JPS6024182A - ヒトｂ細胞ライン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトＢ細胞ライン、詳しくはウィルスで変異さ
れたヒトＢ細胞に由来し、ヒポ牛すシチシークアニンー
ホスホリボシルトラシスフエラーｔ！（ＨＧＰＲＴ）を
欠損しておシ、殊にヒトの抗体産生細胞（Ｂ細胞）との
融合特性を有する新しいヒトＢ細胞ラインに関している
。

ヒト及び他の哺乳動物の免疫系に含まれるリシパ球は、
Ｔ細胞即ち胸腺由来細胞と、Ｂ細胞即ち骨髄由来細胞と
に大別される。上記Ｂ細胞は、抗体を分泌することが知
られておシ、従来細胞融合技術を利用して上記Ｂ細胞の
交雑細胞即ち抗体産生Ｂ細胞と親細胞としての骨髄腫瘍
細胞（ミニローマ）との交雑細胞（バイプリドーマ）を
作製し、該ハイづリドーマよシ単−クローシ由来の抗体
（七ツクローナル抗体）を生産する技術が確立されてい
る〔「臨床科学」第１６巻第９号第１１０８−１１１４
　（１９８０年）参照〕。このミエローマが多量に得ら
れ、しかもその際抗原の精製を必要としないことから、
免疫学分野は勿論のこと、臨床診断学、分子生物学、ウ
ィルス学、細胞生物学等の各種分野において種々の応用
研究がなされ−Ｃいる。しかしながら現在確立されてい
るモノクローナル抗体及びその製造のための親細胞とし
てのミニローマは、大半がマウスに由来するものである
。かかるマウス由来のミニ０−マはそれ自体ヒトの抗体
産生細胞即ちヒトＢ細胞とは異種細胞であシ、一般に細
胞融合が難かしく、作成されるバイプリドーマが不安定
で培養困難であるか又は培養によっても所望のヒト抗体
の分泌を行ない難い場合が多い。また上記マウスミニＯ
−マとマウスＢ細胞との間のバイプリドーマの産生ずる
モノクローナル抗体は、マウスの免疫クロづリンであり
、本来ヒトに対しては異物であシ、そのヒトへの適用は
困難である。従って現在、殊にヒトの免疫ジ０づリンの
遺伝子発現機構の研究や臨床的応用に適したヒトの細胞
融合用親細胞の確立及びその利用によるハイづリドーマ
及び該ハイづリドーマからのモノクローナル抗体の製造
技術の確立が斯界で要望されている。

本発明の目的は、斯界で要望されている上記ヒトのＢ細
胞融合に適した親細胞としてのヒトＢ細胞株即ち安定に
永代培養でき、ヒトのＢ細胞との細胞融合によって安定
な抗体産生能を有するハイづリドーマを形成できるヒト
のＢ細胞株を提供することにある。

本発明によれば、ウィルスで変異されたしトＢ細胞に由
来し、ＨＧＰＲＴを欠損するヒトＢ細胞ライクが提供さ
れる。

本発明に係る上記しトＢ細胞うイシは、ウィルス（Ｅｐ
ｓｔｔｔｉｎ　Ｅａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　）で変異された
しトＢ細胞により誘導され、以下の細胞学的及びその他
の性質を有する点において特徴付けられる。

（＋）　形態学的特徴： 径は正常ヒト末梢血Ｂ細胞の約２〜３倍であり、はぼ球
形をなしている。

（２）染色体数： 対数増殖期にある本発明細胞に、ヂメクライン（Ｄｅｍ
ｅｃｌｉｎｅ、シグマ社製）を添加し、培養、遠沈後、
１％クエシ酸ナナトリウム水溶液懸濁、静置（低張処理
）シ、次いでこれに、固定液を上層し、攪拌、遠沈後、
スライドグラス上で乾燥し、子ムザ液（Ｇｉｅｍｓａ、
メルク社製）で染色し、その分裂中期像５０個について
の各染色体数を計数した。

その結果本発明細胞の平均染色体数は３９であシ、その
大部分は端部着糸型（Ａｃｒｏｃｅｎｔｒｉｔ：ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅ　）であった。上記染色体数の測定方法
及び結果の詳細は、後記実施例に示す０（３）細胞表面
マーカーの発現性： ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃ
ｙａｎａｔｔｔ　）−結合−ウサｆ抗ヒト免疫りＯづリ
ン（マイルスーイ工−ター社製、イスラエル）を用いた
直接免疫螢光抗体法によシ解析した表面免疫、ＪＯづリ
ン（Ｉｇ’）は、陰性であった。

またヒトＴ細胞表面物質に反応するＦＩＴＣ−標識上ノ
クローナル抗体（ペクト：、Ｉ　デイツ＋シソシ社製）
を用い、直接免疫螢光抗体法によりＴ細胞マーカーの発
現性を調べた結果、抗Ｌｅｕ　ｌ抗体に対して陰性であ
った。

（４）免疫ジ０づリンの分泌； 本細胞が免疫グ０づりニアｃＩｙ）を分泌するか否かを
酵素免疫測定法によシ測定した。即ち本細胞を５　Ｘ　
１０５個／ｄの細胞濃度で、ｌＯチｐｃｓ（胎児牛血清
）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（フロー　ラボラトリ
−社製）中で３日間、３７℃で培養し、培養上清を集め
、そのＩｇ濃度を測定した。その結果培養上清中にＩｌ
ｌは検出されず、本細胞はＩりを分泌しないことが確認
された。このことは本細胞が、特に抗体産生細胞との細
胞融合のための親細胞として有利であることを示唆して
いる。即ち本細胞はそれ自体上記の通り１ｇ産生能を有
しないため、これと抗体産生細胞との間のバイプリドー
マから抗体を産生、分泌している細胞の選別が迅速にで
き、また抗体産生細胞に由来する抗体のみを選択的に産
生できる。

（５）増殖性： ８−アザクアニシ（８−ＡＧ％　１００μＭ）、ｌＯチ
ＦＣ８及び５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカづト工タノールを
含有するＲＰＭＩ　−１６４０（）〇−ラボラトリー社
製）培地において、良好に増殖する。また良好な増殖時
には、本細胞は培養プラスチック容器壁に付着する性質
を有している。

（６）　増殖条件ニ 一般に３６〜３７℃の温度条件下及びｐ　Ｈ７，２〜７
．４の条件下で良好に増殖する。また５チ炭酸ガス及び
９５チ空気の培養器内での培養が好適である。

（７）継代培養： ｌＸｌ０’個／ｄの細胞数で限界なく継代培養が可能で
ある。

（８）凍結保存： 液体窒素中で容易に長期間保存できる。

（９）８−アザシアニジ及び６−チオタアニシ耐性二８
−，４に’（１００μＭ）、６−チオクアニシ＜６−７
０％　１００μＭ）に耐性があシ、ヒポ十すンチシ１０
−”Ｍ、アミノづテリン４Ｘ１０−７Ｍ及びデミ。ｌ；
ニア１．６×ｌＯＭを含む培地（ＨＡＴ培地）で死滅す
る。このことから本細胞はＨＧＰＲＴ欠損株であること
が明らかである。

上記諸性質を有する本発明のしトＢ細胞は、ウィルスで
変異されたしトＢ細胞を起源として、以下の如くして取
得できる。ここで起源とするしトＢ細胞としては、公知
のＣＥＳＳを有利に用いることができる。該ＣＥＳＳは
ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　ＢａｒｒＶｉｒｕｓ　）で
変異されたしトＢ細胞であり、約ｌＯチが細胞表面上に
免疫りＯづリンＧ　（１９Ｇ　）を保有し、免疫ジＯづ
リンＭ（ＩｇＭ）及び免疫グ０づり、７Ｄ（ＩｇＤ）は
保有せず、またその０．５〜１．０チの細胞がＩｇＧを
分泌することが知られているＣＪ−１ｍｍｕｎｏ１．、
　Ｖｏｌ　１２７，４１２　（１９８１）　）。

上記起源細胞からの本発明しトＢ細胞の取得は、起源細
胞を、８−ＡＣを添加した適当な培地で培養し、培地の
８−ＡＧ添加量を順次増加させていくことによシ実施で
きる。よシ具体的には例えばまず２μＭの８−ＡＧを含
むＲＰＭＩ　−１６４０（フロー　ラボラトリ−社製）
＋・ｌＯ％ＦＣ５Ｃイルビニ／　（ＩＲＶＩＮＥ）社製
）培地で、起源細胞を１週間培養し、生存細胞を次に１
６μＭの８−ＡＧを含む培地で１週間培養し、その後同
様に８−ＡＣ濃度を２倍づつ増加させた培地で順次培養
し、最終的にＢ−ＡＧ濃度を１００μＭとした培地に生
存する８−ＡＧ耐性細胞株を得る。かくして本発明のし
トＢ細胞株が得られる。これはその後１ＯＯＩ！Ｍの８
−ＡＧ含有培地で強い増殖性を示し、辷の培地で継代培
養、維持できる。

また本発明のしトＢ細胞株は、上記に代え６−チオクア
ニ、／（最終濃度６７μＭ）又は６−メルカづトづリシ
リボシツド（最終濃度ｌμＭ）を用い、上記と同様に培
養することによっても収得できる。

かくして本発明のヒトＢ細胞ラインを得る。これは上記
した諸性質を有し、文献未載の新しいＢ細胞ラインであ
ル、永代培養でき、またほぼ永久的に凍結保存できる。

上記本発明ＨＧＰＲＴ欠損細胞ライシのう養は、各種の
栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培地は、本質的
には合成培地であるが、血清のような天然から得られる
成分を含んでいてもよく、該培地としては例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（）〇−ラボラトリ−社）を、ｐｃｓ
、ウマ血清等の血清補液を用いて改質した培地、又は血
清を含まないイスコブ（ｌ５ｃｏｖｅ　）改質培地を用
いて改質したタルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）改質培
地等が有利に用い得る。上記培地で増殖される本発明細
胞はまた例えばＦＣ８含有イーグル最低必須培地（ＭＥ
Ｍ）培地等の当該分野で細胞培養に一般に用いられてい
る各種の培地で短期間の適応で容易に増殖する。

上記各種培地には、特に８−ＡＧの添加を必要としない
が、通常好ましくは８−ＡＧを添加しておくのがよい。

ま九上記各種培地での培養条件は、通常の細胞培養に利
用される条件でよい。一般には約３６〜３８℃下に３〜
５日毎に液交換を行なうことにより細胞を良好に増殖さ
せ得る。

本発明しトＢ細胞株は、工業技術院微生物工業技術研究
所への寄託が受付けられなかったが、本発明者らにより
、常に分譲可能な状態にて保存されている。

本発明のしトＢ細胞株は、殊にヒトＢ細胞の細胞融合用
親細胞株として有用であシ、本発明はかかる親細胞株を
用いたＢ細胞融合技術、これによシ得られるハイづリド
ーマ及び該バイプリドーマからの七ツクローナル抗体を
も提供するものである。

上記Ｂ細胞融合において利用できるしトＢ細胞扁桃腺Ｂ
細胞等をいずれも例示することができる。

これらＢ細胞は公知の分離手段、例えばこの分野で慣用
されている物理的方法、化学的方法、表面膜法等によシ
単離、精製される。次いで得られたＢ細胞は、各種マイ
トジエシ、例えばホラクライード　マイトジエシ（ＰＷ
Ｍ、甲づコ社）、−５（］ティ、７Ａ　（Ｐｒｏ　Ａ　
）、コシカナバリ、７Ａ　（Ｃａｎ　Ａ）、アＯ抗原、
特異抗原等で刺激して後、上記親細胞と融合させる。上
記しトＢ細胞及び刺激Ｂ細胞の製造の詳細は後述する実
施例に示す通りである。

親細胞たるヒトＢ細胞と、上記しトＢ細胞との融合反応
は、基本的には公知の細胞融合方法と同様にして、融合
促進剤の存在下に適当な培地内で行なわれる。融合促進
剤としては例えばセ、−１タイウィルスＣＨＶＪ）等の
ウィルスを用いてもよいが、近年開発されたポリエチレ
、７＋クリコール（ＰＥＧ）を用いるのが好ましい。該
ＰＥＧとしては平均分子量１ｏｏｏ〜６０００程度のも
のが好ましく、これは培地に約３０〜６０　Ｗ／Ｖ％の
濃度で存在させるのが適嶋である。また培地としては、
ＭＥＮ培地、そのタルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ−１６
４０培地、その他のこの種の細胞培養に利用される通常
の各種培地を利用できる。また上記細胞融合用培地には
所望によシ融合効率を高めるための補助剤として例えば
ジメチルスルホ牛シト等を添加してもよい。

上記細胞融合に当）用いる本発明の親細胞と、ヒトＢ細
胞との使用量比は、特に制限はないが一般には親細胞数
に対してヒトＢ細胞数を約１〜１０倍用いることができ
る。好ましい細胞融合は例えば次の如くして行なわれる
。即ち親細胞株とヒトＢ細胞との所定量を適当な培地内
でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７℃に加温し
たＰＥＧ溶液の適当量を加えてまぜ合せる。これにより
細胞融合反応が開始される。以後適当橙培地を逐次添加
し、遠沈させ、上清をすてる操作を繰返すことにより所
望の融合細胞の出現が認められる。

所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞を、通常
の雑種選別用培地で培養することにより行々われる。こ
の選別用培地は、親細胞は増殖し得す、目的とする交雑
細胞のみが増殖し得る培地（ヒトＢ細胞社本来増殖し得
ない）であシ、その代表例としては例えばしポ＋サシチ
シ、アミノづテリシ及びチミジシを含む培地ＣＨＡＴ培
地）を例示できる。該ＨＡＴ培地としては、例えば１０
〜２０チのＦＣ８を含有するＨＥＭ又はＲＰＭＩ−１６
４０培地に、アミノづテリシ今ｘｌＯ＆。

ヒポ＋サシチ、７１　Ｘ　１０　”　Ｍｓ　チＥ、；、
ｙ１．６Ｘｔｏ”−’Ｍ及び必要に応じてクリツク３Ｘ
１０　Ｍを添加した培地が例示できる。該ＨＡＴ培地で
の細胞の培養は、通常の限界希釈法に従い目的とする交
雑細胞以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するに充分方
時間通常約数日〜数週間程行なわれる。

これにより目的とするしトＢ細胞ハイづリドーマのみが
選択的に増殖する。

かくして得られるバイづリドーマは、核形（核染色体数
）、細胞表面の表現型、マイトジエシ反応性、七ツクロ
ーナル抗体産生能等において、親細胞株１．シトＢ細胞
とは明らかに異なる新しい特性を具備している。このバ
イプリドーマは、前記と同様の適当な培地中で増殖維持
することができるがＨＡＴ培地による選別後、ヒポ＋サ
シチシ及びチミジシを含むＨＴ培地で１〜２週間培養し
た後、通常の培地に移す方が好ましい。

また上記したしトＢ細胞ハイづリドーマは、これを常法
に従い通常の培地で増殖させることによ）、り０−シ化
することができ、これにより夫々単一のバイプリドーマ
に分離することができ、該バイプリドーマからは、その
培養によシ、所望の七ツクローナル抗体を収得すること
ができる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明しトＢ
細胞株の製造例及びその性質等の試験例、かくして得ら
れる細胞株と細胞融合されるしトＢ細胞単離調製例、２
等細胞の融合例並びに融合株の性質等の試験例を挙げる
。

実施例　１ 本発明しトＢ細胞株の製造 起源細胞とするＣＥＳＳは、ヒーター　メルク博士（Ｄ
ｒ、　Ｐｅｔｔｔｒ　Ｒａ１ｐｈ　％５ｌｏａｎ　−Ｋ
ｅｔｔｅｒｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｒｙｅ、　ＮＹ　）よシ
入手した。

上記ＣＥＳＳを、２μＭの８−ＡＧを含むＲｐｕｒ−１
６４０（フロー　ラボラトリ−社製）＋ｌＯチＦＣ８（
イルビン（ＩＲＶＩＮＥ）社製）の培地に、ｌＸｌ０６
個／ｄの細胞濃度で浮遊させ、培養フラスコ（コニ二′
Ｊジ社）内で、５チ炭酸ガス及び６５％空気の通気条件
下、３７℃−下に１週間培養した。次いで生細胞を取シ
出し、４μＭの８−ＡＧを含む同一培地にｌＸｌ０　個
／プの細胞数で浮遊させ、同様にして１週間静置培養し
た。

以下１週間毎に培地に添加する８−ＡＧ濃度を約２倍づ
つ（２→４→８→１６−３２→５０→７５→ｌＯＯμＭ
）増加させ、夫々の培地で生存する細胞を順次培養して
、最終的に１００μＭの８−ＡＧを含む培地で生存する
細胞を得た。上記操作によシ約８週間後に８−ＡＧ耐性
株（本発明しトＢ細胞株）を樹立した。以下これを［Ｗ
−ＩＪと呼ぶ。ＮＷ−１は、１００μＭの８−ＡＧを含
むＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣ５培地で強い増殖性
を示し、この培地で継代培養され、維持されておシ、前
述した特性を有している。代表的特性の試験例を次に示
す。

実施例　２ ＮＷ−１の染色体数分布 対数増殖期にあるＮＷ−１の培地にヂメクライ、、／（
シクマ社製）を０．１μ２／−となるように添加し、３
時間培養後、細胞浮遊液を遠沈管に移し、１２０　Ｏｒ
、ｐ、ｍで５分間遠心し、沈殿した細胞を１％のクエシ
酸ナトリウム水溶液の約ｌｄに懸濁し、１５分間放置し
た（低張処理）。次いで固定液（メタノール：氷酢酸＝
３二Ｉ）を静かに上層していき、約ｌＯ属となったとこ
ろでゆるやかに攪拌し、そのままで５分間放置後、遠心
し、新しい固定液に細胞を懸濁し、再び遠心を繰シ返し
た。

同様な操作を２〜３回繰り返した後、最後に細胞をｌ〜
２ＷＬｌの固定液に懸濁し、その細胞浮遊液を脱脂洗浄
済のスライドクラス上に２〜３滴ずつ落とし、空気乾燥
させた。ｐ　Ｈ６，８のシエレシセン（Ｓ’６ｒｅｎｓ
ｅｎ　）リン酸緩衝液で約２係に希釈しである甲ムザ液
（メルク社製）で１５分間染色し、水染後乾燥した。生
物顕微鏡下で、９００倍（１５×６０）の倍率で良く拡
がった分裂中期像５０個について、染色体数を数えた。

尚染色体数が多く計数困難な場合は、ボラ０イド写真を
撮って数えた。

また同一操作を起源細胞とするＣＥＳＳについても行な
った。

結果は下記第１表に示す通シである。

第　１　表 ＣＥＳＳ　−−−−−３５６２７今 ＮＷ−１１８３４６１−−−−−− ＣＥＳＳ　１０５１１１１１１１１ ＮＷ−１−−−−−−−−−− 上記第１表よりＮＷ−１の平均染色体数は３９であり、
又ＣＥＳＳは染色体数８０本台の近４倍体細胞が大部分
を占め、１７０本以上の近８倍体の細胞も見られたが、
近２倍体の細胞はほとんど見られなかったのに対しＮＷ
−１は染色体数３９本にモードを持つ近２倍体細胞がほ
とんどであることが判る。

また上記ＮＷ−１（染色体数３９のもの）及びＣＥＳＳ
　（染色体数８８のもの）の夫々の顕微鏡写真を解析し
た結果、ＣＥＳＳは中部着果型染色体（ｍ’ｅｔａｔｔ
ｎｔｒｉ、ｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）及び次中部着糸
型染色体（ｓｕｂｍｔｔａｔｔｎｔｒｉｃｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ）であることが判った。

実施例　３ 免疫ジ０づリンの分泌 アフィニティーカラムで精製された４ｐ抗しト免疫グロ
ブリン（ｐッペル社製）を、５０μｆ／ｌの濃度に０．
０５Ｍ炭酸緩衝液（／ＩＨ９，６）に溶ゝ解する。酵素
免疫反応用プレート（ヌシク社製、デンマーク）の各ウ
ェルに２５０μｌの上記抗体溶液を入れ、６時間室温で
静置し、プレート壁に抗体を付着させる。付着していな
い抗体を除去した後、更にプレート壁を１０％馬血清で
覆い、非特異的反応を低くする。次に標準ヒト免疫グ０
づサシ溶液（１０μｔ／ｍｌ）又は＃１’Ｆ−１培養上
清を３０倍に濃縮したサシづル（１η／ｄタシパク量）
を・それぞれ倍数希釈し、夫々２００μｔづつ各ウェル
に加え、室温で２時間反応させる。未反応物質を洗浄し
た後、ペルオ十シターゼ結合抗しト免疫グ０づサシ抗体
（ヤ千）（マイルス社製）液２００μｔを加え、室温で
１時間反応させ、再び生理食塩水で未反応物質を除去す
る。次に酵素基質液２００μｔを加え、室温で４５分間
反応させた後１．１％窒化ソータ５０μｔを加えて反応
を停止させ、吸光度（４９２ｎｍ）を測定し、免疫グロ
プリｙ量を算出する。結果を第１図に示す。

図中（ｌは１９Ｇを、（２）はＮＷ−１を示す。

第１図よシ、ＮＷ−１は免疫りＤづサシを分泌しない細
胞であることが判る。この性質はしトーヒトＢ細胞融合
株をスクリーニングする場合に有利表特徴となる。

実施例　４ ＮＷ−１細胞の増殖に対するアミノづチリルの効果 ＮＷ−１細胞をｌＸＩＯ３個／ゴの細胞濃度になるよう
にＩ　０−６Ｍヒポ＋サシチｙ及び１．６ＸＩＯ−７Ｍ
チミ、；シを含くむＲＰＭＩ　−１６４０＋Ｉ　Ｏ％Ｆ
Ｃ８培地で調製し、種々の濃度のアミノつチリルを加え
、ＮＷ−１細胞の増殖に対する効果を検討しｆｃｏ　２
日後及び今日後に生細胞数を算出し、アミノづチリルの
効果を調べた。結果を下記第２表に示す。

本実験結果よシ、ＮＶＶ−１細胞はＨＡＴ培地で死滅し
、ＨＧＰＲＴ欠損株であることが明らかになった。

第　２　表 実施例　５ ヒトＢ細胞の単離調製 しト肺臓をハサミで細切し、メツシュを通して得た細胞
懸濁液をフィコール−バックで分離し、サシパ球分画を
採取する。こうして得たりシバ球を完全培地（ＲＰＭＩ
　−１６４０＋７．５％ｐｃｓ＋２、−メルカづトエタ
ノール５ｘｌＯ”−５Ｍ）に懸濁しくｌＸｌ０６／ゴ）
、０．３３％Ｖ／Ｖ　ＰＷＭ　（ｆ！づコ社製）を添加
して炭酸ガス培養器中で５日間培養する。

実施例　６ 細胞融合 上記実施例５で得たヒト牌細胞（ＰＷＭ刺激ヒト牌細胞
）及びＮＷ−１を夫々タルベツコニＨＥＭで洗浄した後
、ヒト牌細胞３ｘ１０７とＮＷ−１３Ｘ１０６を混合し
、遠心して細胞沈積物とする。５０チポリエチレシクリ
コール４０００（シグマ社製）を加え細胞融合した後、
タルベツコニＭＥＭで細胞を洗浄し、完全培地３Ｑｍに
懸濁し、懸濁液を２４ウエルのづし一トに１ｍＪずつ分
注する。その翌日ＨＡＴ培地１ｍを各ウェルに加え更に
２日目、３日目に培養液を１ｍずつＨＡＴ培地に置換す
る。

融合１４日後、すべてのウェルで細胞の増殖が認められ
、ＮＷ−１株はヒトＢ細胞と非常に効率よくハイづリド
ーマを形成する性質を持つことが認められた。

実施例　７ 抗体産生ハイづリドーマの検出 実施例６において樹立されたバイプリドーマの中で抗体
産生能を有するバイプリドーマの検出を、リバースづラ
ーク実験方法に従い、以下の通り行なった。即ちヘペス
緩衝液ＩＣ１ｍ＆を添加したＭＥＭ培地１００ｍに対し
、アガロース（牛丼化学社製）５５０■を加え、湯浴中
で溶解した後、４５℃の湯浴中に保つ。この様にして調
製したアガロース溶液３００μｔに対し、３０チづＯテ
ィシス結合羊赤血球２０μｔ、４倍希釈モルモット血清
（補体）２０μｔ１抗ヒト免疫り０づリン血清（Ｃ１ａ
ｓｓ　５ｐｅｓｉｆｉｃ　：　ＩｇＭ、ＩｇＧ及び１９
Ａ　）２０μを及び細胞浮遊液（ハイづリドーマまたは
＃Ｗ−１）１００μｔを加え攪拌した後、プラスチック
シャーレにまいた。炭酸ガス培養器中にて４時間培養し
た後、形成された溶血斑（づラーク）の数を算出した。

結果を第３表に示す。

第　３　表 上記第１表より親細胞株ＮＷ−１には、１９Ｍ及びＩｇ
Ａサブクラスを産生じている細胞は全く認められず、Ｉ
ｇＧを産生じている細胞が１０個当り２個存在すること
が認められた。一方融合細胞株ではＩｇＧを産生ずる細
胞が１０４個当９５０〜１６０個、１９Ｍ又は１９Ａを
産生ずる細胞が１０１′個当り、５〜ｌＯ個存在するこ
とが認められ融合細胞株が免疫ＪＯづサシを産生分泌し
ていることが確認された。またこのような融合細胞株で
は親細胞に比べて染色体数も増加していることが認めら
れた。

【図面の簡単な説明】

≠４４→ヤ第１図は本発明しトＢａ胞が免疫グ０づサシ
を分泌しないことを示すクラ７である。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ■　ウィルスで変異されたしトＢ細胞に由来し、しボ＋
   サシチシークアニシーホスホリボシルトランスフエラー
   ゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損していることを特徴とするヒト
   Ｂ細胞ライン。