 특정한 세포에 의해 생성된 항체를 선택하는 단계에 선행한다. 클론성 B 세포 집단의 형성을 선호하는 조건 하에 농후화된 B 세포 집단을 배양한 후, 농후화는 상기 항원에 특이적인 단일 단일클론 항체를 생성하는 B 세포의 클론성 집단의 획득을 발생시킨다.
본원에 걸쳐, "B 세포의 클론성 집단"은 원하는 항원에 특이적인 단일 항체만을 분비하는 B 세포의 집단을 의미한다. 즉, 이 세포는 원하는 항원에 특이적인 단일클론 항체의 오직 일 유형을 생성한다.
본원에서, 세포 집단 세포의 "농후화"는, 혼합된 세포 집단, 예를 들어 원하는 항원에 대해 면역화된 숙주로부터 유래한 B 세포 함유 단리물에서 함유된, 원하는 세포, 통상적으로 항원-특이적 B 세포의 빈도를 증가시키는 것을 의미한다. 따라서, 농후화된 세포 집단은 농후화 단계의 결과로서 더 높은 빈도 및/또는 더 높은 백분율의 항원-특이적 세포를 갖는 세포 집단을 포함하지만, 이 세포 집단은 상이한 항체를 함유하고 생성할 수 있다.
일반 용어 "세포 집단"은, 다수의 농후화 단계가 수행될 때, 세포 집단이 농후화 전 및 후 둘 다일 수 있다는 것에 유념하여, 농후화 전 및 후의 세포 집단을 포함한다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개 이상의 단계로서 농후화 단계를 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 다수의 농후화 단계, 예컨대
(a) 관심 대상 항원에 면역화되거나 자연히 노출된 숙주로부터 B 세포를 얻고, 수확된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계;
(b) 상기 B 세포 단일 세포 현탁액의 분획을 농후화하여, 농후화 전의 B 세포 분획에 비해 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 생성하는 더 높은 백분율의 B 세포를 함유하는 항원-특이적 B 세포의 제1 농후화된 집단을 얻는 단계;
(c) 제1 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 농후화하여, 제1 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단에 비해 더 높은 백분율의 항원-특이적 B 세포를 함유하는 제2 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 형성하는 단계;
(d) 제2 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 농후화하여, 제2 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단에 비해 더 높은 백분율의 항원-특이적 B 세포를 함유하는 제3 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 형성하는 단계;
(e) 제3 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 배양하여 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(f) 제3 농후화된 세포 집단으로부터 단리된 항원-특이적 세포에 의해 생성된 항체를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
각각의 세포 집단은 다음 단계에서 직접적으로 사용될 수 있거나, 단기간 또는 장기간 저장 동안 또는 이후의 단계, 예를 들어 검출, 단리, 염색 및 분류 동안 부분적으로 또는 전체적으로 (예를 들어, -70℃ 또는 -80℃에서 또는 액체 질소 중에) 냉동될 수 있다. 또한, 세포 집단으로부터의 세포를 개별적으로 현탁하여 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다. 단일 세포 현탁액을 농후화할 수 있어서, 단일 세포 현탁액은 농후화 전의 세포 집단으로 작용한다. 이후, 하나 이상의 항원-특이적 단일 세포 현탁액은 함께 농후화된 세포 집단을 형성하고; 항원-특이적 단일 세포 현탁액은 추가의 분석 및/또는 항체 생성을 위해 함께 그룹화되고, 예를 들어 재도말될 수 있다.
언급된 바대로, 본 발명의 과정에서 사용된 농후화된 B 세포 집단은 상이한 순서로 반복되거나 수행될 수 있는, 본 명세서에 기재된 단계에 따른 항체 선택을 위해, 또한 추가로 농후화되고/되거나, 스크리닝되고/되거나, 배양될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 농후화된, 바람직하게는 클론성 항원-특이적 세포 집단의 적어도 하나의 세포는 항체 선택을 위해 단리되고 배양되고 사용된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은
a. 면역화된 숙주로부터 세포 집단을 수확하여 수확된 세포 집단을 얻는 단계;
b. 수확된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 단일 세포 현탁액을 생성하는 단계;
c. 바람직하게는 크로마토그래피에 의해 적어도 하나의 단일 세포 현탁액을 농후화하여 제1 농후화된 세포 집단을 형성하는 단계;
d. 바람직하게는 ELISA 검정에 의해 제1 농후화된 세포 집단을 농후화하여 바람직하게는 클론성인(즉, 이것은 오직 단일 유형의 항원-특이적 B 세포를 함유함) 제2 농후화된 세포 집단을 형성하는 단계;
e. 바람직하게는 ELISA 검정에 의해 제2 농후화된 세포 집단을 농후화하여 원하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 단일의 또는 적은 수의 B 세포를 함유하는 제3 농후화된 세포 집단을 형성하는 단계;
f. 제3 농후화된 세포 집단을 배양하여 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 세포 집단을 생성하는 단계; 및
g. 제3 농후화된 세포 집단으로부터 단리된 항원-특이적 세포에 의해 생성된 항체를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 단일 B 세포는, 단일 B 세포가 항원-특이성 및/또는 원하는 특성을 갖는 항체를 분비하는지를 확인하기 전에, 농후화된 세포 집단으로부터 단리된다. 다른 실시형태에서, 농후화된 B 세포는 다중웰 플레이트에서 배양되고, 각각의 개별적인 웰은 약 1개 내지 약 200개의 농후화된 B 세포를 함유한다. 예를 들어, 다중웰 플레이트의 각각의 개별적인 웰은 적어도 1개, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 농후화된 B 세포를 함유한다. 바람직하게는, 약 50개 내지 약 100개의 농후화된 B 세포, 약 25개 내지 약 50개의 농후화된 B 세포, 또는 약 10개 내지 약 25개의 농후화된 B 세포가 웰마다 시딩된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포 집단을 농후화하여 약 50% 내지 약 100%, 또는 이것 내의 증분인 항원-특이적 세포 빈도를 갖는 농후화된 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 농후화된 세포 집단은 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 이상의 항원-특이적 세포 빈도를 갖는다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 집단을 농후화하는 방법을 제공하고, 이에 의해 항원-특이적 세포의 빈도는 적어도 약 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 1000배 또는 10,000배, 또는 이것 내의 증분으로 증가한다.
항원-특이성은 임의의 항원과 관련하여 측정될 수 있다. 항원은 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편; 탄수화물; 유기 분자 및 무기 분자; 동물 세포, 박테리아 세포 및 바이러스에 의해 생성된 수용체; 효소; 생물학적 경로의 효현제 및 길항제; 호르몬; 및 사이토카인(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 항체가 결합할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 예시적인 항원은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, 안지오텐신 II, BAFF, CGRP, CXCL13, IP-10, PCSK9, NGF, Nav1.7, VEGF, EPO, EGF 및 HRG를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 항원은 CGRP, PCSK9, Nav1.7, NGF, 안지오텐신 II, IL-6, IL-13, TNF-α 및 VEGF-α를 포함한다.
하나 초과의 농후화 단계를 이용하는 방법에서, 각각의 농후화 단계에서 사용된 항원은 또 다른 농후화 단계에서 사용된 항원과 동일하거나 상이할 수 있다. 동일한 항원에 의한 다수의 농후화 단계는 항원-특이적 세포의 다수의 및/또는 다양한 집단을 생성할 수 있지만, 상이한 항원에 의한 다수의 농후화 단계는 상이한 항원에 대한 상호 특이성(cross-specificity)을 갖는 농후화된 세포 집단을 생성할 수 있다.
세포 집단의 농후화를 항원-특이적 세포를 단리하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 세포-선택 수단에 의해 수행할 수 있다. 예시적인 항원 결합 검정은 방사성 검정 및 비방사성 검정을 포함하고, 비방사성 검정은 광학 방법, 예를 들어 형광, 인광, 화학발광, 전기화학발광, 형광 분극, 형광 공명 에너지 전달 또는 표면 플라스몬 공명에 기초한다. 일 실시형태에서, 항원 인식의 검출은 방사면역검정(RIA), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역침강, 형광 면역검정, 웨스턴 블롯, 표면 플라스몬 공명(프로테온(ProteOn) 또는 비아코어(등록상표)) 분석 또는 또 다른 항원 결합 검정을 포함한다. 바람직하게는, ELISA를 이용하여 항원 인식을 수행한다.
크로마토그래피 기법, 예를 들어 친화도 정제에 의해 세포 집단을 농후화할 수 있다. 예를 들어, 고체 기질(예를 들어, 자석 비드, 예컨대 밀테위(Miltenyi) MACS(등록상표) 마이크로비드 또는 비자석 비드, 예컨대 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 비드) 또는 지지체(예를 들어, 자기 칼럼, 예컨대 밀테위 MS 칼럼(밀테위 바이오테크(Miltenyi Biotech)) 또는 비자기 칼럼, 예컨대 스핀 칼럼 및 중력류 칼럼)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원을 사용하여 항원-특이적 B 세포를 정제할 수 있다.
일 실시형태에서, 바람직하게는 밀테위 비드를 사용함으로써 수확된 세포 집단으로부터의 단일 세포 현탁액을 농후화한다. 예를 들어, 단일-세포 현탁액에서의 세포를 MACS(등록상표) 마이크로비드에 의해 자기적으로 표지할 수 있고, 샘플을 MACS(등록상표) 분리기에 위치한 MACS(등록상표) 칼럼에 적용할 수 있다. 비표지된 세포는 통과하지만, 자기적으로 표지된 세포는 칼럼 내 보유된다. 통과물은 비표지된 세포 분획으로 수집될 수 있다. 짧은 세척 단계 후, 분리기로부터 칼럼을 제거할 수 있고, 칼럼으로부터 자기적으로 표지된 세포를 용리시킬 수 있다.
약 1% 내지 약 5%의 항원-특이적 세포의 빈도를 갖는 수확된 세포 집단으로부터, 100%에 근접하는 항원-특이적 세포의 빈도를 갖는 농후화된 세포 집단이 따라서 유도된다.
고체 기질 또는 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 관심 대상 항원을 부착할 수 있다. 예를 들어, 항원을 바이오티닐화하고, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 뉴트라비딘을 통해 기질 또는 지지체에 부착할 수 있다. 일 실시형태에서, 농후화 단계 (ⅱ)는 고체 기질 또는 지지체, 예컨대 자석 비드 또는 칼럼에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원을 사용한 항원-특이적 B 세포의 친화도 정제를 포함한다. 바람직하게는, 항원은 바이오티닐화되고, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 뉴트라비딘을 통해 기질 또는 지지체에 부착된다.
일 실시형태에서, 농후화 단계는 (1) B 세포를 바이오틴 표지 항원과 조합하는 단계; (2) 임의로, B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 세척하는 단계; (3) 스트렙타비딘 비드를 (1) 또는 (2)의 B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물로 도입하는 단계; (4) 칼럼 위로 스트렙타비딘 비드/B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 통과시키는 단계; 및 (5) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 농후화 단계는 (1) 바이오틴 표지 항원을 스트렙타비딘 비드와 조합하는 단계; (2) 칼럼 위로 바이오틴 표지 항원/스트렙타비딘 비드 조성물을 통과시키는 단계; (3) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 바이오틴 표지 항원 코팅된 비드를 용리시키는 단계; (4) B 세포를 코팅된 비드와 조합하는 단계; (5) 칼럼 위로 B 세포와 코팅된 비드의 혼합물을 통과시키는 단계; 및 (6) 칼럼을 세척하고 칼럼으로부터 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 이 농후화 방법 또는 이들의 조합을 이용할 수 있고, 임의로 적어도 1회 반복하여 추가의 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 생성할 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 항원-특이성 검정 기법을 수행함으로써 세포 집단을 또한 농후화할 수 있다. 예를 들어, 세포를 항원 로딩된 비드 및 표지된, 예를 들어 형광단, 항-숙주 항체(B 세포를 수확하기 위해 사용된 숙주에 특이적임)와 접촉시키는 것을 포함하는 할로 검정(halo assay)을 이용할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 세포 집단을 농후화하기 위해 유동세포계수법을 이용한다. 하기 기재된 바대로, 염색 및 분류에 의해 항원-특이적 B 선택을 단리시킬 수 있다. 간단히 말하면, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 면역자기 세포 분류(MACS)를 이용하여 원하는 특성, 예를 들어 생육성, IgG 발현 및/또는 크기에 기초하여 항원-특이적 B 세포를 선택할 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 단일 세포 현탁액에서 적어도 하나의 검정 농후화 단계를 수행한다. 다른 실시형태에서, 세포 집단을 농후화하는 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 농후화 단계 및 적어도 하나의 검정 농후화 단계를 포함한다.
크기 또는 밀도에 의해 세포 집단을 "농후화"하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,627,052호를 참조한다. 항원-특이성에 의해 세포 집단을 농후화하는 것 이외에 이 단계를 본 방법에서 이용할 수 있다.
본 발명의 세포 집단은 항원을 인식할 수 있는 적어도 하나의 세포를 함유한다. 항원 인식 세포는 B 세포, 혈장 세포 및 이의 자손을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명은 단일 유형의 항원-특이적 B 세포를 함유하는 클론성 세포 집단을 제공하고, 즉 B 세포 집단은 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 단일 단일클론 항체를 생성한다.
B 세포의 클론성 항원-특이적 집단이, 본 명세서에서 제공된 신규한 배양 및 선택 프로토콜에 의해 얻은, 항원-특이적 항체를 분비하는 세포로 주로 이루어지는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 항원-특이적 항체를 분비하는 세포를 함유하는 농후화된 세포 집단을 얻는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 약 50% 내지 약 100%, 또는 이것 내의 증분, 또는 약 60% 이상, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 항원-특이적 항체를 분비하는 세포를 함유하는 농후화된 세포 집단을 제공하다. 바람직하게는, 농후화된 세포 집단은 약 10,000개 이하의 항원-특이적 항체를 분비하는 세포, 더 바람직하게는 약 50개 내지 10,000개, 약 50개 내지 5,000개, 약 50개 내지 1,000개, 약 50개 내지 500개, 약 50개 내지 250개, 또는 이것 내의 증분의 항원-특이적 항체를 분비하는 세포를 포함한다.
농후화된 항원-특이적 B 세포를, 항원-특이적 항체 가변 서열(예를 들어, VH 및 VL 사슬)을 코딩하는 핵산의 증폭, 증폭된 핵산의 서열분석, 상응하는 항체 폴리펩타이드를 생성하는 핵산의 발현 및 생성된 항체의 항원 인식의 결정의 임의의 단계 전에, 후속하여 배양하고, 항원 인식 검정에 의해 검출하고, 임의로, 기능적 활성에 대해 스크리닝하고, 단리하고, 염색하고 분류한다.
항원-특이적 가변 중쇄 구역 및/또는 가변 경쇄 구역을 발현하는 항체 서열을 클로닝하기 위해 항체 생성 및/또는 선택을 포함하는 방법에서 세포 집단의 농후화를 이용한다. 따라서, 본 발명은 항체의 선택 전에 세포 집단을 농후화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 하나의 항원-특이적 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 단계, 적어도 하나의 항원-특이적 세포를 단리시킴으로써 세포 집단을 농후화하여 농후화된 세포 집단을 형성하는 단계 및 적어도 하나의 항원-특이적 세포로부터 항체 생성을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 농후화된 세포 집단은 하나 초과의 항원-특이적 세포를 함유한다.
농후화된
항체 분비 세포 집단의 배양
상기 방법은 또한 배양 단계를 포함하고, 여기서 세포 집단은 바람직하게는 배양 웰마다 단일 증식하는 항체 분비 세포의 생존을 선호하는 조건 하에 영양세포층에서 적합한 배지(예를 들어, 활성화된 T 세포 조건 배지, 특히 1% 내지 5% 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지)와 배양될 수 있다. 조사된 세포 물질, 예를 들어 EL4B 세포로 일반적으로 이루어진 영양세포층은 세포 집단의 일부를 구성하지 않는다. 항체 생성에 충분한 시간, 예를 들어 약 1일 내지 약 2주, 약 1일 내지 약 10일, 적어도 약 3일, 약 3일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 7일, 적어도 약 7일, 또는 다른 이것 내의 증분 동안 적합한 조건 하에 적합한 배지에서 세포를 배양한다. 바람직하게는, 단일 항체를 생성하는 세포 및 이의 자손은 각각의 웰에서 생존하여, 각각의 웰에서 항원-특이적 B 세포의 클론성 집단을 제공한다.
클론성 세포 집단의 형성을 선호하는, 즉 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 조건 하에 단계 (ⅱ)로부터의 농후화된 세포 집단의 하나 이상의 분획을 별개로 배양한다. 일 실시형태에서, 농후화된 세포 집단의 하나 초과의 분획을 동일한 농후화된 세포 집단으로부터의 또 다른 분획과 동시에 별개로 배양한다.
일 실시형태에서, 클론성 항원-특이적 B 세포 집단으로부터 항체 생성 세포를 단리시키고/시키거나, 상기 B 세포를 사용하는 항체, 또는 이러한 항체에 상응하는 핵산 서열을 생성하기 전에, 상기 집단을 생성시키는 조건 하에, 단계 (ⅱ)에서 얻은 농후화된 B 세포 집단의 항원-특이적 B 세포를 배양한다.
농후화된 집단으로부터의 세포를 조합하고 공급 세포와 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 농후화된 세포를 적어도 약 1일 내지 9일, 약 2일 내지 8일, 약 3일 내지 7일, 약 4일 내지 6일, 또는 바람직하게는, 약 5일 내지 7일 동안 이 조건 하에 배양한다. 일 실시형태에서, 공급 세포, 바람직하게는 조사된 EL4 세포(예를 들어, EB4 세포 서브라인 EB4.B5)를 갖는 활성화된 T 세포 조건 배지를 포함하는 배지에서 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단으로부터의 B 세포를 배양한다. 바람직한 실시형태에서, 약 1% 내지 약 5%의 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지를 포함하는 배지에서 농후화된 B 세포를 배양한다.
일 실시형태에서, 수확된 세포 집단으로부터의 농후화된 세포 집단, 예컨대 항원-특이적 단일 세포 현탁액을 다양한 세포 밀도(예를 들어, 웰당 10개, 25개, 50개, 100, 250개, 500개, 또는 1개 내지 1000개의 다른 증분의 세포)로 도말하고, 다중웰 플레이트에서 배양한다. 예를 들어, 농후화된 B 세포를 다중웰 플레이트에서 배양할 수 있고, 각각의 웰은 적어도 1개, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 농후화된 B 세포를 함유한다. 바람직하게는, 각각의 웰은 약 10개 내지 약 100개의 농후화된 B 세포, 약 25개 내지 약 50개의 농후화된 B 세포, 또는 약 10개 내지 약 25개의 농후화된 B 세포를 함유한다. 농후화 단계의 결과로서, 후속적인 배양 단계는 더 적은 세포를 요하고, 예를 들어 다중웰 조직 배양 플레이트에서의 개별적인 웰은 더 낮은 B 세포 배양 농도로 시딩될 수 있고, 원하는 성공률을 여전히 성취한다.
이 단계에서, 클론성 집단에 의해 생성된 면역글로불린 G(IgG)는 항원 특이성과 매우 상관된다. 바람직한 실시형태에서, IgG는 약 50% 초과, 더 바람직하게는 70% 초과, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 이것 내의 증분인 항원 특이성과의 상관관계를 나타낸다. 웰마다 단일 항원-특이적 항체 생성물을 확립하는 제한 조건 하에 B 세포 배양을 설정함으로써 상관관계가 입증된다. 일반적인 IgG 합성에 대한 항원-특이성을 비교한다. 3개의 집단이 관찰되었다: 항원의 단일 포맷을 인식하는 IgG(바이오티닐화 및 직접적인 코팅), 검출 가능한 IgG 및 부동화와 무관한 항원 인식, 및 IgG 생성 단독. IgG 생성은 항원-특이성과 매우 상관된다.
항원 인식 및 기능적 활성에 대한 항체 분비 세포의 스크리닝
농후화 단계 이외에, 항체 선택에 대한 방법은 또한 항원 인식 및 임의로 항체 기능성에 대해 세포 집단을 스크리닝하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 예를 들어, 원하는 항체는 특정한 구조 특징, 예컨대 특정한 에피토프에 대한 결합 또는 특정한 구조의 모방; 길항제 또는 효현제 활성; 또는 중화 활성, 예를 들어 항원과 리간드 사이의 결합의 저해를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 기능성 스크린은 리간드 독립적이다.
일 실시형태에서, 원하는 분비된 단일클론 항체의 존재를 검출하기 위해 상기 기재된 상청액이 임의로 스크리닝되는, 농후화된, 바람직하게는 클론성 항원-특이적 B 세포 집단을 약간의 B 세포, 바람직하게는 단일 B 세포의 단리에 사용할 수 있고, 이 세포를 이후 클론성 B 세포 집단에서 단일 항체를 생성하는 B 세포의 존재를 확인하도록 적절한 검정에서 시험한다. 일 실시형태에서, 약 1개 내지 약 20개의 세포, 바람직하게는 약 15개 미만, 12개, 10개, 5개 또는 3개, 또는 이것 내의 증분의 세포, 가장 바람직하게는 단일 세포를 클론성 B 세포 집단으로부터 단리한다. 바람직하게는 항원-특이성 검정, 특히 ELISA 검정(예를 들어, 상기 기재된 바대로 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 의한 바이오티닐화된 항원 포획을 이용한 선택적 항원 부동화)에 의해 스크린을 수행한다.
항원 결합 친화도; 항원-리간드 결합의 효현작용 또는 길항작용, 특이적 표적 세포 유형의 증식의 유도 또는 저해; 표적 세포의 용해의 유도 또는 저해, 및 항원을 포함하는 생물학적 경로의 유도 또는 저해 중 적어도 하나에 대해 항체 함유 상청액을 또한 스크리닝할 수 있다. 적합한 스크리닝 단계는 확인된 항원-특이적 B 세포에 의해 생성된 항체가 최소 항원 결합 친화도를 보유하는 항체를 생성하는지, 항체가 리간드에 대한 원하는 항원의 결합을 효현시키거나 길항시키는지; 항체가 특이적 세포 유형의 증식을 유도하거나 저해하는지; 항체가 표적 세포에 대한 세포융해 반응을 유도하거나 유발하는지; 항체가 특이적 에피토프에 결합하는지; 및 항체가 항원을 포함하는 특이적 생물학적 경로 또는 경로들을 조절(저해 또는 효현)하는지를 검출하는 검정 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체 기능성에 대한 스크리닝은 항원 리간드와 재조합 수용체 단백질의 자연 상호작용을 재생성하는 실험실내 단백질-단백질 상호작용 검정; 및 리간드 독립적이고 쉽게 모니터링되는 세포 기반 반응(예를 들어, 증식 반응)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 항체 기능은 T1165 세포 증식, TF1 세포 증식, SK-N-MC 세포에서의 cAMP 생성 또는 PCSK9/LDLR 저해를 포함한다.
일반적으로, 항체를 함유하는 상청액을 수집하고, 이것을 상기 기재된 단계에 따른 항체 선택을 위해 농후화하고/하거나, 스크리닝하고/하거나, 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 상청액을 (바람직하게는 항원-특이성 검정, 특히 ELISA 검정에 의해) 농후화하고/하거나, 항체 기능성에 대해 스크리닝한다.
일 실시형태에서, 항체 선택을 위한 방법은 저해 백분율(%)을 측정함으로써 항체 기능성에 대해 세포 집단을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터 발현된 재조합 항체를 얻을 때, 저해 농도(IC50)를 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 단리된, 항원-특이적 세포 중 적어도 하나는 약 100 미만, 50, 30, 25, 10㎍/㎖, 또는 이것 내의 증분의 IC50을 갖는 항체를 생성한다.
다른 실시형태에서, 항체 선택을 위한 방법은 항체 결합 강도에 대해 세포 집단을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 임의의 당해 분야에 공지된 방법(예를 들어, 표면 플라스몬 공명(비아코어(등록상표)))에 의해 항체 결합 강도를 측정할 수 있다. 단리된, 항원-특이적 세포 중 적어도 하나는 높은 항원 친화도, 예를 들어 약 5x10-10M-1 미만, 바람직하게는 약 1x10-13 내지 5x10-10, 1x10-12 내지 1x10-10, 1x10-12 내지 7.5x10-11, 1x10-11 내지 2x10-11, 약 1.5x10-11 이하, 또는 이것 내의 증분의 분해 상수(KD)를 갖는 항체를 생성할 수 있다. 이 실시형태에서, 항체는 친화도 성숙이라 칭해진다. 예를 들어, 항체의 친화도는 파노렉스(Panorex)(등록상표)(에드레콜로맙), 리툭산(Rituxan)(등록상표)(리툭시맙), 허셉틴(Herceptin)(등록상표)(트라추주맙), 마일로타그(Mylotarg)(등록상표)(겐투주맙), 캄파쓰(Campath)(등록상표)(알렘투주맙), 제발린(Zevalin)(상표명)(이브리투모맙), 얼비툭스(Erbitux)(상표명)(세툭시맙), 아바스틴(Avastin)(상표명)(베비시주맙), 랍티바(Raptiva)(상표명)(에팔리주맙), 레미케이드(Remicade)(등록상표)(인플릭시맙), 휴미라(Humira)(상표명)(아달리무맙) 및 졸레어(Xolair)(상표명)(오말리주맙) 중 임의의 하나의 친화도에 필적하거나 이보다 높다. 공지된 친화도 성숙 기법에 의해 항체의 친화도는 또한 증가할 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 기능성 및 항체 결합 강도 중 적어도 하나, 바람직하게는 둘 다에 대해 적어도 하나의 세포 집단을 스크리닝한다.
농후화 단계 이외에, 항체 선택을 위한 방법은 항체 서열 상동성, 특히 인간 상동성에 대해 세포 집단을 스크리닝하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 단리된, 항원-특이적 세포 중 적어도 하나는 약 50% 내지 약 100%, 또는 이것 내의 증분, 또는 약 60% 초과, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 상동성의 인간 항체의 상동성을 갖는 항체를 생성한다. 항체를 인간화하여 CDR 그래프팅 또는 선택도 결정 잔기 그래프팅(selectivity determining residue grafting: SDR)과 같은 당해 분야에 공지된 기법에 의해 인간 서열에 대한 상동성을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 또한 IC50, KD 및/또는 상동성의 면에서 상기 기재된 임의의 실시형태에 따라 항체 그 자체를 제공한다.
항체 분비 세포의 단리: 염색 및 분류
농후화 단계 이외에, 항체 선택을 위한 방법은 또한 단일 항체를 생성하는 세포를 단리시키기 위해 항체 분비 세포를 염색하고 분류하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특히, 염색된 세포의 양성 또는 음성 선택을 수월하게 하는 하나 이상의 라벨을 사용하여 특이적 표현형, 예를 들어 생육성, 표면 마커 발현 등을 갖는 항원-특이적 세포를 확인하기 위해 세포 집단을 염색함으로써 클론성 집단에서의 단일 항원-특이적 세포를 단리시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 후속적인 분류를 위해 농후화된 클론성 집단으로부터의 항원-특이적 B 세포를 염색한다. 항원-특이적 B 세포를 염색하기 위한 예시적인 라벨은 감마, 카파 또는 람다 표면 사슬에 결합하는 형광 및 비형광 시약; CD19; CD27; IgG; IgD; Ia; Fc 수용체; 또는 죽은 세포(예를 들어, PI 또는 7-AAD) 또는 생 세포(예를 들어, 칼세인 염료)를 선택적으로 염색하는 원하는 항원 및 시약을 포함한다. 분류의 특이성을 증가시키기 위해, 원하는 항원-특이적 세포를 표적화하는 다수의 라벨을 사용할 수 있다. 다수의 형광 라벨을 사용할 때, 1개 또는 2개의 레이저를 사용함으로써, 2개, 3개, 4개 이상의 색상에 의해 표지된 세포가 분류될 수 있도록, 명확한 여기/방출 파장을 선택한다.
통상적으로, 검출 시약에 결합하는 2차 검출 시약을 통해 간접적으로 검출 시약을 표지하거나 표지에 적합하게 한다. 이러한 표지화는 무엇보다 형광, 동위원소, 자성 및 상자성일 수 있다. 예를 들어, 소정의 물리적 특징을 갖는 단일 세포를 확인하기 위해 형광 라벨 또는 염료를 사용할 수 있다. 형광 라벨의 예는 630㎚, 525㎚, 575㎚, 675㎚, 610㎚ 및 650㎚ 대역 필터를 사용하여 검출될 수 있는, PI, FITC, PE, PC5(PE-Cy5), ECD(PE-텍사스 레드(Texas Red)) 및 Cy-크롬(Chrome)(R-PE)를 포함한다. 형광 라벨은 세포의 개별 항원 표면 마커에 기초하여 특정한 세포 유형을 특이적으로 확인하는 단일클론 항체에 접합될 수 있다. 세포의 혼합 집단에서, 별개의 하위집단을 구별하기 위해 상이한 형광 라벨을 사용할 수 있다. 하나 초과의 검출 시약을 사용하는 경우, 상이한 검출 시약을 (예를 들어, 상이한 형광단을 사용하여) 구별하여 표지한다.
일 실시형태에서, 항원-특이적 세포를 양성 또는 음성 선택을 수월하게 하는 라벨에 의해 염색한다. 염색 단계는 상이한 형광색소를 갖는 적어도 2개의 라벨을 이용한다. 면역형광을 이용하여 세포를 염색하는 예시적인 방법은 문헌[Radbruch, A., Flow Cytometry and Cell Sorting (Springer, 2nd Ed. 2010), Chapter 3]에 제공되어 있다. 예를 들어, 관심 대상 항원에 특이성을 갖는 항체를 발현하는 생육성 B 세포를 양성으로 선택하기 위해, B 세포를 형광색소 및 생육성 염료에 커플링된 항-IgG 항체에 의해 표지한다. 바람직하게는, 농후화된 항원-특이적 B 세포의 양성 염색은 세포를 IgG 생성 세포를 염색하는 제1 라벨(예를 들어, FITC-항-토끼 Fc) 및 죽은 세포를 염색하는 제2 라벨(예를 들어, PI 또는 7-AAD)에 의해 염색하는 것을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 아르곤 레이저의 488㎚ 스펙트럼 선에 의해 FITC-항-IgG 및 PI에 의해 염색된 항원-특이적 B 세포를 여기시킨다. 대안적으로, 생육성 항원-특이적 B 세포를 음성으로 선택하기 위해, 세포를 생육성 염료 및 샘플에 존재할 수 있는 다른 세포, 예를 들어 공급 세포에 결합하는 형광색소 커플링된 항체에 의해 표지한다. 바람직하게는, 농후화된 항원-특이적 B 세포의 음성 염색은 세포를 공급 세포를 표지하는 제1 라벨(예를 들어, Thy1.2) 및 죽은 세포를 표지하는 제2 라벨(예를 들어, PI 또는 7-AAD)에 의해 염색하는 것을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 아르곤 레이저의 488㎚ 스펙트럼 선에 의해 PE-항-Thy1.2 및 PI에 의해 염색된 항원-특이적 B 세포를 여기시킨다. 녹색(FITC) 및 적색(PE 및 PI) 형광을 각각 525㎚, 575㎚ 및 630㎚ 광대역 필터를 사용하여 수집한다.
게다가, 몇몇 실시형태에서, 염색 및 분류 전에 항원-특이적 세포를 함유하는 몇몇 개별적인 웰을 조합하거나 '혼주한다'(또한 '혼주된 세포 분류물'이라 칭함). 바람직하게는, 유사한 특성, 예를 들어 염색 및 분류 전에 결합 친화도 또는 기능성을 갖는 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 개별적인 웰을 조합한다. 염색 및 분류 단계 전에 임의의 수의 양성으로 확인된 웰(즉, 클론성 집단으로부터 항원-특이적 세포를 함유)을 조합할 수 있다. 일 실시형태에서, 염색 및 분류 전에 약 2개 내지 약 200개, 약 10개 내지 약 100개, 약 25개 내지 약 75개의 웰을 조합한다. 바람직하게는, 염색 및 분류 전에 약 2개 내지 약 10개, 약 10개 내지 약 50개의 웰, 또는 약 50개 내지 약 150개의 웰을 조합한다. 혼주된 세포 분류는 처리량 역량(throughput capacity)을 증가시키고, 벤치워크를 최소화한다. 혼주된 세포 분류물로부터 확인되고 임의의 클로닝 과정을 거쳐 추진되는, 독특한 서열로부터 생긴 항체는 기원의 특정 웰이 아니라 풀로 다시 추적될 수 있다.
대안적으로, 항원-특이적 세포를 함유하는 개별적인 웰을 별개로 염색하고 분류할 수 있다(또한 '단일 웰 분류물'이라 칭함). 단일 웰 분류는 제한된 처리량 역량을 갖지만, 독특한 서열을 클로닝하여 생긴 항체는 이의 기원의 웰로 직접적으로 추적될 수 있다. 부가적으로, 단일 웰 분류는 오리지널 스크린으로부터의 1차 결과와 더 직접적인 상관관계를 제공한다.
농후화, 배양 및 염색 단계 이외에, 상기 방법은, 소정의 원하는 표현형의 세포를 염색하기 위해 사용된 라벨의 존재 또는 부재에 기초하여, 염색된 항원-특이적 세포가 집단 및 하위집단으로 분류된 분류 단계를 또한 포함한다. 분류는 추가의 분석을 위해 관심 대상 세포를 포획하고 수집하게 한다. 수집되면, 현미경으로, 생화학으로 또는 기능적으로 세포를 분석할 수 있다. 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 다양한 유동세포계수법 방법론을 이용하여 염색된 세포를 분류할 수 있다. 유동세포계수법은 단일 세포의 다수의 물리적 특성을 동시에 측정하고 이후 분석한다. 측정된 예시적인 특성은 세포 크기, 상대 입도 또는 내부 복잡성, 및 상대 형광 강도를 포함한다. 각각의 세포의 특징은 이의 광 산란 및 형광 특성에 기초하고, 이 특성은 샘플 내의 하위집단에 대한 정보를 제공하도록 분석된다.
일 실시형태에서, 분류된 항원-특이적 세포에서 전방 산란 광(forward-scattered light: FSC) 및 측방 산란 광(side-scattered light: SSC) 데이터를 수집한다. FSC는 세포 표면적 또는 크기에 비례한다. 대부분 회절된 광의 측정으로서, FSC는 이의 형광과 무관하게 소정의 크기보다 큰 입자를 검출하는 적합한 방법을 제공한다. SSC는, 대부분 회절되고 반사된 광의 측정에 기초한, 내부 복잡성 또는 세포 입도에 비례한다. FSC 및 SSC의 상관된 측정은 불균일 세포 집단에서 세포 유형의 구별을 허용할 수 있다. FSC 및 SSC 데이터와 조합된, 염색 패턴, 예를 들어 형광을 이용하여 어느 세포가 샘플에 존재하는지를 확인하고 이의 상대 백분율을 계수할 수 있다. 이후, 원하는 특성에 기초하여 세포를 추가로 분류할 수 있다.
일 실시형태에서, 유동세포계수법, 예컨대 형광 활성화 세포 분류(FACS), 자기 활성화 세포 분류(MACS) 또는 미세유체공학을 이용하여 염색된 세포를 분류한다. 자동화 FACS(FACScan(상표명) 또는 BD 인플럭스(Influx)(상표명), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) 또는 EPICS 엘리트(Elite)(상표명), 벡만 콜터(Beckman Coulter)), 또는 MACS 기술(autoMACS(등록상표))을 이용하여 세포 분류를 수행하여 고속의 정확한 분류를 촉진할 수 있다. 일 실시형태에서, 염색된 항원-특이적 세포는 RT-PCR 반응 배지로 분류된 단일 세포이고, 이 배지는 분류된 B 세포에 의해 발현된 항체의 항원-특이적 가변 서열의 증폭을 수월하게 한다.
바람직하게는, 표지화에 기초하여 세포를 분류하는 것 이외에, 추가의 분석을 위해 포함되도록 세포의 특징을 규명하는 숫자 또는 그래프 경계를 설정하는, 게이팅을 이용하여 세포를 추가로 분류한다. 예를 들어, 관심 대상 집단 주위에 게이트를 작도할 수 있다. 게이트 또는 구역은 분석 또는 분류를 위해 사건을 단리시키도록 하위집단 주위에 작도된 경계이다. FSC 또는 세포 크기에 기초하여, 오직 원하는 크기의 세포의 분석을 허용하는 FSC 대 SSC 도면에서 게이트를 설정할 수 있다. 일 실시형태에서, 음성 항원-특이적 선택 또는 양성 항원-특이적 선택을 이용하여 분류된 B 세포를 FSC/SSC 게이팅에 의해 추가로 분류한다. 항원-특이적 B 세포의 게이팅된 하위집단이 개선된 증폭 속도와 상관되는 더 큰 더 적은 과립형 표현형을 갖는다.
게이팅 매개변수는 유사한 조성물의 비염색된 세포 집단에 의해 규정된 매개변수에 기초할 수 있다. 특히, 양성 선택(B 세포 염색), 음성 선택(EL4 공급 세포 염색) 및 생육성에 대한 게이트는 비염색된 집단의 자가형광에 기초하여 구축된다. 바람직하게는, 비염색된 집단에 기초한 게이트는 돌출된 게이트 내부에 해당하는 세포 집단의 백분율을 갖지 않거나 아주 적다. 부가적으로, 물리적 매개변수에 기초한 게이트는 예를 들어 집단에서 대부분의 세포(EL4 공급 세포인 것으로 추정됨)보다 더 크고 덜 과립형으로 확인된, 독특한 집단에 기초하여 구축될 수 있다. 세포 염색 시약의 첨가 없이 관심 대상 웰과 함께 배양 상청액의 기능적 검정에 의해 관심 없는 B 세포 배양 웰을 수확하고 처리한다.
확인된 항원-특이적 항체 또는 이의
변이체의
클로닝
본 발명은 또한, 적어도 하나의 원하는 기능적 특성, 예컨대 친화도, 결합도, 세포융해 활성 등을 임의로 보유하는 항원-특이적 B 세포에 의해 발현된 항체에 함유된, 항원-특이적 항체 서열, 즉 VH 및/또는 VL 구역을 클로닝하는 방법을 제공한다. 특히, 본 명세서에서 제공된 방법은 항체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 분류된 B 세포에 의해 발현된 항체의 항원-특이적 가변 서열을 증폭하고, 핵산을 서열분석하고, 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 핵산 또는 이의 변이체를 발현시킴으로써, 농후화된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 항원-특이적 세포로부터 항체를 생성하는 단계를 임의로 포함한다. 실험실내 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 임의의 적합한 방법을 이용할 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 방법은 원하는 항체를 코딩하는 폴리펩타이드 및 핵산 서열을, 전체적으로 또는 부분적으로, 단리시키고 서열분석하는 부가적인 단계를 추가로 포함한다. 관심 대상 항체 코딩 서열은 단리된 항원-특이적 세포로부터 확인된 핵산 및 아미노산 서열에 의해 코딩된 것, 및 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 확인된 핵산과 서열이 동일하지 않은 핵산, 및 이의 변이체를 포함한다.
변이체 폴리펩타이드는 아미노산(aa) 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환, 또는 비필수 아미노산을 제거하는, 예컨대 기능에 필요하지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의해 글라이코실화 부위를 변경하거나, 미스폴딩을 최소화하는, 치환일 수 있다. 변이체는 단백질의 특정한 구역(예를 들어, 기능적 도메인, 촉매 아미노산 잔기 등)의 증대된 생물학적 활성을 보유하거나 갖도록 설계될 수 있다. 변이체는 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 단편, 특히 생물학적 활성 단편 및/또는 기능적 도메인에 상응하는 단편을 포함한다. 클로닝된 유전자의 실험실내 돌연변이유발을 위한 기법이 공지되어 있다. 단백질제거 분해에 대한 이의 저항을 개선하거나, 용해도 특성을 최적화하거나, 치료제로서 이것이 더 적합하게 하도록, 보통의 분자 생물학적 기법을 이용하여 변형된 폴리펩타이드가 본 발명에 또한 포함된다.
이 확인된 핵산 서열 또는 변형된 버전 또는 이의 부분은 원하는 항원에 대해 재조합 항체를 생성하도록 원하는 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
상기 기재된 바대로, 이 방법은 또한 증가한 증폭 속도를 갖는(예를 들어, 더 많은 단리된 항원-특이적 B 세포가, 결합 및/또는 기능적 특성을 확인하도록, 서열분석되고 재조합으로 발현될 수 있는 항원-특이적 항체를 발현함) 항원-특이적 세포를 선택하는 세포 염색 및 분류 단계를 포함한다.
이전에 기재된 바대로, B 세포의 클론성 집단이 원하는 항원에 대해 항체를 생성하는 항체 분비 B 세포를 주로 포함하는 것으로 생각된다. 몇몇 항원 및 상이한 B 세포 집단에 의해 얻은 실험 결과에 기초하여, 클론으로 생성된 B 세포 및 본 발명에 따라 생성된 이로부터 유래한 단리된 항원-특이적 B 세포가, 통상적으로 비교적 높은 친화도를 갖고, 게다가 배양된 항원-특이적 B 세포로부터 단일클론 항체를 유도하는 다른 방법과 비교하여 더 높은 에피토프 다양성의 단일클론 항체의 선택을 효과적으로 및 재현 가능하게 생성하는, 단일클론 항체를 분비하는 것으로 또한 생각된다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 B 세포 선택 방법에서 사용된 면역 세포의 집단은 토끼로부터 유래할 것이다. 그러나, 면역 B 세포의 공급원으로서, 비인간 및 인간 숙주를 포함하는, 항체를 생성하는 다른 숙주를 대안적으로 사용할 수 있다. B 세포의 공급원으로서의 토끼의 사용이 본 발명의 방법에 의해 유래할 수 있는 단일클론 항체의 다양성을 증대시킬 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명에 따라 토끼로부터 유래한 항체 서열은 통상적으로 인간 항체 서열에 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 서열을 보유하여, 인간에서 사용하기에 이것이 선호되게 만드는데, 왜냐하면 이것이 거의 적은 항원성을 보유해야 하기 때문이다. 인간화의 과정에서, 최종 인간화된 항체는, 그래프팅에서 사용된 인간 표적 서열에 대하여, 이의 성질로 인해 극적으로 다른, 숙주 CDR 잔기의 하위세트로 보통 제한된, 훨씬 더 적은 외래/숙주 잔기 함량을 함유하다. 이는 인간화된 항체 단백질에서 완전한 활성 회수의 가능성을 증대시킨다.
원하는 단일클론 항체를 코딩하는 상응하는 핵산 서열을 유래시키도록 확인된 항원-특이적 세포를 사용할 수 있다. (RT-PCR 생성물의 직접적인 서열분석 또는 AluI 분해는 단일 단일클론 항체 유형이 웰마다 생성된다는 것을 확인시켜줄 수 있다.) 상기 언급된 바대로, 이 서열은 이것이 인간 약제에서 사용하기에 적합하도록, 예컨대 인간화에 의해 돌연변이될 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 선택된 항체의 폴리펩타이드 서열 또는 상응하는 핵산 서열을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 또한 바람직하게는 서열, 이의 단편, 또는 선택된 항체의 유전적으로 변형된 버전을 사용하여 재조합 항체를 생성하는 단계를 포함한다. 원하는 특성을 보유하도록 항체 서열을 돌연변이시키는 방법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고, 인간화, 키메라라화, 단쇄 항체의 생성을 포함하고; 이 돌연변이 방법은 원하는 이팩터 기능, 면역원성, 안정성, 글라이코실화의 제거 또는 부가 등을 보유하는 재조합 항체를 생성시킬 수 있다. 재조합 항체는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, COS, BHK, 인간 신장 293, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 양서류 세포(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 적합한 재조합 세포에 의해 생성될 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 반수체 또는 배수체 효모 세포, 즉, 반수체 또는 이배체 효모 세포, 특히 피치아 및 가장 통상적으로 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된다. 이전의 작업은 가능하게는 조사적, 진단학적 및 치료학적 용도에 적합한 기능적 항체를 생성하기 위한 비용 효과적인 플랫폼으로서 효모 피치아 파스토리스를 확립하는 것을 돕는다. 공동 소유된 미국 특허 제7,935,340호; 제7,927,863호 및 제8,268,582호(이들 각각 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에서 포함됨)를 참조한다. 재조합 단백질의 발현을 위한 피. 파스토리스 발효의 설계에 대한 방법들이 문헌에 또한 공지되어 있고, 최적화가 세포 밀도, 브로쓰 용적, 기질 공급 속도, 및 반응의 각각의 상의 길이를 포함하는 매개변수와 관련하여 기재되어 있다. 문헌[Zhang et al., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63]을 참조한다. 또한, 발명의 명칭이 "피치아 파스토리스와 같은 형질전환된 미생물에서 항체와 같은 다중 서브유닛 단백질의 고역가 및 고순도 생성을 위한 다중 카피 전략(MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS)"인 US 20130045888; 및 발명의 명칭이 "피치아 파스토리스와 같은 형질전환된 미생물에서 항체와 같은 다중 서브유닛 단백질의 고순도 생성(HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS)"인 US 20120277408을 참조한다.
피치아 파스토리스의 조작에 사용될 수 있는 예시적인 방법(배양, 형질전환 및 교배의 방법 포함)은 U.S. 20080003643, U.S. 20070298500 및 U.S. 20060270045를 포함하는 공개 출원 및 문헌[Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J. 및 Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.](이들 각각 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
특정한 실시형태에서, 상기 방법은,
a. 면역화되거나 항원에 자연히 노출된 동물로부터 B 세포를 얻어 숙주 항체를 생성하는 단계;
b. 항원 특이성 및 중화에 대해 숙주 항체를 스크리닝하는 단계;
c. 숙주로부터 B 세포를 수확하는 단계;
d. 수확된 B 세포를 농후화하여 증가한 항원-특이적 세포 빈도를 갖는 농후화된 세포 집단을 생성하는 단계;
e. 단일 B 세포의 생존을 선호하는 조건 하에 농후화된 세포 집단으로부터 하나 이상의 하위집단을 배양하여 적어도 하나의 배양 웰에서 클론성 집단을 생성하는 단계;
f. 클론성 집단이 항원에 특이적 항체를 생성하는지를 결정하는 단계;
g. 추정상 클론성 B 세포 배양물로부터 세포의 일부 또는 전부를 단리하고, 임의로 상이한 추정상 클론성 B 세포 배양물로부터 세포를 혼주하는 단계;
h. 양성 또는 음성 세포 분류를 수월하게 하는 적어도 하나의 라벨에 의해 상이한 추정상 클론성 B 세포 배양물로부터 임의로 혼주된 단리된 세포를 염색하는 단계;
i. 염색된 B 세포를 분류하고, 임의로, 분류된 염색된 B 세포를 게이팅한 후 분류된 B 세포를 RT-PCR 반응 배지로 위치시켜 B 세포에 의해 발현된 항체에 함유된 항원-특이적 가변 서열의 증폭을 수월하게 하는 단계;
j. 단일 B 세포에 의해 생성된 항체의 핵산 서열을 서열분석하는 단계;
k. 항원-특이적 항체 가변 구역을 코딩하는 증폭된 핵산을 발현시켜 항체 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
l. 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정하는 단계
를 포함한다.
항원-특이성 및/또는 항체 기능성에 대해 농후화된 항원-특이적 세포의 항원-특이적 세포 상청액을 스크리닝함으로써 결정 단계 (f)를 수행할 수 있다. 유사하게, 항원-특이성 및/또는 항체 기능성에 대해 재조합 항체를 스크리닝함으로써 결정 단계 (l)를 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, ELISA 검정을 이용하여 항원-특이성에 대해 농후화된 항원-특이적 B 세포 및/또는 재조합 항체의 상청액을 스크리닝한다.
본 발명자들은 본 명세서에서 제공된 확인 및 클로닝 방법이 다양한 항원에 대한 항체의 개선된 분량 및 다양성을 생성한다는 것을 입증하였다.
예를 들어, PCSK9 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는, 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터의 재조합으로 발현된 항-PCSK9 항체의 생성 후, PCSK9 결합 친화도를 결정하는 ELISA 검정 및 PCSK9와 LDLR의 상호작용을 조절하는 능력을 갖는 항체를 검출하는 LDL 유입 검정을 이용하여 재조합 항체를 스크리닝한다. 예를 들어, 문헌[Lagace et al. (2006) Secreted PCSK9 decreases the number of LDL receptors in hepatocytes and in livers of parabiotic mice. J. Clin. Investig. 116(11): 2995-3005]을 참조한다. ELISA 스크린을 사용하여 확인된 양성 웰에서 단일 웰 및 혼주된 세포 분류물 둘 다를 포함하는 전체 21개의 상이한 세포 분류물을 수행한다. 다수의 항체 서열을 단리하고, 본 명세서에 제공된 확인 및 클로닝 방법을 이용하여, 생성된 재조합 항체, 예를 들어 Ab1 및 Ab2를 생성한다(실시예 8 참조).
또 다른 예의 방식으로, CGRP 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는, 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터의 재조합으로 발현된 항-CGRP 항체의 생성 후, 항원 결합 친화도를 결정하는 ELISA 검정을 이용하여 재조합 항체를 스크리닝한다. 또한, SK-N-MC 세포에서 cAMP 생성을 차단하는 능력을 갖는 항체를 검출하는 검정을 이용하여 항-CGRP 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Zeller et al. (2008) CGRP function-blocking antibodies inhibit neurogenic vasodilation without affecting heart rate or arterial blood pressure in rate. Br J Pharmacol 155(7):1093-1103]을 참조한다. ELISA 스크린은 35개의 별개의 양성 웰(즉, 상당한 항원 인식 및 효력을 갖는 것으로 확인된 항체 상청액을 함유)을 확인하였다. 35개의 웰을 함께 혼주하고, 양성 및 음성 B 세포 선택에 대해 염색하고, 본 명세서에 기재된 RT-PCT 방법을 이용하여 단리된 혼주된 B 세포로부터 19개의 명확한 항체 서열을 생성한다. 부가적으로, 6개의 개별 양성 웰의 각각에서 단일 웰 분류물을 수행한다. 6개 중 5개의 웰은 항-CGRP 특이적 항체를 생성하는 것으로 결정되었다. 본 명세서에 제공된 확인 및 클로닝 방법을 이용하여 확인된 예시적인 항-CGRP 항체는 Ab3 및 Ab4를 포함한다(실시예 9 참조).
부가적으로, 표적 1 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는, 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터의 재조합으로 발현된 항-표적 1 항체의 생성 후, 표적 1 결합 친화도에 대한 ELISA 검정을 이용하여 재조합 항체를 스크리닝한다(실시예 10 참조).
게다가, NGF 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는, 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터의 재조합으로 발현된 항-NGF 항체의 생성 후, 항원 결합 친화도를 결정하는 ELISA 검정을 이용하여 재조합 항체를 스크리닝한다. TF1 인간 적백혈병성(erythroleukemic) 세포주에서 NGF 유도 증식을 중화시키는 능력을 갖는 항체를 검출하는 TF1 세포 증식 검정을 이용하여 항체를 또한 스크리닝한다. 예를 들어, 문헌[Chevalier et al. (1994) Expression and functionality of the trkA proto-oncogene product/NGF receptor in undifferentiated hematopoietic cells. Blood 83: 1479-1485]을 참조한다. ELISA 스크린은 몇몇 양성 웰을 확인하였고, 이중 54개의 양성 웰이 분류되었다. 특히, 34개의 웰이 단일 웰 분류물에서 분류되었고, 20개의 웰이 혼주된 분류물에서 분류되었다. 전체 8개의 상이한 분류물을 수행한 후 증폭시키고 서열분석한다. 이후, 생성된 항체를 기능적 특성, 예컨대 p75 반응성 및/또는 Ms NGF 교차 반응성에 대해 스크리닝하고, 15개의 상이한 항체, 예를 들어 Ab7 및 Ab8을 확인하였다(실시예 11 참조).
마지막으로, 표적 2 항원 특이성을 갖는 농후화된 B 세포로부터 생성된 항체의 항원-특이적 가변 구역을 코딩하는, 증폭되고 서열분석된 핵산으로부터의 재조합으로 발현된 항-표적 2 항체의 생성 후, 항원 결합 친화도를 결정하는 ELISA 검정을 이용하여 재조합 항체를 스크리닝한다(실시예 12 참조).
IL-6 및 TNFα에 대한 항체의 개선된 확인 및 생성이 또한 US 2007/0269868에 이전에 나타났다. 이 문헌에 개시된 방법은 농후화 방법 및 항원-특이적 세포 단리 방법, 즉 본 명세서에 제공된 염색 및 분류 단계를 포함하도록 쉽게 변형될 수 있다.
본 발명의 B 세포 선택 방법의 개관은 도 15a 내지 도 15c에 제공된다. 이들 도면은 비드/항원/세포 복합체가 얻어지는 초기 단계가 다른 2개의 예시적인 실시형태를 예시한다. 방법 1(도 15a, 상부 왼쪽 코너로부터 시작)에서, 수집된 면역 세포(예를 들어, 항원에 의해 면역화되거나 그렇지 않으면 이에 노출된 동물로부터의 항원-특이적 B 세포를 포함)를 초기에 바이오티닐화된 항원과 조합하고, 생성된 항원 코팅된 세포를 세척하고, 이후 스트렙타비딘 마이크로비드와 접촉시켜 비드/항원/세포 복합체를 생성한다. 반대로, 방법 2(도 15a, 상부 오른쪽 코너로부터 시작)에서, 스트렙타비딘 마이크로비드를 바이오티닐화된 항원과 조합하고, 생성된 비드/항원 복합체를 자기 칼럼에 적용하고 세척하고 용리시키고, 이후 항원/비드 복합체를 면역 세포(예를 들어, 항원에 의해 면역화되거나 그렇지 않으면 이에 노출된 동물로부터의 항원-특이적 B 세포를 포함)와 항온처리하여 비드/항원/세포를 생성한다. 이들 방법은, 방법 1에서, 항원이 초기에 비드에 결합하지 않아서, B 세포에 결합하는 더 큰 자유도를 갖지만; 보유가 비드에 의해 포획된 바이오티닐화된 항원에 따라 달라지므로, 몇몇 B 세포는 소실될 수 있다는 점에서 다르다. 반대로, 방법 2에서, 비드-항원 복합체를 사전 형성함으로써, B 세포가 세포-항원 복합체를 포획하지 못해 소실되지 않아야 하지만; 항원이 비드에 결합하는 것이 제한되고, 그래서 B 세포에 덜 결합할 수 있어서, 또한 몇몇 항원-특이적 B 세포를 소실시킬 수 있다.
방법 1 또는 방법 2에 의해 생성되든, 비드/항원/세포 복합체는 자기 칼럼에 적용되고 세척되고, 이후 칼럼은 자석으로부터 제거되어 (항원 특이적 B 세포를 포함하는) 세포를 용리시킨다. 배양 플레이트마다 세포의 수를 조절하기 위해 세포 분류(예컨대, MACS)를 이용할 수 있지만, 다른 기법을 또한 이용할 수 있다. 통상적으로, 96웰 미량적정 플레이트에서 웰마다 다양한 밀도로 세포를 도말한다. 일반적으로, 각각의 밀도로 10개의 플레이트에 의해 웰마다 10개, 25개, 50개, 100개, 250개 또는 500개의 세포로 세포를 도말한다. 웰이 후속적인 배양 후에 항원-특이적 B 세포의 클론성 집단을 함유하는(즉, 웰은 원하는 항원에 특이적인 단일 단일클론 항체를 함유함) 플레이트를 얻기 위해 시딩 밀도의 범위를 선택한다. (EL4 공급 세포와) 배양한 후, 각각의 웰에서 약 1개 내지 약 100개의 항원-특이적, 클론성 IgG 생성 B 세포가 함유된다.
도 15b는, 관심 대상 항원-특이적 B 세포를 포함하는 세포 배양물을 함유하는 웰을 선택하도록 사용된, 예시적인 배양 조건, 기능적 검정 및 항원 인식 검정을 도식적으로 보여준다. 이 배양물은 통상적으로 5일 내지 7일 동안 방해받지 않고, 그러는 동안 B 세포 집단은 증가하고, 항체는 배양 배지로 분비되고, 분비된 항체를 함유하는 상청액을 이후 수집하고, 원하는 특성, 예컨대 항원 결합 친화도 및/또는 기능적 효과에 대해 평가한다. 바람직하게는, 클론 밀도로 시딩된 플레이트로부터 상청액을 수집하고, 즉 대부분의 웰은 원하는 항원에 특이적인 단일 B 항체만을 함유한다. 소정의 웰의 상청액을 시험함으로써 얻은 결합 및 기능적 결과가 (항체의 조합과 반대로) 단일 항체의 결과일 것이고, 게다가 다수의 독립적인 항체를 클로닝하고 시험할 필요 없이, 웰이 클론성 B 세포 집단을 함유하는 경우, 항체가 더 효과적으로 클로닝될 수 있으므로, 클론성 집단의 사용은 스크리닝의 효율 및 처리량을 증가시킨다.
예를 들어, ELISA에 의해 확인된, 항원 인식 항체를 함유하는 상청액은 추가의 사용을 위해 별개의 플레이트로 옮겨지고 임의로 냉동될 수 있다. 남은 세포를 임의로 예를 들어 -80℃에서 냉동할 수 있고, 이것이 배양된 동일한 플레이트에서 이를 편리하게 수행할 수 있다. 항원 인식 항체를 함유한 상청액에서 추가의 시험, 예컨대 원하는 활성(예를 들어, 표적에 대한 효현제 또는 길항제 활성)에 대한 기능적 검정, 및/또는 특이성(예를 들어, 또 다른 항원, 예컨대 유사한 폴리펩타이드가 아니라 원하는 항원에 대한 특이적 결합)의 추가의 시험을 수행할 수 있다. 원하는 기능적 특성을 갖는 항체를 생성한 웰을 해동하여 항체 코딩 서열의 증폭을 허용할 수 있다.
도 15c는 항체 코딩 서열의 증폭 및 회수를 위해 개별 세포를 얻기 위한 항원-특이적 B 세포의 분류를 도식적으로 도시한 것이다. 해동된 세포를 항-토끼 IgG(양성 염색, 즉 항체를 생성하는 B 세포를 염색) 또는 항-Thy-1.2(음성 염색, 즉 비항체 세포를 염색)에 의해 염색한다. 요오드화프로피듐을 사용하여 세포를 또한 생육성에 대해 염색한다. (본 명세서에 추가로 기재된) 양성 또는 음성 염색 방법, PI 염색, 및 물리적 게이팅 기준을 이용하여, B 세포를 EL-4 및 배양물에 함유된 다른 세포로부터 단리하고, 개별적인 웰로 분류한다. 이후, 클로닝, 서열분석 또는 다른 추가의 용도를 위해 항체 코딩 핵산을 RT-PCR에 의해 증폭하고 회수한다.
상기 기재된 본 발명을 추가로 설명하기 위해, 본 발명자들은 하기 비제한적인 실시예를 제공한다.
실시예
실시예 1: 농후화된 항원-특이적 B 세포 항체 배양물의 생성
관심 대상 표적 항원에 대한 네이티브 면역 반응을 조사하기 위해 전통적인 항체 숙주 동물을 면역화함으로써 항체의 패널을 유도하였다. 통상적으로, 면역화에 사용된 숙주는 토끼 또는 유사한 성숙 과정을 이용하여 항체를 생성하는 다른 숙주이고, 필적하는 다양성, 예를 들어 에피토프 다양성의 항체를 생성하는 항원-특이적 B 세포의 집단을 제공한다. 완전 프로인트 아쥬번트(CFA)를 사용하여 초기 항원 면역화를 수행할 수 있고, 불완전 아쥬번트에 의해 후속적인 부스트를 수행할 수 있다. 면역화 후 약 50일 내지 60일에, 바람직하게는 55일에, 항체 역가를 시험하고, 적절한 역가가 확립된 후 항체 선택(Antibody Selection: ABS) 과정을 개시시켰다. ABS 개시에 대한 2개의 중요한 기준은 다중클론 혈청에서 강력한 항원 인식 및 기능 변경 활성이다.
양성 항체 역가가 확립되는 때에, 동물을 희생시키고 B 세포 공급원을 단리하였다. 이 공급원은 비장, 림프절, 골수 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 단일 세포 현탁액을 생성하고, 세포 현탁액을 세척하여, 이들이 저온 장기간 저장에 적합하도록 만들었다. 이후, 세포를 통상적으로 냉동시켰다.
항체 확인 과정을 개시시키기 위해, 적은 분획의 냉동된 세포 현탁액을 해동하고 세척하고 조직 배양 배지에 위치시켰다. 이후, 이 현탁액을 동물 면역 반응을 생성하기 위해 사용된 항원의 바이오티닐화 형태와 혼합하고, 밀테위 자석 비드 세포 선택 방법론을 이용하여 항원-특이적 세포를 회수하였다. 스트렙타비딘 비드를 사용하여 특이적 농후화를 수행하였다. 예를 들어, 세포 제제를 바이오티닐화된 항원 및 스트렙타비딘 비드와 조합하고, 칼럼 위로 통과시켜, 항원-특이적 B 세포가 칼럼에 결합하게 하고, 이후 결합 B 세포가 용리하였다. 농후화된 집단을 회수하고, 특이적 B 세포 단리의 다음 단계에서 진행시켰다.
실시예 2: 클론성 항원-특이적 B 세포 함유 배양물의 생성
이후, 실시예 1에 따라 생성된 농후화된 B 세포를 96웰 미량적정 플레이트에서 웰마다 다양한 세포 밀도로 도말하였다. 일반적으로, 이는 그룹마다 10개의 플레이트에 의해 웰마다 10개, 25개, 50개, 100개, 250개 또는 500개의 세포이다. 바람직하게는, 약 1개 내지 약 100개의 항원-특이적, 클론성 IgG 생성 B 세포를 웰마다 도말하였다. 배지를 약 50K 냉동된 조사된 EL4(EL4B) 공급 세포와 함께 1-4% 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지로 보충하였다. 이 배양물을 5일 내지 7일 동안 방해하지 않고, 이때에 분비된 항체를 함유하는 상청액을 수집하고, 별개의 검정 설정에서 표적 특성에 대해 평가한다. 남은 상청액은 온전히 있고, 플레이트를 -80℃에서 냉동시켰다. 이들 조건 하에, 배양 과정은 통상적으로 항원-특이적 B 세포의 클론성 집단을 포함하는 혼합 세포 집단을 함유하는 웰을 생성시키고, 즉 개별적인 웰은 원하는 항원에 특이적인 단일 단일클론 항체만을 함유할 것이다.
실시예 3: 원하는 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체에 대한 항체 상청액의 스크리닝
ELISA 방법을 이용하여 항원 인식에 대해 실시예 2에 따라 생성된 클론성 항원-특이적 B 세포 집단을 함유하는 웰로부터 유도된 항체 함유 상청액을 초기에 스크리닝하였다. 이것은 선택적 항원 부동화(예를 들어, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 의한 바이오티닐화된 항원 포획), 비특이적 항원 플레이트 코팅, 또는 대안적으로 항원 빌드업 전략(예를 들어, 헤테로머 단백질-항원 복합체를 생성시키기 위한, 선택적 항원 포획 이후의 결합 파트너 첨가)을 포함한다. 예를 들어, (항원에 자연히 노출되거나 항원에 의해 면역화된) 토끼로부터 얻은 B 세포로부터의 항체 함유 상청액을 바이오틴 변형 항원으로 코팅된 스트렙타비딘 플레이트 또는 비변형 항원으로 코팅된 플레이트에 첨가하고, 항원-특이적 IgG 생성을 항-토끼 IgG에 의해 검출하였다. 유사하게, 전체 IgG 생성을 검출하기 위해 토끼로부터 얻은 B 세포로부터의 항체 함유 상청액을 항-토끼 Fab로 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 상응하는 항-종 IgG, 예를 들어 항-마우스 IgG, 항-래트 IgG, 항-비인간 원시류 IgG 또는 항-인간 IgG를 사용하여, 또 다른 숙주 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 원시류 또는 인간으로부터 얻은 B 세포에 의한 항원-특이적 IgG 생성의 검출을 수행하였다.
항원-특이적 웰 대 전체 IgG (비특이적) 웰의 비율은 농후화 및 클론성의 표시자이다. 특히, 훌륭히 농후화된 항원-특이적 B 세포에 의해 확립된 배양물은 주로 항원-특이적 웰을 생성하지만(도 1, 상부 패널 참조), 빈약하게 농후화된 항원-특이적 B 세포에 의해 확립된 배양물은 항원-특이적 웰과 비특이적 웰 사이에 빈약한 상관관계를 나타낸다(도 1, 하부 패널 참조).
이후, 농후화된 B 세포의 항원-양성 웰 상청액을 리간드에 엄격히 의존하는 기능 변경 검정에서 임의로 시험하였다. 하나의 이러한 예는 항원 리간드와 재조합 수용체 단백질의 자연 상호작용을 재생성하는 실험실내 단백질-단백질 상호작용 검정이다. 대안적으로, 리간드 독립적이고 쉽게 모니터링되는 세포 기반 반응(예를 들어, 증식 반응)을 이용하였다.
상당한 항원 인식 및 효력을 나타내는 상청액은 양성 웰로 간주된다. 이후, 오리지널 양성 웰로부터 유도된 세포를 항체 회수 단계로 이행시켰다.
실시예 4: 항원-특이적 B 세포의 단리
단일 항원-특이적 B 세포를, 단일 항체 서열을 분비하는, (실시예 2 및 3에 따라 생성된) 항원-특이적 B 세포의 클론성 집단을 함유하는 웰로부터 회수하였다. 일반적으로, 웰에 존재하는 B 세포를 항원-특이적 B 세포의 음성 선택 또는 양성 선택에 대한 하나 이상의 마커에 의해 염색하고, 단리된 B 세포에 의해 발현된 항체의 항원-특이적 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 항체 서열의 증폭 및 후속적인 서열분석을 위해, 염색된 세포를 RT-PCR 마스터 혼합물로 직접적으로 또는 간접적으로 분류하였다.
관심 대상 혼주된 웰 또는 단일 웰과 조성이 유사한 대조군 배양 웰의 사용을 통해 세포 분류기 게이팅을 확립하였다. 게이팅 세포 샘플을 해동하고 표적 웰을 따라 염색하였다. 비염색 또는 블랭크 집단에서 초기 게이트를 확립하였다. 이후, 염색된 대조군 샘플을 FACS(비디 인플럭스(BD Influx))에서 실행하고, 게이트는 EL4 배제(CD90.2 양성), B 세포 포함(IgG 양성), 생육성(PI 음성) 및 쥣과 EL4 세포로부터 B 세포를 구별하는 물리적 매개변수(FSC/SSC)에 대해 확인되었다. 후자의 게이트는 배양에서 EL4 세포와 다른 물리적 집단(크기/입도)에 기초하므로, 균주의 부재에서 확립될 수 있다. 게이트가 확립되면, 개별적인 웰로부터의 세포 또는 다수의 웰로부터 혼주된 세포로 이루어진 샘플을 실행하고, 바람직하게는 일치하는 물리적(FSC/SSC) 집단의, EL4 음성/IgG 양성, 생육성 세포를 RT-PCR 마스터 혼합물이 예비 로딩된 96웰 플레이트의 웰로 개별적으로 분류하였다. 도 8을 참조한다. 대안적으로, autoMACS(등록상표) 또는 다른 MACS(등록상표) 세포 분류 기술, 예를 들어 수동 또는 자동 세포 분류 및 분리를 위한 약 50㎚ 초상자성 마이크로비드, 칼럼 및 분리기를 사용할 수 있다. 분류된 플레이트를 분류기로부터 제거하고, 관심 대상 VH 및/또는 VL 구역의 RT-PCR 증폭을 위해 유전자증폭기 또는 -80℃로 직접적으로 옮겼다.
항원-특이적 B 세포의 음성 선택을 위해, 세포 혼합물에 존재하는 쥣과 EL4 세포(CD90.2, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 553014)에 특이적인 형광 표지된 항체로 2 내지 10㎍/㎖로 세포를 염색하였다. 세포를 실온에서 대략 20분 동안 염색하고 항온처리 후 2밀리리터 이하의 FACS 완충제로 2x 세척하였다. 세척 후, 세포를 1밀리리터의 FACS 완충제당 대략 1x10E6(100만)개의 세포로 재현탁시켰다. 재현탁되면, 요오드화프로피듐(비디 바이오사이언시스, 556463)을 0.2 내지 0.5㎍/㎖로 첨가하여 혼합물에서 죽은 세포를 확인하였다. Thy1.2 및 PI에 대해 양성 염색되지 않은 세포를 선택하였다(도 3, 상부 패널 참조). 임의로, 최종 FSC/SSC 게이트를 사용하여 더 큰 덜 과립형인 표현형을 갖는 Thy1.2/PI 음성 세포 집단의 하위집단을 선택하였다(도 3, 하부 패널 참조).
항원-특이적 B 세포의 양성 선택을 위해, 세포 혼합물에 존재하는 토끼 B 세포(항-토끼 IgG Fc, 크리에이티브 다이그노스틱스(Creative Diagnostics), DMAB4779)에 특이적인 형광 표지된 항체로 2 내지 10㎍/㎖로 세포를 염색하였다. 세포를 실온에서 대략 20분 동안 염색하고 항온처리 후 2밀리리터 이하의 FACS 완충제로 2x 세척하였다. 세척 후, 세포를 1밀리리터의 FACS 완충제당 대략 1x10E6(100만)개의 세포로 재현탁시켰다. 재현탁되면, 요오드화프로피듐(비디 바이오사이언시스, 556463)을 0.2 내지 0.5㎍/㎖로 첨가하여 혼합물에서 죽은 세포를 확인하였다. 토끼 IgG에 대해 양성 및 PI에 대해 음성 염색되지 않은 세포를 선택하였다(도 4, 상부 패널 참조). 임의로, 최종 FSC/SSC 게이트를 사용하여 주요 집단보다 더 큰 덜 과립형인 표현형을 갖는 토끼 IgG+ 및 PI- 세포 집단의 하위집단을 선택하였다(도 4, 하부 패널 참조).
개별적인 웰로부터의 염색된 B 세포를 분류할 수 있다(단일 웰 분류물). 통상적으로, 10개 내지 20개의 웰을 증폭 전에 개별적으로 염색하고 개별적으로 분류하였다. 대안적으로, 다수의 웰로부터의 염색된 B 세포를 함께 혼주하고 분류할 수 있다(혼주된 세포 분류물). 예를 들어, 단일 샘플로서 염색하기 위해 적어도 100개의 별개의 웰의 내용물을 함께 해동하고 혼주하였다. 이후, 혼주된 염색된 세포를 분류하고 증폭하고 서열분석하였다.
단일 웰 분류를 위해, 관심 대상 웰을 함유하는 플레이트를 -80℃로부터 제거하고, 웰마다 200마이크로리터의 배지(10% RPMI 완전, 55μM BME)의 5회 세척을 이용하여 각각의 웰로부터 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이후, 각각의 웰로부터의 세포를 FACS 관 내에서 200마이크로리터의 배지 중에 재현탁시켰다. 뚜껑을 느슨하게 고정한 채 세포를 37℃에서 120분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 2밀리리터 이하의 FACS 완충제(둘베코 PBS와 2% FBS)로 세척하고, 100㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다.
혼주된 세포 분류를 위해, 관심 대상 웰을 함유하는 플레이트를 -80℃로부터 제거하고, 웰마다 200마이크로리터의 배지(10% RPMI 완전, 55μM BME)의 5회 세척을 이용하여 각각의 웰로부터 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이후, 혼주된 세포를 웰마다 200마이크로리터의 배지(X 웰 ㆍ 200㎕ = 전체 용적) 중에 재현탁시키고, 적절한 용적의 조직 배양 플라스크로 옮겼다. 세포를 37℃에서 120분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 2밀리리터 이하의 FACS 완충제(둘베코 PBS와 2% FBS)로 세척하고, 혼주된 웰마다 100㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다.
실시예 5: 항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 단리
실시예 4에 따라 생성된 단일 단리된 B 세포로부터 조합 RT-PCR 기반 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다. 프라이머를 표적 면역글로불린 유전자의 보존 구역 및 불변 구역(중쇄 및 경쇄), 예컨대 토끼 면역글로불린 서열에서 어닐링하도록 설계하고, 항체 서열을 얻기 위해 2단계 이중(nested) PCR 회수 단계를 이용하였다. T7과 같은 발현 벡터로부터 생성된 합성 대조군 RNA 샘플을 양성 대조군으로서 사용하였다. 피코 그린(Pico Green) 분석에 의한 회수 및 임의로 (예를 들어, 전기영동에 의한) 크기 통합에 대해 각각의 웰로부터의 암플리콘을 분석하였다. PCR 생성물을 다중웰 플레이트 포맷, 예를 들어 96웰 플레이트에서 직접적으로 서열분석하고, 피코 그린을 이용하여 염색하였다. 대안적으로, 생성된 단편을 AluI로 분해하여 서열 클론성을 지문표시(fingerprint)하였다. 동일한 서열은 이의 전기영동 분석에서 공통 단편화 패턴을 나타냈다. 중요하게는, 세포 클론성을 입증하는 이 공통 단편화 패턴은 웰당 1000개 이하의 세포로 원래 도말된 웰에서도 일반적으로 관찰되었다. 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색을 이용하여 생성된 AluI 분해 생성물을 분석하였다. 이후, 오리지널 중쇄 및 경쇄 암플리콘 단편을 HindIII 및 XhoI 또는 HindIII 및 BsiwI로 제한 효소 분해하여 클로닝을 위한 DNA의 각각의 조각을 준비하였다. 이후, 플라스미드 전파 및 생성을 위해 생성된 분해물을 발현 벡터에 결찰하고 박테리아로 형질전환하였다. 서열 규명을 위해 콜로니를 선택하였다.
통상적으로, 더 큰 덜 과립형인 세포의 일치하는 표현형을 갖도록, 최종 FSC/SSC 게이트에 의해 분류된 항원 발현 특이적 B 세포는 평균 증폭 성공보다 우수하였다. 예를 들어, 시험된 88개 중 26개의 FSC/SSC 게이팅된 Thy1.2/PI 음성 B 세포가 (최종 FSC/SSC 게이트가 없는) 88개 중 1개의 Thy1.2/PI 음성 B 세포와 비교하여 원하는 단편화 패턴을 나타냈다. 도 5를 참조한다.
부가적으로, 음성 및 양성 선택에 대해 염색된 혼주된 분류물에서 평가된 FSC/SSC 게이팅된 항-CGRP 항체를 생성하는 B 세포는 개선된 증폭 속도를 나타냈다. 특히, ELISA를 이용하여 항원-특이성에 대해 양성 시험된 B 세포 상청액을 함유하는 CGRP 배양 플레이트로부터의 32개의 별개의 웰을 함께 혼주하고, 혼주된 집단의 하위세트를 음성 선택(Thy1.2) 및 양성 선택(항-토끼 Fc 단일클론 또는 항-토끼 Fc 다중클론)에 의해 염색하였다. 시작하기 위해, 음성 선택 염색으로부터의 96웰을 분류하고, 69.8%의 FSC/SSC 게이팅된 B 세포는 VH 및 VL 사슬을 증폭시켰다. 부가적으로, 항-토끼 Fc 단일클론 양성 선택 염색으로부터의 80웰을 분류하고, 91.3%의 FSC/SSC 게이팅된 B 세포는 VH 및 VL 사슬을 증폭시켰다. 마지막으로, 항-토끼 Fc 다중클론 염색으로부터의 96웰을 분류하고, 80.2% 및 84.4%의 FSC/SSC 게이팅된 B 세포는 각각 VH 및 VL 사슬을 증폭시켰다.
실시예 6: 원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성
단일 단일클론 항체를 함유하는 각각의 웰에 대한 보정 전장 항체 서열을 확립하고, 퀴아젠 고상 방법론을 이용하여 미니프렙(miniprep) DNA를 제조하였다. 이후, 이 DNA를 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시켜 재조합 전장 항체를 생성하였다. 항원 인식 및 기능적 특성에 대해 미정제 항체 생성물을 시험하여 오리지널 특성이 재조합 항체 단백질에서 발견된다는 것을 확인하였다. 적절한 경우, 대규모 일시적 포유동물 형질감염을 완료하고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통해 항체를 정제하였다. 표준 방법(예를 들어, 프로테온 또는 비아코어(등록상표)) 및 효력 검정에서의 IC50을 이용하여 KD를 평가하였다.
실시예 7: 단리된 B 세포 가변 경쇄 및 중쇄 서열의 회수 및 재조합 항체의 발현
이전에 -70℃에서 저장된, 단일 B 세포로부터 중쇄 및 중쇄에 대한 코딩 서열을 회수하였다. 2 단계 역전사 중합효소 사슬 반응(RT-PCR) 공정을 이용하였다. 단계 1에서, 표준 RT 기반 방법에 의해 관심 대상 부위를 코딩하는 RNA를 회수하고, 이것을 후속하여 증폭시켰다. 발현 벡터: 경쇄: HindIII/BsiWI 및 중쇄: HindIII/XhoI로의 지향성 클로닝을 위해 적절한 DNA 단편을 생성하는 이중 프라이머 PCR 증폭을 통해 단계 2를 수행하였다. 숙주 동물 게놈의 서열 분석으로부터 이 회수 과정에 대한 특이적 서열을 유도시켰다. 새로운 서열의 주요 공급원은 토끼 및 마우스 및 래트가다. 프라이머 서열은 하기와 같다:
이후, 클로닝된 cDNA를 재조합 경쇄 및 중쇄의 발현이 가능하게 하는 2개의 명확한 포유동물 발현 벡터(카파 경쇄 불변 및 감마-1(γ-1) 중쇄 불변)에 결찰하였다. 이 작제물을 인프레임으로 만들고, 서열 회수에서 포함된 자연 신호 서열로 통합하였다. 대규모 DNA 제제를 각각의 발현 플라스미드에 대해 만들고, 플라스미드 둘 다를 사용하여 인간 신장 293 세포로 형질감염시킴으로써 전장 토끼/인간 키메라 항체의 일시적 생성을 수행하였다. 배양에서 5일 후, 생성된 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 항원 인식에 대해 조건 배지를 직접적으로 시험하거나, 단백질 A 크로마토그래피를 통해 재조합 항체를 친화도 정제하였다.
이후, 상기 기재된 ELISA 방법을 이용하여 항원 인식에 대해 항체를 시험하였다. 또한, 정제된 항체를 위해, 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 또는 바이오라드(BioRad) 또는 프로테온 측정에 의해 KD를 확립하였다. 마지막으로, 회수된 서열과 관련된 특정한 웰에 기인하는 오리지널 기능 변경 특성을 시험하였다.
경쇄
및
중쇄
서열 회수에 대한 실험 방법.
본 방법은 퀴아젠 원 스텝 RT-PCR 키트(Qiagen One Step RT-PCR kit)에 대한 제조업자의 사양에 기재된 기술에 기초한다. 공통 마스터 혼합물을 제조하고, 이것은 RNasin(프로메가(Promega))을 포함하여 RNA 분해를 방지하였다. 0.58μM의 각각의 단계 1 프라이머(프라이머 서열 번호 1, 3, 7 및 9)를 함유하는 50㎕의 RT-PCR 마스터 혼합물을 이전에 회수된 냉동된 세포를 함유하는 250㎕의 에펜도르프 관에 첨가하고, 얼음에서 조심스럽게 혼합하였다. 원 스텝 RT-PCR을 하기 사이클 계획으로 수행하였다: (1) 50℃, 30분; (2) 95℃, 15분; (3) 94℃, 30초; (4) 54℃, 30초; (5) 72℃, 1분; (6) 단계 3으로 넘어감, 35회 사이클 전체; (7) 72℃, 3분; 및 (8) 4℃, 보류.
이 사이클을 완료할 때, 1.5㎕의 1차 RT-PCR 반응을 이용하여 경쇄 및 중쇄 가변 구역을 회수하기 위해 별개의 반응에서 2차 PCR 증폭을 수행하였다. 하기 사이클 계획을 이용한, 0.4μM의 2차 이중 PCR 프라이머 경쇄(프라이머 서열 번호 2 및 4; 서열 번호 2 및 5; 또는 서열 번호 2 및 6) 및 중쇄(프라이머 서열 번호 8 및 10)에 의한 KOD 중합효소 추진된 증폭(노바겐(Novagen)): (1) 94℃, 2분; (2) 94℃, 30초; (3) 60℃, 30초; (4) 72℃, 45초; (5) 단계 2로 넘어감, 35회 사이클 전체; (6) 72℃, 3분; 및 (7) 4℃, 보류.
2차 증폭의 완료 후, 10㎕의 반응물을 제거하고, 2% TAE 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 남은 40㎕의 반응물을 퀴아젠 퀴아퀵(Qiagen Qiaquick)(상표명) PCR 클린업 키트(PCR Clean-up kit)를 통해 정제하고, 75㎕ 중에 용리시켰다.
이 암플리콘을 후속하여 37℃에서 60분 동안 이어서 55℃에서 30분 동안 하기 조건을 이용하여 경쇄의 경우 HindIII/BsiWI 및 중쇄의 경우 HindIII/XhoI에 의해 분해시켰다: 10㎕의 정제된 PCR 생성물, 3㎕의 10x 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 제한 효소 완충제 2, 0.5㎕의 HindIII(5U), 및 0.5㎕의 BsiWI(5U) 또는 0.5㎕의 XhoI. 퀴아젠 퀴아퀵(상표명) PCR 방법을 통해 분해물을 정제하였다. 이것을 후속하여 적절한 발현 벡터에 결찰하였다. 이후, 2㎕의 이 반응물을 사용하여, TOP10(인비트로겐(Invitrogen)) 또는 XL-10(스트라타진(Stratagene))을 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 LB/카나마이신(50㎍/㎖)에 도말하였다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝 방법을 통해 삽입물에 대해 생성된 콜로니를 스크리닝하였다:
콜로니를 60㎕의 LB/카나마이신에 넣고, 30분 이상 동안 항온처리하였다. 30분에, 대략 1㎕를 제거하고, 중쇄에 대해 서열 번호 11 및 12 및 경쇄에 대해 서열 번호 11 및 13의 2μM의 프라이머 쌍을 함유하는 표준 30㎕의 KOD 증폭 반응(노바겐)에서 사용하였다. 증폭 계획은 하기와 같다: (1) 96℃, 2분; (2) 96℃, 20초; (3) 68℃, 25초; (4) 2로 넘어감, 40회 사이클 전체에 대해 반복; 및 (5) 68℃, 2분.
피코 그린 분석을 이용하여 증폭을 검정하였다. 이후, 샘플을 다중웰 플레이트 포맷, 예를 들어 96웰 플레이트에서 직접적으로 서열분석하였다.
실시예 8: 인간 PCSK9에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 이용함으로써, 인간 PCSK9(huPCSK9)에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 Ab1 및 Ab2를 포함하는, 광범위한 패널의 항체를 생성할 수 있다. 항체는 huPCSK9에 대해 높은 친화도(예를 들어, 약 10 내지 약 900 pM KD)를 갖고, 세포 기반 스크리닝 시스템(HepG2)에서 huPCSK9의 강력한 길항작용을 나타냈다. 더욱이, 항체의 수집은 huPCSK9 추진된 과정에 대해 명확한 길항작용 방식을 나타냈다.
면역화 전략: 토끼를 huPCSK9(R&D)에 의해 면역화하였다. 면역화는 완전 프로인트 아쥬번트(CFA)(시그마(Sigma)) 중의 100㎍의 제1 피하(sc) 주사에 이어서 불완전 프로인트 아쥬번트(IFA)(시그마) 중의 각각 50㎍의, 2주 간격의, 2개의 부스트로 이루어졌다. 동물을 55일에 채혈시키고, ELISA(항원 인식)에 의해 혈청 역가를 결정하였다.
항체 선택 역가 평가: 인간 huPCSK9에 결합하는 항체를 확인하고 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 간단히 말하면, 실온에서 대략 1시간 동안 또는 대안적으로 4℃에서 밤새 PBS 중에 희석된 바이오티닐화된 인간 PCSK9(웰마다 50㎕, 1㎍/㎖)에 의해 뉴트라비딘 코팅된 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 코팅하였다. 이후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 ELISA 완충제에 의해 차단하고, 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈 20)를 사용하여 세척하였다. ELISA 완충제(PBS(pH 7.4) 중의 0.5% 어피 젤라틴)를 사용하여 시험된 혈청 샘플을 연속하여 희석하였다. 50마이크로리터의 희석된 혈청 샘플을 웰로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 항온처리 후, 플레이트를 세척 완충제로 세척하였다. 전개를 위해, 항-토끼 특이적 Fc-HRP(ELISA 완충제 중의 1:5000 희석)를 웰에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 세척 용액에 의한 3x 세척 단계 후, 실온에서 2분 동안 TMB 기질을 이용하여 플레이트를 전개시키고, 0.5M HCl을 사용하여 반응물을 급냉시켰다. 450㎚에서 웰 흡광도를 판독하였다.
조직 수확: 허용되는 역가를 확립하면, 토끼(들)을 희생시켰다. 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고, 하기와 같이 처리하였다:
비장 및 림프절을, 조직을 분리하고 20㏄ 주사기의 플린저로 70㎛(피셔)에서 무균 와이어 메시를 통해 통과시킴으로써, 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 글루코스가 적은 상기 기재된 변형 RPMI 배지에서 세포를 수집하였다. 세포를 원심분리에 의해 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 트립판 블루로 염색하고 혈구계산기를 이용하여 계수함으로써 세포 밀도를 결정하였다. 세포를 1500rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 FBS(하이클론(Hyclone)) 중의 적절한 용적의 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 시그마) 중에 재현탁시키고, 1㎖/바이알로 분산시켰다. 이후, 바이알을 -70℃에서 24시간 동안 저장한 후 장기간 저장을 위해 액체 질소(LN2) 탱크에 위치시켰다.
전혈을 2000rpm에서 30분 동안 원심분리함으로써 혈장을 제거하고, PBS에 의해 남은 혈액 용적을 50㎖로 재현탁시키고, 용적을 균등하게 2개의 새로운 50㎖ 원뿔 관(코닝(Corning))으로 분할함으로써 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 8㎖의 림포라이트(Lympholyte) 토끼(씨더레인(Cedarlane))를 혈액 혼합물 아래에 조심스럽게 언더레이어링하고, 소성 없이 2000rpm에서 실온에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, PBMC 층을 유리 파스퇴르 피펫(VWR)을 사용하여 조심스럽게 제거하고 조합하고 깨끗한 50㎖의 바이알에 위치시켰다. 세포를 실온에서 10분 동안 원심분리에 의해 2000rpm에서 PBS로 1회 세척하고, 세포 밀도를 트립판 블루 염색에 의해 결정하였다. 세척 후, 세포를 적절한 용적의 10% DMSO/FBS 배지 중에 재현탁시키고 상기 기재된 바대로 냉동시켰다.
B 세포 배양: B 세포 배양의 설정 일에, PBMC, 비장세포 또는 림프절 바이알을 사용을 위해 해동하였다. 바이알을 LN2 탱크로부터 제거하고, 해동까지 37℃ 수욕에 위치시켰다. 바이알의 내용물을 15㎖의 원뿔 원심분리 관(코닝)으로 옮기고, 10㎖의 상기 기재된 변형 RPMI를 관에 천천히 첨가하였다. 세포를 1-2K rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 10㎖의 새로운 배지 중에 재현탁시켰다. 세포 밀도 및 생육성을 트립판 블루 염색에 의해 결정하였다. 세포를 다시 세척하고, 1E7 세포마다 100㎕의 인산염 완충 제제[(PBF): Ca/Mg 비함유 PBS(하이클론), 2mM 에틸렌 - 다이아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(시그마-바이오틴 비함유)] 중에 재현탁시켰다. 세척 동안, 바이오티닐화된 항원을 PBF 중에 대략 5㎍/㎖로 희석하였다. 바이오티닐화된 항원을 10-20㎕의 MACS(등록상표) 스트렙타비딘 비드(밀테니(Milteni))와 조합하고, 4℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 코팅된 비드를 예비 습윤된 MACS(등록상표) MS 칼럼(밀테니) 칼럼 위로 통과시켰다. 코팅된 비드를 500㎕의 PBF로 3회 세정하고, 원래 용적으로 용리시켰다. 코팅된 비드를 해동된 세포와 조합하고 혼합하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포와 비드의 혼합물을 MS 칼럼 위로 통과시켰다. 칼럼을 500㎕의 PBF로 5회 세척하고, 자석으로부터 제거하고, 세포를 0.5 내지 1㎖의 PBF 중에 용리시켰다. 세포를 계수하고, 적절한 용적의 상기 기재된 변형된 RPMI 중에 재현탁시켰다. 양성 선택(농후화)은 출발 세포 농도로부터 1%의 평균을 생성시켰다. 배양에 대한 세포 시딩 수준에서 형성을 제공하기 위해 파일럿 세포 스크린을 확립하였다. 3개 내지 10개의 96웰 플레이트의 3개 내지 4개의 그룹(전체 40개 이하의 플레이트로 이루어짐)을 시딩 밀도마다 10개, 20개, 50개 및 100개의 농후화된 B 세포로 설정하였다. 또한, 각각의 웰은 조사된 EL-4.B5 세포(5,000 Rads)의 웰당 50K 세포, 및 250㎕/웰의 최종 용적에서 고글루코스 변형된 RPMI 배지에서 적절한 수준의 T 세포 상청액(제제에 따라 1% 내지 5% 범위)을 함유하였다. 배양물을 37℃에서 4% CO2에서 5일 내지 7일 동안 항온처리하였다.
선택적 항체 분비 B 세포의 확인: 5일 내지 7일에 항원 인식 및 기능적 활성에 대해 배양물을 시험하였다.
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: B 세포 배양(BCC) 웰(모두 40개의 플레이트)로부터의 50㎕의 상청액이 항체의 공급원으로 사용된다는 것을 제외하고, 역가 평가에 대해 기재된 동일한 ELISA 포맷을 항원 인식 스크리닝에 사용하였다. 조건 배지를 항원 코팅된 플레이트로 옮겼다. 양성 웰을 ELISA에 의해 확인한 후, 양성 B 세포 배양 웰로부터의 상청액을 제거하고, 96웰 마스터 플레이트(들)로 옮겼다. 이후, 40㎕/웰을 제외하고 모든 상청액을 제거하고 FBS 중에 16% DMSO의 60㎕/웰을 첨가함으로써 오리지널 배양 플레이트를 냉동시켰다. 플레이트를 페이퍼 타월로 랩핑하여 해동을 느리게 하고 -70℃에 위치시켰다.
기능적 활성 스크리닝: 이후, huPCSK9-LDLr 결합 ELISA에서 기능적 활성에 대해 마스터 플레이트를 스크리닝하였다. 뉴트라비딘 플레이트를 바이오티닐화된 다중클론 항-huPCSK9(R&D)로 코팅하고 세척하였다. 코팅 후, 일시적으로 형질전환된 인간 신장 293 세포로부터의 비정제된 D374Y huPCSK9를 B 세포 상청액과 항온처리한 후 웰에 첨가하고 결합되게 하였다. 부가적인 세척 후, 재조합, his-태그화 LDLr(R&D)을 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 또 다른 세척 후, 항-his 태그, HRP 접합 항체(인비트로겐)를 첨가하여(롯트 의존적 농도), LDLr 결합을 검출하였다. 3회의 부가적인 세척 후, 50㎕의 TMB를 첨가하여 15분 동안 전개시키고 이후 50㎕의 0.5M HCl을 첨가하였다. 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
B 세포 회수-단일 웰 분류물: 관심 대상 웰을 함유하는 플레이트를 -70℃로부터 제거하고, 웰마다 200마이크로리터의 배지(10% RPMI 완전, 55μM BME)의 5회 세척을 이용하여 각각의 웰로부터 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이후, 각각의 웰로부터의 세포를 FACS 관 내에서 200마이크로리터의 배지 중에 재현탁시켰다. 뚜껑을 느슨하게 고정한 채 세포를 37℃에서 120분 동안 (4% CO2) 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 2밀리리터 이하의 FACS 완충제(둘베코 PBS와 2% FBS)로 세척하고, 100㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다.
B 세포 회수- 혼주된 분류물: 관심 대상 웰을 함유하는 플레이트를 -70℃로부터 제거하고, 웰마다 200마이크로리터의 배지(10% RPMI 완전, 55μM BME)의 5회 세척을 이용하여 각각의 웰로부터 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 혼주하고 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 이후, 세포를 웰마다 200마이크로리터의 배지 중에 재현탁시키고 혼주하고 적절한 용적의 조직 배양 플라스크로 옮겼다. 세포를 37℃에서 120분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 2밀리리터 이하의 FACS 완충제(둘베코 PBS와 2% FBS)로 세척하고, 혼주된 웰마다 100㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다.
B 세포 회수-양성 염색: 실온에서 대략 20분 동안 세포 혼합물에 존재하는 쥣과 EL4 세포(CD90.2, 비디 바이오사이언시스, 553014)에 특이적인 형광 표지된 항체로 2 내지 10㎍/㎖로 세포를 염색하였다. 항온처리 후, 세포를 2밀리리터 이하의 FACS 완충제로 2x 세척하였다. 세척 후, 세포를 1밀리리터의 FACS 완충제당 대략 1x10E6(100만)개의 세포로 재현탁시켰다. 재현탁되면, 요오드화프로피듐(비디 바이오사이언시스, 556463)을 0.2 내지 0.5㎍/㎖로 첨가하여 혼합물에서 죽은 세포를 확인하였다.
B 세포 회수-음성 염색: 세포 혼합물에 존재하는 토끼 B 세포(항-토끼 IgG Fc, 크리에이티브 다이그노스틱스, DMAB4779)에 특이적인 형광 표지된 항체로 2 내지 10㎍/㎖로 세포를 염색하였다. 세포를 실온에서 대략 20분 동안 염색하고 항온처리 후 2밀리리터 이하의 FACS 완충제로 2x 세척하였다. 세척 후, 세포를 1밀리리터의 FACS 완충제당 대략 1x10E6(100만)개의 세포로 재현탁시켰다. 재현탁되면, 요오드화프로피듐(비디 바이오사이언시스, 556463)을 0.2 내지 0.5㎍/㎖로 첨가하여 혼합물에서 죽은 세포를 확인하였다.
B 세포 분류 방법: 관심 대상 혼주된 웰 또는 단일 웰과 조성이 유사한 대조군 배양 웰의 사용을 통해 세포 분류기 게이팅을 확립하였다. 게이팅 세포 샘플을 해동하고 표적 웰을 따라 염색하였다. 비염색 또는 블랭크 집단에서 초기 게이트를 확립하였다. 이후, 염색된 대조군 샘플을 FACS(비디 인플럭스)에서 실행하고, 게이트는 EL4 배제(CD90.2 양성/CD90.2+), B 세포 포함(IgG 양성/IgG+), 생육성(PI 음성/PI-) 및 쥣과 EL4 세포로부터 B 세포를 구별하는 물리적 매개변수(FSC/SSC)에 대해 확인되었다. 후자의 게이트는 배양에서 EL4 세포와 다른 물리적 집단(크기/입도)에 기초하므로, 균주의 부재에서 확립될 수 있다. 게이트가 확립되면, 개별적인 웰로부터의 세포 또는 다수의 웰로부터 혼주된 세포로 이루어진 샘플을 실행하고, 일치하는 물리적(FSC/SSC) 특성을 갖는, EL4 음성/IgG 양성, 생육성 세포를 RT-PCR 마스터 혼합물이 예비 로딩된 96웰 플레이트의 웰로 개별적으로 분류하였다. 분류된 플레이트를 분류기로부터 제거하고, 관심 대상 VH 및 VL 구역의 RT-PCR 증폭을 위해 유전자증폭기 또는 -80℃로 직접적으로 옮겼다.
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: 단일 단리된 B 세포로부터 조합 RT-PCR 기반 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다. 제한 효소를 함유하는 프라이머를 표적 면역글로불린 유전자의 보존 구역 및 불변 구역(중쇄 및 경쇄), 예컨대 토끼 면역글로불린 서열에서 어닐링하도록 설계하고, 항체 서열을 증폭시키기 위해 2단계 이중 PCR 회수 단계를 이용하였다. 피코 그린 분석에 의한 회수 및 임의로 (예를 들어, 전기영동에 의한) 크기 통합에 대해 각각의 웰로부터의 암플리콘을 분석하였다. 생성된 단편을 서열 확인을 위해 전송하였다. 동일한 항체를 이의 서열분석 반환을 통해 쉽게 확인할 수 있다. 이후, 오리지널 중쇄 및 경쇄 암플리콘 단편을 PCR 프라이머 내에 함유된 제한 효소 부위를 사용하여 분해하고, 발현 벡터로 클로닝하였다. 서브클로닝된 DNA 단편을 함유하는 벡터를 증폭시키고 정제하였다. 발현 전에 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄의 서열을 검증하였다.
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: 인간 PCSK9에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 모든 항온처리를 실온에서 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(써모 사이언티픽)를 ELISA 완충제(PBS, 0.5% 어피 젤라틴, 0.05% 트윈-20)에 의해 1시간 동안 차단하였다. 차단 후, 플레이트를 1시간 동안 바이오티닐화-huPCSK9 함유 용액(ELISA 완충제 중의 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 이후, 인간 PCSK9 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20) 중에 3회 세척하였다. 코팅 후, 플레이트를 1시간 동안 ELISA 완충제로 다시 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 이후 항체의 희석 시리즈와 항온처리하고, 이 항체를 대략 1시간 동안 시험하였다. 이 항온처리 종료 시, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어(Peroxidase conjugated affinipure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적 [잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)])과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 다음에, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3분 내지 5분 동안 항온처리하였다. 0.5M HCl을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
HepG2 세포에 의한 LDL-C 유입의 조절에 의한 재조합 항체의 기능적 규명: huPCSK9에 의해 HepG2 세포에서 LDL-C 유입의 저해를 중화시키는 항-PCSK9 항체의 능력을 세포 기반 검정에서 시험하였다. HepG2 세포를 콜라겐 코팅된 96웰 플레이트에서 시딩하였다(30,000개의 세포/웰). 24시간 후, 배지를 0.5% 저함량 지질 FBS를 함유하는 새로운 배지(MEM)로 대체하였다. 다양한 농도의 항-PCSK9 항체를 실온에서 1시간 동안 3㎍/㎖의 huPCSK9와 항온처리하고, 이후 HepG2 세포에 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 항온처리하였다. BODIPY-LDL을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 제거하고, 세포를 RIPA 완충제로 용해시키고, 세포에 의해 채워진 BODIPY-LDL의 양을 플레이트 판독기(여기, 485㎚; 방출 535㎚)에서 측정하였다.
이 실시예는 다수의 항-PCSK9 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab1 및 Ab2는 huPCSK9에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났고(도 6 참조), huPCSK9와 LDLR의 상호작용을 차단하는 능력을 입증하였다(도 7 참조).
실시예 9: HuCGRP 알파에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 사용함으로써, CGRPα의 강력한 기능적 길항작용을 나타내는 항체의 수집을 생성할 수 있다. CGRPα에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 Ab3 및 Ab4(후자는 대부분의 기능적 그룹을 포함함)를 포함하는, 펩타이드의 N 또는 C 말단에서 CGRPα에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 확인하였다.
면역화 전략: 토끼를 인간 CGRPα(아메리칸 펩타이즈(American Peptides)(캘리포니아주 서니베일) 및 바켐(Bachem)(캘리포니아주 토란스))에 의해 면역화하였다. 면역화는 완전 프로인트 아쥬번트(CFA)(시그마) 중의 100㎍의 KLH와 혼합된 100㎍의 항원의 제1 피하(sc) 주사에 이어서 불완전 프로인트 아쥬번트(IFA)(시그마) 중의 각각 50㎍과 혼합된 50㎍의 항원의, 2주 간격의, 2개의 부스트로 이루어졌다. 동물을 55일에 채혈시키고, ELISA(항원 인식) 및 SK-N-MC에서의 CGRP 추진된 cAMP 증가의 저해에 의해 혈청 역가를 결정하였다.
ABS 역가 평가: 항원 인식 검정을, 하기 예외로, huPCSK9에 기재된 프로토콜에 의해 CGRPα에 대해 결정하였다(실시예 8 참조): 뉴트라비딘 플레이트를 상기 기재된 농도에서 N 또는 C 말단 바이오티닐화된 CGRP-α 둘 다로 코팅하였다.
기능적 역가 평가: 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하고 규명하기 위해, 전기화학발광(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), MSD)을 이용하여 cAMP 수치 검정의 CGRP 추진된 증가의 저해를 수행하였다. 간단히 말하면, 시험하고자 하는 항체 제제를 96웰 환저 폴리스타이렌 플레이트(코스타(Costar))에서 MSD 검정 완충제(허페스(Hepes), MgCl2, pH 7.3, 1㎎/㎖ 차단제 A, 메소 스케일 디스커버리) 중에 연속하여 희석하였다. 이 플레이트에, 인간 CGRPα를 첨가하고(10ng/㎖ 최종 농도), MSD 검정 완충제 중에 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 검정-키트 제조업자에 의해 제시된 바대로 적절한 대조군을 사용하였다. 인간 신경상피종 세포(SK-N-MC, ATCC)를 EDTA 용액(PBS 중의 5mM)을 사용하여 탈착시키고, 원심분리에 의해 성장 배지(MEM, 10% FBS, 항생제)를 사용하여 세척하였다. 세포 수를 검정 완충제 중에 1㎖마다 200만 개의 세포로 조정하고, 세포를 cAMP 검정 플레이트로 로딩하기 바로 전에 IBMX(3-아이소뷰틸-1-메틸산틴, 시그마)를 0.2mM의 최종 농도로 첨가하였다. 별개로 항체/huCGRPα를 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후, 이것을 상기 기재된 10㎕의 세포 현탁액과 함께 MSD cAMP 검정 플레이트로 옮겼다. 이 플레이트를 30분 동안 진탕시키면서 실온에서 항온처리하였다. 동시에, 중지 용액(용해 완충제 중의 TAG 라벨 cAMP(MSD)의 1:200 희석)을 제조하였다. 20㎕/웰의 중지 용액을 MSD 검정 플레이트에 첨가하고, 추가의 20분에서 실온에서 진탕시켰다. 100㎕의 판독 완충제(MSD; 물 중의 1:4 희석)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 섹터 이미저(Sector Imager) 2400(MSD)를 사용하여 플레이트를 판독하고, 데이터 피트 및 IC50 결정에 프리즘 소프트웨어(Prism software)를 사용하였다.
조직 수확: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 토끼 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 처리하고 냉동시켰다(실시예 8 참조).
B 세포 배양( BCC ): N 및 C 말단 바이오티닐화된 huCGRPα를 사용하여 세포 농후화를 수행하는 것을 제외하고, huPCSK9에 대해 실시예 8에 기재된 바대로 B 세포 배양물을 제조하였다.
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: 단일 지점으로서 상기 기재된 바대로 항원 인식 스크리닝을 수행하였다.
기능적 활성 스크리닝: B 세포 상청액에 함유된 기능적 활성을 결정하기 위해, 혈청 샘플의 기능적 역가의 결정에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 하기 변형으로 이용하였다. 간단히 말하면, 희석된 다중클론 혈청 샘플 대신에 B 세포 상청액(20㎕)을 사용하였다.
B 세포 회수: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 FACS 방법을 수행하였다(실시예 8 참조).
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: huPCSK9에 대해 상기 기재된 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다(실시예 8 참조).
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: 역가 평가 부문에 기재된 바대로 결합에 대해 재조합 항체를 평가하였다. N 및 C 말단 바이오티닐화된 ELISA를 별개로 실행하여 결합 특이성을 결정하였다. ELISA에 의해 측정되는, CGRP에 대한 결합 친화도는 예시적인 항체 Ab3 및 Ab4에 대해 결정되었다. 도 8을 참조한다.
CGRP 추진된 세포내 cAMP 수치의 조절에 의한 재조합 항체의 기능적 규명: cAMP 검정의 CGRPα 매개된 증가한 세포 수치를 저해하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, 전기화학발광 검정-키트(메소 스케일 디스커버리, MSD)를 사용하였다. 간단히 말하면, 시험하고자 하는 항체 제제를 96웰 환저 폴리스타이렌 플레이트(코스타)에서 MSD 검정 완충제(허페스, MgCl2, pH 7.3, 1㎎/㎖ 차단제 A, 메소 스케일 디스커버리) 중에 연속하여 희석하였다. 이 플레이트에, 인간 CGRPα를 첨가하고(25ng/㎖ 최종 농도), MSD 검정 완충제 중에 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 검정-키트 제조업자에 의해 제시된 바대로 적절한 대조군을 사용하였다. 인간 신경상피종 세포(SK-N-MC, ATCC)를 EDTA 용액(5mM)을 사용하여 탈착시키고, 원심분리에 의해 성장 배지(MEM, 10% FBS, 항생제)를 사용하여 세척하였다. 세포 수를 검정 완충제 중에 1㎖마다 200만 개의 세포로 조정하고, 세포를 cAMP 검정 플레이트로 로딩하기 바로 전에 IBMX(3-아이소뷰틸-1-메틸산틴, 50mM 시그마)를 0.2mM의 최종 농도로 첨가하였다. 별개로 항체/huCGRPα를 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후, 이것을 상기 기재된 10㎕의 세포 현탁액과 함께 MSD cAMP 검정 플레이트로 옮겼다. 이 플레이트를 30분 동안 진탕시키면서 실온에서 항온처리하였다. 동시에, 중지 용액(용해 완충제 중의 TAG 라벨 cAMP(MSD)의 1:200 희석)을 제조하였다. 20㎕/웰의 중지 용액을 MSD 검정 플레이트에 첨가하고, 추가의 20분에서 실온에서 진탕시켰다. 100㎕의 판독 완충제(MSD; 물 중의 1:4 희석)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 섹터 이미저 2400(MSD)를 사용하여 플레이트를 판독하고, 데이터 피트 및 IC50 결정에 프리즘 소프트웨어를 사용하였다
이 실시예는 다수의 항-CGRP 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab3 및 Ab4는 CGRP에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났다(도 9 참조).
실시예 10: 표적 1에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 사용함으로써, 표적 1에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 Ab5 및 Ab6을 포함하는, 표적 1의 강력한 기능적 길항작용을 나타내는 항체의 수집을 생성할 수 있다.
면역화 전략: 토끼를 CGRPα에 대해 기재된 바대로 개별 펩타이드로 면역화하였다(실시예 9 참조). 면역화를 위해 세포 표면 단백질의 세포외 루프에 상응하는 펩타이드의 3개의 형태를 설계하고 합성하였다. 이 단편은 온전한 세포 구조를 위한 매우 항체 접근 가능한 에피토프를 나타낸다.
ABS 역가 평가: 항원 인식 검정을 huPCSK9에 대해 실시예 8에 기재된 프로토콜에 의해 표적 1에 대해 결정하였다. 역가 결정을 위해 이 펩타이드에 대해 특이적 펩타이드에 의해 면역화된 토끼를 평가하였다.
조직 수확: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 토끼 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 처리하고 냉동시켰다(실시예 8 참조).
B 세포 배양: B 세포 배양을 huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 설정하였다(실시예 8 참조).
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: 단일 지점으로서 상기 기재된 바대로 항원 인식 스크리닝을 수행하였다(실시예 8 참조).
B 세포 회수: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 FACS 방법을 수행하였다(실시예 8 참조).
항원-특이적 B 세포로부터 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: huPCSK9에 대해 기재된 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다(실시예 8 참조).
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: 표적 1 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 도 9를 참조한다. 실온에서 모든 항온처리를 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(피어스(Pierce))를 1시간 동안 바이오티닐화된 표적 1 펩타이드 함유 용액(PBS 중의 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 이후, 표적 1 펩타이드 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20) 중에 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 대략 1시간 동안 차단 용액(PBS, 0.5% 어피 젤라틴, 0.05% 트윈-20)을 사용하여 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 이후 항체의 희석 시리즈와 항온처리하고, 이 항체를 대략 1시간 동안 시험하였다. 이 항온처리 종료 시, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이때, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3분 내지 5분 동안 항온처리하였다. HCl 함유 용액(0.5M)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
이 실시예는 다수의 항-표적 1 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab5 및 Ab6은 표적 1에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났다(도 9 참조).
실시예 11: 인간 베타-NGF에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 사용함으로써, 베타-NGF에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 예시적인 항-NGF 항체 Ab7 및 Ab8을 포함하는, 광범위한 패널의 항체를 생성할 수 있다. 항체는 NGF에 대해 높은 친화도(약 10 -900 pM KD)를 갖고, 세포 기반 스크리닝 시스템(TF1 및 PC-12)에서 NGF의 강력한 길항작용을 나타낸다. 더욱이, 항체의 수집은 NGF 추진 과정에 대해 명확한 방식의 길항작용을 나타냈다.
면역화 전략: 토끼를 huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 개별 펩타이드로 면역화하였다(실시예 8 참조).
ABS 역가 평가: 항원 인식 검정을 huPCSK9에 대해 상기 기재된 프로토콜에 의해 huB-NGF에 대해 결정하였다(실시예 8 참조).
기능적 역가 평가: 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하고 규명하기 위해, 셀티터(CellTiter)(상표명) 96 수성 일 용액 세포 증식 검정(Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)(프로메가 G3580호)을 이용하여 TF1(ATCC CRL-2003호) 세포의 NGF 추진된 증식의 저해를 수행하였다. 간단히 말하면, 시험하고자 하는 항체 제제를 B-NGF를 갖는 96웰 환저 폴리스타이렌 플레이트(코스타)에서 10% CRPMI(완전 RPMI 배지 + 10% FBS) 중에 연속하여 희석하였다. 실온에서 항온처리 후, 항체-NGF 복합체를 TF1 세포(웰마다 25,000개의 세포)에 첨가하고, 48시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 셀티터(상표명) 96 수성 일 용액 세포 증식 검정을 이용하여 세포 생육성을 결정하였다. 생성된 플레이트를 492㎚에서 표준 플레이트 판독기에서 분석하고, 그래프 표시하여 증식 반응을 확립하였다. 기능 변경 역가는 이 검정에서 증식을 감퇴시켰다.
조직 수확: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 토끼 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 처리하고 냉동시켰다(실시예 8 참조).
B 세포 배양: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 B 세포 배양을 설정하였다(실시예 8 참조).
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: 단일 지점으로서 상기 기재된 바대로 항원 인식 스크리닝을 수행하였다(실시예 8 참조). 상기 기재된 바대로 B-NGF 인식에 기초하여 마스터 플레이트를 생성하였다.
기능적 활성 스크리닝: 마스터 플레이트를 이후 상기 기재된 바대로 TF1 증식 검정에서 기능적 활성에 대해 스크리닝하였다.
B 세포 회수: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 FACS 방법을 수행하였다(실시예 8 참조).
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: huPCSK9에 대해 기재된 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다(실시예 8 참조).
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: hu B-NGF에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 도 10을 참조한다. 실온에서 모든 항온처리를 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(써모 사이언티픽)를 1시간 동안 바이오티닐화된 hu B-NGF 함유 용액(PBS 중의 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 이후, hu B-NGF 펩타이드 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20) 중에 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 대략 1시간 동안 차단 용액(PBS, 0.5% 어피 젤라틴, 0.05% 트윈-20)을 사용하여 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 이후 항체의 희석 시리즈와 항온처리하고, 이 항체를 대략 1시간 동안 시험하였다. 이 항온처리 종료 시, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이때, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3분 내지 5분 동안 항온처리하였다. HCl 함유 용액(0.5M)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
TF1 세포 증식 검정에 의한 재조합 항체의 기능적 규명: 재조합 hu B-NGF 항체를 hu B-NGF 기능적 역가 부문에 기재된 바대로 TF-1 증식 검정에서 기능에 대해 평가하였다. 도 11을 참조한다.
이 실시예는 다수의 항-hu B-NGF 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab7 및 Ab8은 B-NGF에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났고(도 10 참조), TF1 증식 검정에서 증식을 감퇴시켰다(도 11 참조).
실시예 12: 표적 2에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 사용함으로써, 표적 2에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 예시적인 항-표적 2 항체 Ab9 및 Ab10을 포함하는, 광범위한 패널의 항체를 생성할 수 있다. 생성된 항체는 표적 2 특이성, 및 표적 2에 대한 동종성 단백질에 대한 결합의 보유를 포함하는 다양한 에피토프에 결합할 수 있고, 기능적 검정에 의해 효력에 대해 항체를 또한 검정하였다.
면역화 전략: 토끼를 (KLH와 혼합된) CGRPα에 대해 실시예 9에 기재된 바대로 및 부가적인 방법에 의해 표적 2로 면역화하였다. 구체적으로, 표적 2 항원은 KLH 및 토끼 혈청 알부민(Rabbit Serum Albumin: RSA)에 직접적으로 접합된 펩타이드이다. 각각의 경우에, CGRPα에서처럼, 100㎍의 항원 또는 KLH/RSA 접합 항원을 초기 면역화에 대한 CFA 및 후속적인 면역화에 대한 50㎍의 부스트와 사용하였다. 접합 면역화를 위해, ㎍ 양(100㎍ 초기, 50㎍ 부스트)을 항원과 일치시켰다. 이전에 기재된 시점에 혈액을 채취하였다.
ABS 역가 평가: 표적 2의 바이오티닐화된 형태를 사용하여 huPCSK9에 대해 기재된 프로토콜에 의해 표적 2에 대해 항원 인식 검정을 결정하였다(실시예 8 참조).
기능적 역가 평가: 이노시톨 1-포스페이트에 기초하여 2차 메신저 판독을 이용하여 세포 기반 HTRF 검정을 통해 효력에 대해 표적 2에 대한 항체를 검정하였다.
조직 수확: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 토끼 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 처리하고 냉동시켰다(실시예 8 참조).
B 세포 배양: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 B 세포 배양을 설정하였다(실시예 8 참조).
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: 단일 지점으로서 상기 기재된 바대로 항원 인식 스크리닝을 수행하고(실시예 8 참조), 항원 양성 웰로부터 마스터 플레이트를 생성하였다.
기능적 활성 스크리닝: 마스터 플레이트를 이후 상기 기재된 바대로 HTRF 검정에서 기능적 활성에 대해 스크리닝하였다. 항체 공급원에 대해 70㎕의 상청액을 사용하였다.
B 세포 회수: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 FACS 방법을 수행하였다(실시예 8 참조).
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: huPCSK9에 대해 기재된 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다(실시예 8 참조).
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: 표적 2에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 도 12를 참조한다. 실온에서 모든 항온처리를 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(써모 사이언티픽)를 1시간 동안 바이오티닐화된 표적 2 함유 용액(PBS 중의 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 이후, 표적 2 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20) 중에 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 대략 1시간 동안 차단 용액(PBS, 0.5% 어피 젤라틴, 0.05% 트윈-20)을 사용하여 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 이후 항체의 희석 시리즈와 항온처리하고, 이 항체를 대략 1시간 동안 시험하였다. 이 항온처리 종료 시, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이때, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3분 내지 5분 동안 항온처리하였다. HCl 함유 용액(0.5M)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
세포 기반 HTRF 검정에 의한 재조합 항체의 기능적 규명: 재조합 표적 2 항체를 기능적 역가 부문에 기재된 바대로 세포 기반 HTRF 검정에서 기능에 대해 평가하였다. 도 13을 참조한다.
이 실시예는 다수의 항-표적 2 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab9 및 Ab10은 표적 2에 대해 높은 결합 친화도(도 12 참조) 및 HTRF 검정에서 기능적 활성(도 13 참조)을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 13: 표적 3에 결합하는 항체의 제조
본 명세서에 기재된 항체 선택 프로토콜을 사용함으로써, 표적 3에 대해 특이성을 갖는 명확한 항체인 예시적인 항-표적 3 항체 Ab11 및 Ab12를 포함하는, 광범위한 패널의 항체를 생성할 수 있다. 생성된 항체는 표적 3에 특이적인 다양한 에피토프에 결합한다.
면역화 전략: 토끼를 (KLH와 혼합된) CGRPα에 대해 실시예 9에 기재된 바대로 및 부가적인 방법에 의해 표적 3으로 면역화하였다. 구체적으로, 표적 3 항원은 KLH에 직접적으로 접합된 펩타이드이다. 각각의 경우에, CGRPα에서처럼, 100㎍의 항원 또는 KLH/RSA 접합 항원을 초기 면역화에 대한 CFA 및 후속적인 면역화에 대한 50㎍의 부스트와 사용하였다. 접합 면역화를 위해, ㎍ 양(100㎍ 초기, 50㎍ 부스트)을 유리 비접합 항원과 일치시켰다. 이전에 기재된 시점에 혈액을 채취하였다.
ABS 역가 평가: 표적 3의 바이오티닐화된 형태를 사용하여 huPCSK9에 대해 기재된 프로토콜에 의해 표적 3에 대해 항원 인식 검정을 결정하였다(실시예 8 참조).
기능적 역가 평가: 사이클릭-AMP에 기초하여 2차 메신저 판독을 이용하여 세포 기반 전기화학발광(메소 스케일 디스커버리, MSD) 검정을 통해 효력에 대해 표적 3에 대한 항체를 검정할 수 있다.
조직 수확: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 토끼 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 처리하고 냉동시켰다(실시예 8 참조).
B 세포 배양: huPCSK9에 대해 기재된 바대로 B 세포 배양을 설정하였다(실시예 8 참조).
B 세포 배양 항원 인식 스크리닝: 단일 지점으로서 상기 기재된 바대로 항원 인식 스크리닝을 수행하고(실시예 8 참조), 항원 양성 웰로부터 마스터 플레이트를 생성하였다.
기능적 활성 스크리닝: 마스터 플레이트를 상기 기재된 바대로 MSD 검정에서 기능적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 항체 공급원에 대해 70㎕의 상청액을 사용할 수 있다.
B 세포 회수: huPCSK9에 대해 상기 기재된 바대로 FACS 방법을 수행하였다(실시예 8 참조).
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정: huPCSK9에 대해 기재된 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다(실시예 8 참조).
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 생성: 특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 인간 신장 293 세포로 형질감염시키고, 재조합 항체를 후속하여 배양 배지로부터 회수하였다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원 인식: 표적 3에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, ELISA에 의해 항체 함유 용액을 시험하였다. 도 14를 참조한다. 실온에서 모든 항온처리를 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(써모 사이언티픽)를 1시간 동안 바이오티닐화된 표적 3 함유 용액(PBS 중의 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 이후, 표적 3 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% 트윈-20) 중에 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 대략 1시간 동안 차단 용액(PBS, 0.5% 어피 젤라틴, 0.05% 트윈-20)을 사용하여 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 이후 항체의 희석 시리즈와 항온처리하고, 이 항체를 대략 1시간 동안 시험하였다. 이 항온처리 종료 시, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이때, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3분 내지 5분 동안 항온처리하였다. HCl 함유 용액(0.5M)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기에서 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
세포 기반 HTRF 또는 MSD 검정에 의한 재조합 항체의 기능적 규명: 재조합 표적 3 항체를 기능적 역가 부문에 기재된 바대로 세포 기반 HTRF 검정에서 기능에 대해 평가할 수 있다.
이 실시예는 다수의 항-표적 3 항체 서열이 확인된 항원-특이적 B 세포로부터 클로닝된다는 것을 나타낸다. 예시적인 항체 Ab11 및 Ab12는 표적 3에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났다(도 14 참조).
상기 예는 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지의 완전한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 당업자에게 제공하도록 기재되어 있고, 본 발명으로 생각되는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도, 농도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력이 이루어지지만, 약간의 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다. 달리 기재되지 않은 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
본 발명의 다양한 예시된 실시형태의 상기 설명은 완전한 것으로 또는 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 특정한 실시형태 및 본 발명에 대한 예가 예시 목적을 위해 본 명세서에 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자가 인식하는 것처럼 다양한 균등한 변형이 본 발명의 범위 내에 가능하다. 본 발명의 본 명세서에 제공된 교시내용은 상기 기재된 예 이외의 다른 목적에 적용될 수 있다.
본 발명은 특히 상기 설명 및 예에 기재된 것 이외의 방식으로 실행될 수 있다. 본 발명의 다양한 변형 및 변경이 상기 교시내용의 견지에서 가능하고, 따라서 청구범위 내에 있다.
상기 상세한 설명의 견지에서 본 발명에 이들 변경 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정한 실시형태에 본 발명을 제한하도록 해석되지 않아야 한다. 따라서, 본 발명은 본 개시내용에 의해 제한되지 않지만, 대신에 본 발명의 범위는 전적으로 하기 청구범위에 의해 한정될 것이다.
배경, 요약, 상세한 설명 및 예에서 인용된 각각의 문헌을 포함하여, 본 명세서에 인용된 각각의 문헌의 전체 개시내용(특허, 특허 출원, 저널 논문, 요약서, 매뉴얼, 책 또는 다른 개시내용을 포함)은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
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Claims (23)
- 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법으로서,
(ⅰ) 관심 대상 항원에 면역화되거나 자연히 노출된 숙주로부터 B 세포를 얻는 단계;
(ⅱ) 상기 B 세포의 분획을 농후화하여 항원-특이적 B 세포의 농후화된 집단을 얻는 단계로서, 상기 집단은 농후화 전의 상기 B 세포 분획에 비해 상기 관심 대상 항원에 결합하는 항체를 생성하는 B 세포를 더 높은 백분율로 함유하는, 상기 항원-특이적 B 세포의 농후화된 집단을 얻는 단계;
(ⅲ) 상기 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단의 형성을 선호하는 배양 조건 하에 상기 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단으로부터 하나 이상의 분획을 분리하여 배양하는 단계;
(ⅳ) 상기 관심 대상 항원에 결합하는 단일 항체를 생성하는 클론성 B 세포 집단을 검출하여, 하나 이상의 항원-특이적 B 세포를 확인하는 단계;
(ⅴ) 임의로, 단계 (ⅳ)에서 확인된 클론성 항원-특이적 B 세포 집단을 스크리닝하여 적어도 하나의 원하는 기능적 특성을 보유하는 항원-특이적 항체를 생성하는 B 세포를 확인하는 단계;
(ⅵ) 임의로, 상이한 클론성 B 세포 배양물로부터 얻은 항원-특이적 B 세포를 혼주(pooling)하는 단계;
(ⅶ) 단계 (ⅳ) 후에 또는 상기 임의의 단계 (ⅴ) 또는 임의의 단계 (ⅵ) 후에 얻은 항원-특이적 B 세포를 염색된 B 세포의 양성 및/또는 음성 선택을 수월하게 하는 적어도 하나의 라벨에 의해 염색하는 단계; 및
(ⅷ) 상기 염색된 항원-특이적 B 세포를 분류하고, 임의로, 상기 분류된 염색된 B 세포를 게이팅(gating)하여 단일 항원-특이적 B 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항에 있어서,
(ⅸ) 상기 분류된 B 세포를 상기 분류된 B 세포에 의해 발현된 항원-특이적 항체 가변 서열의 증폭을 수월하게 하는 역전사 중합효소 사슬 반응(reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR) 반응 배지에 위치시키는 단계로서, 임의로, 단계 (xi)는 효모, 박테리아, 식물, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포; 이배체 효모, 피치아 종(Pichia species); 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 재조합 세포에서의 발현을 포함하는 단계;
(ⅹ) 상기 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 증폭된 핵산을 서열분석하는 단계;
(xi) 상기 항원-특이적 항체 가변 서열을 코딩하는 상기 증폭된 핵산 또는 이의 변이체를 발현시켜 항체 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
(xⅱ) 임의로 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA), 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunoadsorbent assay: ELISA), 면역침강, 형광 면역검정, 웨스턴 블롯, 표면 플라스몬 공명(비아코어(BIAcore)(등록상표)) 분석 또는 예컨대 ELISA에 의한 또 다른 항원 결합 검정을 이용하여 상기 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 상기 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정함으로써, 상기 발현된 항체 폴리펩타이드 중 어느 것이 상기 관심 대상 항원에 결합하는지를 결정하는 단계
에 의해, 상기 가변 경쇄 구역 및/또는 가변 중쇄 구역을 코딩하는 항원-특이적 항체 가변 서열을 클로닝하는 단계를 추가로 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 숙주는 기니아 피그, 토끼, 마우스, 래트, 비인간 원시류 또는 인간이거나, 상기 숙주는 토끼인, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅰ)는 비장, 림프절, 골수, 말초 혈액 단핵 세포 및 혈액으로부터 선택되는 적어도 하나의 공급원으로부터 B 세포를 수확하는 단계를 포함하거나, 단계 (ⅰ)는 비장, 림프절, 골수, 말초 혈액 단핵 세포 및 혈액으로부터 선택되는 하나 초과의 공급원으로부터 B 세포를 수확하고, 하나 초과의 공급원으로부터 상기 B 세포를 혼주하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주로부터의 혈청에 존재하는 항원-특이적 항체 및/또는 중화 항체의 역가를 확립하는 단계를 추가로 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 상기 농후화 단계 (ⅱ)는 고체 기질 또는 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원을 사용한 항원-특이적 B 세포의 친화도 정제를 포함하고, 임의로, 상기 고체 기질은 자석 비드를 포함하고/하거나, 임의로, 상기 고체 기질은 칼럼을 포함하고/하거나, 임의로, 상기 고체 기질 또는 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 항원은 바이오티닐화되고 스트렙타비딘, 아비딘 또는 뉴트라비딘을 통해 상기 기질 또는 지지체에 부착되거나;
(b) 상기 농후화 단계 (ⅱ)는 (1) B 세포를 바이오틴 표지 항원과 조합하는 단계; (2) 임의로, 상기 B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 세척하는 단계; (3) 스트렙타비딘 비드를 (1) 또는 (2)의 상기 B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물에 도입하는 단계; (4) 칼럼 위로 상기 스트렙타비딘 비드/B 세포/바이오틴 표지 항원 조성물을 통과시키는 단계; 및 (5) 상기 칼럼을 세척하고 상기 칼럼으로부터 상기 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함하거나;
(c) 상기 농후화 단계 (ⅱ)는 (1) 바이오틴 표지 항원을 스트렙타비딘 비드와 조합하는 단계; (2) 칼럼 위로 상기 바이오틴 표지 항원/스트렙타비딘 비드 조성물을 통과시키는 단계; (3) 상기 칼럼을 세척하고 상기 칼럼으로부터 바이오틴 표지 항원 코팅된 비드를 용리시키는 단계; (4) B 세포를 상기 코팅된 비드와 조합하는 단계; (5) 상기 칼럼 위로 B 세포와 코팅된 비드의 혼합물을 통과시키는 단계; 및 (6) 상기 칼럼을 세척하고 상기 칼럼으로부터 상기 결합 B 세포를 용리시켜, 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 얻는 단계를 포함하거나; 또는
(d) 상기 농후화 방법 (a), (b) 및/또는 (c) 또는 상기 농후화 방법의 조합은 적어도 1회 반복되어 추가의 농후화된 항원-특이적 B 세포 집단을 생성시키고;
상기 농후화 단계 (ⅱ)는 항원-특이적 B 세포의 백분율을 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1,000배 또는 적어도 10,000배 농후화시키고/시키거나, 상기 농후화된 B 세포 집단에서의 항원-특이적 B 세포의 백분율은 적어도 1%, 5% 또는 10%인, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농후화된 항원-특이적 B 세포는 공급 세포를 포함하는 배지에서 단계 (ⅲ)에서 배양되고; 임의로,
(a) 상기 공급 세포는 조사된 EL4 세포이거나;
(b) 상기 배양 배지는 활성화된 T 세포 조건 배지를 포함하거나;
(c) 상기 농후화된 B 세포는 약 1% 내지 약 5%의 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지를 포함하는 배지에서 배양되고;
임의로, 상기 배양은 적어도 약 1일 내지 9일, 2일 내지 8일, 3일 내지 7일, 4일 내지 6일 또는 5일 내지 7일 동안 실행되거나, 임의로, 상기 배양은 약 5일 내지 7일 동안 실행되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농후화된 B 세포는 적어도 1개, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개의 농후화된 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양되고; 임의로,
(a) 상기 농후화된 B 세포는 약 50개 내지 약 100개의 농후화된 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양되거나;
(b) 상기 농후화된 B 세포는 약 25개 내지 약 50개의 농후화된 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양되거나;
(c) 상기 농후화된 B 세포는 약 10개 내지 약 25개의 농후화된 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양되거나; 또는
(d) 상기 농후화된 B 세포는, 다중웰 플레이트의 각각의 웰에서 조사된 EL4 세포 및 T 세포 상청액(T cell supernatant: TSN)과 조합된, 약 1개 내지 약 200개의 농후화된 항원-특이적 B 세포를 함유하는 각각의 웰을 갖는 다중웰 플레이트에서 배양되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 검출 단계 (ⅳ)는 상기 배양된 농후화된 B 세포로부터 상청액을 제거하는 단계 및 상기 상청액을 평가하여 항원-반응성 상청액을 함유하는 다중웰 플레이트에서 개별적인 웰을 확인함으로써, 항원-특이적 B 세포를 함유하는 웰을 검출하는 단계를 포함하고; 임의로,
(a) 상기 상청액은 ELISA에 의해 평가되고/되거나;
(b) 상기 상청액은 약 2일 내지 약 7일 동안 상기 농후화된 B 세포를 배양한 후 항원-특이적 IgG 생성 및 전체 IgG 생성에 대해 평가되고/되거나;
(c) 상기 상청액은, (1) 플레이트를 항-종 Fab에 의해 코팅함으로써; (2) 배양된 B 세포로부터의 상청액을 상기 플레이트에 첨가함으로써; 그리고 (3) 상기 상청액에서 전체 IgG를 항-종 IgG에 의해 검출함으로써, 전체 IgG 생성에 의해 평가되고, 임의로, 상기 항-종 Fab는 항-토끼 Fab이고, 상기 항-종 IgG는 항-토끼 IgG이고/이거나;
(d) 상기 상청액은, (1) 플레이트를 비표지된 항원에 의해 코팅하거나 스트렙타비딘 플레이트를 바이오틴 표지 항원에 의해 코팅함으로써; (2) 배양된 B 세포로부터의 상청액을 상기 플레이트에 첨가함으로써; 그리고 (3) 상기 상청액에서 항원-특이적 IgG를 항-종 IgG에 의해 검출함으로써, 항원-특이적 IgG 생성에 의해 평가되고, 임의로, 상기 항-종 IgG는 항-토끼 IgG이고;
임의로, 상기 다중웰 플레이트에서 항원-특이적 웰 대 전체 IgG 웰의 비율은 B 세포 농후화 및 클론성과 상관되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임의의 기능적 활성 스크리닝 단계 (ⅴ)는 항원-특이적 기능적 검정을 이용하여 상기 항원-반응성 상청액을 평가하여 적어도 하나의 원하는 기능적 특성을 갖는 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 웰을 확인하는 단계를 포함하고; 임의로,
(a) 상기 임의의 기능적 활성 스크리닝 단계 (ⅴ)는 단계 (ⅳ)에서 확인된 항원-특이적 B 세포를 스크리닝하여 결합 파트너에 결합하는 항원의 효현작용 또는 길항작용; 특이적 표적 세포 유형의 증식의 유도 또는 저해; 표적 세포의 용해의 유도 또는 저해; 또는 항원을 포함하는 생물학적 경로의 유도 또는 저해를 나타내는 항원-특이적 항체를 생성하는 B 세포를 확인하는 단계를 포함하고; 추가로 임의로,
(b) 상기 항원-특이적 항체는 T1165 세포의 증식의 유도 또는 저해; TF1 세포의 증식의 유도 또는 저해; SK-N-MC 세포에서의 cAMP 생성의 유도 또는 저해; 또는 PCSK9/LDLR 상호작용의 저해에 대해 스크리닝되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) ELISA 스크린으로부터의 항원-반응성 상청액은 또 다른 플레이트로 전달되고 냉동되고/되거나;
(b) 하나 이상의 냉동 및 저장 단계는, 임의로 냉동 또는 저장 배지의 첨가에 의해, 하나 이상의 방법 단계에 개재하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색 단계 (ⅶ)는 음성 항원-특이적 B 선택 방법을 수월하게 하고, 임의로, 상기 음성 항원-특이적 B 선택 방법은 유동세포계수법을 이용하여 모든 생육성 비-EL4 세포를 분류하는 단계를 포함하고; 임의로, 상기 음성 항원-특이적 B 선택은, B 세포를 Thy1.2에 대해 특이적인 표지된 항체와 같은 조사된 EL4 세포를 염색하는 제1 라벨 및 요오드화프로피듐(propidium iodide: PI)과 같은 비생육성 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색 단계 (ⅶ)는 양성 항원-특이적 B 선택 방법을 수월하게 하고, 임의로, 상기 양성 항원-특이적 B 선택 방법은 유동세포계수법을 이용하여 모든 생육성 종-특이적 B 세포를 분류하는 단계를 포함하고; 임의로, 상기 양성 항원-특이적 B 선택은, 항-토끼 IgG와 같은 종 IgG에 대해 특이적인 표지된 항체와 같은 종-특이적 B 세포를 염색하는 제1 라벨 및 요오드화프로피듐(PI)과 같은 비생육성 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임의의 게이팅 단계 (ⅷ)는 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는 분류된 생육성 비-EL4 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유동세포계수법은 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 면역자기 세포 분류(immunomagnetic cell sorting: MACS)를 이용하여 수행되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분류 단계 (ⅷ)는 상기 세포를 RT-PCR 반응 배지로 직접적으로 분류하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 상이한 개별적인 웰은 염색 및 세포 분류 전에 조합되거나, (b) 유사한 친화도 및/또는 원하는 기능적 특성을 갖는 항원-특이적 항체를 분비하는 항원-특이적 B 세포를 함유하는 상이한 개별적인 웰은 염색 및 분류 전에 조합되고; 임의로,
(ⅰ) 약 2개 내지 약 10개의 상이한 개별적인 웰의 항원-특이적 B 세포가 조합되거나;
(ⅱ) 약 10개 내지 약 50개의 상이한 개별적인 웰의 항원-특이적 B 세포가 조합되거나; 또는
(ⅲ) 약 50개 내지 약 150개의 상이한 개별적인 웰의 항원-특이적 B 세포가 조합되는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅰ)는 면역화 후 약 20일 내지 약 90일에, 예컨대 면역화 후 약 50일 내지 약 60일에 상기 숙주로부터 B 세포를 얻는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임의의 게이팅 단계는 비염색된 세포의 자가형광에 기초하여 게이트를 구축하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 확인하는 방법.
- 명확한 물리적 프로필(FSC/SSC 집단)을 보유하는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된, 주로 생육성 비-EL4 세포의 분류된 집단으로서, 임의로, 상기 집단은 생육성 종-특이적 B 세포를 포함하는, 세포의 분류된 집단.
- 제20항에 있어서, B 세포를 Thy1.2에 대해 특이적인 표지된 항체와 같은 조사된 EL4 세포를 염색하는 제1 라벨 및 요오드화프로피듐(PI)과 같은 비생육성 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는, 음성 항원-특이적 B 선택을 이용하여 유동세포계수법에 의해 얻어지는, 세포의 분류된 집단.
- 제20항에 있어서, 토끼 IgG에 대해 특이적인 표지된 항체와 같은 종-특이적 B 세포를 염색하는 제1 라벨 및 요오드화프로피듐(PI)과 같은 비생육성 세포를 염색하는 제2 라벨에 의해 염색함으로써 수행되는, 양성 항원-특이적 B 선택을 이용하여 유동세포계수법에 의해 얻어지는, 세포의 분류된 집단.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원, CGRP, NGF, 신경전달물질(neurotransmitter), PCSK9 또는 IL-6과 같은 인간 항원에 특이적인 B 세포를 포함하는, 세포의 분류된 집단.
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