CN101365720A - 完全人杂交瘤融合配偶体细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明的某些方面涉及称为人核型嵌合细胞的新型完全人融合配偶体细胞系，以及制备它们的方法。然后人核型嵌合细胞与人抗体分泌性淋巴样细胞融合，从而制备称为基于核型嵌合的杂交瘤的完全人杂交瘤，其同样地分泌完全人单克隆抗体。通过下列步骤制备人核型嵌合细胞：从第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，并将该供体细胞核转移到来自第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞质中。随着时间，所述细胞核同步化并融合，从而形成嵌合的核型嵌合融合配偶体细胞系。细胞核转移可以通过利用胞质内细胞核注射或通过碰撞诱导的细胞核引入来实现。
Description
对相关申请的交叉参考
本申请要求2005年8月26日提交的临时申请号60/711,819的权利，根据35 U.S.C.§119(e)，引入其全部内容作为参考，如同完全在本文所提出的一样。
发明领域
本发明处于用于产生杂交瘤的融合配偶体细胞系领域中，所述杂交瘤分泌完全人单克隆抗体。
政府利益陈述
本发明在政府支持以及基金号OC010016下进行，该基金由美军国防部规划项目(U.S.Army Department of Defense Program Project)授予。政府拥有本发明中的某些权利。
发明背景
Kohler和Milstein(Kohler G，和Milstein C.，自然(Nature)1975；256：495)关于能够分泌对抗预定义抗原的特异性单克隆抗体(MAbs)的小鼠杂交瘤的基本发现引来了实验免疫学的新纪元。许多与抗血清相关的问题得到了克服。杂交瘤细胞系的克隆选择和无限增殖化确保抗体产物的单克隆性和永久可用性。然而，在临床水平，所述受体的使用明显受到这样的事实的限制，所述事实是它们是异种蛋白并起到对人的抗原的作用。
由于Kohler和Milstein的报告，小鼠单克隆抗体的生产成为常规技术。然而，异种MAb体内诊断和治疗的应用通常与不需要的效果，如人抗小鼠免疫球蛋白应答相联系。制备完全人单克隆抗体的进展受到适合用作融合配偶体的人骨髓瘤缺乏的妨碍，所述配偶体具有小鼠骨髓瘤细胞的理想性质，如稳定性和高抗体生产。已证明埃巴病毒(EBV)的使用对人类淋巴细胞的无限增殖化是非常有效的(Kozbor D，和Roder J.，免疫学杂志(J.Immunology)1981；127：1275；Casual O，科学(Science)1986；234：476)，但是具有某些限制，如低抗体分泌率，抗体分泌品系不良的克隆发生和迫使频繁亚克隆的染色体不稳定性。
最具潜力的融合配偶体之一是具有发展良好的蛋白合成系统的同源骨髓瘤细胞。Nilsson K.和Ponten J.，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)1975；15：321。然而，培养的困难解释了为什么几乎没有品系能够适应体外生长并能够产生可存活的杂种。Goldman-Leikin R E，试验临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)1989：113：335。尽管MAb的产生相对稳定，现存的同源骨髓瘤具有低融合产率并缓慢杂交生长。Brodin T，免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)1983；60：1。遗传不稳定性，如当小鼠骨髓瘤用作具有人细胞的无限增殖化配偶体时所存在的遗传不稳定性，是种间杂交的主要缺点。小鼠-人细胞杂种的产生并不困难。在体外，这些细胞具有与常规小鼠-小鼠杂交瘤相似的生长特征。Teng N N H，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))1983；80：7308。然而，人染色体的自发性消除显著地降低稳定MAb分泌的概率。Weiss M C，和Green H.美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))1967；58：1104。为了改进Hu-MAb产生的生长特征和稳定性，已使用小鼠骨髓瘤细胞和人淋巴细胞间的异杂种(Oestberg L，和Pursch E.，杂交瘤(Hybridoma)1983；2：361)以及异骨髓瘤(heteromyelomas)(Kozbor D，等，免疫学杂志(J.Immunology)1984；133：3001)作为融合配偶体。然而，利用鼠/人异骨髓瘤制成的杂交瘤不产生完全人抗体的难题依然存在。
仅报道了一种完全人融合配偶体细胞系。Abraham Karpas等由患有多发性骨髓瘤的患者开发了融合配偶体细胞系(称为Karpas 707)；它不是细胞融合的产物。Abraham Karpas等，PNAS，2001年2月13日，卷98，No.4，1799-1804，和Vaisbourd，M.，等，杂交瘤和Hybridomics(Hybridomaand Hybridomics)，卷20，No.5，2001，287-292，引入其全部内容作为参考，就如同完全由本文所提出的一样。理想的融合配偶体细胞系应该不分泌任何免疫球蛋白，且应该具有短倍增时间。不幸地，Karpas 707分泌γ轻链并具有非常缓慢的约35小时的倍增时间。
克服这些难题的一种努力是改变小鼠单克隆抗体，这是通过结合啮齿动物可变区和人恒定区，从而产生嵌合抗体，或通过将来自小鼠抗体的互补性决定区基因片段移植到人基因，从而产生人源化抗体实现的。这些改变减少但不消除抗体的免疫原性。为了体外产生人单克隆抗体，发展了噬菌体展示技术，并开发了含有人而非小鼠Ig基因的转基因小鼠品系。Bruggemann，M.，等(1996)免疫学今日(Immunol.Today)17，391-97。这些小鼠品系具有人基因并产生人抗体，但是不是在人，而是在小鼠宿主中选择该品系的多样性，且该抗体在小鼠而非人环境中经历亲和性成熟。还尝试了具有埃巴病毒的β淋巴细胞的无限增殖化，但是典型地，其来源细胞不稳定，并分泌非常少量的抗体。
因此，存在着对完全人，天然融合配偶体细胞系的巨大需要，所述细胞系不产生任何免疫球蛋白，稳定，与人淋巴细胞良好融合，并引起稳定产生完全人源化抗体的杂交瘤。
发明简述
本发明的某些方面涉及制备称为核型嵌合(Karyochi)细胞的新型完全人融合配偶体细胞系的方法，所述核型嵌合细胞可以与抗体分泌性细胞融合，从而制备完全人杂交瘤，称为基于核型嵌合的杂交瘤，其同样地分泌完全人单克隆抗体。一些方面涉及由基于核型嵌合的杂交瘤制备的完全人抗体。其他方面涉及某些可以用于制备核型嵌合细胞的亲代细胞，包括人淋巴瘤细胞系FP0，其具有专利保藏号PTA-7466，和人骨髓瘤细胞系FP1.0，其具有专利保藏号PTA-7465。某些方面进一步涉及人嵌合融合配偶体细胞系Karyochi-XX，其具有专利保藏号PTA-7468，和Karyochi-7，其具有专利保藏号PTA-7467。
本发明的一个方面涉及核型嵌合融合配偶体细胞系(具有来自两个不同细胞的细胞核的嵌合细胞)和利用来自单一动物物种，优选地来自人的细胞制备它们的方法。核型嵌合细胞通过下列步骤制备：在单一动物物种中，从第一恶性肿瘤B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，将供体细胞核转移到单一动物物种中来自第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞的细胞质中，并容许一段时间，以使受体细胞中的两个细胞核同步化和融合，从而形成嵌合核型嵌合融合配偶体细胞系。核转移可以利用胞质内细胞核注射或通过碰撞诱导的细胞核引入实现。在本发明的一些方面中，第一和第二人淋巴样细胞系是不同的人细胞系，其选自包括骨髓瘤，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，成淋巴细胞瘤和白血病细胞系的组。虽然本发明优选的方面涉及制备并利用完全人核型嵌合细胞和基于核型嵌合的杂交瘤从而获得完全人单克隆抗体，可以利用任何产生抗体的动物物种，包括所有的哺乳动物，鸟类和爬行动物，制备核型嵌合细胞和基于核型嵌合的杂交瘤。
本发明的一些实施方案涉及产生和分泌单克隆抗体的基于核型嵌合的杂交瘤，以及制备它们的方法。在优选的实施方案中，基于核型嵌合的杂交瘤是完全人的并产生完全人单克隆抗体；然而，可以对任何动物物种制备基于核型嵌合的杂交瘤。例如，通过下列步骤可以制备人的基于核型嵌合的杂交瘤：获得如上述制备的人核型嵌合融合配偶体细胞，将其与人抗体产生性淋巴样细胞融合，并容许一段时间，以使核型嵌合细胞的细胞核和淋巴样细胞的细胞核同步化并融合，从而形成基于核型嵌合的杂交瘤。人抗体产生性淋巴样细胞可以是脾细胞，淋巴结细胞，来自淋巴集结的细胞，外周血淋巴细胞，B细胞，T细胞，或扁桃体腺淋巴细胞。在本发明的一个方面，利用淋巴样细胞系制备基于核型嵌合的杂交瘤，每种所述淋巴样细胞系表达不同的选择标记，包括8-氮鸟嘌呤抗性，5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶或G-418抗性。在本发明的一些方面，用于制备基于核型嵌合的杂交瘤的人抗体产生性淋巴样细胞来自患有病症的人，所述病症导致与该病症相关的抗原的表达，例如所述病症是诸如细菌感染且抗原是细菌内毒素的疾病，或者所述病症是癌症且抗原是癌症抗原。然后再将基于核型嵌合的杂交瘤选择为产生特异于或对与该病症相关抗原具有高亲和性的人单克隆抗体。在本发明的一个方面，用于制备杂交瘤的淋巴样细胞来自动物，优选地来自人，其患有包括诸如下列疾病的病症：癌症，传染病，自体免疫疾病，与过表达激素或酶相关的疾病，移植物对抗宿主疾病(graftvs.host disease)，和心血管疾病。在某些实施方案中，完全人单克隆抗体特异于或对这样的抗原具有高亲和性，所述抗原可以是肿瘤相关抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，激素，酶，核酸，毒素，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，寄生虫抗原，pyron，酶或真核生物抗原。
附图简述
通过在附图中的图举例说明本发明，而非限制本发明，其中：
图1是举例说明用于构建核型嵌合细胞的方法的图。图1A举例说明胞质内细胞核注射技术(ICN)，且图1B举例说明碰撞诱导的细胞核引入方法(IINA)。
定义
人淋巴样细胞系(“HuLCL”)包括骨髓瘤，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，和成淋巴细胞瘤，以及白血病细胞系。除非另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应该具有为该领域中的那些普通技术人员所普遍理解的最广泛的含义。另外，除非另外通过上下文要求，单数术语应该包括复数，且复数术语应该包括单数。
通常，与本文所述细胞和组织培养，分子生物学，和蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交相关的命名法及其技术是众所周知的，且普遍用于本领域，这正如多种一般和更具体的参考文献所述，如在本说明书中引用和讨论的那些。见例如Singleton等，微生物和分子生物学词典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)2.增补(sup.nd)版本，J.Wiley & Sons(纽约，N.Y.1994)；Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第二版，冷泉港实验室出版(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，N.Y.(1989))，将其作为参考引入本文。
本文中，“哺乳动物”意指任何哺乳动物，优选地为人。
用于本文的术语“除人外的哺乳动物”和“非人哺乳动物”彼此同义，其意指以上定义的除人以外的所有哺乳动物。
用于本文的术语“单克隆抗体”指获自基本同种抗体种群的抗体，即包含该种群的个体抗体除了可能的天然发生的以较小数量出现的突变外，均相同，且该术语包括其任意的片段或部分。单克隆抗体是高特异性的，其针对单一抗原位点或表位。此外，与包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。用于本文时，单克隆抗体由基于核型嵌合的杂交瘤产生和分泌。由完全人的基于核型嵌合的杂交瘤制备的本发明的完全人单克隆抗体可以是任何的人单克隆抗体或其部分，其具有属于任意种类和任意亚种免疫球蛋白的同种型，所述任意种类和任意亚种免疫球蛋白包括IgG(IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4)，IgM，IgA(IgA1和IgA2)，IgD，IGD，和IgE或IgM。本发明特别优选的免疫球蛋白的实例是属于人来源的IgG(IgM，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)的那些。
术语“表位”用于指蛋白抗原上的抗体结合位点。表位决定子通常由分子，诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并通常具有特殊三维结构特性，以及特殊带电特性。
本发明范围内的“分离的”单克隆抗体是已经从其天然环境成分中鉴定并分离和/或回收的单克隆抗体。
用于本文的“中和单克隆抗体”是能够消除或显著降低与其结合的靶抗原的效应子功能的单克隆抗体分子，所述靶抗原诸如癌症抗原或肿瘤抗原。在实施方案中，中和抗体会以1-10，10-20，20-30，30-50，50-70，70-80，80-90，90-95，95-99，99-100％降低效应子功能。
核型意指整套细胞或器官染色体。
核配意指两个或多个细胞核的融合。
人淋巴样细胞系(“HuLCL”)包括骨髓瘤，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，成淋巴细胞瘤，和白血病细胞系。
异骨髓瘤意指组合来自两种不同淋巴样细胞系的遗传物质的细胞系，该组合通过融合来自每种淋巴样细胞系的完整细胞实现；该术语包括异淋巴瘤。相反，核型嵌合细胞不由两个完整细胞的融合形成，且因此不能将由此生成的细胞定义为异杂交瘤或异骨髓瘤。
杂交瘤意指无限增殖的抗体产生性细胞系，其稳定的产生抗体，且通过融合来自无限增殖细胞系(转化的)的细胞和抗体产生性细胞，诸如β淋巴细胞制成。
人-鼠杂交瘤意指无限增殖的抗体产生性细胞系，其由鼠异骨髓瘤细胞系和人β淋巴细胞的融合产生。
供体细胞核意指从淋巴样细胞或淋巴样细胞系(优选地是人)分离的细胞核，所述细胞核基本无细胞质。
受体细胞意指来自淋巴样细胞系(优选地是人)的完整细胞。
嵌合细胞意指具有来自两种不同异种细胞染色体的细胞。
核型嵌合细胞意指用作融合配偶体细胞系的嵌合细胞，其利用来自单一动物物种，优选地是人的细胞制成的。为了制备核型嵌合细胞，从正常B细胞或B细胞系获得基本无细胞质的分离的供体细胞核，并再将其转移到取自T或B淋巴样细胞系的完整受体细胞中。随着时间，供体细胞核和受体细胞的细胞核融合为单一细胞核，由此产生嵌合核型嵌合融合配偶体细胞。核型嵌合细胞优选地由来自相同物种，优选地是人的供体细胞核和受体细胞制成，然而可以使用任何产生抗体的动物物种，包括哺乳动物，鸟类和爬行动物。如果供体细胞核和受体细胞均取自恶性B细胞系，则它们必须来自不同的(异种的)细胞系。人核型嵌合细胞可以用于制备完全人抗体分泌性杂交瘤，其被称为基于核型嵌合的杂交瘤。多种细胞组合可以用于制备核型嵌合细胞：
| 受体细胞 | 供体细胞核 | KARYOCHI细胞类型 |
| 恶性T细胞 | 恶性B细胞 | T/B嵌合细胞 |
| 恶性T细胞 | 正常B细胞 | T/B嵌合细胞 |
| 恶性B细胞1，1型 | 恶性B细胞，II型 | B/B嵌合细胞 |
| 恶性B细胞 | 正常B细胞 | B/B嵌合细胞 |
Trioma意指具有三个细胞核的细胞。
抗体产生性淋巴样细胞意指来自任何动物物种的能够产生抗体的任何淋巴样细胞，如外周血淋巴细胞，脾细胞，淋巴结细胞，B细胞，扁桃体腺淋巴细胞，或淋巴集结细胞，优选地是人淋巴样细胞。
基于核型嵌合的杂交瘤意指单克隆抗体产生性细胞系，其由核型嵌合细胞与抗体产生性淋巴样细胞的融合产生。优选地，核型嵌合细胞和抗体产生性淋巴样细胞来自相同的物种，优选地来自人，由此基于核型嵌合的杂交瘤产生并分泌完全人单克隆抗体。利用来自任何制备抗体的动物，包括哺乳动物，爬行动物和鸟类的细胞可以制备基于核型嵌合的杂交瘤。
T细胞(或T淋巴细胞)意指任何这样的淋巴细胞，所述淋巴细胞在胸腺中成熟并具有通过其细胞表面上的受体识别特异性肽抗原的能力。
B细胞意指能够在检测特殊抗原存在性的反应中产生抗体的淋巴细胞类型。
特异性单克隆抗体意指这样的抗体类型，其特异性结合于特殊且确定的抗原，表位，细胞或组织，并且不结合于不对给定抗体特殊且确定的其他抗原，表位，细胞或组织。高亲和性单克隆抗体意指强有力地结合于特殊且确定抗原，表位，细胞和组织的抗体，其具有在范围10-7-10-13M内的亲和性常数(Ka)。
发明详述
本发明的某些实施方案涉及在本文中定义的称为“核型嵌合细胞”的新型嵌合融合配偶体细胞系，以及制备和使用它们的方法。核型嵌合细胞通过下列步骤制备：获得基本无细胞质的分离的供体细胞核；并将该分离的细胞核转移到完整受体细胞的细胞质中。在优选的实施方案中，供体细胞核和受体细胞来自相同的动物物种，优选地来自于人。当使用人细胞时，供体细胞核来自淋巴样细胞系，由此制备T/B或B/B嵌合核型嵌合细胞。在构建嵌合细胞中使用T细胞可以是有利的，其原因在于T细胞分泌一系列刺激细胞生长和抗体分泌的自分泌和旁分泌生长因子和细胞因子。由此形成的嵌合细胞具有两种不同的核型；因此得名“核型嵌合细胞”。因为核型嵌合细胞不是由两个完整细胞融合形成的；所以不能将由此产生的细胞定义为异杂交瘤或异骨髓瘤。核型嵌合细胞是携带两套不同染色体的嵌合细胞，所述染色体来源于不同细胞类型，所述不同细胞类型优选地来自相同的物种。随着时间，核型嵌合细胞中的细胞核同步化并融合，从而形成单一细胞核。人核型嵌合细胞是理想的融合配偶体细胞系，从而用于形成本文所定义的完全人单克隆抗体产生性杂交瘤，其被称为“基于核型嵌合的杂交瘤”。核型嵌合细胞可以来自任何具有抗体产生性细胞的动物，包括所有的哺乳动物，鸟类和爬行动物。
本发明进一步涉及制备核型嵌合细胞的方法。所述方法包括：从正常或恶性B细胞，例如利用在体外受精中首先使用的细胞核分离技术，获得基本无细胞质的分离的供体细胞核。转移供体细胞核的优选方法是将供体细胞核胞质内细胞核注射到受体细胞的细胞质中。细胞核转移还可以通过利用碰撞诱导的细胞核引入(IINI)进行。
本发明某些实施方案涉及基于核型嵌合的杂交瘤，优选地是能够产生完全人单克隆抗体的完全人杂交瘤，以及制备它们的方法。在一个实施方案中，通过下列步骤可以获得基于核型嵌合的杂交瘤：融合所述核型嵌合细胞(优选地是人)和抗体产生性淋巴样细胞(优选地是人)，并选择单克隆抗产生性的基于核型嵌合的杂交瘤，其产生针对目标抗原的抗体。本发明进一步涉及由人的基于核型嵌合的杂交瘤制成的完全人单克隆抗体(下文“HuMAbs”)，以及由任意物种中的基于核型嵌合的杂交瘤制成的任何单克隆抗体。某些实施方案还涉及由全部来源于相同物种的细胞制成的单克隆抗体，由此使该抗体与该物种完全相容。按照本发明的实施方案，杂交瘤复制在体外或体内均有效。因此，基于核型嵌合的杂交瘤细胞可以在，例如培养皿、培养瓶、孔或生物反应器中，以及免疫受损的小鼠体内生长。在某些实施方案中，人抗体产生性淋巴样细胞取自患有诸如包括感染或癌症疾病病症的患者，所述病症导致至少一种与该病症在动物中的存在相关的抗原(例如疾病特异性，病症特异性或肿瘤相关抗原)的表达。在某些实施方案中，利用来自已知感染的，或患病的或具有目标病症的受试者的抗体分泌性细胞制备人的基于核型嵌合的杂交瘤。然后针对已知与感染、疾病或病症相关的抗原的特异性或亲和性，筛选由这些杂交瘤产生的分离的完全HuMAbs。然后可以利用本领域已知的方法治疗地或诊断地使用所述HuMAbs。在某些实施方案中，分离的完全人(或其他物种)单克隆抗体结合于可以杀死表达抗原的靶细胞的毒素或放射性核素。本文所有的实例都是为了制备完全人核型嵌合细胞，基于核型嵌合的杂交瘤和单克隆抗体。
-用于制备完全人单克隆抗体产生性杂交瘤的良好融合配偶体细胞系理想地应该符合下列要求。它应该：
-在起源上，完全是人的；
-不产生或产生可忽略的量的内源性免疫球蛋白或个体免疫球蛋白链；
-具有短倍增时间；
-在混悬培养物中生长
-适合于与不同组织来源的B细胞的高效融合；
-与产生不同Ig同种型的B细胞的融合中无偏向性(对于Ig类型无选择性)；
-产生稳定的Ig产生性杂种，其能够长期稳定地产生特异性Ig；
和
-容易适应于无血清和蛋白质培养基及在生物反应器中的培养，从而进行单克隆抗体的大规模生产。
到目前为止，不存在符合这些标准的完全人融合配偶体细胞系。
在我们早期的工作中，我们开发了异骨髓瘤融合配偶体细胞系，叫做MFP2(ATCC登记号HB-12482)，其是目前可获得的较好的融合配偶体细胞系之一。已经充分地研究了MFP2细胞，并且是美国专利号6,197,582的主题，将其全部内容引入本文作为参考，就如同完全在本文所提出的一样。然而，即使MFP2细胞如此之好，它们仍不是完全人的，因为它们是由融合小鼠骨髓瘤653细胞和人骨髓瘤RPMI 8226细胞形成的。表1比较了动物和人来源的若干融合配偶体细胞系(MFP2，X63，653，RPMI-8226，和B6B11)的一般特征。如表1所示，RPMI 8226自身不是良好的融合配偶体细胞系。它产生IgG轻链，具有与其他细胞非显著水平的融合性，以及非常低的融合效率。然而，与小鼠骨髓瘤653融合的RPMI形成MFP2细胞系，所述MFP2细胞系尽管事实上不是完全人的，但仍是良好的融合配偶体细胞系(FPCL)。
Abraham Karpas等报道了仅有的潜在有效完全人融合配偶体细胞系，其被称为Karpas 707。Abraham Karpas等，PNAS，2001年2月13日，卷98，No.4，1799-1804和Vaisbourd，M.等，杂交瘤和Hybridomics(Hybridoma and Hybridomics)，卷20，No.5，2001，287-292，引入其全部内容作为参考，就如同完全由本文提出的一样。从患有多发性骨髓瘤的患者确定Karpas 707，然而，它不是细胞融合的产物。Karpas 707细胞分泌γ轻链并且具有非常缓慢的约为35小时的倍增时间。分析来自Karpas 707异杂交瘤的抗体重和轻链可变区的报告显示就家族应用、片段应用、体细胞突变和链配对而言，它们不是人B淋巴细胞的代表。Karpas 707的长倍增时间和IgG轻链的产生的组合使其作为人融合配偶体细胞系不是那么理想。尚未报道Karpas 707细胞的融合效率。
核型嵌合细胞：形成和特征
本发明的某些实施方案涉及新型人融合配偶体细胞系(FPCL)，称为核型嵌合细胞，其用于制备完全人抗体产生性杂交瘤，称为基于核型嵌合的杂交瘤。核型嵌合细胞符合以上对理想人融合配偶体细胞系所列出的所有标准。与已知的由利用来自两种不同物种和来自两个完整细胞的融合的细胞制成的杂种融合配偶体细胞不同，利用来自相同物种制备核型嵌合细胞，并且它们不由两个完整的细胞的融合形成。取而代之地，核型嵌合细胞是通过将分离的基本无细胞质的供体细胞核转移到完整受体细胞的细胞质中而制成的，其中所述供体细胞核例如来自正常或恶性B细胞，所述受体细胞取自不同的淋巴样细胞系。由此形成的嵌合细胞具有两种不同的核型；由此得名“核型嵌合细胞”，从而将它们与由两个完整细胞的融合制成的细胞区分开。在优选的实施方案中，核型嵌合细胞完全是人的。细胞核转移后，核型嵌合细胞中的两个细胞核逐渐同步化并融合。核型嵌合细胞是非整倍体，即人核型嵌合细胞不具有典型的23对同源人染色体组。在当供体和受体细胞都来自转化的细胞时的那些核型嵌合细胞中，显著的染色体不稳定性是平常的。人核型嵌合细胞典型地具有超过46条染色体。当组合两种核型时，它们不形成稳定的核型嵌合嵌合体，其中染色体数量是简单的算术和。嵌合后，该细胞随着时间经历染色体消除，直至核型稳定。通常将转化细胞嵌合体的核型表达为这样的模式，即可以在来自相同细胞系的个体细胞中发现的染色体数量的范围。初步研究估计人核型嵌合细胞具有约120-约140条染色体的模式数量。
对于供体和受体细胞核使用异种细胞类型的决定基于先前的常用完整细胞融合经验，其显示出异杂交瘤和异骨髓瘤在与人淋巴细胞融合从而制备杂交瘤中比单独地任意亲代细胞系表现得好得多。Ostberg L.移植中的人单克隆抗体(Human monoclonal antibodies in transplantation)，移植学报(Transplant Proc.)1992年，8月24日(4增补(suppl)2)：26-30；OstbergL，Pursch E.稳定产生人抗体的人X(小鼠X人)杂交瘤，(Human X(mouseX human)hybridomas stably producing human antibodies)，杂交瘤(Hybridomas)1983；2(4)：361-7；Nilsson K，等，用于产生单克隆抗体和其他生物分子的动物细胞包载(Entrapment of animal cells for production ofmonoclonal antibodies and other biomolecules)，自然(Nature).1983年4月14日；302(5909)：629-30；Ostberg L.人X(小鼠X人)杂交瘤(Human X(mouse X human)hybridomas，酶学方法(Methods Enzymol.)1986；121：228-34；Isaacson C.等，人和灵长类用于体内治疗的单克隆抗体(Human and primate monoclonal antibodies for in vivo therapy)，临床化学(Clin Chem.)1988年9月；34(9)：1681-8，引入其全部内容在本文作为参考，就如同完全在本文所提出的一样。适合于制备核型嵌合细胞的淋巴样细胞系包括骨髓瘤，淋巴瘤，成淋巴细胞瘤和白血病。在一个实施方案中，通过融合来自非转化的T或B淋巴样细胞的供体细胞和来自淋巴样细胞系的细胞形成核型嵌合细胞。
在优选的实施方案中，利用胞质内细胞核注射(ICNI)技术分离供体细胞核，所述ICNI技术用于从精子中分离细胞核，从而进行体外受精(IVF)。Trokoudes KM，等，细胞质内精子注射治疗后由来自圆头精子症男子的精子引起的怀孕(Pregnancy with spermatozoa from a globozoospermic manafter intracytoplasmic sperminjection treatment)人类生殖(Hum Reprod)，1995年4月；10(4)：880-2；Hlinka D，等，改良的不使用聚乙烯吡咯烷酮的细胞质内精子注射方法(A modified method of intracytoplasmic sperm injectionwithout the use of polyvinylpyrrolidone)，人类生殖(Hum Reprod.)1998年7月；13(7)：1922-7；Katayose H，等，利用压动吸移管向卵母细胞有效注射公牛精子(Efficient injection of bull spermatozoa into oocytes using aPiezo-driven pipette)动物生殖学(Theriogenology)，1999年11月；52(7)：1215-24，在本文引入其全部内容作为参考，就如同完全由本文所提出的一样。该方法涉及利用超细显微操作针(直径<5um)将细胞核从供体细胞中取出，从而使其基本无细胞质，并将细胞核注射到完整受体细胞的细胞质中。受体细胞典型地具有约30-60微米的直径和平均约50,000微米3的体积。供体细胞核的体积(基本上无细胞质)变化相当大，但是典型地为约150微米3，是受体细胞体积的约0.3％。因此，本发明利用基本无细胞质的供体细胞核(而不是完整供体细胞)来形成融合配偶体细胞系的新方法引起对细胞质基础结构微不足道的破坏和对受体细胞体积微不足道的改变。而且，受体细胞细胞质的破坏受供体细胞核插入的位点的限制。遍及受体细胞的内质网和高尔基体保持基本完整。推测在制备核型嵌合细胞中受体细胞的最小破坏至少部分地解释了它们对制备稳定单克隆抗体产生性，基于核型嵌合的杂交瘤改进的成功。
在下列文献中更充分地描述了ICNI方法和其他细胞核转移方法：Khalili MA，等，辅助生殖遗传杂志(J Assist Reprod.Genet.)2002；19：84-6；和K.D.Nusser，等，人类生殖(Human Reproduction)，卷16，No.1，130-137，引入其全部内容在本文作为参考，就如同完全在本文所提出的一样。有关用于细胞核分离和纯化的方法，我们参考Deborah L.Hodge，等，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)，2002年，第1742-1753页，卷22，No.6；和Dijkwel，P.A.，等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)1991，11，3850-3859，引入其全部内容在本文作为参考，就如同完全在本文所提出的一样。
在另一个实施方案中，利用碰撞诱导的细胞核引入(IINA)迫使供体细胞核进入受体细胞的细胞质。Wallace DC，等，细胞生物学杂志(J CellBiol.)人类组织培养细胞中氯霉素抗性的细胞质递送(Cytoplasmic transferof chloramphenicol resistance in human tissue culture cells.)1975年10月；67(1)：174-88；Jeon，K.W.J阿米巴变形杆菌中去核的选择性作用和异种细胞核在细胞质细胞器上的转移(Selective effects of enucleation andtransfer of heterologous nuclei on cytoplasmic organelles in Amoeba proteus)，原生动物学(Protozool)，1975年8月；22(3)：402-5；Appels R，等，HeLa的第一次分裂计时鸡红细胞异核体。鸡细胞核向子细胞的转移，(The firstdivision of HeLa times chick erythrocyte heterokaryons.Transfer of chicknuclei to daughter cells)，试验细胞研究(Exp Cell Res.)1975年4月；92(1)：79-86，引入其全部内容在本文作为参考，就如同完全在本文所提出的一样。在IINI方法中，利用溶解细胞和在蔗糖梯度中分离细胞核来分离纯化的基本无细胞质的供体细胞核。数次洗涤后，沉淀细胞核，重新混悬于0.5％清蛋白和10％蔗糖/PBS中，计数并为IINA备用。然后利用离心机，使分离的细胞核在数百G的力量下沉淀于受体细胞层上。当使用400-500g的力量时，一定部分的供体细胞核在不破坏或毁坏受体细胞的条件下，穿透受体细胞膜并与细胞质整合。图1A是利用ICNI制备核型嵌合细胞的方法的图。图1B是利用IINA制备核型嵌合细胞的方法的图。接受多于一个细胞核的细胞通常不能存活。核型嵌合细胞的选择是通过在HAT和G418的存在下培养受体细胞完成的，其中HAT和G418是两种选择性标记，其仅容许嵌合细胞的存活，而没有接受供体细胞核的受体细胞将会死亡。
可以使用多种细胞组合来制备核型嵌合细胞。一些组合显示在表2中。
表1
融合配偶体细胞系的一般特征
Karyochi-7 MFP-2
来源 人异骨髓瘤 trioma{(小鼠x人)异
骨髓瘤x人淋巴细胞}
核型(特征) 120-140 80-90
倍增时间(小时) 20 20-22
产物(Ig) 无 无
融合性(fusibility) 人PMNC，淋巴结 人，猴LN，
PBL，扁桃体，脾
融合效率 >1/105 1/105
融合效率PEG 高(>1/105) 高
融合效率ELEC 高(>1/104) 高
杂交瘤Ig-产物 IgG，IgM IgM，IgG，IgA，IgE(D)？
Ig-水平 高达30ug/ml/24小时 高达400ug/ml/24小时
/106细胞 /106细胞(一个实例)
糖基化 可能是人(半乳糖丰富) 可能是人(半乳糖丰富)
克隆发生 高 高
稳定性(杂交瘤) 9-10个月 超过5年
无血清培养基 是 是
腹水生成 是，在免疫缺陷小鼠中 否
生物反应器生成 是 是
抵抗同种异体反应性 是(G418res) 是，对于MFP-2-S克隆
可转染的 ND 是(至少一个实例)
ND＝无数据
表2
用于制备核型嵌合细胞的细胞组合
| 受体细胞 | 供体细胞核 | KARYOCHI细胞类型 |
| 恶性T细胞 | 恶性B细胞 | T/B嵌合细胞 |
| 恶性T细胞 | 正常B细胞 | T/B嵌合细胞 |
| 恶性B细胞，1型 | 恶性B细胞，II型 | B/B嵌合细胞 |
| 恶性B细胞 | 正常B细胞 | B/B嵌合细胞 |
迄今已制备了12个完全人核型嵌合融合配偶体细胞系。将它们命名为Karyochi 1-6，Karyochi XX，以及Karyochi XX的子代，其被命名为XX1，XX-3，XX-5，XX-7和XX-10。在表3中阐明了核型嵌合细胞系1-6和XX的谱系。Karyochi-XX是利用FP0成淋巴细胞瘤作为供体细胞核和FP1.0骨髓瘤作为受体细胞而产生的核型杂交细胞种群。然后利用本领域中所熟知的并在杂交瘤发展中广泛应用的单细胞克隆程序克隆该种群(Karyochi-XX)。选择了10种标记为Karyochi-XX-1到Karyochi-XX-10的亚克隆，从而进一步评估它们的融合效率以及形成稳定杂交瘤的能力。这些亚克隆之一，即Karyochi-XX-7(以下称“Karyochi-7”)表现出优选的性质，并被选择进行进一步的研究。Karyochi-7是稳定克隆的核型杂交融合配偶体细胞系，其来源于亲代细胞FP0和FP1.0。某些实施方案涉及Karyochi-7细胞，其已被保藏于ATCC，且具有专利保藏号PTA-7467；还涉及以专利保藏号PTA-7468被保藏于ATCC的Karyochi-XX细胞。
表3
核型嵌合细胞的系谱
| 核型嵌合细胞系 | 供体细胞核来源 | 受体细胞核来源 |
| Karyochi-1 | 正常B细胞 | FP0成淋巴细胞瘤细胞 |
| Karyochi-2 | 正常B细胞 | RPMI8226成淋巴细胞瘤细胞 |
| Karyochi-3 | FP1.0骨髓瘤细胞 | FP3成淋巴细胞瘤细胞 |
| Karyochi-4 | FP2成淋巴细胞瘤细胞 | FP3成淋巴细胞瘤细胞 |
| Karyochi-5 | FP3成淋巴细胞瘤细胞 | RPMI8226成淋巴细胞瘤 |
| Karyochi-6 | FP0成淋巴细胞瘤 | FP2骨髓瘤细胞 |
| Karyochi-XX(从1到10的克隆) | FP0细胞霍奇金淋巴瘤活组织检查 | FP1.0细胞骨髓瘤活组织检查 |
利用与来自PBL、脾和淋巴结的人淋巴样抗体产生性细胞融合的核型嵌合融合配偶体细胞系1，2，5，XX-1，XX-3，XX-5，Karyochi-7，和XX-10制备8种完全人的基于核型嵌合的杂交瘤细胞系，其分泌完全人单克隆抗体。表4和5显示这些基于核型嵌合的杂交瘤的多种特征。基于表4和5中的数据，将Karyochi-7细胞系(Karyochi XX的FP.0 x FP1.0子代)选做对优化单克隆抗体产生性杂交瘤优选的融合配偶体细胞系。人们预期依赖于为杂交瘤融合所选择的人单克隆抗体产生性淋巴样细胞，多种核型嵌合细胞系是优选的。
表4
基于KARYOCHI杂交瘤
| 基于核型嵌合的杂交瘤系列# | 融合配偶体细胞系＝核型嵌合细胞 | 人淋巴样细胞 | 融合效率(PEG，10-5) | 随着时间的稳定性(月) | 产量ug/ml/24小时/106细胞(范围) |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#1 | Karyochi 1 | PBL，脾，结节 | 0.1-0.3 | 1.5 | 0.5-1 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#2 | Karyochi 2 | PBL，脾，结节 | <0.1 | 1 | 1-2 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#3 | Karyochi 5 | PBL，脾，PBL froz | 0.3-0.4 | 2.5 | 0.5-1 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#4 | KaryochiXX.1 | PBL，脾，PBL froz | 1-2 | 5 | 2-3 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#5 | KaryochiXX.3 | PBL，结节 | 1-2 | 5 | 0.5-1 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#6 | KaryochiXX.5 | PBL，脾，结节 | 0.5-0.6 | 4 | 8-10 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#7 | KaryochiXX.7[Karyochi7] | PBL，脾，结节，PBN froz | 5-10 | 9-10 | 25-30 |
| 基于核型嵌合的杂交瘤#8 | KaryochiXX.10 | 脾，结节 | 2-3 | 5-6 | 5-8 |
参考完全人Karyochi-XX细胞系描述了制备核型嵌合细胞的实例，其中所述完全人Karyochi-XX细胞系是由来自人FP0细胞的供体细胞核制成的，所述人FP0细胞是在取自霍奇金淋巴瘤患者的活组织检查的培养物中建立的。Karyochi 7融合配偶体细胞是Karyochi XX的子代。FPO细胞具有混合的表型：CD3+CD4+CD19-CD20-CD45-CD38-CD33-CD34-CD138-λ-κ-a，该表型显示其T细胞起源；已将这些细胞保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并具有专利保藏号PTA-7466，其在本发明的实施方案中有所涉及。FPO细胞具有不规则形状的形态学，且它们在混悬液中生长成团。FPO细胞受紫外线诱变，并且选择了具有对8-氮鸟嘌呤(8-Ag)(命名为“FP0-AgR细胞”)和对HAT(次黄嘌呤，氨基嘌呤和胸苷)的敏感性的双重抗性的那些细胞。FP0表示融合配偶体0。接着用赋予遗传霉素(geneticin)G418抗性的Neo+质粒转染FP0-AgR细胞并且选择遗传霉素G418抗性克隆。将由此产生的细胞，其被命名为“FP0-AgR-neo+细胞”，用作细胞核供体。本发明的某些实施方案涉及FP0-AgR-neo+细胞系，其被保藏于ATCC。
表5
KARYOCHI融合配偶体细胞：组细胞特征
| Karyochi-XX.7，(Karyochi-7) | Karyochi-XX.10 | Karyochi-XX.3 | Karyochi-XX.1 | |
| 倍增时间(小时) | 20-22 | 24-26 | 30-32 | 20-22 |
| 产物(内源Ig) | 无 | 无 | 无 | λ链的追踪 |
| 融合性 | SPL，LNL，PBL | LNL，PBL | SPL，LNL | SPL，LNL |
| 融合效率 | >1/105 | 2-3/105 | 1-2/105 | 1-2/105 |
| 杂交瘤Ig产物 | IgG，IgM，IgA | IgG，IgM，IgA | IgG，IgM | IgM |
| 杂交瘤Ig水平ug/ml/24h/106细胞 | 25-30，一个实例高达300 | 5-8 | 1-2 | 1-2 |
| 克隆发生 | 高 | 中 | 中 | 中 |
| 稳定性(杂交瘤)，月 | 9-10 | 5-6 | 5 | 5 |
| 无血清培养基 | 是 | NT | NT | 否 |
| 腹水生成 | 在免疫缺陷小鼠中，是 | NT | NT | NT |
| 生物反应器生成 | 是 | 是 | 是 | NT |
用于制备Karyochi XX和Karyochi-7细胞的完整受体细胞是人FP1.0细胞，其在取自骨髓瘤患者的活组织检查的培养物中建立。FP1.0细胞没有受到诱变，且使用初始的“野生”型作为核型嵌合细胞的受体细胞。一个实施方案涉及已被保藏于ATCC的FP1.0细胞，并给予其专利保藏号PTA-7465；它们具有下列表型：CD38+CD56+CD138+CD45-CD19-CD20-CD3-CD4-CD10+CD33-CD34-λ-κ-。FP1.0野生型细胞具有圆形外形；且它们在混悬液中生长，在标准RPMI-1640培养基中达到接近2 x 106细胞/ml的密度。为了制备核型嵌合细胞，将来自FP0-AgR-neo+细胞的分离的供体细胞核显微注射到完整受体FP1.0细胞的细胞质中。注射系列包括20-30个细胞，其以约3个细胞/微滴进行。
用于向完整受体细胞转移分离的供体细胞核的ICNI和IINA方法均导致双核体(携带两个细胞核的细胞)；一个是受体原有的细胞核及另一个是供体细胞核。供体细胞核注射后，在第一次有丝分裂的中期过程中，细胞核融合，且来自两个细胞核的染色体混合。受体细胞分裂后，产生的子细胞在单一细胞核中携带由来自两个亲代细胞的染色体组成的混合的核型。为了选择真核型嵌合细胞，培养携带供体细胞核的受体细胞48小时，其后将它们置于含有选择性试剂HAT和G418的培养基中。只有称为核型嵌合细胞的真嵌合体可以存活于该选择性培养基中。没有接受供体细胞核的细胞在HAT的存在下死亡。相似地，接受了供体细胞核但由于某种原因失去它们自身细胞核的细胞在G418存在下死亡。只有具有供体细胞核(FP0-AgR-neo+)和来自受体细胞(FP1.0)的细胞核的核型嵌合细胞可以在HAT和G418存在下存活。
表6
KARYOCHI-7与KARPAS707的比较
| Karyochi-7 | Karpas 707 | |
| 核型(模式数目) | 120-140 | 210-220 |
| 倍增时间 | 20小时 | 35小时+ |
| IgG产物 | 无 | IgG轻链 |
| 融合性 | PMNC，淋巴细胞，淋巴结，脾细胞，上皮细胞 | 人扁桃体，埃巴病毒转化细胞(164个细胞) |
| 融合效率(一般) | >1/105 | 无信息 |
| 融合效率PEG | 高(>5/105) | 无信息，明显地对PEG敏感 |
| 融合效率电 | 高(>10/104) | 高 |
| 杂交瘤IgG产物 | IgG，IgM，IgA | IgG，IgM |
| 杂交瘤IgG水平 | 25-30ug，一个实例高达300ug/ml/24小时/106细胞 | 21.0ug/ml/24小时/106细胞 |
| 克隆发生 | 高 | 无信息 |
| 稳定性FPCLs | 高，无克隆条件下至少10个月 | 无信息 |
| 稳定性杂交瘤 | 9-10月或更长 | 5个月或更长 |
| 无血清培养基 | 是 | 无信息 |
| 腹水 | 否，除在免疫缺陷小鼠外 | 无信息 |
| 生物反应器 | 是 | 无信息 |
| MAbs的糖基化 | 可能是人，半乳糖丰富，无直接数据 | 无信息 |
| 抵抗同种异体反应性 | 是，G418标记 | 无信息 |
如表4和5显示，不是所有的核型嵌合细胞都具有相同的关于融合性，融合效率，克隆发生，在无血清培养基中旺盛生长能力、和在腹水或生物反应器中生产能力的特征。表6显示有利地将Karyochi-7细胞与完全人Karpas 707融合配偶体细胞系进行比较。Karyochi-7细胞具有约二十(20)小时的倍增时间，其略优于MFP2细胞的20-22小时的倍增时间(表1)。而且，Karyochi-7细胞比具有三十五(35)小时倍增时间的Karpas 707细胞繁殖地快得多。与MFP2细胞相似，Karyochi-7细胞不产生在融合配偶体细胞系中高度需要的免疫球蛋白。相反，Karpas 707细胞产生轻λ链IgG分子。Karyochi-7细胞能够与人多形核细胞(PMNC)、淋巴结细胞、淋巴细胞和脾细胞融合。已报道Karpas 707细胞与埃巴病毒转化细胞系(164个细胞)，与新鲜扁桃体细胞和与来自外周血的白血细胞形成异杂交瘤，从而产生稳定的杂种，所述杂种在5个月的持续生长中不失去免疫球蛋白的分泌。Karyochi-7细胞系已稳定了12个月的时期，其维持它的倍增时间和融合效率。重要地，利用Karyochi-7细胞作为融合配偶体细胞系制成的基于核型嵌合的杂交瘤已经在7个月的时期内处于同等的稳定；监测到杂交瘤最长稳定了10个月，见表4。核型嵌合细胞，特别是某些实施方案所涉及的Karyochi-7细胞，是理想的融合配偶体。它们在起源上是完全人的，不产生或产生可忽略量的内源免疫球蛋白或个体免疫球蛋白链，具有短倍增时间，在混悬液中生长，具有与不同组织起源的B细胞融合的高效率，在与产生不同Ig同种型的B细胞的融合中无偏向性(对于Ig类型无选择性)，生成稳定的Ig产生性杂种，其能够长期稳定地产生特异性免疫球蛋白，并且容易适合于无血清培养基和生物反应器中的培养，从而大规模产生单克隆抗体。融合效率在融合配偶体细胞系中非常重要。Karyochi-7细胞具有良好的>1/105淋巴样细胞的融合效率，有利地将其与MFP2细胞，X63.653小鼠浆细胞瘤细胞(见表1)，和B6B11异骨髓瘤细胞(见表1)进行比较。Karyochi-7细胞在PEG中的融合效率很高(>1/105)，且它利用电融合进行甚至更好(>1/104)。Zimmerman U.，等，人抗体杂交瘤(Hum.Antibodies Hybridomas)1995；6(2)：77-80，将其内容引入本文作为参考。
重要地，基于核型嵌合的杂交瘤产生高水平的IgG和IgM(高达300ug/ml/24小时/106细胞)，其与MFP2杂交瘤和Karpas 707细胞产生的水平相当。基于核型嵌合的杂交瘤在产生不同Ig同种型的B细胞的融合中无偏向性(对于Ig类型无选择性)。以Karyochi-7细胞制成的基于核型嵌合的杂交瘤产生高水平的IgG，IgA和IgM(高达300ug/ml/24小时/106细胞)，其与MFP2杂交瘤和Karpas 707细胞产生的水平相当。以Karyochi-7细胞制成的基于核型嵌合的杂交瘤还可以适应无血清培养基和在生物反应器中的培养，从而大规模产生完全人单克隆抗体。而且，Karyochi-7细胞利用融合的PEG形式与淋巴细胞非常良好地融合，而Karpas 707细胞系对PEG敏感。
基于核型嵌合的杂交瘤的形成
本发明的某些实施方案涉及通过融合核型嵌合细胞和抗体产生性淋巴样细胞(优选地人的)制成的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述核型嵌合细胞优选地是人的，所述抗体产生性淋巴样细胞包括外周血淋巴细胞，脾细胞，淋巴结细胞，B细胞，T细胞，扁桃体腺淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，成红血球细胞或淋巴集结细胞。利用如表5中所示的多种核型嵌合细胞和人淋巴样细胞的组合制备了基于核型嵌合的杂交瘤
通过融合Karyochi-7细胞和人脾细胞制成了一种特殊的杂交瘤系列，其被命名为基于核型嵌合的杂交瘤#7(表4)。通过按照本领域已知的方法，利用杂交瘤克隆因子(Origen 50-0615)进行有限稀释来克隆基于核型嵌合的杂交瘤#7。Fazekas de St.Groth，S.，等免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)35：1-21(1980)；Sugasawara，R.，组织培养方法杂志(Journal of Tissue Culture Methods)12：93-95，(1989)；和Sugasawara，R.，生物/技术(Bio/Technology)6：895-902(1988)，引入其全部内容在本文，就如同其完全在本文所提出的一样。按照实施例1中所描述的本领域已知方法，针对非特异性免疫球蛋白分泌的存在，筛选杂交瘤的上清液。基于核型嵌合的杂交瘤#7(不与Karyochi-7，即融合配偶体细胞系相混淆)产生高达约300ug/ml/24小时/106细胞(一个实例)水平的所有种类的完全人单克隆抗体(IgG，IgM和IgA)，并且在培养中稳定了9个月。它继续旺盛地生长、繁殖、产生和分泌抗体。在本发明的一个实施方案中，涉及通过下列步骤制备人单克隆抗体产生性的基于核型嵌合的杂交瘤的方法，所述步骤是：获得人核型嵌合细胞，融合核型嵌合细胞和人淋巴样细胞，容许一段时间以使来自核型嵌合细胞和淋巴样细胞的细胞核同步化并融合，在允许产生抗体的条件下培养该融合的细胞，确定所述融合的细胞是否产生单克隆抗体，和如产生，选择并鉴定作为基于核型嵌合的杂交瘤的细胞。
在我们早期的工作中，我们显示了来自甲状腺癌患者的淋巴结来源杂交瘤产生抗甲状腺球蛋白抗体。Kalantarov G，Rudchenko S，Trakht I，人抗体(Human Antibodies)，11，3，2002，pp.85-96，将其内容引入本文作为参考。由于该患者没有已知的自体免疫疾病(即抗甲状腺素抗体)史，所以这是未预料到的结果。这显示出在该患者中产生的对抗甲状腺球蛋白的抗体受到癌性甲状腺腺癌细胞的存在的诱导，已知所述癌性甲状腺腺癌细胞分泌甲状腺球蛋白。由此显示了患者中的肿瘤细胞可以诱导对肿瘤相关抗原的体液免疫应答。还显示了利用融合来自患有癌症患者的淋巴细胞和融合配偶体细胞系从而产生分泌抗肿瘤的单克隆抗体的杂交瘤可以鉴定和无限增殖抗体产生性细胞。
在对人乳腺癌的美国专利号6,197,582中获得并描述了相似的结果，引入其全部内容在本文作为参考，就如同其完全在本文所提出的一样。从经历乳房切除术或乳房肿瘤切除术的乳腺癌患者中切除腋窝淋巴结。将从这些淋巴结中分离的淋巴细胞融合于MFP-2融合配偶体细胞。然后，针对乳腺癌细胞系MCF7，SK-BR-3，ZR-75-1筛选由所生成的杂交瘤所产生和分泌的单克隆抗体。几乎所有的杂交瘤产生IgG或IgM(分别约85％和10％)。接近15％的针对乳腺癌细胞系检验的杂交瘤产生特异地针对乳腺癌细胞的抗体。以两种途径测试杂交瘤上清液：(1)在CELISA(细胞ELISA)测定中的活细胞上和(2)通过利用细胞溶解产物的蛋白质印迹法。甚至是接受了77周期的化学疗法的患者仍然产生适合于与融合配偶体细胞系融合以形成杂交瘤的抗癌症抗体，其中可以合理地认为所述化学疗法对患者的免疫系统具有抑制作用。Trakht I.，等，未公开的数据。这些方法在本领域中已知，并可以用于测试由基于核型嵌合的杂交瘤制成的分离的完全HuMAbs。
利用B淋巴细胞可以相似地制备基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述B淋巴细胞取自动物，优选地是患有疾病或病症，如癌症或感染的人。利用已知方法可以确定由人单克隆抗体识别的特异性抗原的分子量范围。为了描绘抗原靶标的性质，可以进行免疫沉淀反应及随后的微量测序。另外，随机肽组合文库可以用于鉴定癌症特异性抗体的分子靶标。Birch-MachinI.，等病毒学方法杂志(J.Virol.Methods).2000；88(1)：89-104，将其内容引入本文作为参考。还可以针对已知的癌症特异性抗原筛选人单克隆抗体，其中所述已知的癌症特异性抗原已被描述为癌症免疫疗法的潜在目标，其包括HER2/neu，粘蛋白1和粘蛋白2，p53，c-myc，血液抗原T，Tn和唾液酰(sialyl)-Tn，EGF的剪截形式，Lewis-Y抗原和其他。已在癌症患者中描述了对这些抗原循环抗体的存在。Moller G.，1995，将其内容引入本文作为参考。可以针对任意癌症抗原制备HuMAbs，所述癌症抗原包括肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、骨癌、甲状腺癌、乳腺癌或前列腺癌。
传染病通常伴随着充分发展的体液和细胞免疫应答。患有某种感染的患者通常含有大量的特异性抗体产生性淋巴细胞，其可以用于产生基于核型嵌合的杂交瘤。受到感染的个体还倾向于过表达促炎细胞因子和淋巴因子，包括肿瘤坏死因子α和白介素-1a，其在感染性休克的实例中有所涉及。利用来自基于核型嵌合的杂交瘤的分离的人单克隆抗体可以中和这些细胞因子。抗体中和疗法的其他靶标包括传染性病原体和它们的毒素，如破伤风毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素和脂质A。典型地，感染了细菌、真菌、原生动物或病毒的患者的外周血含有循环抗体产生性细胞，其可以被分离并与核型嵌合细胞融合，从而产生基于核型嵌合的杂交瘤，该基于核型嵌合的杂交瘤产生针对抗原的完全人单克隆抗体，所述抗原特别地产生于感染的宿主中，其包括在对传染的响应中产生的那些，或通过感染性病原体本身表达的抗原，例如细菌内毒素。作为实例，PBLs可以获自患有感染性休克、艾滋病、汉坦(hanta)病毒感染、HIV、HTLV-I、HTLV-II、流行性感冒、依波拉病毒、人乳头瘤病毒、葡萄球菌(Staphlococcus)、链球菌(Streptococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、大肠杆菌(E.coli)、炭疽或隐球菌(cryptococcus)、乙型肝炎和丙型肝炎、疱疹病毒的患者。可以针对各自的抗原筛选通过融合这些PBLs(或其他抗体产生性细胞)和核型嵌合细胞制成的基于核型嵌合的杂交瘤，从而选择产生具有治疗价值和特异性的单克隆抗体的杂交瘤。利用本发明的细胞和方法，可以制备大量抗HIV抗体，从而在为了治疗AIDS的被动免疫疗法中使用。可以以自体或异体方式使用所述抗体。因此本发明另一个实施方案涉及通过以下步骤制备的人的基于核型嵌合的杂交瘤，所述步骤是：融合来自患有感染、疾病或病症的患者的淋巴样细胞和核型嵌合融合配偶体细胞，并且涉及由它们所产生的HuMAbs，所述HuMAbs特异于与各自的感染、疾病或病症相关的抗原。所述抗原可以特异于导致感染的病原体，或者它可以与由病原体产生的蛋白质结合，或者与根据病原体DNA由感染的宿主产生的抗原结合。所述抗原还可以涉及在感染的个体中以异常量产生的细胞因子和淋巴因子。
人单克隆抗体还可以治疗性地用于治疗患有自体免疫疾病的患者，这是通过利用它们阻断自体抗体，或阻断患者自身的，涉及自体免疫细胞毒性的CD4+T细胞实现的。在本发明的一个实施方案中，由通过融合核型嵌合细胞和患者的CD4+细胞产生的基于核型嵌合的杂交瘤可以产生针对CD4+细胞的人单克隆抗体。然后针对涉及CD4的HuMAbs的产生和分泌筛选由此生成的杂交瘤。可以治疗性地使用这些HuMAbs，从而减少或耗尽患者中多余的CD4+细胞，由此解除自体免疫细胞攻击。所述抗体还可以用在患有过表达CD4的其他患者中，其原因是所述抗体是完全人的，并且应该是被良好耐受的。在另一个实施方案中，核型嵌合细胞可以用于产生基于核型嵌合的杂交瘤细胞，其能够产生涉及特异性自体抗体的抗独特型HuMAbs。例如，自体免疫甲状腺炎是自体免疫功能障碍，其中在患者血浆中存在抗甲状腺球蛋白抗体的高滴定度。为了与核型嵌合细胞融合，可以从所述患者中分离PBL来源的淋巴细胞。可以筛选由此生成的基于核型嵌合的杂交瘤细胞，从而鉴定能够产生HuMAbs的那些，所述HuMAbs具有基本抗独特型免疫应答，所述免疫应答涉及与甲状腺球蛋白反应的自体抗体。然后这些抗独特型的抗体可以用于通过中和以及由此减少或耗尽患者中的抗甲状腺球蛋白抗体来调节自体免疫疾病。可以自体或异体使用所述方法。在自体方法中，在待治疗的患者的外周血中鉴定抗独特型抗体产生性细胞，然后将其分离并与核型嵌合细胞融合。在对由基于核型嵌合的杂交瘤产生的特异性抗-抗甲状腺球蛋白HuMAbs抗体进行选择后，将抗体被动地施用于最初的患者。在异体的方法中，将抗-抗甲状腺球蛋白抗体施用于不同的患者。
由基于核型嵌合的杂交瘤产生的HuMAbs可以通过OKT-3(抗CD3)标记阻断T细胞，用于预防器官移植排斥。还可以产生粘附分子的抗体(抗整联蛋白抗体)，从而预防免疫细胞的迁移，这在例如类风湿性关节炎中很重要。利用对抗血小板的GPIIb/IIIa的人单克隆抗体可以调节血液凝固，例如，在冠状血管成形术后的急性心肌缺血中。静脉内输注免疫球蛋白帮助中和Fc受体介导的血小板细胞或其他血细胞的凝集(例如，血小板减少性紫癜(thromobytopenic purpura))。Hu-MAbs还可以用于解毒或中和毒素或毒液暴露。所述暴露包括，但不限于蛇、蜘蛛或毒蟾蜍咬伤，和黄蜂或蝎螫伤。为了实现这些，从暴露于毒素/毒液的患者中分离淋巴样细胞，并且使这些细胞与核型嵌合细胞融合，从而制备基于核型嵌合的杂交瘤，针对对毒素/毒液的亲和性筛选了所述基于核型嵌合的杂交瘤的Hu-MAbs。备选地，如下所述，用非毒性剂量的毒素/抗原可以体外免疫淋巴细胞，且这些细胞可以用于融合。这些类型的治疗所需要的天然人免疫球蛋白存在缺点。目前用于中和响尾蛇毒液的马抗血清在30％的情形中导致血清病疾病。本文所描述的人单克隆抗体产生系统促进基本上无限制量的完全人免疫球蛋白的体外生成，可以将所述完全人免疫球蛋白选为适合特殊需要的。例如，在阻断Fc受体的免疫球蛋白的情形中，替代当仅有小部分分子具有所需性质时，用汇集的免疫球蛋白制剂治疗患者，利用核型嵌合融合配偶体和基于核型嵌合的杂交瘤可以产生具有所需性质的分子的免疫球蛋白制剂。
先前对产生人抗肿瘤抗体或对抗传染性病原体的抗体的努力要求具有纯化的或分离的抗原的受试者的被迫或人工免疫反应。利用本发明的核型嵌合细胞和杂交瘤，抗原可以是未知的。发展抗体的起始材料是免疫活性的淋巴细胞的库，所述免疫活性的淋巴细胞逐渐成为对以其天然形式和体内环境存在的外来抗原的天然免疫应答的一部分。用于形成基于核型嵌合的杂交瘤的淋巴细胞可以针对如在Trakht，美国专利号6,197,582中描述的目标抗原被体外免疫。接着，利用本领域所熟知的程序，可以针对杂交瘤产生对抗所述抗原的HuMAbs的能力，对其进行选择。基本上，将新鲜分离的淋巴细胞重新混悬于适当的培养基中，如含有2.5mM L-亮氨酸甲酯(Leu-OMe)的RPMI-S(Borrebaeck，CAK，等，1987)，并且将其培养为最终浓度约107细胞/ml。然后可以用不同浓度的促细胞分裂原，如商陆有丝分裂原(PWM)和目标抗原培养混悬的淋巴细胞。免疫反应后，被免疫的淋巴细胞可以与核型嵌合细胞融合，从而制备基于核型嵌合的杂交瘤。可以使用测定，如酶联免疫测定法(ELISA)，针对对抗目标抗原的抗体的存在，测试基于核型嵌合的杂交瘤上清液。
因此，在某些实施方案中，与本发明的核型嵌合细胞相融合的人抗体产生性淋巴样细胞获自患有诸如这样的疾病状况的病症(以下称为“所述病症”)的患者，针对所述疾病病症至少产生了一种与所述病症相关的抗原。该抗原可以是被鉴定的和已知的，或导致宿主淋巴细胞制备对抗它的抗体的未知抗原。另一个实施方案涉及通过融合取自患有所述病症的患者的淋巴样细胞和核型嵌合细胞制成的人的基于核型嵌合的杂交瘤，从而使产生的基于核型嵌合的杂交瘤分泌人单克隆抗体，所述抗体具有对疾病特异性抗原的特异性或高结合亲和性。本发明的其他实施方案涉及由基于核型嵌合的杂交瘤产生的HuMAbs以及它们的治疗学应用，并且涉及由任意种类的核型嵌合杂交瘤所产生的任何其他单克隆抗体。按照本发明的另一个实施方案，所述疾病特异性抗原是肿瘤相关抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，酶，核酸，免疫球蛋白，毒素，病毒抗原，细菌抗原或真核生物抗原。在本发明的实施方案中，所述抗原是哺乳动物、昆虫、大肠杆菌或克雷伯氏菌抗原。在一些实施方案中，由基于核型嵌合的杂交瘤产生的HuMAbs与效应子化合物偶联，所述效应子化合物诸如治疗或诊断使用的细胞毒素试剂、药物、酶、染料或放射性同位素。
解释由人的基于核型嵌合的杂交瘤产生的HuMAbs的稳定产生的机制是未知的。其他人提出第一次融合后保留在配偶体品系中的人染色体或其片段以这样的方式改变细胞内环境，所述方式是使人淋巴细胞染色体或片段在第二次融合后是稳定的。Oestberg L，和Pursch E.，1983。本发明的完全人核型嵌合细胞是超越先前的融合配偶体细胞系的显著改进，其原因在于它们可以用于制备产生完全人单克隆抗体的基于核型嵌合的杂交瘤，并且因为核型嵌合细胞作为融合配偶体在其他参数上有利地不亚于MFP2细胞。本发明的完全人核型嵌合细胞和基于核型嵌合的杂交瘤包括为研究天然人抗体在正常和病理生理条件下的所有组成成分提供基础。本文描述的细胞和方法为鉴定新型肿瘤或传染病相关标记提供基础，并且提供完全人单克隆抗体，从而进行体内治疗和体外诊断应用，该应用即使在多次施用时仍具有微不足道的副作用风险。按照本发明的实施方案，为了进行简易探测，将HuMABs偶联于可检测的标记，如放射性标记的分子、荧光分子、酶、配体、比色标记或磁珠。
本发明还提供分离的核酸，所述核酸编码由所述人的基于核型嵌合的杂交瘤产生的人单克隆抗体。所述核酸可以包括，但不限于DNA，RNA，cDNA，寡核苷酸类似物，载体，表达载体或探针。另外，本发明预期了用于在宿主细胞中表达编码单克隆抗体的核酸的DNA构建体，所述宿主细胞能够表达所述单克隆抗体或其部分。
为了诊断、治疗和监测多种病症，包括如癌症的疾病，长期存在着对人单克隆抗体的需要。在临床试验中使用异种抗体的努力尚未产生有希望的结果。例如，来自小鼠的非人抗体导致人抗小鼠免疫应答的发展，对可以最终引起过敏反应的外来蛋白质的敏化，和生物作用的缺乏，其原因是异体抗体的效应子性质可以错配人免疫系统成分。人单克隆抗体具有大量优点。一个是人单克隆抗体可以识别那些仅在人体内产生免疫性的肿瘤相关抗原(TAA)，而大多数情形中异体抗体识别那些在宿主体内表达免疫优势的抗原和抗原表位并且经常是组织特异性表位。另一个优点是人单克隆抗体和宿主免疫系统效应子成分(如补体)间充分发展的相互作用。另外，由于人单克隆抗体在人受试者中是同源的，较少引起对可注射的人单克隆抗体的变应性和/或过敏反应。本发明的核型嵌合细胞融合配偶体细胞系，基于核型嵌合的杂交瘤和HuMAbs促进鉴定、无限增殖化和离体扩展完全人单克隆抗体产生性细胞，所述细胞在体内由对抗原的天然体液免疫应答形成。由于用于制备人的基于核型嵌合的杂交瘤的人淋巴样细胞是天然免疫系统应答的一部分，所以它们产生的完全人单克隆抗体与免疫系统中的其他成分相容，且能够在人受试者体内诱导安全有效且特异性的生物响应。
如上所述，鉴定并可以以无限制的方式离体生成特异性单克隆抗体产生性细胞(利用生物反应器，SCID小鼠，等)。所述抗体可以在相同受试者体内自体地或在不同受试者体内异体地治疗性地用作被动免疫疗法。人单克隆抗体的同源或异源应用可以是高效的，原因在于可以向相同患者输注完全HuMAbs许多次，且其没有发展抗异种免疫应答的危险。输注的HuMAbs，依赖于其效应子功能，可以初始化靶肿瘤细胞的补体依赖性细胞溶解，或抗体依赖性细胞的细胞毒性抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(通过NK或CTL细胞)，或通过凋亡提供直接的细胞毒性作用。发展的抗体还可以用于入侵性诊断法(成像，免疫闪烁照相术)或疗法(药物靶向，放射性免疫疗法，补体依赖性细胞溶解，ADCC，凋亡细胞溶解等)。
天然抗体和免疫球蛋白，其包括由核型嵌合杂交瘤产生的人单克隆抗体，通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链间变化。每条重和轻链还具有均匀间隔的链内二硫桥键。在每条重链的一个末端存在可变结构域(VH)，跟随其后的是若干恒定结构域。每条轻链在一个末端(VL)具有可变结构域，并且在其另一个末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域排列成行，且轻链可变结构域与重链的可变结构域排列成行。认为特定的氨基酸残基形成轻和重链的可变结构域间的界面。Chothia等.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)186：651(1985)；Novotny和Haber，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82：4592(1985)；Chothia等，自然(Nature)342：877-883(1989)。
单克隆抗体或其部分包括通过用蛋白酶，如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理单克隆抗体而产生的＂F(ab′)2＂和＂Fab＂′片段。＂F(ab′)2＂和＂Fab＂′片段意指通过消化免疫球蛋白产生的抗体片段，所述免疫球蛋白存在于两条H链每一条间的铰链区中的二硫键附近。例如，木瓜蛋白酶裂解存在于两条H链每一条间的铰链区中的二硫键上游的IgG，从而产生两个同源抗体片段。这两个同源抗体片段中的每一个称为Fab′。在另一个实例中，胃蛋白酶裂解存在于两条H链每一条间的铰链区中的二硫键下游的IgG，从而产生略微大于这样的片段的抗体片段，所述这样的片段中两个上述Fab′在铰链区连接。该抗体片段称为F(ab′)2。
本发明范围内的“分离的”单克隆抗体是其天然环境的成分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是妨碍抗体诊断或治疗应用的物质，其可以包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在某些优选的实施方案中，会将单克隆抗体纯化为(1)高于由劳里(Lowry)方法和通过使用旋杯式测序仪确定的末端或内部氨基酸序列确定的抗体重量的95％，或(2)由SDS-PAGE在还原或非还原条件下利用考马斯蓝或优选地银染色确定的同质性。由于抗体的天然环境成分的至少一种应该不会出现，所以分离的抗体包括在重组细胞中的原位抗体。然而，正常地，分离的抗体应该通过至少一个纯化步骤制备而成。
可以通过下列步骤筛选产生单克隆抗体的基于核型嵌合的杂交瘤，所述步骤是：例如在微量滴定板中培养细胞，并例如通过酶免疫测定法，如放射性免疫测定法(RIA)和酶联免疫溶剂测定法(ELISA)，在观察到杂交瘤生长的孔中的培养上清液中，测量其对包括免疫原的任意目标抗原的反应性。通过下列步骤可以从基于核型嵌合的杂交瘤产生单克隆抗体，所述步骤是：体外或体内培养杂交瘤，并从生成的培养上清液或腹水中分离抗体，所述体内诸如在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔的腹水中，优选地为大鼠或更优选地为小鼠。例如，在腹水渗出液方法中，通过i.p.将矿物油，如降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)施用于哺乳动物，在所述哺乳动物中生长了杂交瘤，例如，所述哺乳动物可以是骨髓瘤细胞来源的相同物种。然后，向动物i.p.施用约1 x 107-1 x 109个细胞的杂交瘤，并且在该动物体内生长大量杂交瘤细胞。1-4周后，优选地2-3周后，从该动物收集腹水或血清。如果有必要从腹水或血清中纯化抗体，则可以通过常规方法进行纯化，诸如硫酸铵盐析，在阴离子交换剂，例如DEAE纤维素上的离子交换层析法，蛋白质A琼脂糖凝胶上的亲和性层析法和凝胶过滤，并且这些可以单独或组合使用。在美国专利号6,605,705中描述了生长杂交瘤和分离单克隆抗体的其他方法，将其引入本文作为参考。
取决于，例如待培养细胞的性质，测试研究的目标，和培养方法的多种条件，利用已知营养培养基或任何源自已知基础培养基的营养培养基，可以进行体外培养基于核型嵌合的杂交瘤，以生长、维持和储存所述杂交瘤，从而在培养上清液中产生单克隆抗体。通过本领域已知的任意方法，可以从上文提及的杂交瘤培养上清液或腹水中分离并纯化单克隆抗体，所述方法包括饱和硫酸铵沉淀，优球蛋白沉淀法，己酸法，辛酸法，离子交换层析法(DEAE或DE52)，利用抗免疫球蛋白柱或蛋白质A柱的亲和层析法。还可以利用常规方法，如细胞培养法，腹水渗透液法等分离本发明的人单克隆抗体。例如，在细胞培养法中，在常规培养条件下，将杂交瘤培养在培养基中2-14天，所述培养基诸如含有10-20％小牛血清的RPMI-1640，MEM，或E-RDF或无血清培养基，所述常规培养条件例如37摄氏度，5％CO2。接着，可以从该培养物中获得抗体。
本文中的“结合率常数(Ka)”意指基于抗体抗原反应动力学计算的指示单克隆抗体对靶抗原结合强度(程度)的数值。“解离率常数(Kd)”意指指示单克隆抗体从靶抗原解离强度(程度)的数值。“解离常数(Kd)”是通过“解离率常数(Kd)”除以“结合率常数(Ka)”值获得的数值。这些常数用于代表单克隆抗体对抗原的亲和性，及其对中和抗原的活性。可以按照多种方法分析所述常数，并且可以容易地利用商业测定试剂盒BiacoreX(阿莫仙制药(Amersham Pharmacia))或相似的试剂盒，按照试剂盒所附的手册和试验方法进行分析。分别用1/M.秒，1/秒和M(摩尔)单位表示利用所述试剂盒获得的ka，kd和Kd值。较高的ka值表示所测单克隆抗体的强抗原结合活性，且较小的Kd值表示抗体的强抗原中和活性。
利用参考具体实施方案，在上文说明书中已经描述了本发明。然而，显而易见的是在不偏离本发明较广泛的精神和范围的条件下，可以对实施方案进行多种改进和改变。说明书和附图应该被视为举例说明，而非限制本发明。
实施例
实施例1：制备人嵌合核型嵌合细胞
为了IINI进行的供体细胞核的分离
如前所述，使用基于毛地黄皂苷方案分离细胞核。简要的，用冰冷的细胞洗涤缓冲液(CWB)漂洗处于单层中的细胞两次，所述CWB由5mMTris-HCl，pH 7.4，50mM KCl，0.5mM EDTA，0.05mM精胺，0.125mM亚精胺，0.5％硫乙二醇，和0.25mM PMSF组成。然后在将含有0.1％毛地黄皂苷(水溶性形式；希格玛(Sigma))的CWB置于所述单层(5mL/15cm板)上后，用塑料细胞提升器(费希尔科技(Fisher Scientific)，斯普林菲尔，NJ，USA)刮去该细胞。迫使该细胞混悬液三次经过21号的皮下注射针，并将其层铺于装在15mL圆锥形塑料管中的2mL含12.5％丙三醇的CWB-毛地黄皂苷上。通过在3000g离心10分钟沉淀细胞核。该细胞核分离方案用于为IINI制备细胞核。
淋巴细胞：脾细胞，淋巴细胞和PBLs的分离
淋巴结：培养基：补充了丙酮酸钠、非必需氨基酸和维生素的任意无血清培养基可以用于分离人淋巴细胞。将淋巴结组织置于100mm的培养皿中，用剪刀解剖，并且再用玻璃杵将其挤过筛网。将沉淀物混悬于含有0.5％胎牛血清的DMEM培养基中，并将该细胞混悬液转移到50ml的管中，其下铺有Histopaque-1.077(希格玛(Sigma)，H8889)(细胞混悬液体积的1/3)，并以400g在室温(RT)下离心40分钟。淋巴细胞在Hystopaque的边界上形成乳白色环，这帮助它们的识别以进行抽吸。然后抽吸淋巴细胞，用相同的培养基洗涤淋巴细胞两次，并对其进行计数。
血液：用补充了丙酮酸钠、非必需氨基酸和维生素的任意无血清培养基1:1地稀释血液，并分配在50ml的管中。其下铺有Histopaque-1.077(希格玛(Sigma)，H8889)(细胞混悬液体积的1/3)，并以400g在室温下离心40分钟。外周血淋巴细胞在Hystopaque的边界上形成乳白色环，这帮助它们的识别以进行抽吸。然后抽吸PBLs，用相同的培养基洗涤PBLs两次，并对其进行计数。
B.制备核型嵌合
在取自霍奇金淋巴瘤患者的活组织检查的培养物中建立FP0细胞。该FPO细胞具有混合的表型：CD3+CD4+CD19-CD20-CD45-CD38-CD33-CD34-CD138-λ-κ-，所述表型指示其T细胞起源。该细胞具有不规则形状的形态，并且它们在混悬液中成团生长。通过数轮每轮30秒的紫外线光诱变这些细胞，并通过从5ug/ml到20ug/ml逐渐增高的8-氮鸟嘌呤(8-Ag)浓度，对8-Ag抗性进行选择。最终的突变体FP0-AgR细胞能够在20ug/ml8-Ag的存在下生长。这些FP0AgR细胞对HAT(次黄嘌呤，氨基嘌呤和胸苷)敏感，从而使得所有细胞在HAT存在下在72小时内死亡。然后用Neo+质粒转染FP0-AgR细胞，并且在1,000ug/ml G418(具有约600ug/ml的有效浓度的总质量浓度)的存在下选择遗传霉素G418抗性克隆。产生的FP0-AgR-neo+细胞用作细胞核供体。
在取自骨髓瘤患者的活组织检查的培养物中建立人FP1.0细胞。在培养物中选定细胞，并使其在10％FCS(胎牛血清)的存在下生长。这些细胞没有受到诱变，且最初的“野生”型用作受体细胞，从而产生核型的嵌合体。对FP1.0细胞进行表型鉴定(phenotyping)，并发现其具有下列表型：CD38+CD56+CD138+CD45-CD19-CD20-CD3-CD4-CD10+CD33-CD34-λ-κ-。该细胞具有圆形形状；并且它们在混悬液中生长，并在增补了维生素、谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FCS的标准RPMI-1640培养基中达到接近2x106细胞/ml的密度。
通过从FP0-AgR-neo+细胞去除细胞核以使该细胞核基本无细胞质而产生核型嵌合(核型嵌合体)细胞。分离的FP0细胞核是供体细胞核。将供体细胞核转移到受体FP1.0细胞的细胞质中，在其中细胞核最终与FP1.0细胞的细胞核融合，从而形成核型嵌合细胞。供体细胞核的转移可以利用两种不同的技术实现。向受体细胞的细胞溶胶胞质内注射供体细胞核是优选的细胞核转移方法。(胞质内细胞核注射-ICNI)。该方法涉及利用超细显微操作针(直径<6um)从供体细胞中去除细胞核，并向受体细胞的细胞质内注射该细胞核。
所使用的细胞融合方法之一是碰撞诱导的供体细胞核引入受体细胞细胞质的变化。碰撞诱导的供体细胞核引入受体细胞细胞质(Impact InducedNucleus Administration-IINA)利用分离自供体细胞的纯化的细胞核制剂，利用离心机在数百G的力量下将所述细胞核沉淀于受体细胞层上。相关参考文献是：Hahn C.等，1990；Smith P.等，1988；Hill M.等，1985，Nahava K.等，1977；和Jett M.等.1977，将这些参考文献引入本文作为参考。当使用400-500g的力时，一定部分的细胞核穿透受体细胞膜并与细胞质整合，这保留它们的完整性和功能性。典型地，双核体良好地存活，而具有三个或更多细胞核的细胞死亡。然后为确定染色体的数量进行细胞的核型测定，从而明确地鉴定接受两个细胞核的核型嵌合细胞。
这两种方法均导致双核体，即携带两个细胞核的细胞，一个是受体最初的细胞核和另一个是供体的细胞核。细胞核转移后，在第一次有丝分裂的中期过程中，细胞核融合，且来自两个细胞核的染色体混合。受体细胞分裂后，产生的子细胞将携带处于单一细胞核中的混合核型，所述混合核型由双方亲代细胞的染色体组成。为了选择真嵌合体(异骨髓瘤)，培养该细胞48小时，其后将它们置于含有选择性试剂HAT和G418的培养基中。只有称为核型嵌合细胞的真嵌合体可以存活于该选择性培养基中。没有接受供体细胞核的细胞在HAT的存在下死亡。相似地，接受了供体细胞核但由于某种原因失去它们自身细胞核的细胞也在G418存在下死亡。只有核型嵌合细胞可以在HAT和G418存在下存活。
C.Karyochi-7采用的融合方案
以下阐明了融合核型嵌合细胞(Karyochi-7)和分离自脾、淋巴结或血液的淋巴细胞，从而制备基于核型嵌合的杂交瘤的方案：
1 淋巴细胞和Karyochi-7细胞均需要利用以200g，RT离心10分钟，洗涤4次，并且在融合前计数。适合于洗涤的培养基包括补充了L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，NEAA和维生素的任意无血清培养基。
2 在锥虫蓝(Cellgro，25-900-LI)存在下利用血球计计数细胞，从而确定细胞的生存能力。以储液0.4％的形式供给锥虫蓝。为了制备0.1％的工作溶液，混合1份的锥虫蓝和3份的PBS。为了计数细胞，混合等体积的细胞混悬液和0.1％的锥虫蓝。
3 细胞计数后，以1:4或1:5(Karyochi-7:淋巴细胞)的比例混合Karyochi-7和淋巴细胞，加入洗涤培养基至50ml，并在200g，RT下沉淀细胞混合物10分钟。
4 倾析上清液，并倒置该管30秒。吸去所有剩余的培养基。
5 通过用拇指摇动所述管重新混悬该沉淀。
6 加入经过37℃预温的聚乙二醇(PEG-1500)(希格玛(Sigma)，P7181)，对于约10-300 x 106细胞的细胞混合物，加入300ul；且对于细胞数量高于300 x 106的，加入400ul。在室温(RT)下，持续摇动培养3分钟。
7 利用下列时间表，用洗涤培养基洗涤PEG溶液：10ml进行10分钟，和5ml进行5分钟。
8 通过加入C-RPMI，以PEG洗涤程序继续洗涤：--10ml进行5分钟，和5ml进行1分钟。
9 在RT下，以200g离心细胞混悬液10分钟。将该细胞以浓度1 x 106淋巴细胞/ml重新混悬于含有1x HAT(希格玛(Sigma)，H0262)和1 xHT(希格玛(Sigma)，H0137)的C-RPMI中，并以约200ul/孔的量将该混悬液涂布在96孔板上(Falcon，3872)。
10 每3-4天，用含有HAT和HT的相同培养基替换1/2的培养基。在筛选前，让基于核型嵌合的杂交瘤细胞生长约2-4周。当基于核型嵌合的杂交瘤细胞占据孔体积的约1/5时，应该开始筛选。
D.基于核型嵌合的杂交瘤细胞的克隆
利用杂交瘤克隆因子(奥瑞根(Origen)，50-0615)作为原料(C-RPMI的20％)，通过有限稀释克隆基于核型嵌合的杂交瘤细胞。克隆取决于细胞进行2-4周。
E.针对非特异性Ig分泌的存在筛选基于核型嵌合的杂交瘤上清液
以下阐明了用于检测非特异性免疫球蛋白分泌存在的筛选方法：
1 制备碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1M Na2CO3，1份，0.1M NaHCO3，9份)，pH 9.6。
2 使用捕获抗体山羊抗人IgG(Fc特异性)(希格玛(Sigma)，I2136)或山羊抗人IgM(希格玛(Sigma)，I2386)。
3 制备1ug/ml碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的捕获抗体溶液，并以100ul/孔(100ng/孔)将其涂布于96孔板(非无菌，Nunc，439454)上。用石蜡膜覆盖该板，并在4℃培养过夜。
4 用去离子(DI)水洗涤该板5次，并在RT下，用磷酸缓冲盐中的0.3％的奶粉(Foodclub)阻断非特异性结合1小时。
5 以100ul/孔的量应用基于核型嵌合的杂交瘤上清液。以最高浓度5ug/孔的量应用标准人IgM(希格玛(Sigma)I8260)或标准人IgG(希格玛(Sigma)I2511)，并RT培养2小时。
6 用DI水洗涤该板6次。
7 在PBS/奶(0.3％)中1:2000地制备第二抗体(山羊抗人多价Ig过氧化物酶标记的，希格玛(Sigma)，A8400)溶液。将100ul标记的抗体应用于该板，并RT培养1小时。
8 用DI水洗涤该板8次。
9 在1ml DMSO中溶解1片底物(四甲基联苯胺，希格玛(Sigma)T5525)，并加入9ml含有0.03％过硼酸钠(希格玛(Sigma)P4922)的0.05磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH5.0(希格玛(Sigma)P4809)。
10 将底物溶液加入到孔中(100ul/孔)。
11 在655nm读板(滤光器#7)。
12 通过ELISA，利用与过氧化物酶缀合且被人免疫球蛋白吸附的鼠抗人轻和重链(MAH-L，H)和山羊抗小鼠免疫球蛋白(25ug/ml)，可以确定所分泌的单克隆抗体的同种型。利用美国专利号6,197,582所述的过氧化物酶抗过氧化物酶系统(PAP)，可以通过免疫细胞化学评估细胞质轻和/或重链在基于核型嵌合的杂交瘤中的产生，引入其全部内容在本文中作为参考，就如同其完全在本文所提出的一样。
F.融合方案
按照对各个细胞系所描述的那些内容使用融合方案。在那些不可以使用所述方案的情形中，使用了采用Karyochi-7的融合方案。在每个实验过程中，随着时间监测了下列参数：
-融合效率，表示为显示阳性细胞生长的孔的数量和杂种/人淋巴细胞数量的频率；
-显示了Ig产生的孔的数量；
-经过6周时期，在非克隆的基于核型嵌合的杂交瘤种群中Ig产生的稳定性；
-克隆发生；和
-经过至少6周时期，在个体克隆中Ig产生的稳定性。
G.染色体分析
通过下列技术可以获得中期染色体制备物。在指数生长过程中向细胞加入秋水仙碱。然后如所述用胰蛋白酶作用细胞，并为G带显带技术对细胞进行染色(Seabright S.，Lancet1971；2：971.)(每个品系10-15个板)。然后为了计数染色体数量，对于每个细胞系至少分析了50个中期图像。
H.由流式细胞术进行DNA分析
为了评估DNA含量，可以用1ml 70％的乙醇固定细胞(1次，10上标6(10.sup.6))，洗涤，用处于Hank′s溶液(pH 7.4)中的0.3mg/ml核糖核酸酶A(Serva)培养2-3小时，并用处于Hank′s溶液中的碘化丙锭(propidium iodide)(0.05mg/ml，希格玛(Sigma))染色2小时。然后在FACS-II细胞荧光计(百顿狄金森(Becton Dickinson))中测量DNA含量。由氩离子激光以400mW能量，在488nm处激发荧光(164-05型，光谱-物理(Spectra-Physics))，并在600nm长波通干涉滤光片(long passinterference filter)(迪翠科光学(Ditric Optica))后记录该荧光。
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Claims (41)
1.人淋巴瘤细胞系FP0，其具有专利保藏号PTA-7466。
2.人骨髓瘤细胞系FP1.0，其具有专利保藏号PTA-7465。
3.人融合配偶体细胞系Karyocho-7，其具有专利保藏号PTA-7467。
4.人融合配偶体细胞系Karyochi-XX，其具有专利保藏号PTA-7468。
5.利用来自单一动物物种的细胞制备核型嵌合融合配偶体细胞系的方法，其包括：
a.从所述单一动物物种中的第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，
b.将所述供体细胞核转移到来自所述单一动物物种中的第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞细胞质中，
c.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，和
d.鉴定并选择核型嵌合融合配偶体细胞系。
6.权利要求5的方法，其中通过胞质内细胞核注射将所述供体细胞核转移到所述受体细胞的细胞质中。
7.权利要求5的方法，其中通过碰撞诱导的细胞核引入将所述供体细胞核转移到所述受体细胞的细胞质中。
8.权利要求5的方法，其中所述第一和第二人淋巴样细胞系是不同的人细胞系，其选自包括下列各项的组：骨髓瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成淋巴细胞瘤和白血病细胞系。
9.权利要求5的方法，其中所述动物物种是哺乳动物类的成员。
10.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物是人。
11.权利要求5的方法，其中所述供体细胞来自具有专利保藏号PTA-7466的人淋巴瘤细胞系FP0，且所述受体细胞来自具有专利保藏号PTA-7465的人骨髓瘤细胞系FP1.0。
12.权利要求5的方法，其中所述供体细胞核和所述受体细胞各表达不同的选择标记，所述选择标记是选自包括下列各项的组的成员：8-氮鸟嘌呤抗性，5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶或G-418抗性。
13.利用来自单一动物物种的细胞制备单克隆抗体分泌性的基于核型嵌合的杂交瘤的方法，其包括：
a.通过下列步骤获得核型嵌合融合配偶体细胞：
1.从所述单一动物物种中的第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，
2.将所述供体细胞核转移到来自所述单一动物物种中的第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞细胞质中，
3.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，从而形成所述核型嵌合融合配偶体细胞，和
4.鉴定并选择所述核型嵌合融合配偶体细胞系，
b.融合步骤a的核型嵌合融合配偶体细胞和来自所述单一动物物种的抗体产生性淋巴样细胞，
c.容许一段时间，以使所述核型嵌合细胞的细胞核和所述淋巴样细胞的细胞核同步化并融合，
d.在允许抗体生成的条件下培养步骤c中形成的融合细胞，和
e.鉴定并选择所述单克隆抗体分泌性的基于核型嵌合的杂交瘤。
14.权利要求13的方法，其中所述单一动物物种是哺乳动物物种。
15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物是人。
16.权利要求15的方法，其中所述动物是非人哺乳动物、爬行动物或鸟类。
17.权利要求13的方法，其中步骤b的抗体产生性淋巴样细胞是人细胞，其为选自包括下列各项的组的成员：脾细胞、淋巴结细胞、来自淋巴集结的细胞，外周血淋巴细胞、B细胞、T细胞和扁桃体腺淋巴细胞。
18.权利要求13的方法，其中所述动物是人，步骤b的抗体产生性淋巴样细胞来自患有病症的人，所述病症导致与所述病症相关的抗原的表达，并且所述基于核型嵌合的杂交瘤产生人单克隆抗体，所述人单克隆抗体特异于所述抗原或对所述抗原具有高亲和性。
19.权利要求18的方法，其中所述病症是疾病，且与所述病症相关的抗原是激发免疫应答的疾病特异性抗原。
20.权利要求19的方法，其中所述疾病是包括下列各项的组的成员：癌症，传染病，自体免疫疾病，与过表达激素或酶相关的疾病，移植物对抗宿主疾病，和心血管疾病。
21.权利要求18的方法，其中所述抗原是选自包括下列各项的组的成员：肿瘤相关抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，酶，激素，核酸，毒素，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，寄生虫抗原，pyron，和真核生物抗原。
22.通过下列步骤制备的人核型嵌合融合配偶体细胞：
a.从第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离人供体细胞核，所述人供体细胞核基本上无细胞质，
b.将所述供体细胞核转移到来自第二T或B淋巴样细胞系的人受体细胞细胞质中，和
c.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，和
d.鉴定并选择所述人核型嵌合融合配偶体细胞系。
23.权利要求22的核型嵌合细胞，其中所述第一和第二人淋巴样细胞系是不同的，且是选自包括下列各项的组的成员：骨髓瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成淋巴细胞瘤和白血病细胞系。
24.权利要求22的核型嵌合融合配偶体细胞，其中所述供体细胞核来自具有专利保藏号PTA-7466的人淋巴瘤细胞系FP0，且所述受体细胞来自具有专利保藏号PTA-7465的人骨髓瘤细胞系FP1.0。
25.产生人单克隆抗体的人的基于核型嵌合的杂交瘤，其通过下列步骤制备：
a.通过下列步骤获得人核型嵌合细胞：
1.从第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离人供体细胞核，所述人供体细胞核基本上无细胞质，
2.将所述供体细胞核转移到来自第二T或B淋巴样细胞系的人受体细胞细胞质中，和
3.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，和
4.鉴定并选择所述人核型嵌合融合配偶体细胞系；
b.融合步骤a的核型嵌合细胞和人的抗体产生性淋巴样细胞，
c.容许一段时间，以使所述核型嵌合细胞的细胞核和所述淋巴样细胞的细胞核同步化并融合，
d.在允许抗体生成的条件下培养步骤c中形成的融合细胞，和
e.鉴定并选择产生人单克隆抗体的基于核型嵌合的杂交瘤。
26.权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤，其中步骤a的核型嵌合细胞是人Karyochi-7融合配偶体细胞，其具有专利保藏号PTA-7467。
27.分离的完全人单克隆抗体或其部分或片段，其通过权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤产生。
28.分离的完全人单克隆抗体或其部分或片段，其通过权利要求26的基于核型嵌合的杂交瘤产生。
29.权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述人的抗体产生性淋巴样细胞来自患有病症的人，所述病症导致与所述病症相关的抗原的表达，并且所述基于核型嵌合的杂交瘤产生人单克隆抗体，所述人单克隆抗体特异于所述抗原或对所述抗原具有高亲和性。
30.权利要求29的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述病症是疾病，且与所述病症相关的抗原是在患有所述疾病的患者中激发免疫应答的疾病特异性抗原。
31.权利要求30的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述疾病是包括下列各项的组的成员：癌症，传染病，自体免疫疾病，与过表达激素或酶相关的疾病，移植物对抗宿主疾病，和心血管疾病。
32.权利要求29的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述抗原是选自包括下列各项的组的成员：肿瘤相关抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，激素，酶，核酸，毒素，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，寄生虫抗原，pyron，酶，和真核生物抗原。
33.权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述第一和第二淋巴样细胞系是不同的，且它们是选自包括下列各项的组的成员：骨髓瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成淋巴细胞瘤细胞系或白血病细胞系。
34.分离的完全人单克隆抗体或其部分或片段，其通过权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤产生，其中所述人的抗体产生性淋巴样细胞来自患有病症的人患者，所述病症导致与所述病症相关的抗原的表达，并且其中所述单克隆抗体特异于所述抗原或对所述抗原具有高亲和性。
35.分离的完全人单克隆抗体或其部分或片段，其通过权利要求25的基于核型嵌合的杂交瘤产生，其中所述人抗体产生性淋巴样细胞来自患有疾病的人，所述疾病选自包括下列各项的组：癌症，传染病，自体免疫疾病，与过表达激素或酶相关的疾病，移植物对抗宿主疾病，和心血管疾病，并且其中所述抗原是选自包括下列各项的组的成员：肿瘤相关抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，激素，酶，核酸，毒素，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，寄生虫抗原，pyron，酶，和真核生物抗原，并且其中所述单克隆抗体特异于所述抗原或对所述抗原具有高亲和性。
36.权利要求13的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述第一和第二非人动物淋巴样细胞系各表达不同的选择标记，所述选择标记是选自包括下列各项的组的成员：8-氮鸟嘌呤抗性，5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和G-418抗性。
37.权利要求5的方法，其中所述动物是非人哺乳动物、爬行动物或鸟类。
38.利用来自单一非人动物物种的细胞制备的核型嵌合融合配偶体细胞系，其通过下列步骤制备：
1.从单一动物物种中的第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，
2.将所述供体细胞核转移到来自所述单一动物物种中的第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞细胞质中，
3.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，和
4.鉴定并选择利用来自所述单一非人动物物种的细胞制备的核型嵌合融合配偶体细胞系。
39.利用来自单一非人动物物种的细胞制备的单克隆抗体分泌性的基于核型嵌合的杂交瘤，其通过下列步骤制备：
a.通过下列步骤获得核型嵌合细胞：
1.从所述单一动物物种中的第一恶性B淋巴细胞细胞系或正常B淋巴细胞分离供体细胞核，所述供体细胞核基本上无细胞质，
2.将所述供体细胞核转移到来自所述单一动物物种中的第二T或B淋巴样细胞系的受体细胞细胞质中，
3.容许一段时间，以使所述受体细胞中的两个细胞核同步化并融合，和
4.鉴定并选择利用来自所述单一动物物种的细胞制备的核型嵌合融合配偶体细胞系，
b.融合步骤a的核型嵌合细胞和来自所述单一动物物种的抗体产生性淋巴样细胞，
c.容许一段时间，以使所述核型嵌合细胞的细胞核和所述淋巴样细胞的细胞核同步化并融合，
d.在允许抗体生成的条件下培养步骤c中形成的融合细胞，和
e.鉴定并选择来自所述单一非人动物物种的单克隆抗体产生性的基于核型嵌合的杂交瘤。
40.权利要求39的单克隆抗体分泌性的基于核型嵌合的杂交瘤，其中所述单一动物物种是包括下列各项的组的成员：非人哺乳动物、爬行动物和鸟类。
41.分离的单克隆抗体或其部分或片段，其通过权利要求39的基于核型嵌合的杂交瘤产生。
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