WO2007119808A1 - 融合パートナー細胞 - Google Patents

融合パートナー細胞 Download PDF

Info

Publication number
WO2007119808A1
WO2007119808A1 PCT/JP2007/058129 JP2007058129W WO2007119808A1 WO 2007119808 A1 WO2007119808 A1 WO 2007119808A1 JP 2007058129 W JP2007058129 W JP 2007058129W WO 2007119808 A1 WO2007119808 A1 WO 2007119808A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
cells
antibody
producing
fusion partner
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/058129
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naomasa Yamamoto
Mizuho Kaneda
Original Assignee
Medical And Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. filed Critical Medical And Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority to EP07741565A priority Critical patent/EP2009094B1/en
Priority to KR1020087027724A priority patent/KR101429254B1/ko
Priority to BRPI0710650-5A priority patent/BRPI0710650A2/pt
Priority to DE602007007071T priority patent/DE602007007071D1/de
Priority to CN200780022113XA priority patent/CN101466828B/zh
Priority to JP2008510996A priority patent/JP5160412B2/ja
Priority to US12/296,899 priority patent/US8173425B2/en
Publication of WO2007119808A1 publication Critical patent/WO2007119808A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a fusion partner cell and a hyperidoma.
  • Hypridoma (fused cells) is used for substance production by cultured cells. Many animal cells produce commercially or academically useful substances. However, it is generally difficult to cultivate animal cells, and no technique has been established for culturing animal cells stably over a long period of time while maintaining the ability to produce substances. Therefore, myeloma, which can be cultured stably in vitro in vitro, is used as a fusion partner cell, and the fusion partner cell and a cell that produces a physiologically active substance are fused to form a hyperidoma. A technique to create cells with both traits has been proposed.
  • Monoclonal antibodies using the cell fusion method are used to test the properties such as the production amount and binding properties of antibodies produced by hyperpridoma, and unify the cells to be selected. It is produced by growing cells and creating a uniform cell population. These hyperpridomas are grown in vitro or in vivo (as ascites) and expanded for mass production of antibodies.
  • a technique for developing a monoclonal antibody using the cell fusion method is already known (see Non-Patent Document 1).
  • Monoclonal antibodies are said to be more specific than antiserum-purified polyclonal antibodies, making them an important tool for various immunological analysis methods!
  • hyperidoma When cell fusion is performed between allogeneic cells, it is simply called a hyperidoma.
  • mouse monoclonal antibodies are produced by this method.
  • antibody-producing cells isolated from one species and fused with immortalized cells from another species are called heterohypridoma.
  • heterohybrid is used interchangeably with xenogeneic fusion, and the resulting cell is called heterohypridoma.
  • an antibody-producing cell obtained by fusing cells derived from three types of animals is also called a trioma.
  • the monoclonal antibody produced by this method is rat Nyanster antibody, which is a myeloma cell derived from mouse.
  • the mouse X rat or mouse X hamster heterohypridoma is prepared by fusing the vesicles with rat lymphocytes that have been administered a predetermined antigen.
  • the heterohypridoma thus obtained is cloned to obtain a monoclonal antibody derived from each immunized animal.
  • Non-Patent Document 1 Waldman.T., Science 252: pl657-1662 (1991)
  • Non-Patent Document 2 Pro ⁇ Natl.Acad.Sci. (USA) 80: p7308-7312,1983
  • Non-Patent Document 3 Raybould et al., Science 240: pl788-1790, 1988
  • Non-Patent Document 4 Kennedy et al., J. Gen. Virol. 69: p3023- 3032, 1988
  • Non-Patent Document 5 Flynn et al. J. Immunol. Methods 121: p237-246, 1989
  • Patent Document 1 US Patent No. 4634664
  • Patent Document 2 US Patent No. 4977081
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of more easily applying stable substance production by a hyperpridoma in a wide range of animal species. Specifically, an object of the present invention is to provide a new fusion partner useful for the production of a hyperidoma and a production method thereof. Alternatively, an object of the present invention is to provide a hyperidoma obtained by fusing the fusion partner obtained by the present invention and a substance-producing cell, a method for producing the same, and a method for producing a substance using the hyperidoma.
  • the production of substances using cell fusion technology is limited except for limited animals such as mice.
  • the lack of cells useful as fusion partners for cell fusion is one of the important issues of cell fusion technology in animals other than mice.
  • the present inventors have found that cells useful as a fusion partner can be obtained by fusing specific cells.
  • the fusion partner toner cells established by the present inventors give a stable high-pridoma by fusion with cells other than mice.
  • the present invention was completed by confirming that the thus obtained ibridoma stably maintained its trait during cloning and was also useful as a substance-producing cell. It has also been clarified that the hyperpridoma of the present invention can produce an antibody that specifically recognizes an antigen.
  • the present invention relates to the following fusion partner cells and the hyperpridoma of the fusion partner cells and substance-producing cells. Alternatively, the present invention relates to a method for producing these cells, and a method for producing a substance utilizing hyperpridoma.
  • the first animal species is a mouse, and the myeloma cells are selected from the group consisting of the following mouse myeloma cells and cell lines derived from these cell lines: Fusion partner cells;
  • the first animal species is a mouse, and the myeloma cells are selected from the group consisting of the following mouse myeloma cells and cell lines derived from these cell lines: High Pridoma;
  • a method for producing a fusion partner cell comprising the following steps;
  • step (2) A step of culturing the cells fused in step (1) and recovering fusion partner cells from the culture medium.
  • a method for producing a high-pridoma comprising the following steps;
  • a step of culturing the cells fused in the step (1) and recovering the hyperidoma from the culture [15] A method for producing an antibody-producing cell comprising the following steps;
  • step (2) A step of recovering the hyperidoma obtained in step (1) as antibody-producing cells.
  • step (2) A step of culturing the hyperidoma obtained in step (1) and recovering the antibody from the culture.
  • a method for producing an antibody against an infectious disease comprising the following steps;
  • step (2) A step of culturing the hyperidoma obtained in step (1) and recovering an antibody against the infection from the culture.
  • the present invention relates to the use of a fused cell obtained by fusing the following cells (a) and (b) as a fusion partner cell. More specifically, the present invention includes the use of the fusion cell as a fusion partner cell with an antibody producing cell.
  • a fusion partner cell that provides a stable hyperpridoma by cell fusion with a heterologous cell.
  • the hyperidoma obtained by cell fusion with the fusion partner cell of the present invention stably produces a substance.
  • the fusion partner cell of the present invention provides a hybridoma that produces an antibody derived from an antibody-producing cell by cell fusion with the antibody-producing cell.
  • the fusion partner cell of the present invention provides a hybridoma that produces a human antibody or a mouse antibody by cell fusion with a human or mouse antibody-producing cell. It has been difficult to stably maintain human antibody-producing cells. Accordingly, providing cells that stably produce human antibodies is a significant effect of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cell cycle of MEG-01.
  • FIG. 2 A diagram showing the concept of screening for a HgG-producing hybridoma by ELISA.
  • FIG. 4 Photograph showing confirmation of IgG in each elution fraction of clones K0142 (+), MK16 (+), and MK99 (+).
  • (+) indicates an ELISA positive clone
  • (+) indicates an ELISA negative clone.
  • FIG. 5 Elution fraction of each clone, a photograph confirming IgG of the dialyzed sample after concentration.
  • FIG. 6 is a diagram showing the steps of an improved method for SPYMEG cell fusion.
  • FIG. 7 is a diagram comparing the number of colonies formed before and after the improvement of the cell fusion method, and the number of IgG producing clones.
  • FIG. 8 shows the reactivity of IgG-producing clones that react with influenza in ELISA.
  • FIG. 9 is a graph showing reactivity to influenza vaccine by Western-blotting.
  • FIG. 10 is a diagram showing SDS-PAGE of purified HgG (6-19) and confirmation of reactivity.
  • the values in the table are ELISA values sensitized with influenza HA vaccine and indicate the absorbance at a wavelength of 450 nm.
  • hyperidoma refers to a cell obtained by cell fusion.
  • nobridoma is produced by the fusion of cells of different species, or cells of the same species from different individuals or tissues.
  • cells obtained by fusing the same cells of the same species are also included in the cells.
  • the hyperidoma in the present invention includes a fused cell obtained by fusion of two or more cells. That is, the fused cell ⁇ obtained by further fusing the cell C to the hybridoma a obtained by cell fusion between the cell A and the cell B is also included in the nobridoma of the present invention.
  • Cell A Cell A
  • Cell ⁇ [Hybridoma (X) [Hypridoma a]
  • X (cell C) [no, ibridoma 13]
  • the species from which cell ⁇ , cell ⁇ , and cell C that give the hyperidoma ⁇ fused with the above three types of cells is arbitrary. Accordingly, the present invention includes cases where the species from which these cells are derived are the same or different. Hypridoma obtained by the fusion of three types of cells is sometimes called a trioma.
  • the species from which cell B (first cell) and cell B (second cell) are derived is different, and the species from which cell B and cell C (third cell) are derived is the same. It is. Or, when the species from which cell A and cell C are derived is the same, or when cell A, cell B, and cell C are all derived from different species, they are included in the present invention. Be turned.
  • a cell obtained by cell fusion that can be easily cultured in vitro for a long period of time is particularly called a hyperidoma. Therefore, a preferred hybridoma in the present invention refers to a cell that can be easily cultured for a long time in vitro after cell fusion.
  • preferred hyperidomas in the present invention are cells in which cell growth is maintained after limited dilution. In other words, cells whose cell growth is maintained after limited dilution are included in cells that can be easily cultured for a long time in vitro after cell fusion.
  • a preferred hyperidoma in the present invention is a cell that maintains the character of the cell used for cell fusion.
  • the characteristics of cells to be maintained in a hyperidoma include the ability to produce substances possessed by the cells.
  • the cell used for cell fusion is a cell that produces an antibody or cyto force-in
  • a preferred hyperidoma in the present invention maintains the ability to produce these substances.
  • the hyperidoma in the present invention does not necessarily completely maintain the traits of the cells used for cell fusion.
  • the hyperpridoma in the present invention does not necessarily completely maintain the traits of the cells used for cell fusion.
  • the hyperpridoma in the present invention can be used. included.
  • the "fusion partner cell” refers to a cell that can produce a hybridoma by fusing with another cell.
  • a preferred fusion partner cell enables long-term cell survival in vitro by cell fusion.
  • the fusion partner cell preferably has an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker means a trait that can (or cannot!) Be viable under specific culture conditions.
  • HGPRT-deficient and TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • Normal cells take up these pyrimidine analogs in their DNA and therefore die.
  • Cells lacking these enzymes cannot take up these pyrimidine analogs and can survive in selective media.
  • G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) by the neomycin resistance gene.
  • the present invention provides a fusion partner cell obtainable by fusing the following cells (a) and (b).
  • the present invention also provides a method for producing a fusion partner cell comprising the following steps. (1) a step of fusing the following cells (a) and (b),
  • step (2) A step of culturing the cells fused in step (1) and recovering fusion partner cells from the culture medium.
  • the myeloma cell derived from the first animal species is a cell derived from myeloma that can be cloned alone.
  • the ability to clone alone means that it can start and maintain even with a single cell force in an artificial culture environment.
  • any cell can be used as long as it can provide a fusion partner by cell fusion with leukemia cells.
  • examples of known cells that can be used as myeloma cells in the present invention include the following cell lines.
  • ATCC is the deposit number of the American Tissue and Culture Collection
  • JCRB is the deposit number of the JCRB cell bank (Japanese Collection of Research Bioresources). Therefore, any of these cell lines can be sold from the cell bank.
  • the JCRB cell bank cell lines are distributed through the Health Science Research Resources Bank (HSRRB).
  • MOPC21 (ATCC number HB-8411)
  • mice myeloma cell lines or cell lines derived from these mouse myeloma cell lines are a group of mouse myeloma cell lines or cell lines derived from these mouse myeloma cell lines.
  • An induced cell line refers to a cell line that has been cloned again by introducing additional traits such as drug resistance.
  • the leukemia cells derived from the second animal species in the present invention are leukemia cells containing the Extra-S phase in the cell cycle.
  • the cell cycle is composed of the following cycles. Cells that continue to proliferate continue to divide by repeating the G1 to M phase cycles. On the other hand, when cell growth is stopped, the cell cycle is stopped after a stable state called GO phase after M phase.
  • the S phase is a period during which nucleic acid synthesis is performed.
  • MEG-01 includes the Extra-S phase in the cell cycle that increases genomic DNA and has the property of making the chromosome polyploid (Oncogene 13: p695-703, 1996) (Fig. 1)
  • the use of leukemia cells that have an Extra-S phase in the cell cycle and have the property of making the chromosome polyploidy can also be expected to have the effect of preventing the loss of chromosomes derived from antibody-producing cells. .
  • the leukemia cell containing Extra-S phase in the cell cycle is derived from an animal species different from the myeloma described above, and preferably the same as the species from which the third cell described later is derived.
  • Leukemia cells can be obtained from hematopoietic tissues and peripheral blood of individuals with leukemia. Hematopoietic tissues include bone marrow, spleen, or lymph Includes clauses.
  • Examples of leukemia include megakaryocyte leukemia.
  • white blood cells or mononuclear cells can be separated by centrifuging peripheral blood by the Ficoll method and collecting a cell fraction having a specific gravity.
  • the isolated leukemia cells contain the Extra-S phase in the cell cycle using an increase in the cell chromosome as an index.
  • the increase in chromosome can be confirmed, for example, by an increase in the ploidy (total number of chromosomes) of cells treated with 12-o-tetrade canoyl phorbol 13 acetate (TPA).
  • TPA 12-o-tetrade canoyl phorbol 13 acetate
  • the increase in broody can be detected with a flow cytometer or broody analyzer.
  • known leukemia cells can also be used in the present invention.
  • the following cell lines can be exemplified as known cells that can be used as leukemia cells derived from the second animal species in the present invention.
  • MEG-01 and HEL are human megakaryocytic leukemia cell lines (Blood 66: pl384-1392, 1985, J. Clin. Invest. 85: pl072-1084).
  • M07e (Avanzi GC et al. J Cell Physiol. 1990 Dec; 145 (3): 458-64.) MEG-A2 (JCRB No.IFO50478)
  • MEG-01 has 8AG resistance useful as a selectable marker.
  • MEG-01 itself is capable of producing S-immunoglobulin and is therefore preferred as a fusion partner for the production of high-pridoma with antibody-producing cells.
  • the fusion partner cell of the present invention comprises a myeloma cell derived from the first animal species, a leukemia cell derived from the second animal species, and a leukemia cell containing an Extra-S phase in the cell cycle. It can be obtained by fusing.
  • a known cell fusion technique such as a polyethylene glycol (PEG) method or an electrofusion method can be used.
  • the operation of the polyethylene glycol method is as follows. First, the cell ratio between myeloma cells and leukemia cells is optimized for each specific fusion condition.
  • concentration of polyethylene glycol (PEG) is determined by those skilled in the art based on conditions such as the molecular weight of PEG. You can choose. For example, 35% PEG1500 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) is one of the conditions for general cell fusion. Cell fusion is performed by slowly adding 1 mL of 35% PEG1500 to the cell pellet Z cell mixture for 1.5 minutes followed by gradual dilution in serum-free medium followed by serum-containing medium.
  • cell fusion Other methods that can also be used to facilitate cell fusion include electrofusion.
  • cells are placed in a special buffer and aligned by applying an electric field.
  • the aligned cells have an increased chance of contact with other cells and can efficiently fuse the cells.
  • the fusion mixture is brought to a cell density of 8xl0 5 cells / mL in 150 ml of HB—GRO medium (Irvine Scientific, Santa Ana, California) containing, for example, 15% urine fetal serum, and 2.0 ⁇ 10 5 cells / well.
  • HB—GRO medium Irvine Scientific, Santa Ana, California
  • fusion partner cells Incubate to 8AG resistance and obtain fusion partner cells.
  • the obtained fusion partner cells can be cloned as necessary. Cloned fusion partner cells contribute to the maintenance of reproducibility in the production of hypridoma.
  • SP2 / 0-Agl4 is used as a myeloma cell derived from the first animal species
  • M EG is used as a leukemia cell derived from the second animal species and containing the Extra-S phase in the cell cycle.
  • -01 can be used respectively.
  • the fusion partner cells thus provided can be stably passaged over a long period of time, and the ability of antibody-producing cells to become universal fusion partner cells for obtaining monoclonal antibodies.
  • a fusion partner that can stably bring about hybridomas using antibody-producing cells derived from species other than mice, similar to mouse myeloma, which was established as a mouse homo-hypridoma! Useful.
  • SPYM EG which is a fusion partner cell obtained by fusing mouse myeloma cell line SP2 / 0-Agl4 and human leukemia cell line MEG-01, Deposited at the Patent Biological Depositary Center under the deposit number FERM BP-10761.
  • the present invention relates to a hybridoma that can be obtained using the above fusion partner cell. That is, the present invention provides a hyperidoma that can be obtained by fusing the following cells (1) and (2).
  • a fusion partner cell obtainable by fusing the following cells (a) and (b),
  • the present invention also provides a method for producing a high-pridoma including the following steps.
  • leukemia cells derived from a second animal species leukemia cells containing Extra-S phase in the cell cycle
  • step (1) (2) culturing the cells fused in step (1) and recovering fusion partner cells from the culture medium
  • step (3) a step of fusing a third cell to the fusion partner cell recovered in step (2), and
  • step (3) A step of culturing the cells fused in step (3) and recovering the hyperidoma from the culture.
  • the third cell in the present invention is a cell derived from the same species as the first cell or the second cell, or from a different species. Specifically, for example, cells derived from humans, rabbits, mice, rats, rabbits, goats, and hidges can be used. More specifically, when a fusion partner obtained from a mouse-derived myeloma (first cell) and a human-derived leukemia cell (second cell) is used, the preferred cell as the third cell is human. There Is derived from a mouse. In particular, the ability to use human-derived cells as the third cells is a great advantage of the fusion partner cells of the present invention.
  • the third cell in the present invention is a cell that is expected to be able to be cultured for a long period of time. More specifically, for example, a cell having the ability to produce a target substance can be used as the third cell.
  • a hyperidoma that can maintain cells having the desired trait for a long period of time can be obtained.
  • immortalize In order to maintain cells for a long period of time by adopting a hybridoma, it is generally referred to as immortalize.
  • any cell that produces the target physiologically active substance can be used as the third cell.
  • an antibody can be mentioned. That is, antibody-producing cells are preferable as the third cells in the present invention.
  • antibody-producing cells include white blood cells (peripheral lymphocyte cells) and spleen cells. Methods for collecting vitality of these cells are known.
  • the third cell include an antibody-producing cell derived from a subject having a history of exposure to an infectious disease pathogen antigen. Examples of subjects with an infectious disease pathogen antigen exposure history include subjects who have been inoculated with an infectious disease pathogen antigen (vaccine), or subjects with an infection history of infection.
  • the infectious disease is not particularly limited, but preferably, influenza, viral hepatitis such as AIDS, HCV and HBV can be exemplified.
  • peripheral blood lymphocytes are preferred as antibody-producing cells in the present invention.
  • Peripheral blood lymphocytes can be easily obtained by blood collection.
  • a mouse peripheral blood lymphocyte as a hyperidoma according to the present invention, a hyperidoma producing a mouse antibody can be easily obtained.
  • human peripheral blood lymphocytes as a hyperidoma according to the present invention, a hyperidoma producing a human antibody can be easily obtained.
  • the fusion partner and the third cell can be fused by the same technique as the cell fusion of the first cell and the second cell described above.
  • PE G method or electrofusion method can be used.
  • the fusion partner of the present invention When SPYMEG is used for cell fusion with human peripheral blood lymphocytes, the following conditions can be shown as preferable conditions.
  • the number of peripheral blood leukocytes (PBL) to be fused is preferably adjusted to 1 ⁇ 10 7 to 10 8 .
  • Polyethylene glycol (PEG) is added to the collected cell fraction to fuse the cells.
  • the concentration of PEG used for cell fusion is 30% to 70%, preferably 40 to 60%, more preferably 50%.
  • serum-free medium and PEG those used for ordinary cell fusion by those skilled in the art can be appropriately used.
  • the following medium or PEG can be used for cell fusion in the present invention.
  • PEG 1500 Aldrich, Milwaukee, Wisconsin
  • HAT HAT supplement (50x) (GIBCO, Catalog No. 21060-017)
  • Serum-free medium RPMI 1640 (SIGMA, catalog No R8758)
  • antibody-producing cells can be obtained from immunized animals.
  • An immunized animal is immunized with an arbitrary antigen in advance together with an appropriate adjuvant.
  • An antigen can be combined with a carrier protein to make an immunogen.
  • a carrier protein for obtaining the immunogen mussel hemocyanin (KLH), sushi serum albumin (BSA) or the like can be used. Usagi, mouse, rat, goat, or hidge are generally used as immune animals.
  • Freund's complete adjuvant (FCA) or the like is generally used as the adjuvant (A dv. Tubercl. Res., 1: 130-148, 1956).
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • the antibody titer is traced by ELISA or Otatero method.
  • antibody-producing cells After confirming that the antibody titer has sufficiently increased, antibody-producing cells are removed and the cells are dispersed to obtain antibody-producing cells used for cell fusion. Like humans, splenocytes and peripheral blood phosphorus Antibody-producing cells can be collected by collecting the papillocytes. The antibody-producing cells obtained in this way can be used as the hybridoma of the present invention by fusing with the fusion partner of the present invention.
  • an antibody in the method for producing a hyperidoma of the present invention, can be produced by using an antibody-producing cell as the third cell. That is, the present invention provides a method for producing an antibody comprising the following steps.
  • a step of obtaining fusion partner cells by the following steps;
  • step (B) Step of culturing the cells fused in step (A) and recovering fusion partner cells from the culture;
  • step (1) a step of fusing antibody-producing cells to the fusion partner cell obtained in step (1) to obtain a hyperidoma
  • step (3) A step of culturing the hyperidoma obtained in step (2) and recovering the antibody from the culture.
  • the present invention relates to a method for producing a cell producing an antibody useful for producing the above-mentioned antibody. That is, the present invention provides a method for producing an antibody-producing cell comprising the following steps.
  • a step of obtaining fusion partner cells by the following steps;
  • step (B) Step of culturing the cells fused in step (A) and recovering fusion partner cells from the culture.
  • step (2) A step of re-fusion of antibody-producing cells with the fusion partner cell obtained in step (1) to obtain a hyperidoma; and (3) A step of recovering the hyperidoma obtained in step (2) as antibody-producing cells.
  • Hypridoma can preferentially proliferate cells that have succeeded in cell fusion by culturing in an appropriate selective medium.
  • a selective medium containing HAT can be used.
  • the hybridoma can be clawed. Methods for crawling hyperidoma are known. That is, it is possible to clone hybridomas by limiting dilution. A hybridoma that has been limitingly diluted theoretically forms a population of cells grown from one cell. The cell population thus obtained is a cell population having uniform genetic characteristics, that is, a clone. An antibody that also obtains cloned hybridoma power is called a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are antibodies that have highly uniform antigen binding properties.
  • the present invention provides a method for producing a monoclonal antibody including the following steps.
  • a step of obtaining fusion partner cells by the following steps;
  • step (B) Step of culturing the cells fused in step (A) and recovering fusion partner cells from the culture;
  • step (2) a step of fusing an antibody-producing cell to the fusion partner cell obtained in step (1) to form a hyperidoma, and cloning the hyperidoma that produces the target antibody;
  • step (3) A step of culturing the hybridoma cloned in step (2) and recovering the monoclonal antibody from the culture.
  • the present invention relates to a method for producing a cell that produces an antibody useful for producing the above antibody. That is, the present invention provides a method for producing an antibody-producing cell comprising the following steps. provide.
  • a step of obtaining fusion partner cells by the following steps;
  • step (B) Step of culturing the cells fused in step (A) and recovering fusion partner cells from the culture.
  • step (2) A step of re-fusion of antibody-producing cells with the fusion partner cell obtained in step (1) to obtain a hyperidoma;
  • step (3) A step of recovering the hyperidoma obtained in step (2) as antibody-producing cells.
  • antibody-producing cells can be cloned.
  • cloning antibody-producing cells that produce the desired antibody cells that produce monoclonal antibodies can be obtained. That is, the present invention provides a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody, comprising the following steps.
  • a step of obtaining fusion partner cells by the following steps;
  • step (B) Step of culturing the cells fused in step (A) and recovering fusion partner cells from the culture.
  • step (2) a step of re-fusion of antibody-producing cells with the fusion partner cell obtained in step (1) to form a hyperidoma, and cloning the hyperidoma producing the desired antibody;
  • step (3) The step of collecting the hybridoma cloned in step (2) as antibody-producing cells.
  • the hyperidoma of the present invention is an antibody-producing cell having a stable antibody-producing ability in vitro. Therefore, while it is a heterono, ibridoma, it is possible to grow cells in an appropriate medium. In addition, the ability to produce antibodies is maintained. Therefore, it is unlikely that the necessary clones will be lost during the cloning process. In addition, the established high-pridoma clone can be maintained stably.
  • An antibody or a monoclonal antibody can be produced by culturing the hyperidoma obtained by the present invention or a clone thereof. It is preferable to use a serum-free medium or a low-concentration serum medium as the medium because the antibody can be easily purified.
  • Basic animal cell culture media include DMEM, RPMI1640, or ASF medium 103.
  • Monoclonal antibodies can also be recovered as ascites by inoculating nude mice into the abdominal cavity of skid mice.
  • FCS rabbit fetal serum
  • Components that enhance antibody production in vitro include, for example, D-pesilamine, acetoacetic acid, biguanides, vitamin K5, ⁇ -acetyl glutamic acid (JP-A-8-70858), interleukin 6 (Nature, 324: 6092, 73-6; 1986), sugar alcohol (JP-A-2-200177), lipopolysaccharide (JP-A-4-20294), phorbol ester (JP-A-1-171494), or butyric acid (hybridoma Vol. 4, No. 1) , p63; 1985).
  • the monoclonal antibody thus obtained can be purified by salting-out using ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., ion exchange chromatography, gel filtration, or affinity chromatography.
  • the RPMI + 5% FCS cells have been cultured in a culture solution (usually medium) SP2 / 0-Ag-14 (3xl0 7) and MEG- 01 (3 ⁇ 6xl0 7) were fused with PEG in a conventional manner.
  • the fused cells are placed in normal medium (for 3 days RPMI + 5% FCS), and cultured for 3 days on the 3rd day in an RPMI solution without FCS.
  • limiting dilution was performed with a normal medium containing 8AG and cultured for 5 days. Since the fused cells have grown, this was taken as a fusion partner cell SPYMEG.
  • SPYMEG was deposited at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of February 24, 2006 under the deposit number FE RM BP-10761 (transferred from FERM P-20816). SPYMEG is 8A G resistant and died when cultured in HAT medium.
  • the collected human peripheral blood leukocytes and SPYMEG were mixed at a ratio of 2: 1 to 10: 1 and centrifuged (4-8 x 10 7 samples were obtained from 40 mL of peripheral blood. 4 SPYMEGs were 75 cm flasks. Use minutes
  • Cell fusion was performed by adding 0.6-1.0 mL of 50% PEG (PEG4000, MERCK Cat No 1097270100, RPMI (RPMI 1640, SIGMA, Cat No R8758)) to the pellet. After washing with RPMI serum-free medium, 15% FBS (EQUITECH-BIO INC Lot.SFB30-1548)-HA T (HAT supplement (BM—condimed, roche Cat No 663573) (50x), GIBCO Cat No 2 1060-017 ) Suspended with 160 mL of 1% BM medium and seeded in 8 96-well plates. The culture medium was changed 3 days after seeding, and the culture supernatant was sampled from a 96-well plate at the stage where colonization of hyperidoma was confirmed (after 2 to 3 weeks), and primary screening was performed.
  • PEG PEG4000, MERCK Cat No 1097270100, RPMI (RPMI 1640, SIGMA, Cat No R8758)
  • FBS
  • the sample (superior culture) was applied at a flow rate of 1 drop / second, and the pass-through was collected. PBS / 0.1%
  • the flow rate was dissociated at full speed with 0.1-5M Glycine-HC1 buffer pH 2.3, 2-5 times the column bed volume. Dissociation was collected in a test tube using a fraction collector. In the test tube, 1MTris-HC1 buffer pH8.0 was put in 1/5 or more of the dissociation amount (mL).
  • the dissociated product and the neutral 1M Tris-HCl buffer pH 8.0 were mixed as soon as possible.
  • the pooled material was subjected to SDS-PAGE with 12.5% gel and sample buffer (2ME +) to check the purity.
  • the sample amount per lane was 5 ⁇ g, and the same amount was run in the previous lot for comparison. It was packed in a dialysis tube and dialyzed with PBS or PBS / 0.1% NaN3 100 times or more of the collection volume once and 6 times or more 3 times. After the concentration was completed, the dialysis tube was thoroughly washed with deionized water, and the dialysis tube was thoroughly agitated to dissolve the protein attached to the tube wall, and the concentrated solution was taken out from the tube. Thereafter, the concentration was measured.
  • the dissociated materials can be collected and stirred together with a single graduated cylinder, beaker, etc.
  • 1M Tris-HCl buffer pH 8.0 for neutralization to 1/5 or more of the dissociated product recovery volume (mL), and check that the pH is 8.0 using pH test paper after recovery. If the pH is lower than 8.0, obtain a neutralization buffer and immediately adjust to pH 8.0.
  • Usagi anti-human IgG polyclonal antibody was diluted to 10 ⁇ g / mL with Sensitive Buffer (PBS). Each 50 ⁇ l / well was dispensed into a microplate (Nunc MaxiSorp). It was allowed to stand at 4 ° C. Sensitive effect Buffer was removed and water was shaken off. Blocking Buffer (1% BSA 0.1% NaN in P
  • BS was dispensed at 100 ⁇ l / well, and left at 4 ° C for 1 hour.
  • the hybridoma culture supernatant was dispensed in 50 ⁇ l / well sensitized microplates (prepared in a). The reaction was allowed to stand at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed, and after washing 3 times with a washing buffer (0.05% Tween 20ZPBS), water was shaken off.
  • Labeled antibody Peroxidase system diluted 5000 times The anti-human IgG POD-labeled polyclonal antibody
  • An enzyme substrate solution tetramethylbenzidine solution
  • the enzyme substrate solution was dispensed at 50 / zl / well.
  • the reaction was allowed to proceed for about 15 minutes at room temperature.
  • the reaction stop solution (2N H 2 SO 4) was dispensed at 50 / zl / well.
  • Absorbance main wavelength A450 / sub
  • Wavelength A620 was measured.
  • Figure 2 shows a conceptual diagram of the ELISA method used in this study.
  • the prepared fusion partner cell SPYMEG was compared with the existing human fusion partner cell Karpas (Ab raham Karpas et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Feb 13; 98 (4): 1799-1804) (Fig. 3).
  • SPYMEG is a spherical cell similar to general mouse myeloma cells, and its adhesion was weak compared to Karpas. Furthermore, the growth ability was high (data not shown). These results indicate that SPYMEG has higher performance as a fusion partner cell than Karpas. Furthermore, the established fusion partner cell SPYMEG was shown to be stable without losing productivity even after 100% culture (1 month culture) after sleeping after freezing (data not shown) .
  • Table 1 shows the production of IgG, which is obtained from the fusion of SPYMEG and human peripheral blood leukocytes. Hypridoma was seeded in 8 96-well microplates (768 wells), and the number of wells that formed colonies, of which produced IgG, and maintained IgG production when cultured for more than 3 weeks. Shows the number of uels that were played. Screening by ELISA was performed.
  • Table 2 shows the yield of purified IgG from each clone culture supernatant that was positive. Purified IgG strength from 100 mL of culture supernatant was also calculated, and the HgG concentration in the culture supernatant was 2 to 11 ⁇ g / mL. It was confirmed that the concentration was almost equivalent to that of normal mouse hyperpridoma.
  • peripheral blood is diluted with PBS, mixed with HISTPAQUE and centrifuged to obtain leukocytes (B cells) with higher purity than 1S.
  • Peripheral blood is mixed with HetaSep (HETASTARCH) and red blood cells are mixed. After pretreatment, the human peripheral blood leukocytes were collected by the method of overlaying HISTPAQUE (Fig. 6).
  • Centrifugation was performed at 1800 rpm for 30 min at room temperature, and after centrifugation, a white band layer (leukocyte layer) formed in the middle of the solution was collected with a Pasteur pipette into a 50 ml tube. About 30 ml of serum-free medium DMEM was added, centrifuged at 1600 rpm for 8 min and washed.
  • the prepared heterohypridoma was purified for IgG and measured for HgG by ELISA according to the methods described in [Example 3] and [Example 4]. As a result, it was confirmed that both the number of colonies formed by cell fusion and the number of IgG-producing clones increased as a result of improving the heterohypridoma production method (Fig. 7). .
  • the reactivity of the IgG-producing clone prepared by the method of [Example 7] to the influenza vaccine was confirmed. Specifically, the IgG production of clones was confirmed by sandwich ELISA on the plate that felt influenza vaccine and the plate that did not sense anything and only blocked (removal of non-specific clones) by the following steps. .
  • influenza vaccine diluted 30-fold with PBS was poured into an ELISA plate at 50 ⁇ l / well and allowed to stand (feel).
  • Influenza HA vaccine Institute of Chemistry and Blood Therapy, Japan
  • This product is obtained by individually culturing influenza virus type A and B strains individually in growing eggs, purifying and concentrating allantoic fluid containing the proliferated virus by sucrose density gradient centrifugation, etc. After treatment, the suspension is treated with haemagglutinin (HA) fraction suspension, inactivated with formalin, and diluted with phosphate buffered saline-sodium solution so that it contains the specified amount of HA. ing.
  • HA haemagglutinin
  • the solution was removed and the blocking buffer was allowed to stand for 200 1 / well (blocking).
  • the blocking buffer was removed, and the culture supernatant of Hyperidoma was reacted at 50 1 / well at room temperature for 1 hour.
  • the supernatant was removed and washed 3 times with 0.05% TweenPBS.
  • Anti-HgGHRP-labeled antibody (MBL: 206) was diluted 5000 times and allowed to react for 1 hour at room temperature. After washing three times, 50 1 each of chromogenic substrate was added to develop color for 15 minutes, a reaction stop solution was added, and the absorbance (OD450) was measured with a plate reader.
  • Equal volume of influenza HA vaccine and sample buffer were mixed and boiled for 5 minutes. 20 1 (Vaccine 10 1) was applied to a 12.5% gel. SDS-PAGE was performed, transferred to a PVDF membrane (immobil on-P CatNo IPVH00010), and blocked with 4 ° C O / N in 2% skim milk / PBS. Anti-human IgG HRP (MBL code 206) X 3000 in 10% BlockAce I PBS was used as a detection antibody and treated at room temperature for 1 hour. Washed 3 times with buffer (0.05% Tween 20 in PBS). Development was carried out in 1 minute using PHICE (super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate ⁇ code.34 080). Hyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103K was used as the film, 3% acetic acid was used as the stop solution for Rendor (Fuji Film), and Renfix (Fuji Film) was used as the fixing solution.
  • PHICE super signal WestP
  • HgG that reacts with influenza HA vaccine was purified by the following steps.
  • the culture supernatant was applied at a flow rate of 1 drop / second, and the pass through was collected.
  • the column Protein G Sepharose: Protein G sepharose 4 Fast Flow CatNo: 17-061 8-03
  • the dialysis tube was thoroughly washed with deionized water, and the dialysis tube was thoroughly agitated to dissolve the protein attached to the tube wall, and the concentrated solution was removed from the tube. Thereafter, the concentration of the concentrated solution was measured.
  • the present invention is useful for substance production using animal cells.
  • cells that produce useful substances can be made into high-pridomas that can be easily cultured in vitro by cell fusion with the fusion partner of the present invention.
  • Examples of cells that produce useful substances include antibody-producing cells.
  • the present invention is useful as a method for producing an antibody.
  • the present invention can produce a hyperidoma using human antibody-producing cells as a material.
  • the hyperidoma obtained by the present invention stably produces human antibodies.
  • the blood of a patient who has recovered from an infection is likely to have cells that produce antibodies that neutralize the pathogen or the toxin produced by the pathogen! If such an antibody-producing cell of a patient is a hyperprideoma according to the present invention, an antibody useful for the treatment of infectious diseases can be produced.
  • infectious diseases for which therapeutic antibodies can be obtained according to the present invention include influenza, AIDS, viral hepatitis such as HCV and HBV, and the like.
  • antibody-producing cells of cancer patients may contain cells that produce antibodies having a damaging effect on cancer cells. If such an antibody-producing cell is a hyperidoma according to the present invention, an antibody effective for cancer treatment can be obtained.
  • human antibodies can be obtained using human antibody-producing cells. Human antibodies are preferred as therapeutic antibodies because they can be safely administered to humans. In order to use an antibody that has gained the power of a mouse, which is commonly used as a monoclonal antibody production tool, for human therapy, chimerization is a modification of humanization. It is clear that the method for producing an antibody of the present invention is useful as a method for producing a therapeutic antibody as compared with the case where decoration is necessary.

Abstract

　第１の動物種に由来するミエローマ細胞と第２の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期をもち染色体を倍数体にする性質を有する白血病細胞を融合させることにより、マウス以外の種ともヘテロハイブリドーマを作製できる融合パートナー細胞を作製した。この融合パートナー細胞をマウス以外の物質産生細胞と融合させ、ヘテロハイブリドーマを作製することにより、安定した物質生産が可能となった。

Description

明 細 書
融合パートナー細胞
技術分野
[0001] 本発明は、融合パートナー細胞、並びにハイプリドーマに関する。
背景技術
[0002] ハイプリドーマ（融合細胞）は、培養細胞による物質生産に利用されている。動物細 胞の中には商業的に、あるいは学術的に有用な物質を産生するものも多い。しかし 一般に動物細胞の培養は困難で、物質産生能を維持しつつ長期にわたり安定して 動物細胞を培養する技術は確立されていない。そこで、生体外で永久に安定した培 養が可能なミエローマを融合パートナー細胞とし、融合パートナー細胞と生理活性物 質を産生する細胞を融合させてハイプリドーマとすることで培養能と物質生産能の両 方の形質を備えた細胞を作り出す技術が提案された。
[0003] 細胞融合法を用いるモノクローナル抗体は、ハイプリドーマが産生する抗体の産生 量や結合性などの性質を試験し、選択する細胞を単一化する。そして細胞を増殖さ せ、均一な細胞集団を作出することによって生産される。これらのハイプリドーマはィ ンビトロまたはインビボ (腹水として)で培養増殖され、抗体の大量生産のために拡張 される。細胞融合法を用いるモノクローナル抗体を開発するための手法は既に知ら れている（非特許文献 1参照)。モノクローナル抗体は、抗血清力 精製したポリクロ ーナル抗体に比べて特異性に優れるとされており、各種の免疫学的な分析手法に ぉ 、て重要なツーノレとなって!/、る。
[0004] 細胞融合が同種の細胞間で行われる場合、単にハイプリドーマと呼ばれる。一般的 にはマウスのモノクローナル抗体などはこの方法で作製される。これに対し、ある種か ら単離されて別の種に由来する不死化細胞と融合された抗体産生細胞はへテロハイ プリドーマと呼ばれる。ヘテロハイブリッドという用語は異種間融合と同意義に使用さ れ、作出された細胞はへテロハイプリドーマと呼ばれる。さらに、三種類の動物種由 来の細胞を融合させた抗体産生細胞であればトリオ一マとも呼ばれる。この方法で作 製されるモノクローナル抗体はラットゃノヽムスターの抗体で、マウス由来の骨髄腫細 胞と予め予定の抗原を投与したラットゃノヽムスターのリンパ球と融合させ、マウス Xラ ット、あるいはマウス Xハムスターのヘテロハイプリドーマが作製される。こうして得ら れたヘテロハイプリドーマは、クロー-ングされ、各免疫動物由来のモノクローナル抗 体が得られる。
[0005] 現在までに、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ヒッジのモノクローナル抗体を作製するへテロハイ プリドーマについての報告がある（非特許文献 2— 5、特許文献 1、 2参照)。
[0006] しかし、ヘテロハイプリドーマによるモノクローナル抗体の作製は融合する細胞の生 物学的系統の種間が遠くなる程、抗体を産生させることが難しいとされている。たとえ ばマウス Xゥサギ、ある 、はマウス Xヒトのハイブリドーマでは抗体の産生は極めて難 しい。ノ、イブリドーマは異常な染色体数ゆえに、分離が常に同一の染色体対を娘細 胞に与えるとは限らず、これらの染色体が失われることもある。
非特許文献 1： Waldman.T., Science 252:pl657- 1662(1991)
非特許文献 2 : Pro^Natl.Acad.Sci.(USA) 80:p7308- 7312,1983
非特許文献 3 : Raybouldら, Science 240:pl788- 1790,1988
非特許文献 4 : Kennedyら, J.Gen.Virol.69:p3023- 3032,1988
非特許文献 5 : Flynnら J.Immunol.Methods 121:p237- 246,1989
特許文献 1：米国特許第 4634664号明細書
特許文献 2：米国特許第 4977081号明細書
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、ハイプリドーマによる安定的な物質生産を幅広い動物種でより容 易に応用できる技術を提供することである。具体的には、本発明は、ハイプリドーマ の作製に有用な新たな融合パートナー、およびその作製方法の提供を課題とする。 あるいは本発明は、本発明によって得られた融合パートナーと物質生産細胞との融 合によって得られたハイプリドーマ、その製造方法、そして当該ハイプリドーマによる 物質の生産方法の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 細胞融合技術を利用した物質の生産は、マウスなどの限られた動物を除くと、さま ざまな課題が残されていた。たとえば、細胞融合に用いる融合パートナーとして有用 な細胞が提供されていないことは、マウス以外の動物における細胞融合技術の重要 な課題の一つである。本発明者らは、特定の細胞を融合させることによって、融合パ 一トナーとして有用な細胞を得られることを見出した。本発明者らが榭立した融合パ 一トナー細胞は、マウス以外の細胞との融合によって、安定なハイプリドーマを与える 。更に、こうして得られたノ、イブリドーマは、クローユングの間もその形質を安定に維 持し、そして物質生産細胞としても有用であることを確認して本発明を完成した。また 、本発明のハイプリドーマによって、抗原を特異的に認識する抗体を産生できること が明らかとなった。
すなわち本発明は、以下の融合パートナー細胞、並びにこの融合パートナー細胞 と物質生産細胞とのハイプリドーマに関する。あるいは本発明は、これらの細胞の製 造方法、並びにハイプリドーマを利用する物質の製造方法に関する。
〔i〕 次の細胞 ωおよび (b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細 胞；
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞。
〔2〕 第 1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細 胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔1〕 に記載の融合パートナー細胞；
MOPC21, P3X63AG8、 SP2/0、 NS- 1、 P3.X63AG8.653、 F0、 S194/5.XXO.BU- 1、 FO X-NY、および SP2/0-Agl4。
〔3〕 第 2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれ らの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔1〕に記載の融合 パートナー細胞；
MEG— 01、 HELゝ UT— 7、 M07eゝ MEG— A2、および DAMI。
〔4〕 第 1の細胞が SP2Z0—Agl4であり、第 2の細胞が MEG- 01である、〔1〕に記載 の融合パートナー細胞。 [5] 受託番号 FERM BP— 10761として寄託された融合パートナー細胞 SPYMEG。 〔6〕 以下の細胞（1)および（2)を融合することによって得ることができるハイプリドー マ；
(1)次の細胞 ωおよび (b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細 胞、および
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)第 3の細胞。
〔7〕 第 1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細 胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔6〕 に記載のハイプリドーマ；
MOPC21, P3X63AG8、 SP2/0、 NS- 1、 P3.X63AG8.653、 F0、 S194/5.XXO.BU- 1、 FO X-NY、および SP2/0-Agl4。
〔8〕 第 2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれ らの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔6〕に記載のハイ ブリドーマ；
MEG— 01、 HELゝ UT— 7、 M07eゝ MEG— A2、および DAMI。
〔9〕 第 1の細胞が SP2Z0— Agl4であり、第 2の細胞が MEG- 01である、〔6〕に記載 のノヽイブリドーマ。
〔10〕 融合パートナー細胞力 受託番号 FERM BP— 10761として寄託された SPYM EGである、〔6〕に記載のハイプリドーマ。
〔11〕 第 3の細胞力 第 2の細胞と同じ動物種に由来する細胞である〔6〕に記載の ハイプリドーマ。
〔12〕 第 3の細胞力 抗体産生細胞である〔11〕に記載のハイプリドーマ。
〔13〕 以下の工程を含む融合パートナー細胞を製造する方法；
(1)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、 (b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物カゝら融合パートナー細胞を回収する 工程。
〔14〕 以下の工程を含むハイプリドーマを製造する方法；
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融 合させる工程、および
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物からハイプリドーマを回収する工程。 〔15〕 以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法；
(1)〔13〕記載の方法によって得られた、融合パートナー細胞と抗体産生細胞を融合 させてハイプリドーマを得る工程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
〔16〕 付カ卩的に工程（1)で得たノ、イブリドーマをクローユングする工程を含む、〔15〕 に記載の方法。
〔17〕 以下の工程を含む抗体を製造する方法；
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融 合させてハイプリドーマを得る工程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを培養し、培養物カゝら抗体を回収する工程。
〔18〕 付カ卩的に工程（1)で得たノ、イブリドーマをクローユングする工程を含む、〔17〕 に記載の方法。
〔19〕以下の工程を含む感染症に対する抗体を製造する方法；
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、感染症の病原体抗 原の暴露履歴のある対象由来の抗体産生細胞を融合させてハイプリドーマを得るェ 程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを培養し、培養物カゝら感染症に対する抗体を回収 する工程。
〔20〕感染症力 インフルエンザ、 AIDS,またはウィルス性肝炎のいずれかである〔19
〕に記載の方法。 [0009] あるいは本発明は、次の細胞 (a)および (b)を融合することにより得ることができる融 合細胞の、融合パートナー細胞としての使用に関する。より具体的には、本発明は、 当該融合細胞の、抗体産生細胞との融合パートナー細胞としての使用を含む。
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞
発明の効果
[0010] 本発明によって、異種の細胞との細胞融合によって、安定なハイプリドーマを与え る融合パートナー細胞が提供された。本発明の融合パートナー細胞との細胞融合に よって得られたハイプリドーマは、物質を安定に生産する。特に、本発明の融合パー トナー細胞は、抗体産生細胞との細胞融合によって、抗体産生細胞に由来する抗体 を産生するハイブリドーマを与える。本発明の融合パートナー細胞は、好ましい態様 において、ヒトあるいはマウスの抗体産生細胞との細胞融合によって、ヒト抗体あるい はマウス抗体を産生するハイプリドーマを与える。ヒトの抗体産生細胞を安定に維持 することは困難とされていた。したがって、ヒトの抗体を安定に産生する細胞を提供し たことは、本発明の大きな効果である。
[0011] ノ、イブリドーマが形質を安定に維持することは、物質の生産のみならず、細胞のクロ 一ユングにおいても重要な特徴である。たとえば抗体産生細胞は、モノクローナル抗 体を得るためにハイプリドーマがクローユングされる。細胞のクローユングは、単一の 細胞力 増殖した細胞集団を得ることに他ならない。したがって、単一の細胞が分裂 を繰り返す過程で、細胞の形質が安定していなければ、 目的とする細胞のクローニン グは困難を極める。本発明によって提供されたハイブリドーマは、細胞の形質を安定 に維持するので、容易〖こクローニングすることができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]MEG- 01の細胞周期を示した図である。
[図 2]ELISA法によるヒ HgG産生ハイブリドーマのスクリーニングの概念を示した図で ある。
[図 3]本発明の融合パートナー細胞 SPYMEGと既存の融合パートナー細胞 Karpasの 形態を比較した写真である。
[図 4]クローン K0142(+),MK16(+),MK99(+)の各溶出フラクションの IgGを確認した写 真である。図中の (+)は ELISA陽性クローン、（-)は ELISA陰性クローンを示す。
[図 5]各クローンの溶出フラクション、透析'濃縮後のサンプルの IgGを確認した写真 である。
[図 6]SPYMEG細胞融合の改良方法の工程を示す図である。
[図 7]細胞融合方法の改良前後のコロニー形成数、 IgG産生クローン数を比較した図 である。 96穴プレート 4枚あたりのコロニー形成ゥエル数、 IgG産生ゥエル数を示した細 胞融合の工程を改良することにより、コロニー形成ゥエル数、 IgG産生ゥエル数が顕著 に増加しており、そのうちインフルエンザのスクリーニングではインフルエンザワクチン を特異的に認識する抗体が複数個得られた。抗原を特異的に認識する抗体の確立 に始めて成功した。
[図 8]インフルエンザに反応する IgG産生クローンの ELISAでの反応性を示す図である
[図 9]Western-blottingによるインフルエンザワクチンに対する反応性を示す図である
[図 10]精製ヒ HgG (6-19)の SDS- PAGEおよび反応性の確認を示す図である。表中の 値は、インフルエンザ HAワクチンを感作した ELISAの値で、波長 450nmにおける吸光 度を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明にお 、て「ハイプリドーマ」は、細胞融合によって得られた細胞を言う。通常 、 ノ、イブリドーマは、種の異なる細胞、あるいは同種の異なる個体や組織に由来する 細胞の融合によって製造される。あるいは、同じ種の同じ細胞同士を融合させた細胞 も、ノ、イブリドーマに含まれる。更に本発明におけるハイプリドーマは、 2以上の細胞 の融合によって得られた融合細胞を含む。すなわち、細胞 Aと細胞 Bとの細胞融合に よって得られたノヽイブリドーマ aに対し、更に細胞 Cを融合させることによって得られ た融合細胞 βも、本発明におけるノ、イブリドーマに含まれる。
(細胞 A) X (細胞 Β) = [ハイブリドーマ (X ] [ハイプリドーマ a ] X (細胞 C) = [ノ、イブリドーマ 13 ]
上記の 3種類の細胞を融合させたハイプリドーマ βを与える細胞 Α、細胞 Β、および 細胞 Cが由来する種は任意である。したがって、これらの細胞が由来する種は、同一 の場合と、異なる場合とが本発明に含まれる。 3種類の細胞の融合によって得られる ハイプリドーマを、特にトリオ一マと呼ぶ場合がある。
本発明の好ましい態様においては、細胞 Α (第 1の細胞）と細胞 B (第 2の細胞）が由 来する種は異なり、細胞 Bと細胞 C (第 3の細胞）が由来する種は同一である。あるい は、細胞 A、および細胞 Cが由来する種が同一の場合、もしくは細胞 A、細胞 B、およ び細胞 Cがいずれも異なる種に由来する場合も、本発明におけるノ、イブリドーマに含 まれる。
[0014] 一般に、細胞融合によって得られた、 in vitroで長期にわたり容易に培養することが できる細胞を、特にハイプリドーマと言う。したがって本発明における好ましいハイプリ ドーマは、細胞融合の後に、 in vitroで長期にわたり容易に培養することができる細胞 を言う。あるいは本発明における好ましいハイプリドーマは、限界希釈 (limited dilution )の後に細胞の増殖が維持される細胞である。言い換えれば、限界希釈 (limited diluti on)の後に細胞の増殖が維持される細胞は、細胞融合の後に、 in vitroで長期にわた り容易に培養することができる細胞に含まれる。
[0015] 更に、本発明における好ましいハイプリドーマは、細胞融合に利用した細胞の形質 を維持している細胞である。本発明において、ハイプリドーマにおいて維持されるべ き細胞の形質には、細胞が有する物質を生産する能力が含まれる。たとえば、細胞 融合に用いた細胞が、抗体やサイト力インを産生する細胞の場合、本発明における 好ましいハイプリドーマは、これらの物質を生産する能力を維持する。
[0016] ただし、本発明におけるハイプリドーマは、細胞融合に用いた細胞が備える形質を 必ずしも完全に維持する必要はない。したがって、たとえば、先に示した抗体以外に 、細胞表面抗原や細胞内に蓄積する酵素や転写因子の産生も、これらの形質の維 持が望まれる場合には、ハイプリドーマが維持すべき形質に含まれる。しかし、これら の物質生産を要しない場合には、これらの物質を生産する能力が失われた細胞であ つても、必要とする物質の生産を維持している限り、本発明におけるハイプリドーマに 含まれる。
[0017] 本発明において「融合パートナー細胞」とは、他の細胞と融合することによりハイプリ ドーマを作製することができる細胞をいう。本発明において、好ましい融合パートナー 細胞は、細胞融合によって、 in vitroにおける細胞の長期にわたる生存を可能とする
[0018] さらに、融合パートナー細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備 えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（ある いはできな!/、)形質を意味する。
動物細胞における選択マーカーには、ヒポキサンチン—グァニン—ホスホリボシルト ランスフェラーゼ欠損（以下 HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損 (以下 TK欠損と省略する）によってもたらされるヒポキサンチン一アミノプテリン一チミ ジン感受性（以下 HAT感受性と省略する）等が知られて ヽる。 HAT感受性の細胞は H AT選択培地中で DNA合成を行うことができず死滅する力 正常な細胞と融合すると 正常細胞のサルベージ回路を利用して DNAの合成を継続することができるため HAT 選択培地中でも増殖するようになる。
[0019] HGPRT欠損や TK欠損の細胞は、それぞれ 6チォグァニン、 8ァザグァニン（以下 8A Gと省略する）、あるいは 5'ブロモデォキシゥリジンを含む培地で選択することができる 。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログを DNA中に取り込んでしまうので死滅する 力 これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので 選択培地の中で生存することができる。この他 G418耐性と呼ばれる選択マーカーは 、ネオマイシン耐性遺伝子によって 2-デォキシストレプタミン系抗生物質 (ゲンタマイ シン類似体）に対する耐性を与える。
[0020] 本発明は、次の細胞 (a)および (b)を融合することにより得ることができる融合パート ナー細胞を提供する。
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞。
[0021] また本発明は、以下の工程を含む融合パートナー細胞を製造する方法を提供する (1)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物カゝら融合パートナー細胞を回収する 工程。
[0022] 本発明において、第 1の動物種に由来するミエローマ細胞とは、単独でクローニン グが可能な骨髄腫 (myeloma)に由来する細胞である。単独でクローユングが可能とは 、人工的な培養環境下で 1つの細胞力 でも増殖を開始し、維持することができること を意味する。
[0023] 本発明で第 1の動物種に由来するミエローマ細胞は、白血病細胞との細胞融合に よって融合パートナーを与えうる限り、どのような細胞を利用することもできる。たとえ ば、本発明におけるミエローマ細胞として利用可能な公知の細胞として、以下のよう な細胞株を例示することができる。以下に示す細胞株の一覧において、 ATCCは Am erican Tissue and Culture Collectionの、また JCRBは JCRB細胞バンク (Japanese Coll ection of Research Bioresources)の寄託番号であることを示す。したがって、これらの 細胞株は、いずれも、当該セルバンクより分譲を受けることができる。なお JCRB細胞 バンクの細胞株は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク (Health Science Research R esources Bank； HSRRB)を通じて分譲されている。
MOPC21 (ATCC番号 HB- 8411)
P3X63AG8 (ATCC番号 T1B9)
SP2/0 (ATCC番号 CRL 1581)
NS-1 (ATCC番号 TIB18)
P3.X63AG8.653 (ATCC番号 CRL 1580)
F0 (ATCC番号 CRL 1646)
S194/5.XXO.BU-1 (ATCC番号 CRL 1580)
FOX-NY (ATCC番号 CRL 1732) SP2/0- Agl4 (JCRB番号 0029)
これらの細胞株のうちで先に述べたような好ましい特徴を備えているのは、一群の マウスミエローマ細胞株、あるいはこれらマウスミエローマ細胞株から誘導された細胞 株である。誘導された細胞株とは、薬剤耐性などの付加的な形質を導入し改めてクロ 一ユングした細胞株を意味する。
[0024] 本発明における第 2の動物種に由来する白血病細胞は、細胞周期に Extra-S期を 含む白血病細胞である。一般に、真核細胞においては、次のようなサイクルで細胞 周期が構成されている。細胞増殖を続ける細胞は、 G1期〜 M期のサイクルを繰り返 すことで、細胞分裂を継続する。一方、細胞増殖を停止するときには、 M期の後に GO 期と呼ばれる安定した状態となって細胞周期が停止する。
- [G1期 HS期 HG2期 HM期]-
[0025] これらの各細胞周期の中で、 S期は核酸の合成 (synthesis)が行われる期間である。
このとき、染色体を構成するゲノム DNAが複製され、細胞分裂の準備が整うと考えら れている。倍ィ匕したゲノム DNAは、 M期に有糸分裂によって 2つの細胞に分離される 。ところが、特定の細胞において、ゲノム DNAの複製が行われた後に、細胞の分裂に 進まない現象が観察された。 DNAの合成を完了しながら、 M期の細胞分裂に移行し ない期間は、 Extra-S期と名づけられた。分裂しない細胞では合成されたゲノム DNA が蓄積され、細胞中の DNAの増加が観察される。たとえば本発明における好ましい 白血病細胞である MEG-01の平均染色体数は、 2n=104で、正常細胞（2n=46)よりも 遥かに多い。 MEG- 01がゲノム DNAを増加させる細胞周期に Extra-S期を含み、染色 体を倍数体にする性質を有するためである (Oncogene 13: p695-703, 1996) (図 1) このように、本発明においては、細胞周期に Extra-S期を含み、染色体を倍数体に する性質を有する白血病細胞を用いることで、ヘテロハイプリドーマ力も抗体産生細 胞由来の染色体の脱落を防ぐ効果が期待できる。
[0026] 本発明における、細胞周期に Extra-S期を含む白血病細胞は、先に述べたミエロー マとは異なる動物種に由来し、かつ好ましくは後に述べる第 3の細胞が由来する種と 同一の種に由来する白血病細胞である。白血病細胞は、白血病を有する個体の、造 血組織や末梢血力 得ることができる。造血組織には、骨髄、脾臓、あるいはリンパ 節などが含まれる。白血病としては、例えば巨核球系白血病が挙げられる。たとえば 、末梢血をフイコール法で遠心分離して、特定の比重の細胞分画を回収することによ り、白血球細胞、あるいは単核球細胞などを分離することができる。
更に分離された白血病細胞が細胞周期に Extra-S期を含むことは、細胞の染色体 の増加を指標として確認することができる。染色体の増加は、たとえば、 12-o-tetrade canoyl phorbol 13 acetate (TPA)で処理した細胞のプロイディー（染色体総数）の増 加によって確認することができる。ブロイディーの増加は、フローサイトメーターや、ブ ロイディーアナライザによって検出することができる。
[0027] あるいは、公知の白血病細胞を本発明に利用することもできる。たとえば、本発明 における第 2の動物種に由来する白血病細胞として利用可能な公知の細胞として以 下のような細胞株を例示することができる。 MEG- 01及び HELは、ヒトの巨核球系白血 病細胞株である (Blood 66: pl384-1392, 1985、 J. Clin. Invest. 85: pl072- 1084)。
MEG- 01 (ATCC番号 CRL- 2021)
HEL (JCRB番号 0062)
UT-7 (N. Komatsu et al. Cancer Res. 51: 341—348, 1991)
M07e (Avanzi GC et al. J Cell Physiol. 1990 Dec;145(3):458- 64.) MEG-A2 (JCRB No.IFO50478)
DAMI (Blood 89: p4238, 1997)
特に MEG- 01は、選択マーカーとして有用な 8AG耐性を有する。また MEG-01自身 力 Sィムノグロブリンを産生して ヽな 、ため、抗体産生細胞とのハイプリドーマの作製用 の融合パートナーとして好まし 、。
[0028] 本発明の融合パートナー細胞は、第 1の動物種に由来するミエローマ細胞と、第 2 の動物種に由来する白血病細胞であって細胞周期に Extra-S期を含む白血病細胞 を、細胞融合することによって得ることができる。細胞融合には、ポリエチレングリコー ル (PEG)法や電気融合法などの公知の細胞融合技術を利用することができる。
[0029] ポリエチレングリコール法の操作は次のとおりである。まずミエローマ細胞と、白血 病細胞の細胞比は、それぞれ特定の融合条件について最適化される。ポリエチレン グリコール (PEG)の濃度は、 PEGの分子量等の条件をもとに、当業者は最適な条件を 選択することができる。例えば 35 %の PEG1500 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)は、 一般的な細胞融合のための条件の一つである。 lmLの 35 %PEG1500を細胞ペレット Z細胞混合物に、 1. 5分間、ゆっくり加えた後、徐々に血清不含培地、次いで、血清 含有培地で希釈することにより、細胞融合が行われる。
細胞融合を容易にするために同様に使用され得る他の方法には電気融合が含ま れる。この方法では、細胞を特殊な緩衝液中に置き、電場を加えることによって細胞 を整列させる。整列した細胞は、他の細胞と接触の機会が増し、効率的に細胞を融 合させることができる。
融合混合物を、例えば 15 %ゥシ胎仔血清を含有する HB— GRO培地（Irvine Scientif ic, Santa Ana, California)150ml中で細胞密度 8xl05細胞/ mLにし、 2. 0 X 105細胞/ゥ エルで 96ゥエルプレートに分散させる。細胞を 5— 10 %CO雰囲気下、 37 °Cでインキ
2
ュベーシヨンして 8AG耐性とし、融合パートナー細胞を得ることができる。得られた融 合パートナー細胞は、必要に応じて、クローニングすることができる。クローニングされ た融合パートナー細胞は、ハイプリドーマの製造において、再現性の維持に貢献す る。
[0030] 例えば、第 1の動物種に由来するミエローマ細胞として SP2/0-Agl4を、第 2の動物 種に由来する白血病細胞であって細胞周期に Extra-S期を含む白血病細胞として M EG- 01を、それぞれ用いることができる。
[0031] こうして提供される融合パートナー細胞は、それ自身長期にわたって安定に継代す ることができ、抗体産生細胞力もモノクローナル抗体を得るための普遍的な融合パー トナー細胞となる。つまりマウスのホモハイプリドーマにぉ 、て確立されて!、るマウスミ エローマと同様に、マウス以外の生物種由来の抗体産生細胞を利用してハイブリド 一マを安定してもたらすことができる融合パートナーとして有用である。本発明によつ て得られた融合パートナー細胞のうち、マウスミエローマ細胞株 SP2/0-Agl4とヒト白 血病細胞株 MEG-01を融合することにより得られた融合パートナー細胞である SPYM EGは、特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-10761として寄託されている。
(a)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(b)寄託日：平成 18年 2月 24日
(c)受託番号： FERM BP-10761
(平成 18年 2月 24日に寄託された FERM P- 20816 より移管）
[0032] 本発明は、上記の融合パートナー細胞を用いて得ることができるノ、イブリドーマに 関する。すなわち本発明は、以下の細胞（1)および（2)を融合することによって得るこ とができるハイプリドーマを提供する。
(1)次の細胞 (a)および (b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細 胞、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)第 3の細胞。
[0033] また本発明は、以下の工程を含むハイプリドーマを製造する方法を提供する。
(1)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物カゝら融合パートナー細胞を回収する 工程、
(3)工程 (2)で回収した融合パートナー細胞に、第 3の細胞を融合させる工程、およ び
(4)工程 (3)で融合した細胞を培養し、培養物からハイプリドーマを回収する工程。
[0034] 本発明における第 3の細胞は、第 1の細胞もしくは第 2の細胞と同じ種、あるいは異 なる種に由来する細胞である。具体的には、たとえば、ヒト、ゥサギ、マウス、ラット、ゥ シ、ャギおよびヒッジ等に由来する細胞を利用することができる。より具体的には、マ ウス由来のミエローマ（第 1の細胞）と、ヒト由来の白血病細胞（第 2の細胞）によって 得られた融合パートナーを用いる場合、第 3の細胞として好ましい細胞は、ヒトあるい はマウス由来である。特にヒト由来の細胞を第 3の細胞として利用できることは、本発 明の融合パートナー細胞の大きな利点である。
[0035] 本発明における第 3の細胞は、最終的に長期にわたる培養を可能とすることが期待 されている細胞である。より具体的には、たとえば、 目的とする物質を生産する能力を 有する細胞を第 3の細胞として用いることができる。このような細胞を、本発明の融合 パートナーと細胞融合することによって、 目的とする形質を有する細胞を、長期にわ たって維持することができるハイプリドーマを得ることができる。ノ、イブリドーマとするこ とによって、細胞が長期間維持できるようにすることを、一般に不死化 (immortalize)と
[0036] 本発明にお 、ては、 目的とする生理活性物質を産生する任意の細胞を第 3の細胞 として利用することができる。本発明における好ましい生理活性物質として、抗体を挙 げることができる。すなわち抗体産生細胞は、本発明における第 3の細胞として好ま しい。抗体産生細胞には、例えば白血球細胞 (末梢リンパ球細胞）、脾臓細胞などを 挙げることができる。これらの細胞を生体力 採取する方法は公知である。第 3の細 胞としては、より具体的には、感染症の病原体抗原の暴露履歴のある対象由来の抗 体産生細胞を挙げることが出来る。感染症の病原体抗原の暴露履歴のある対象とは 、感染症の病原体抗原 (ワクチン)をヮクチネーシヨンされた対象、または感染症に感 染履歴のある対象等を挙げることが出来る。本発明において、感染症は特に限定さ れないが、好ましくは、インフルエンザ、 AIDS, HCVや HBVなどのウィルス性肝炎など を例示することが出来る。
特に末梢血リンパ球は、本発明における抗体産生細胞として好ましい。末梢血リン パ球は、採血によって容易に得ることができる。マウスの末梢血リンパ球を本発明に 基づいてハイプリドーマとすることにより、マウス抗体を産生するハイプリドーマを容易 に得ることができる。さらに、ヒトの末梢血リンパ球を本発明に基づいてハイプリドーマ とすることにより、ヒト抗体を産生するハイプリドーマを容易に得ることができる。
[0037] 本発明において、融合パートナーと第 3の細胞は、先に述べた第 1の細胞と第 2の 細胞の細胞融合と同様の手法により、細胞融合することができる。細胞融合には、 PE G法や電気融合法を利用することができる。たとえば、本発明の融合パートナーとし て SPYMEGを用い、ヒト末梢血リンパ球との細胞融合を行う場合、好ましい条件として 次のような条件を示すことができる。
[0038] まず融合させる末梢血白血球 (PBL)の細胞数は、 1 X 107〜108個に調整するのが 好まし 、。 SPYMEGと PBLを 2： 1〜10： 1の割合で混合し、 V、つたん遠心分離して沈殿 させ、上澄み液を除く。回収した細胞分画にポリエチレングリコール (PEG)を加えて細 胞を融合させる。細胞融合に用いる PEGの濃度は、 30 %〜70 %、好ましくは 40〜60 % 、より好ましくは 50 %である。細胞数に応じて 0.1 mL〜2.0 mL、好ましくは 0.6 mL〜1.0 mLの PEG溶液を、 60秒〜 90秒かけてピペットで細胞に加えながらかき混ぜる。 PEG 溶液をカ卩ぇ終わったら、更にそのままピペットで 2分〜 3分力き混ぜる。その後、さらに 10〜14 mLの無血清培地を 30秒から 60秒間かけて少しづつ加えながら力き混ぜる。 その後、無血清培地を加え遠心分離する。遠心後、上精を除き、細胞を無血清培地 で 1回洗浄する。洗浄後の細胞を HAT培地 (15 %FBS、 HAT(x50)、 in RPMI)で懸濁し 、 96穴プレートに播種する。
[0039] 無血清培地や PEGには、当業者が通常の細胞融合に使用するものを適宜利用す ることができる。たとえば本発明における細胞融合には、以下のような培地や PEGを 禾 IJ用することがでさる。
PEG: PEG 1500 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)
HAT: HAT supplement(50x) (GIBCO製、カタログ No. 21060-017)
無血清培地： RPMI 1640 (SIGMA製、カタログ No R8758)
[0040] その他にも、抗体産生細胞は、免疫動物から得ることもできる。予め任意の抗原を 適当なアジュバントとともに免疫動物に免疫する。抗原は、担体蛋白質と結合させて 免疫原とすることも可能である。免疫原を得るための担体蛋白質には、スカシガイへ モシァニン (KLH)、あるいはゥシ血清アルブミン (BSA)等を用いることができる。免疫動 物には、ゥサギ、マウス、ラット、ャギ、あるいはヒッジなどが一般に利用される。アジュ バントとしては、フロイントのコンプリートアジュバント（FCA)等が一般に用いられる（A dv. Tubercl. Res., 1:130-148, 1956)。 ELISAやオタテロ-一法によって抗体価を追 跡し、充分に抗体価が上昇したことを確認して抗体産生細胞を摘出しその細胞を分 散させて細胞融合に用いる抗体産生細胞とする。ヒトと同様に、脾細胞や末梢血リン パ球を回収することによって、抗体産生細胞を回収することができる。こうして得られ た抗体産生細胞は、本発明の融合パートナーと融合することによって、本発明のハイ プリドーマとすることができる。
[0041] このように、本発明のハイプリドーマの製造方法において、第 3の細胞に抗体産生 細胞を用いることによって、抗体を製造することができる。すなわち本発明は、以下の 工程を含む抗体を製造する方法を提供する。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程；
(A)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含 む白血病細胞、および
(B)工程 (A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収す る工程；
(2)工程（1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を融合させハイプリドーマ を得る工程;および
(3)工程 (2)で得たハイプリドーマを培養し、培養物から抗体を回収する工程。
[0042] あるいは本発明は、上記の抗体の製造に有用な抗体を産生する細胞の製造方法 に関する。すなわち本発明は、以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法を 提供する。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程；
(A)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含 む白血病細胞、および
(B)工程 (A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収す る工程。
(2)工程（1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイプリドー マを得る工程;および (3)工程 (2)で得たハイプリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
[0043] 本発明の融合パートナー細胞を用いることにより、抗体を安定に産生するハイプリド 一マを得ることができる。ハイプリドーマは、適当な選択培地で培養することによって 、細胞融合に成功した細胞を優先的に増殖させることができる。たとえば、融合パー トナー細胞として本発明の SPYMEGを用いたときには、 HATを含む選択培地を利用 することができる。
[0044] 本発明による抗体の製造方法、あるいは抗体産生細胞の製造方法にお!、て、ハイ ブリドーマは、クローユングすることができる。ハイプリドーマをクローユングする方法 は公知である。すなわち、限界希釈法によってノ、イブリドーマをクローニングすること 力 Sできる。限界希釈されたハイブリドーマは、理論的に、 1細胞から増殖した細胞集 団を形成する。こうして得られた細胞集団は、均一な遺伝的特徴を有する細胞集団、 すなわちクローンである。クローンィ匕されたノヽイブリドーマ力も得られる抗体は、モノク ローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体は、高度に均一な抗原結合特性を有 する抗体である。
[0045] すなわち本発明は、次の工程を含むモノクローナル抗体の製造方法を提供する。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程；
(A)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含 む白血病細胞、および
(B)工程 (A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収す る工程；
(2)工程（1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を融合させてハイプリドー マとし、目的とする抗体を産生するハイプリドーマをクローユングする工程;および
(3)工程（2)でクローユングされたノヽイブリドーマを培養し、培養物からモノクローナ ル抗体を回収する工程。
[0046] あるいは本発明は、上記の抗体の製造に有用な抗体を産生する細胞の製造方法 に関する。すなわち本発明は、以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法を 提供する。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程；
(A)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含 む白血病細胞、および
(B)工程 (A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収す る工程。
(2)工程（1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイプリドー マを得る工程;および
(3)工程 (2)で得たハイプリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
[0047] 本発明にお 、ては、抗体産生細胞をクローユングすることができる。目的とする抗 体を産生する抗体産生細胞をクロー-ングすることにより、モノクローナル抗体を産生 する細胞とすることができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、モノクローナル抗 体を産生するハイブリドーマの製造方法を提供する。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程；
(A)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含 む白血病細胞、および
(B)工程 (A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収す る工程。
(2)工程（1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイプリドー マとし、目的とする抗体を産生するハイプリドーマをクローユングする工程;および
(3)工程（2)でクローユングされたノヽイブリドーマを抗体産生細胞として回収するェ 程。
[0048] 本発明のハイプリドーマは、 in vitroで安定した抗体産生能を持つ抗体産生細胞で ある。そのため、ヘテロノ、イブリドーマでありながら、適当な培地中で細胞の増殖とと もに、抗体産生能も維持する。そのため、クロー-ングの過程で、必要なクローンが 失われる可能性が低い。更にいつたん榭立されたハイプリドーマクローンも安定に維 持できる。
[0049] 本発明によって得られたハイプリドーマあるいはそのクローンの培養によって、抗体 あるいはモノクローナル抗体を産生させることができる。培地としては無血清培地又 は低濃度血清培地等を用いると、抗体の精製が容易となるので好ましい。基本的な 動物細胞培養培地には、 DMEM培地、 RPMI1640培地あるいは ASF培地 103等が知ら れて 、る。またヌードマウスゃスキッドマウスの腹腔に接種して腹水としてモノクローナ ル抗体を回収することもできる。
培地に血清をカ卩えるときには、ゥシ胎児血清（以下 FCSと省略する）を 5— 10 %v/vで 利用するとよい。またこれらの培地で本発明のハイプリドーマを培養するとき、公知の 抗体産生増強因子を添加すると有利である。 in vitroで抗体産生を増強する成分に は、たとえば D—ぺ-シラミン、ァセト酢酸、ビグアナイド類、ビタミン K5、 Ν—ァセチル グルタミン酸 (特開平 8- 70858)、インターロイキン 6(Nature,324:6092,73- 6;1986)、糖ァ ルコール (特開平 2-200177)、リポポリサッカライド (特開平 4-20294)、フオルボールェ ステル (特開平 1-171494)、あるいは酪酸 (hybridoma Vol.4,No.l, p63;1985)等が知ら れている。このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモ-ゥム、硫酸ナト リウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、あるいはァフィ- ティークロマトグラフィー等により精製することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0050] 〔実施例 1〕
融合パートナー細胞の作製
RPMI + 5 %FCS (通常培地）の培養液で培養してきた SP2/0-Ag-14 (3xl07)と MEG- 01(3〜6xl07)の細胞を常法に従って PEGで融合させた。融合細胞を 3日間通常培地（ RPMI + 5 % FCS)で培養し、 3日目に FCSを含まない RPMI溶液で 19日間培養した。 19 日目に 8AGを含む通常培地で限界希釈をし、 5日間培養した。融合細胞が増殖して きたので、これをとり融合パートナー細胞 SPYMEGとした。 SPYMEGは、受託番号 FE RM BP- 10761 (FERM P- 20816から移管）として、 2006年 2月 24日付けで、独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。 SPYMEGは 8A G耐性であり、 HAT培地で培養すると死滅した。
[0051] 〔実施例 2〕
PEG法によるへテロハイプリドーマの作製
a)ヒト末梢血白血球の回収 (比重遠心法）
へパリン採血したヒト末梢血 40 mLを 10 mLずつ 50 mLのチューブに分注し、滅菌 PB Cを 25 mLカ卩ぇ混和し、 HISTOPAQUE (SIGMA H8889)を 50 mLチューブに 15 mLず つ分注したものに重層し、 800rpm、 30min室温で遠心した。遠心後、白血球層を回 収した。
b)融合パートナー細胞（SPYMEG)の回収
75cm2培養フラスコで増殖させた SPYMEG (培地： 10 %FBS- RPMI)を回収した。 c)細胞融合
回収したヒト末梢血白血球と SPYMEGを 2 : 1〜10： 1の割合になるように混和し、遠心 した（末梢血 40 mLから 4〜8 X 107個得られた。 SPYMEGは 75cmフラスコ 4本分を使用
2
した）。ペレットに 50 %PEG (PEG4000, MERCK Cat No 1097270100、 RPMI (RPMI 164 0、 SIGMA, Cat No R8758)で等量希釈） 0.6-1.0 mL加え、細胞融合を行った。 RPMI 血清無添加培地で洗浄後、 15 %FBS (EQUITECH-BIO INC Lot.SFB30- 1548) - HA T (HAT supplement (BM—condimed、 roche Cat No 663573) (50x)、 GIBCO Cat No 2 1060-017) 1 %BM培地 160 mLでサスペンドし、 96穴プレート 8枚に播種した。播種よ り 3日後に培地を交換し、ハイプリドーマのコロニー形成が確認された段階で (2〜3週 間後） 96穴プレートから培養上清をサンプリングし、 1次スクリーニングを行った。
[0052] 〔実施例 3〕
kG精製プロトコール
サンプル (培養上精)を流速 1滴/秒でアプライし、パススルーを回収した。 PBS/0.1 % NaN3でカラムを流速を最大にして洗った（吸光度計で A280 = 0.05以下になるまで洗 つた）。カラムベッド体積の 2- 5倍量の 0.17M Glycine- HC1 buffer pH 2.3で流速は全 速で解離した。フラクションコレクターを用いて解離物を試験管に集めた。試験管に は lMTris- HC1 buffer pH8.0を解離物量（mL)の 1/5以上入れておいた。解離物と中 和用 1M Tris-HCl buffer pH8.0とはなるべく早く混和した。各フラクションの A280を測 定後、蛋白のあるフラクションを探し、 A280=0.1以上のフラクションをプールした。 プール後 pH試験紙で pH8.0であることを確認した。プールしたものは 12.5 %ゲル、 サンプル buffer(2ME+)で SDS-PAGEを行い、純度をチェックした。各レーン当たりの サンプル量は 5 μ gとし、前 lotも同量泳動し、比較した。透析チューブに詰め、回収 体積の 100倍以上の PBS又は PBS/0.1 %NaN3で 1回 6時間以上で 3回以上透析した。 濃縮終了後透析チューブを脱イオン水で十分に洗浄してから、透析チューブをよく 揉み、チューブ壁についたタンパク質を溶かし、濃縮液をチューブから出した。その 後、濃度を測定した。
あるいは、フラクションコレクターを用いず、解離物をまとめて 1本のメスシリンダー、 ビーカー等で撹拌しながら回収することもできる。この場合も中和用 1M Tris-HCl buff er pH8.0を解離物回収量 (mL)の 1/5以上入れ、回収後 pH試験紙で pH8.0であること を確認する。仮に pH8.0以下の時は中和用 bufferをカ卩え、即座に pH8.0とする。
〔実施例 4〕
ELISA法によるヒト kGの測定
a)感作プレートの作製
ゥサギ抗ヒト IgGポリクローナル抗体を感作用 Buffer (PBS)で 10 μ g/mLに希釈した。 50 μ 1/wellずつマイクロプレート（Nunc MaxiSorp)に分注した。 4 °Cでー晚静置した。 感作用 Bufferを除去し、水分を振り取った。 Blocking用 Buffer (1 %BSA 0.1 %NaN in P
3
BS)を 100 μ 1/wellずつ分注し、 4 °Cで 1晚静置した。
b) ELISA法
ノヽイブリドーマ培養上清を感作マイクロプレート (aで準備したもの)〖こ 50 μ 1/wellずつ 分注した。室温で 1時間静置反応した。反応液を除去し、洗浄用 Buffer (0.05 %Tween 20ZPBS)で 3回洗浄後、水分を振り取った。標識抗体 (Peroxidase系 5000倍希釈し て使用、抗ヒト IgG POD標識ポリクローナル抗体）を希釈し、 50 1/wellずつ分注した 後、室温で 1時間静置した。酵素基質液 (テトラメチルベンチジン溶液)を調製した。 プレートの標識抗体液を除去し、洗浄用 Bufferで 3回洗浄後、水分を振り取った。酵 素基質液を 50 /z l/wellずつ分注した。室温で 15分程度反応させた。反応停止液 (2N H SO )を 50 /z l/wellずつ分注した。プレートリーダーにより吸光度（主波長 A450/副
2 4
波長 A620)を測定した。本試験で用いた ELISA法の概念図を図 2に示す。
[0054] 〔実施例 5〕
Western- blottingによるヒト IgGの確認
1 mg/mLの抗体溶液とサンプルバッファーを等量混和し、 5分間煮沸した。 10 μ 1( 抗体 5 μ 8)を12.5 %ゲルにアプライした。 SDS- PAGEを行い、 PVDF膜（immobilon- P CatNo IPVH00010)に転写し、 4 °C O/N in 2 %スキムミルク/ PBSでブロッキングした。 検出用抗体として抗ラット IgG POD X 2500 in 10 % BlockAce I PBSを用い、室温で 1 時間処理した。バッファー（0.05 % Tween 20 in PBS)で 3回洗浄した。基質は PIERCE (.super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate ^ code. «34080 ) 用 ヽ、處光 β~ 1分で現像した。フィルムは Hyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103K を用い、現像液はレンドール（富士フィルム)停止液は 3 %酢酸、定着液はレンフィック ス（富士フィルム）をそれぞれ用いた。
[0055] 〔実施例 6〕 a)融合パートナー細胞の作製
作製した融合パートナー細胞 SPYMEGと既存のヒト融合パートナー細胞 Karpas (Ab raham Karpas et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Feb 13;98(4):1799- 1804)を比較 して観察した（図 3)。 SPYMEGは一般的なマウスミエローマ細胞と同様に球形の細胞 であり、 Karpasに比較して接着性が弱力つた。さらに、増殖能は高力つた (データ示さ ず）。これらのことから、 SPYMEGの融合パートナー細胞としての性能は、 Karpasよりも 高いことが示された。さらに、確立された融合パートナー細胞 SPYMEGは、凍結後に 起眠し、 100 mL培養（1ヶ月培養)をしたときでも産生能を消失することなぐ安定的で あることが示された (データ示さず)。 [0056] b) SPYMEGとヒト末梢血白血球細胞を融合したハイブリドーマ (抗体産生細胞）の作 製
表 1に SPYMEGとヒト末梢血白血球細胞を融合して得られたノヽイブリドーマ (抗体産 生細胞）力もの IgGの産生を示す。ハイプリドーマを 96穴マイクロプレート 8枚（768ゥェ ル）に播種し、コロニーを形成したゥエル数、そのうち IgGを産生したゥエル数、さらに その中で 3週間以上培養したときに IgGの産生を維持したゥエル数を示す。 ELISA法 によるスクリーニングを行った。
この結果から、本試験により IgGを産生するハイブリドーマが作製されたことが示され た。また、既存の融合パートナー細胞 Karpasからは IgG産生クローンを得ることができ なかった。このことから、 SPYMEGは Karpasよりも効率よくハイブリドーマを作製できる 融合パートナー細胞であることが示された。
[0057] [表 1]
Figure imgf000025_0001
[0058] IgG産生クローンをプロテイン Gカラムに添加した後、溶出させたときの各溶出フラク シヨンにっ 、て SDS- PAGE及び Western- blotにより確認した（図 4)。図中の (+)は ELIS A陽性クローン、（-)は ELISA陰性クローンを示す。 K0142フラクション 2は ELISA陽性 であり、 SDS-PAGEでもヒト IgGの存在が確認された力 Western-blotではシグナルが 確認できな力つた。今回は何らかの原因で検出できな力つたことが考えられた。
さらに、各クローンの溶出フラクション、透析'濃縮後のサンプルの確認をした（図 5) 。 SDS-PAGEで ELISA陰性クローンでも IgGの H鎖、 L鎖と思われるバンドが確認され ているが、抗ヒト IgG抗体を用いた Western-blotの結果、検出されないことから、 FBS 由来の IgGであると予想された。 ELISA陰性クローンの lane5でバンドが検出されてい る力 陰性の判断が培養上精での ELISAの結果であることから、このクローンはごく少 量 IgGを産生していることが考えられる。また、今回の結果から、 SPYMEG自身もヒト Ig Gを産生して 、な 、ことが確認された。
表 2に、陽性を示した各クローン培養上清力もの精製 IgGの収量を示す。培養上清 1 00 mLからの精製 IgG力も算出した、培養上清中のヒ HgG濃度は 2〜11 μ g/mLだつ た。通常のマウスハイプリドーマとほぼ同等の濃度であることが確認された。
[0059] [表 2]
Figure imgf000026_0001
[0060] 〔実施例 7〕
ヘテロハイプリドーマの作製方法の改 &
〔実施例 2〕においては末梢血を PBSで希釈し、 HISTPAQUEに重層し遠心していた 1S より純度の高い白血球（B細胞）を得るために、末梢血を HetaSep (HETASTARCH )と混和して赤血球を除く前処理を行ってから、 HISTPAQUEに重層するという方法に よりヒト末梢血白血球を回収した（図 6)。
[0061] 具体的には、インフルエンザ HAワクチンの接種を受けた患者由来の末梢血約 10ml を 15mlチューブに入れ、 HetaSep (StemCell Technologies Inc CAT#07906)を 2〜3ml 加えた。転倒攪拌を行い室温で 1時間静置した。静置後の上澄 (オレンジ色)を回収 し、 HISTPAQUEを 15mlチューブに界面を乱さないようにパスツールピペットでゆっくり 重層した。 1800rpm、 30min室温で遠心分離を行い、遠心分離後、溶液の真ん中あた りに出来る白い帯の層（白血球層）をパスツールピペットで 50mlチューブに回収した。 30ml程度の無血清培地 DMEMを加え、 1600rpmで 8min遠心分離を行!、洗浄した。
〔実施例 2〕に記載の方法により、回収されたヒト末梢血白血球と、融合パートナー 細胞 SPYMEGの細胞融合を行った。細胞融合における基礎培地として、 PRMIの代わ りに無血清培地 DMEMを用いた。
作製されたへテロハイプリドーマにつ!、て〔実施例 3〕および〔実施例 4〕に記載の方 法により、 IgGの精製および ELISA法によるヒ HgGの測定を行った。その結果、細胞融 合により得られたコロニーの形成数、および IgG産生クローン数がともに、ヘテロハイ プリドーマの作製方法に改良をカ卩えることで、増加していることが確認された（図 7)。
[0062] 〔実施例 8〕
インフルエンザワクチンに対する反応性の確認
〔実施例 7〕の方法によって作製された IgG産生クローンのインフルエンザワクチンに 対する反応性の確認を行った。具体的には、以下の工程により、インフルエンザワク チンを感さしたプレート、および何も感させずブロッキングのみ行ったプレート（非特 異反応するクローンの除去）におけるクローンの IgG産生をサンドイッチ ELISAで確認 した。
[0063] インフルエンザワクチンを PBSで 30倍希釈したものを ELISAプレートに 50 μ 1/well分 注してー晚静置した (感さ）。インフルエンザワクチンとしてはインフルエンザ HAヮクチ ン (化学及び血液療法研究所、 日本)を用いた。本剤は、インフルエンザウイルスの A 型および B型株をそれぞれ個別に発育鶏卵で培養し、増殖したウィルスを含む尿膜 腔液を蔗糖密度勾配遠心法等により精製濃縮後、ウィルス粒子をエーテル等により 処理してヘムァグルチニン (以下 HA)画分浮遊液とし、ホルマリンで不活ィ匕した後、リ ン酸塩緩衝塩ィ匕ナトリウム液を用いて各株ウィルスの HAが規定量含まれるよう希釈 調整されている。
溶液を除き、ブロッキングバッファーを 200 1/wellカ卩ぇー晚静置した (ブロッキング） 。ブロッキングバッファーを除き、ハイプリドーマの培養上清を 50 1/wellカ卩ぇ室温で 1 時間反応させた。上清を除き、 0.05%TweenPBSで 3回洗浄した。
抗ヒ HgGHRP標識抗体 (MBL:206)を 5000倍希釈で加え 1時間室温で反応させた。 3回洗浄後、発色基質を 50 1ずつ加え 15分間発色させ、反応停止液を加えてプレ 一トリーダーで吸光度（OD450)を測定した。
その結果、 10クローンほどインフルエンザワクチンに反応するクローンが確認された (図 8)。本発明のへテロノ、イブリドーマにより、抗原特異的に反応するヒト抗体の確立 に成功した。
[0064] 〔実施例 9〕
Western- blottingによるヒト IgGの確認
インフルエンザ HAワクチンをサンプルとしてヒト IgG産生ハイブリドーマの培養上清 の Western-blottingの反応性を確認した。
インフルエンザ HAワクチンとサンプルバッファーを等量混和し、 5分間煮沸した。 20 1 (ワクチン 10 1)を 12.5%ゲルにアプライした。 SDS- PAGEを行い、 PVDF膜 (immobil on- P CatNo IPVH00010)に転写し、 4 °C O/N in 2 %スキムミルク/ PBSでブロッキング した。検出用抗体として抗ヒト IgG HRP(MBL code 206) X 3000 in 10 % BlockAce I PBSを用い、室温で 1時間処理した。バッファー（0.05 % Tween 20 in PBS)で 3回洗浄 した。 貧 ίま PIERCE (super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate^ code.34 080 )を用い、露光は 1分で現像した。フィルムは Hyperfilm ECL Amersham Bioscienc e Cat No RPN3103Kを用い、現像液はレンドール（富士フィルム）停止液は 3 %酢酸、 定着液はレンフィックス（富士フィルム）をそれぞれ用いた。
その結果、クローン (6-19)において特異的なバンドを検出した（図 9)。
[0065] 〔実施例 10〕
精製ヒト IgG (6-19)の SDS- PAGEおよび反]^件の確認
まず、〔実施例 9〕の Western-blottingにおいて反応性を示したヒト IgG産生ハイブリド 一マの培養上清から、以下の工程によりインフルエンザ HAワクチンに反応するヒ Hg Gを精製した。
[0066] 培養上清を流量 1滴/秒でアプライし、 pass throughを回収した。 PBS/0.1% NaN3-P BSでカラム（Protein Gセファロース： Protein G sepharose 4 Fast Flow CatNo:17- 061 8-03)を流速を最大にして洗浄した（吸光度計で A280 = 0.05以下になるまで洗った） 。カラムベット volの 2-5倍量の 0.17M Glycine-HCl buffer pH 2.3で流速は全速で解離 する。フラクションコレクターを用いて解離物を試験管に集めた。試験管には中和用 バッファー 1M Tris-HCl buffer pH8.0を解離物量 (ml)の 1/5以上入れておき、解離物 とバッファーを速やかに混和した。各フラクションの A280を測定後、蛋白質が検出さ れたフラクションのうち A280 = 0.1以上のフラクションをプールした。プール後 pH試験 紙で pH8.0であることを確認した。プールしたものは 12.5%ゲル、 sample buffer(2ME+) で SDS-PAGEを行い、純度をチェックした（図 10)。プールしたフラクションを透析チュ ーブに詰めて、回収 vol.の 100倍以上の PBS又は PBS/0.1%NaN3で、一回 6時間以上 で 3回透析を行った。濃縮終了後透析チューブを脱イオン水で十分に洗浄してから、 透析チューブをよく揉み、チューブ壁についた蛋白質を溶かし、濃縮液をチューブか ら出した。その後、濃縮液について濃度の測定を行った。
以上の結果、培養上清 200mlから 2.5mgの精製 IgGが得られ（図 10)、結合活性も保 持されて!ヽることが確認された。
産業上の利用可能性
[0067] 本発明は、動物細胞を利用した物質生産に有用である。具体的には、本発明の融 合パートナーとの細胞融合によって、有用物質を生産する細胞を、 in vitroでの培養 が容易なハイプリドーマとすることができる。有用物質を産生する細胞として、抗体産 生細胞を挙げることができる。
[0068] すなわち本発明は、抗体の製造方法として有用である。特に本発明は、ヒト抗体産 生細胞を材料としてハイプリドーマを製造することができる。本発明によって得られた ハイプリドーマはヒト抗体を安定に産生する。たとえば、感染症から回復した患者の血 液には、病原体あるいは病原体が産生する毒素を中和する抗体を産生する細胞が 存在して!/、る可能性が高 、。このような患者の抗体産生細胞を本発明によってハイ プリドーマとすれば、感染症の治療に有用な抗体を産生させることができる。
本発明によって治療用の抗体を得ることができる感染症として、たとえば、インフル ェンザ、 AIDS、 HCVや HBVなどのウィルス性肝炎などを示すことができる。
[0069] あるいは、がん患者の抗体産生細胞には、癌細胞に対する障害作用を有する抗体 を産生して 、る細胞が存在する可能性がある。このような抗体産生細胞を本発明によ つてハイプリドーマとすれば、癌の治療に有効な抗体を得ることができる。
[0070] 本発明の抗体の製造方法によれば、ヒトの抗体産生細胞を利用して、ヒトの抗体を 得ることができる。ヒト抗体は、ヒトに対して安全に投与することができるので、治療用 の抗体として好ま 、。モノクローナル抗体の製造ツールとして一般に利用されて ヽ るマウス力も得られた抗体をヒトの治療に用いるためには、キメラ化ゃヒト化などの修 飾が必要であったことと比べると、本発明の抗体の製造方法が、治療用抗体の製造 方法として有用であることは明らかである。

Claims

請求の範囲
[1] 次の細胞 ωおよび (b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞；
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞。
[2] 第 1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、お よびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項 1に 記載の融合パートナー細胞；
MOPC21, P3X63AG8、 SP2/0、 NS- 1、 P3.X63AG8.653、 F0、 S194/5.XXO.BU- 1、 FO X-NY、および SP2/0-Agl4。
[3] 第 2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細 胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項 1に記載の融合パ 一トナー細胞；
MEG— 01、 HELゝ UT— 7、 M07eゝ MEG— A2、および DAMI。
[4] 第 1の細胞が SP2Z0— Agl4であり、第 2の細胞が MEG- 01である、請求項 1に記載の 融合パートナー細胞。
[5] 受託番号 FERM BP— 10761として寄託された融合パートナー細胞 SPYMEG。
[6] 以下の細胞（1)および（2)を融合することによって得ることができるハイプリドーマ；
(1)次の細胞 (a)および (b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細 胞、および
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)第 3の細胞。
[7] 第 1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、お よびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項 6に 記載のハイプリドーマ；
MOPC21, P3X63AG8、 SP2/0、 NS- 1、 P3.X63AG8.653、 F0、 S194/5.XXO.BU- 1、 FO X-NY、および SP2/0-Agl4。
[8] 第 2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細 胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項 6に記載のハイプリ ドーマ；
MEG— 01、 HELゝ UT— 7、 M07eゝ MEG— A2、および DAMI。
[9] 第 1の細胞が SP2Z0— Agl4であり、第 2の細胞が MEG- 01である、請求項 6に記載の ハイプリドーマ。
[10] 融合パートナー細胞力 受託番号 FERM BP— 10761として寄託された SPYMEGであ る、請求項 6に記載のハイプリドーマ。
[11] 第 3の細胞が、第 2の細胞と同じ動物種に由来する細胞である請求項 6に記載のハイ ブリドーマ。
[12] 第 3の細胞が、抗体産生細胞である請求項 11に記載のハイプリドーマ。
[13] 以下の工程を含む融合パートナー細胞を製造する方法；
(1)次の細胞 (a)および (b)を融合する工程、
(a)第 1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第 2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期に Extra-S期を含む白 血病細胞、および
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物カゝら融合パートナー細胞を回収する 工程。
[14] 以下の工程を含むハイプリドーマを製造する方法；
(1)請求項 13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞 を融合させる工程、および
(2)工程（1)で融合した細胞を培養し、培養物からハイプリドーマを回収する工程。
[15] 以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法；
(1)請求項 13記載の方法によって得られた、融合パートナー細胞と抗体産生細胞を 融合させてハイプリドーマを得る工程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
[16] 付カ卩的に工程（1)で得たノヽイブリドーマをクローユングする工程を含む、請求項 15に 記載の方法。
[17] 以下の工程を含む抗体を製造する方法；
(1)請求項 13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞 を融合させてハイプリドーマを得る工程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを培養し、培養物カゝら抗体を回収する工程。
[18] 付カ卩的に工程（1)で得たノヽイブリドーマをクローユングする工程を含む、請求項 17に 記載の方法。
[19] 以下の工程を含む感染症に対する抗体を製造する方法；
(1)請求項 13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、感染症の病原 体抗原の暴露履歴のある対象由来の抗体産生細胞を融合させてハイプリドーマを得 る工程、および
(2)工程（1)で得たハイプリドーマを培養し、培養物カゝら感染症に対する抗体を回収 する工程。
[20] 感染症が、インフルエンザ、 AIDS,またはウィルス性肝炎の 、ずれかである請求項 1 9に記載の方法。
PCT/JP2007/058129 2006-04-13 2007-04-13 融合パートナー細胞 WO2007119808A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07741565A EP2009094B1 (en) 2006-04-13 2007-04-13 Fusion partner cells
KR1020087027724A KR101429254B1 (ko) 2006-04-13 2007-04-13 융합 파트너 세포
BRPI0710650-5A BRPI0710650A2 (pt) 2006-04-13 2007-04-13 células parceiras de fusão
DE602007007071T DE602007007071D1 (de) 2006-04-13 2007-04-13 Fusionspartnerzellen
CN200780022113XA CN101466828B (zh) 2006-04-13 2007-04-13 融合伴侣细胞
JP2008510996A JP5160412B2 (ja) 2006-04-13 2007-04-13 融合パートナー細胞
US12/296,899 US8173425B2 (en) 2006-04-13 2007-04-13 Fusion partner cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006110889 2006-04-13
JP2006-110889 2006-04-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007119808A1 true WO2007119808A1 (ja) 2007-10-25

Family

ID=38609568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/058129 WO2007119808A1 (ja) 2006-04-13 2007-04-13 融合パートナー細胞

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8173425B2 (ja)
EP (1) EP2009094B1 (ja)
JP (1) JP5160412B2 (ja)
KR (1) KR101429254B1 (ja)
CN (1) CN101466828B (ja)
BR (1) BRPI0710650A2 (ja)
DE (1) DE602007007071D1 (ja)
RU (1) RU2431667C9 (ja)
WO (1) WO2007119808A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015068781A1 (ja) 2013-11-06 2015-05-14 国立大学法人大阪大学 インフルエンザウイルスａ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体
JP2015529630A (ja) * 2012-08-31 2015-10-08 国立大学法人大阪大学 Ｂ型ボツリヌス神経毒素に対する結合／中和ヒトモノクローナル抗体

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201400100SA (en) * 2011-09-09 2014-06-27 Univ Osaka Dengue-virus serotype neutralizing antibodies
CN108251413A (zh) * 2018-02-05 2018-07-06 翁炳焕 一种用于制备细胞因子的杂交瘤t细胞株的构建
CN108998426A (zh) * 2018-06-15 2018-12-14 翁炳焕 一种粒系白血病融合基因检测质控参考株的制备

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61124380A (ja) * 1984-01-06 1986-06-12 ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・オブ・ザ・リ−ランド・スタンフオ−ド・ジユニア・ユニバ−シテイ モノクロ−ン抗体生産における新しい細胞融合の相手、その産物及び調製方法
US4634664A (en) 1982-01-22 1987-01-06 Sandoz Ltd. Process for the production of human mono-clonal antibodies
JPH01171494A (ja) 1987-12-26 1989-07-06 Tosoh Corp 培養細胞によるヒト免疫グロブリン産生能の増強法
JPH02200177A (ja) 1989-01-31 1990-08-08 Nippon Kayaku Co Ltd 動物細胞培養用組成物、培養方法および生理活性物質の製造法
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
JPH0420294A (ja) 1990-05-11 1992-01-23 Chemo Sero Therapeut Res Inst 細胞培養によるタンパク質産生方法
JPH0870858A (ja) 1993-12-24 1996-03-19 Eiken Chem Co Ltd 動物細胞培養用培地

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4574116A (en) 1983-01-13 1986-03-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Methods and cell lines for immortalization and monoclonal antibody production by antigen-stimulated B-lymphocytes
US6007814A (en) * 1992-06-15 1999-12-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody M195 and constructs thereof
WO1998015579A1 (en) * 1996-10-09 1998-04-16 Canterbury Health Limited Dendritic cell-specific antibodies
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
US6071737A (en) * 1998-03-16 2000-06-06 The Regents Of The University Of California Equine Neospora isolate and its uses
US6197582B1 (en) * 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
WO2002012347A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Immunomedics, Inc. Immunotherapy for chronic myelocytic leukemia

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634664A (en) 1982-01-22 1987-01-06 Sandoz Ltd. Process for the production of human mono-clonal antibodies
JPS61124380A (ja) * 1984-01-06 1986-06-12 ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・オブ・ザ・リ−ランド・スタンフオ−ド・ジユニア・ユニバ−シテイ モノクロ−ン抗体生産における新しい細胞融合の相手、その産物及び調製方法
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
JPH01171494A (ja) 1987-12-26 1989-07-06 Tosoh Corp 培養細胞によるヒト免疫グロブリン産生能の増強法
JPH02200177A (ja) 1989-01-31 1990-08-08 Nippon Kayaku Co Ltd 動物細胞培養用組成物、培養方法および生理活性物質の製造法
JPH0420294A (ja) 1990-05-11 1992-01-23 Chemo Sero Therapeut Res Inst 細胞培養によるタンパク質産生方法
JPH0870858A (ja) 1993-12-24 1996-03-19 Eiken Chem Co Ltd 動物細胞培養用培地

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABRAHAM KARPAS ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 4, 13 February 2001 (2001-02-13), pages 1799 - 1804
ADV. TUBERCL. RES., vol. 1, 1956, pages 130 - 148
AVANZI GC ET AL., J. CELL PHYSIOL., vol. 145, no. 3, December 1990 (1990-12-01), pages 458 - 64
BLOOD, vol. 66, 1985, pages 1384 - 1392
CARROLL W.L. ET AL.: "Mouse x human heterohybridomas as fusion partners with human B cell tumors", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 89, no. 1, 1 May 1986 (1986-05-01), pages 61 - 72, XP001194428 *
FLYNN ET AL., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 121, 1989, pages 237 - 246
J. CLIN. INVEST., vol. 85, pages 1072 - 1084
JOX A. ET AL.: "Stable nontumorigenic phenotype of somatic cell hybrids between malignant Burkitt's lymphoma cells and autologous EBV-immortalized B cells despite induction of chromosomal breakage and loss", CANCER RES., vol. 58, no. 21, 1 November 1998 (1998-11-01), pages 4930 - 4939, XP003018813 *
KENNEDY ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 69, 1988, pages 3023 - 3032
N. KOMATSU ET AL., CANCER RES., vol. 51, 1991, pages 341 - 348
NATURE, vol. 324, no. 6092, 1986, pages 73 - 6
ONCOGENE, vol. 13, 1996, pages 695 - 703
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 80, 1983, pages 7308 - 7312
RAYBOULD ET AL., SCIENCE, vol. 240, 1988, pages 1788 - 1790
See also references of EP2009094A4
THOMPSON K.M. ET AL.: "The efficient production of stable, human monoclonal antibody-secreting hybridomas from EBV-transformed lymphocytes using the mouse myeloma X63-Ag8.653 as a fusion partner", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 94, no. 1-2, 20 November 1986 (1986-11-20), pages 7 - 12, XP003018815 *
WALDMAN, T., SCIENCE, vol. 252, 1991, pages 1657 - 1662
ZANELLA I. ET AL.: "New heteromyeloma cell lines for the production of human monoclonal antibodies", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 156, no. 2, 8 December 1992 (1992-12-08), pages 205 - 215, XP003018814 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015529630A (ja) * 2012-08-31 2015-10-08 国立大学法人大阪大学 Ｂ型ボツリヌス神経毒素に対する結合／中和ヒトモノクローナル抗体
WO2015068781A1 (ja) 2013-11-06 2015-05-14 国立大学法人大阪大学 インフルエンザウイルスａ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
RU2431667C2 (ru) 2011-10-20
DE602007007071D1 (de) 2010-07-22
US20100028946A1 (en) 2010-02-04
EP2009094A1 (en) 2008-12-31
RU2008144703A (ru) 2010-05-20
CN101466828B (zh) 2011-12-21
JP5160412B2 (ja) 2013-03-13
KR101429254B1 (ko) 2014-08-18
EP2009094B1 (en) 2010-06-09
EP2009094A4 (en) 2009-05-13
RU2431667C9 (ru) 2012-03-27
US8173425B2 (en) 2012-05-08
CN101466828A (zh) 2009-06-24
BRPI0710650A2 (pt) 2011-08-23
JPWO2007119808A1 (ja) 2009-08-27
KR20090010053A (ko) 2009-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0488470B1 (en) Method for the production of antibodies
GB2113715A (en) Process for the production of human mono-clonal antibodies
US20070154995A1 (en) Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
US5114847A (en) Process for the production of permanently culturable animal and human cell lines and the use thereof
JP5160412B2 (ja) 融合パートナー細胞
RU99101121A (ru) Полипептиды, способные к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-d-антигенам, днк, кодирующая их, способы их получения и применение
US8859278B2 (en) Fully human hybridoma fusion partner cell lines
JPS6054687A (ja) ヒト　モノクロ−ン抗体の製法
US4618585A (en) Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies directed against cervical cancer cells
JP2004502454A5 (ja)
JP2004502454A (ja) ヒト骨髄腫細胞系
EP0096839B1 (en) Method for producing human antibody
WO1989000607A1 (en) Preparation of human monoclonal antibodies of selected specificity and isotypes
RU2741095C2 (ru) Способ получения клеточных линий, стабильно продуцирующих человеческие моноклональные антитела класса igg
JP3084030B2 (ja) 新規ハイブリドーマ
JPH03183477A (ja) ハイブリドーマ

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780022113.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07741565

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008510996

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 8913/DELNP/2008

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007741565

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087027724

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008144703

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12296899

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0710650

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20081013