JPH05503214A - 因子依存性ヒトｂ細胞系統の作製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 因子依存性ヒトＢ細胞系統の作製性 技術分野 本発明は、一般的には免疫学の分野に関するものであり、更に詳細には、抗体産 生能を持つヒト・リンパ球Ｂ細胞の長期培養を確立する方法に関するものである 。

背景技術 容易に入手可能な、ヒト・モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、有 用な製薬および診断用の組成物を生ずるだろう。ヒト・モノクローナル抗体が直 接的に有用であることが判明するかも知れない領域は、ウィルスおよび細菌性疾 病に対する受動的免疫化や、薬剤および毒物の排除、新生物の診断における映像 分析、腫瘍への薬剤のターゲティングならびに自己免疫症患者の調整を含む。

ヒト・モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの間接的な利用法は、細菌あるい はその他の非ヒト発現系における遺伝的に操作されたモノクローナル抗体を作製 するためのメツセンジャーＲＮＡ源としての、それらの利用にあり、たとえばス ケラら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２４０．　ｐｇｓ、１０３８−１０４ｉ　 （１９８８）：およびムーアら、米国特許第４．６４２．３３４号などである。

これらの方法には、潜在的に危険なヒトの汚染物質を含まない抗体あるいは結合 組成物を供給するという大きな利点がある。残念ながら、現在まで、ｉｎ　ｖｉ ｖｏにおいてヒト・モノクローナル抗体を利用する試みは極めて限られており、 たとえばバーネットら、イン・ンユトレルカウカス編、旦ト・ハイブリドーマ・ 診断および製薬上の応用（マーセル・デツカ−、ニューヨーク、１９８７）など がある。この分野における進歩の最大の障害は、長期でかつ免疫されたヒトＢ細 胞系統を得ることが出来なかったこと、たとえばジェイムズら、Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　Ｖｏｌ、１００．９ｇ５．５−４０　（１９８７）； およびヴアン・プラント、Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ＶｏＬ、７．　ｐｇｓ、５６１−５６３　（１９８９ ）などがある。

こうした系統を日常的に生産する方法および、Ｂ細胞の抗原特異的な部分集団を 濃縮し、増殖させる方法が利用可能となることがヒト・モノクローナル抗体の応 用のための主要な打開点となるだろう。

発明の開示 本発明は、因子依存性ヒトＢ細胞系統および抗原特異的部分集団を確立する方法 に向けられたものである。この方法は、所望の特異性の免疫グロブリンをもつ休 止型Ｂ細胞、または抗原特異的部分集団を単離し、そのＣＤ４０抗原を架橋する 事の出来る薬剤存在下で、Ｂｍ胞あるいは抗原特異的部分集団を培養する過程を 含む。この架橋剤はＣＤ４０特異的な、固定されたモノクローナル抗体が好まし い。より好ましいのは、このモノクローナル抗体が微小球、リポソームあるいは 細胞膜などの、固層あるいは非水層の液状物質上に固定されていることである。

もっとも好ましいのは、ＣＤ４０特異的モノクローナル抗体がＩｇＧイソタイプ のものであるときは常に、Ｂ細胞あるいは抗原特異的な部分集団を、ＦｃγＲＩ ｒとしても知られる表面分子であるＣＤｖ３２を発現する非複製哺乳動物細胞と ともに培養することによって、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が固定されること である。この場合、固定化は抗体分子のＦｃ領域をＦｃγ受容体と結合すること によって行われる。Ｂ細胞クローンまたは部分集団の長期培養には、架橋剤が常 に存在していることが必要であり、培養の増殖速度は、サイトカインであるイン ターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）　、インタ ーロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）のいず れかが、単独あるいは組み合わせて共存することによって増強される。

本発明は、形質転換がＣＤ４０架橋剤存在下で行われる、エプンユタインーパー ルウイルス（ＥＢＶ）によって形質転換されたＢ細胞系統を生産する方法も含む 。

本発明の重要な特徴は、休止状態のＢ細胞を出発材料としていることである。

これらの細胞は、活性化されたＢ細胞とは対照に、その表面結合免疫グロブリン を保持しているため、抗原特異的選択を容易にする。

図面の簡単な説明 第１Ａ図および第１Ｂ図は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体存在・非存在下およ び、ＩＬ−４存在・非存在下で、ＣＤｖ３２を発現しているＬ細胞に放射線照射 したフィーダー・レイヤー上における、Ｂ細胞の増殖に関するデータを示す。

第２図は、異なる方法で表示された、抗ＣＤ４０抗体に対する、休止Ｂ細胞の増 殖を示す。

発明の詳細な説明 本発明で用いる休止状態のＢ細胞は、さまざまな材料から、種々の方法で得られ 、たとえばディサバトら編、Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　Ｖｏｌ、 １０ｇ　（１９８４）およびジエイムズら編（前出）などがある。Ｂ細胞は末梢 血、膵臓あるいは扁桃腺から得られることが好ましい。もっとも好ましいのは、 扁桃腺から、以下の技術、すなわち、扁桃腺を単細胞懸濁液を得るために、ｐＨ ７，２のリン酸緩衝生理食塩水中で、ワイヤー・メッシュを用いることによって 解離して得ることである。単核細胞は、通常のフィコール−ハイバーク勾配法に よって分離される。精製されたＢ細胞集団を得るために、臭化２−アミノエチル イソチオウロニウム処理をしたヒツジの赤血球を用い、２回ロゼッティングを行 うことによって単核細胞がらＴｍ胞が除かれる。２５ｍ１のＲＰｊｌｌ　１６４ ０と１０％のウソ胎児血清を含むプラスチック・フラスコ中で、Ｔ細胞を除いた 単核細胞（約２．５Ｘ１０’細胞のバッチ）を３７℃で１時間培養することによ って、接着細胞（単球）は、Ｔ細胞を除いた単核細胞がら除去される。蛍光活性 化された細胞のソーティング分析によって決定されたように、この結果得られた 標品は〉９８％のＢ細胞とく１％のＴ細胞およびく１％の単球を含んでいる。休 止状態のＢ細ａは、１．０７５．１．０７０．１．０６０．１．０５５　ｇ／ｅ ｌノ密Ｋを持つ４ＢＭｔｖ溶液からなる、パーコール不連続勾配（ファルマンア 、ウプスラ、スエーデン）を用いることによって、この標品から得られる。休止 状態のＢ細胞はもっとも密度の高いパーコール溶液の下側に、ペレットとなって 回収される。

抗原特異的な休止状態のＢ細胞部分集団を更に選択するには、ふるい分け、ロゼ ッティング、免疫吸着アフィニティー・クロマトグラフィー、蛍光活性化細胞ソ ーティング（ＦＡＣ３）などを含む種々の技術によって行うことが出来る。カサ イら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３４．　ｐｇｓ、４７６−４７９　（１９ ８６）は、蛍光活性化細胞ソーティングによる末梢血からの抗原特異的Ｂ細胞の 選択について述べている。簡単に説明すると、問題の抗原はビオチン化され、Ｂ 細胞とインキュベーションし、次に蛍光標識したアビジンとインキュベーション する。ビオチン化された抗原に特異的な抗体を持つ細胞は、蛍光＊識の存在によ って分別される。ＦＡＣ３に基づくリンパ球の選択法について述べたそれ以外の 参考文献は、バークスら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　Ｖ。

１．１０＆　ｐｇｓ、１９７−２４１　（１９８４）および米国特許第４．３２ ５．７０６号明細書を含んでいる。

ふるい分け、免疫吸着アフィニティー・クロマトグラフィーおよびロゼッティン グは、タイプ、ハバードらおよびヘガートによって、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ＋ｎ ｏ１．、　Ｖｏｌ、１０＆それぞれｐｇｓ、１１８−１２４．１３９−１４７お よび３８６−３９２　（１９８４）において述べられている。

ＣＤ４０に特異的なモノクローナル抗体は、通常の方法で得られる。モノクロー ナル抗体Ｇ２８−５あるいは１ｌａｂ８９が架橋剤として用いられることが好ま しい。Ｇ２Ｂ−５はレベツターら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、１３８ ．　ｐｇｓ、７８ｇ−７９４（１９８７）および英国特許出願第８７１３６５０ 号明細書で述べられており、モノクローナル抗体Ｇ２８−５を産生ずるハイブリ ドーマ細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ ）（ロックヴイル、ＭＤ）に、寄託番号ＨＢ９１１０で寄託されている。Ｍａｂ ８９は、ヴイレら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　ｖｏｌ、１９．　ｐ ｇｓ、１４６３−１４６７　（１９８９）で述べられており、モノクローナル抗 体Ｍａｂ８９を産生ずるハイブリドーマ細胞系統は、１９８９年９月１４日にヨ ーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー、応用微生物学 および研究のためのＰＨＬＳセンター、ポートン・ダウン、セーリスベリー、ｔ ｉｌｔｓ。

ＳＦ３０ＪＧ、英国に、寄託番号８９０９１４０１で寄託されている。簡単に述 べると、Ｍａｂ８９は以下のようにして得られた。８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス に、抗工ｇＭ抗体で活性化した扁桃腺のＢ細胞５．　ＯＸ　１０’を、３週問お きに合計４回腹腔内注射した。最後の注射の３日後、膵臓細胞が回収され、ポリ エチレン・グリコール１０００　（メルク）を用いて、ＮＳＩミエローマ細胞（ 比率５：１）と融合させた。１０％熱不活性化ウシつ児血清、２ＩＩＩＭグルタ ミン、１００Ｉ［Ｊ／ｍｌペニシリンおよびｉ１００Ｉ１／ｍｌストレプトマイ シンを含む、１２２Ｍ１１６４０完全培地を入れた５ｈｌフラスコ中で３７℃、 −夜インキュベーションした後、細胞懸濁液は、ヒポキサンチンとアザセリンを 補充した培地の入った２４穴のプレートに分配された。ハイブリドーマ上清は、 ンジョイ細胞、扁桃腺単核細胞および抗ＩｇＭ抗体によって活性化されたＢ細胞 への結合能について検索された。

抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を固定するために、微小球、赤血球、表面抗ＣＤ ４０を発現している、放射線照射されたハイブリドーマなど、いくつかの異なる 基質を用いることが出来る。選択マーカーをもつベクターおよび、宿主適合性プ ロモーターならびにＦｃγ［Ｉをコードする事が出来るｃＤＮ＾挿入断片を持つ ベクターによって、宿主哺乳動物細胞をコ・トランスフェクションすることによ って、ＦＣγＲを安定に発現できる哺乳動物細胞系統が作製されることが好まし い。このような挿入断片、すなわちｐｃＤ−ｈＦｃ　７　Ｒ−１６，２を持つｃ ＤＮ＾クローンは、寄託番号６７５６５のもとにＡＴＣＣから入手することがで き、スチニワートら、Ｊ、Ｅｘｐ、　１ｌｅｄ、、Ｖｏｌ、１６６、　ｐｇＳ、 １６６ｇ−１６８４（１９８７）で述べられている。このベクターは、タカベら 、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　ＶｏｌＪ、　ｐｇｓ、４６６−４７２ 　（１９８８）ｉ：：よって述べられているように、ＳＶ４０ブＯモーターが］ １ＴＩ７（Ｉ）レトロウィルスからの、長い終結反復配列部を下流に挿入するこ とにより、発現が改善するように修飾されていることを除いて、オカヤマとバー ク、Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉａｌ、、　Ｖｏｌ２．　ｐｇｓ、１５１−１７ ０　（１９ｇ２）、およびＶｏｌ、３．ｐｇｓ、２８０−２８９　（１９８３） において述べられたｐｃＤシャトル・ベクターと類似のものである。このベクタ ーは、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、１３８．　ｐｇ、　１７９　（ １９８０）で述べられているように、大腸菌に１２株のＭＣ１０６１内で筒便に 増される。

ｐｃＤ−ｈＦｃγＲ−１６，２のための、宿主としては、チャイニーズ・ハムス ター卵巣細胞および、寄託番号ＣＣＬ１．３でアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションから入手可能な、チミジン・キナーゼ欠損突然変異（ｔｋ−）　 Ｌ細胞などの、マウスＬ細胞を含む。選択マーカーによって、完全に宿生ゲノム に挿入したＦｃγＲ遺伝子を含む可能性が高い宿主細胞を選択することができる 。典型的な態様としては、トランスフェクション溶液中のマーカーを含んだベク ターに対するｐｃＤ−ｈＦｃγＲ−１６，２の比は、約１０：１である。したが って、もしマーカー遺伝子が宿主ゲノムに挿入されれば、ｐｃＤ−ｈＦｃγＲ− １６，２もまた、その高濃度のゆえに、挿入されることは極めてありうることで ある。この選択マーカーは、目的の形質転換体の培養が、復帰型細胞の生育に負 けない手段を提供する。ｔｋ−マウスＬ細胞は、ｐｃＤ−ｈＦｃγＲ−１６，２ および、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターの調節下にあるチミジン・キナーゼ遺伝子を 持つｐＳＶ２プラスミドであるｐｓＶ２ｔｋによってコ・トランスフェクション された。ｐＳｖ２プラスミドは、ムリガンら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２０ ９．　ｐｇｓ、１４２２−１４２７　（１９８０）　；サブラマー二ら、ｊｌｏ ｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　ＶｏＬｌ、　ｐｇｓ、８５４−８６４　（１ ９８１）において説明されており、寄託番号３７１４６のもとにアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションから入手できる。どちらのプラスミドも大腸菌 、たとえば寄託番号３３６９４でＡＴＣＣから入手可能なＨＢＩＯＩ株内で増幅 され、塩化セシウム平衡遠心法によって精製される。１０％のウソ胎児血清を含 むダルベツコの修飾イーグル培地（ＤＩＩＥ）　１０ｍ１中の、約Ｉ　Ｘ　ｌ（ １，’のｔｋ−Ｌ細胞懸濁液は、）“アルコン３００３デイツシユに入れ、５〔 酸化炭素ガス、インキュベーター中で、３７℃、２０時間培養され、その後、培 地は１０％ウシ胎児血清を含む新鮮なりＭＥｌｏｍｌと交換される。この培養は 更に４時間インキュベーションされる。インキュベーション後、０．５ｍｌの溶 液Ａ　（５量Ｍ　１ｌｌｅｐｅｓ、　２８ｈｌｌ　Ｎａｃｌ、　１．５ｍＭリン 酸ナトリウム緩衝液、　、ｐＨ７，２２）、および０．５ｍｌの溶液Ｅ　（２Ｍ ＣａＣ１２、Ｉｈｇ　ｐｃＤ−ｈＦｃ７１？−１６，２，ｂａｇ　ｐｓｖ２ｔｋ ）が培養液に添加され、そしテコノ培養は５九ＣＯ，ガス中で３７℃、２４時間 インキュベーションされ、その後、細胞はＨＡＴを加えた選択培地（たとえば、 シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）上におがれる。２週間後、生存して いるコロニーは限界希釈によってサブクローニングされ、クローンはＦｃγＲの 発現についてアッセイされる。

ＩＬ〜２、比−４、ＩＬ−６あるいはＩＮＦ−７が、単独またはそれらが組み合 わされて、Ｂ細胞の培養に対し約１ｎＭの濃度で添加されることが好ましい。そ れ以外に、ＩＬ−４の濃度は、ヨコタら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、８３．　ｐｇｓ、５８９４−５８９８　（１９８６）のよ うに単位が定義されているところの、単位／ｍ’ｌで表わすことができる。そこ では、ＩＬ−４の単位は、３日間フィトヘマグルチニンで前活性化され、その後 よく洗われたＴ細胞５Ｘ：１０３／２００μｍに、トリチウム化したチミジンを 最大刺激の半分量取り込ませるために必要とされるＩＬ−４量として定義される 。Ｂ細胞培養は約１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含んでいることが好ましい。

実施例 実施例１　抗（：Ｄ４０抗体および江−４に依存したヒトＢ＠胞の長期培養５０ ｈＪの完全培地中の、２Ｘ４０Ｓの精製さりた膵臓Ｂ細胞が、ｌｐｇ／ｍｌの抗 ＣＤ４０　Ｍａｂ８９とと、もに放射線照射した２、５．Ｘ　！Ｄ’のＣＤｖ３ ２　Ｌ細胞を、含む４８大のマイクロ・プレートρウェルに、！Ｌ−４非存在下 あるいは１．ｐＯＵ／ｍｌのＩＬ−４存在下で接種された。Ｍａｂ８９単独ある いは！ａｂ８９とＩＬ−４とでインキュベー、ンヨンした培養は、第５日めに、 放射線照射した２、５Ｘ１０’のＣＤｖ３２　Ｌ細胞をまいた２つのウェルに、 はじめの刺激物質の存在あるいは非り、扛下で分、配された？　トリパン・ブル ー法を用い、た、生存しているＢ細胞の計数は、血球計数盤において行われた。

第１Ａ図は、それぞれの培養条件に対する、Ｂ細胞集団の生育率を示している。

第７．９および１３日めの一方のウェルにおいて計数された細胞数は、第５日め の培養を分配したことを考慮するために２倍される。細胞数は１０の同一のウェ ルで計数され、その変動計数は１０％以下であることが解った。第１Ａ図の曲！ Ｉｌは、Ｍａｂｇ９およびＩＬ−４非存在下での、ＣＤｖ３２　Ｌ細胞上で培養 したＢａ胞の生育を表わしている。曲ＪＩ２は、はじめに１１℃ｇ／ｍｌのＭａ ｂ８９と、次に第５日めに培養を分配し、その半分の細胞を１Ｂｇ／■ｌのＭａ ｂ８９および、放射線照射した２、５Ｘ１０’のＣＤＷ３２　Ｌ細胞とともに他 のウェルに移されたＢ細胞培養の生育を表わしている。曲線３は、はじめに１Ｂ ｇ／ｍｌのＭａｂ８９と、次に第５日めに培養を分配し、その半分の細胞を、放 射線照射した２、５Ｘ１０’のＣＤｖ３２　Ｌ細胞とともに、ｋｌａｂ８９を添 加されずに他のウェルに移された、Ｂ細胞培養の生育を表わしている。曲線４は 、はじめにｌａｇ／ｍｌのＭａｂ８９と１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４と、次に第５ 日めに培養を分配し、その半分の細胞を１Ｂｇ／ｍｌのＭａｂ８９と１００Ｕ／ ｍｌのＩＬ−４ならびに、放射線照射した２、５Ｘ１０’のＣ０ｗ３２　Ｌ細胞 とともに、他のウェルに移されたＢ細胞培養の生育を表わしている。曲線５は、 はじめに１Ｂｇ／ａ＋１のＭａｂ８９とｌ００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４と、次に第５ 日めに培養を分配し、しかし今度はＩＢｇ／ｍｌのＭａｂ８９と１００Ｕ／＋１ １のＩＬ−４を加えずに、その半分の細胞を放射線照射した２、５Ｘ１０’のＣ Ｄｖ３２Ｌ細胞とともに、他のウェルに移されたＢ細胞培養の生育を表わしてい る。ＩＬ−４存在下で、ＣＤ４０の架橋効果の増強が明らかに見られる。

別の実験において、精製された扁桃腺Ｂ細胞は、４８大のマイクロ・プレートに 入れた５０（Ｉａｌの完全培地において、放射線照射したＣ０ｗ３２　Ｌ細胞と １００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４存在の下、１０Ｓ細胞／ｍｌの濃度で培養された。細 胞は第１Ｂ図に示された時間で計数され、新たに放射線照射したＣＤｖ３２　Ｌ 細胞と、ｌａｇ／ｍｌのＭａｂ８９および１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む新鮮 な培地を入れた新しいウェルに、１０ＳのＢ細胞を毎週末に接種することによっ て、培養が再び開始された。曲線１は、除かれた培養液が置換される必要がなか った場合の理論的なり細胞集団のサイズを表わしている。曲線２から曲線５は、 はじめの培養および再び開始した培養における実質的なり細胞集団を示している 。曲線６と曲線７は、Ｂ細胞培養試料がＭａｂ８９なしで再び開始されたときの 集団のサイズの低下を示している。

実施例２　１Ｌ−６およびＩＦＮ−γによる、Ｂ細胞増殖の更に強い増強Ｂ細胞 は、円錐型のマイクロタイターで、１Ｂｇ／ｍｌのＭａｂ８９とともに、５Ｘ１ ０”の放、射−照射されたＣＤｖ３２　Ｌ細胞の上で培養された。（１μＣｉに よる１６時間のパルスを行った後、）トリチル化したチミジンの取り込みが、以 下の表に示した時点でアッセイされた。この表中のそれぞれの値＋来、３連で行 った測定の平均である。サイトカインの濃度は、２５　Ｕ／ｍｌ　ＩＬ−４＋　 ２．５　’ＩＵ／１ｌｅｌ　ＩＬ−１；　２０ＩＵ／＋ｍｌ　ＩＬ−２；　５０ １１／ｍ戟@ＩＬ− ６および１０００１Ｕ／ｍｌ　ＩＦＮ−７であった。第８日において、ＩＬ−４ とＩＦＮ−７との間に強い相乗的な増殖誘導効果が見られた。　゛トリチル化チ ミジンの取り込み（ｃｐｓ　ｘ　１０−’）添加したサイトカイン　第２日　第 ４Ｂ　第６日　□　第８日２．５ｘｌＯ’の精製されだＢ細胞は、２．５”ｘ　 ｌｐ’の放射線照射されたＣ０ｗ３２　Ｌ細胞の存在・非存在下、０．５１ｇ７ ｍｌのＭａｂ８９の存在・非存在下、および１００ＬＩ／＋ｉｌのＩＬ−４の存 在・非存在下において培養された。第８日めに上清が採取され、ＥＬＩＳＡ法に よって免疫グロブリン濃度が決定された。さまざまなイソタイプに対する結果を 表ＩＩに示！一旦 濃度（ｎｇ／ｍ］） 培養条件　１ｇＧ　ＩｇＡ　ＩｇＭ　ＩｇＥ対照　８０　２０　１２５　＜０． ２ Ｍａｂ８９　２２５　７０　３８０　−−ＩＬ−４１００＜１０　８０　＜０． ２Ｍａｂ　８９　＋ＩＬ−４１０５３０１７０＜０．２Ｌ細胞　２１０　１０　 ２９０　＜０．２Ｌ細胞＋Ｉ　ＩＬ−４６５０２００４９０＜０．２Ｌ細胞＋Ｍ ａ　ｂ　８９　１８００　４０　３２０　＜０．２ＬＨ胞＋Ｍａｂ８９＋ＩＬ− ４５８２５６５０３１２００４５８表面抗ＣＤ４０抗体を発現するハイブリドー マの生育誘導効果が試験された。６つの実験条件が試験され、また、第２図のカ ラム１から６は、次に挙げる条件に相当しており、それらはすなわち、１０５の 精製されたＢ細胞を接種したマイクロタイター・プレートからなる対照（カラム １）　、１０’の精製されたＢ細胞と１Ｂｇ／ｍｌのＭａｂ８９を接種したマイ クロタイター・プレートからなる対照（カラム２）　、１０’の放射線照射され たハイブリドーマ８９．１．４細＃８！（これは、その表面に抗体を発現するハ イブリドーマ８９由来である）を接種したマイクロタイター・プレートからなる 対照（カラム３）　、１０Ｓの精製されたＢ細胞と、１０４の放射線照射された 無関係なハイブリドーマを接種したマイクロタイター・プレートからなる対照（ カラム４）　、１０’の精製されたＢ細胞と、１０４の放射線照射されたハイブ リドーマ８９．１゜４細胞を接種したマイクロタイター・プレートからなる対照 （カラム５）、および１０５の精製されたＢ細胞と、ＣＤＷ３２でトランスフェ クションし、放射線照射された１０４のＬ細胞および１Ｂｇ／ｍｌのＭａｂ８９ を接種したマイクロタイター・プレートからなる対照（カラム６）である。それ ぞれの条件下での細胞の増殖はトリチル化されたチミジンの取り込みによってア ッセイされた。その結果は第２図に示されている。放射線照射されたハイブリド ーマ８９．１．４上に固定された抗ＣＤ４０は、休止状態のＢ細胞の増殖誘導に 関して、Ｃ０ｗ３２でトランスフェクンタンしたし細胞とほぼ間等の効果を持っ ている。

貢施例５　１１ａｂ８９による、Ｂ細胞のＥＢＶ感染の増強抗体を産生するヒト Ｂ１１ｒ！系統を確立するために重要な方法は、エブン二タイン・バール・ウィ ルス（ＥＢＦ）によってＢ細胞を感染することによるものであり、たとえば、ジ ェイムズ、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、２９．　ｐｇ、 ２５７　（１９８９）がある。

しかし、感染法は極めて非効率的であり、たとえば／ユタインら、ｃｅｌｌ、　 Ｉｓｍｕｎ。

１、、　ＶｏＬ、７９．　ｐｇ、３０９　（１９８３）を参照されたい。ＣＤ４ ０架橋剤の存在がＢ１１ｔｉ！の感染効率を上げることが発見された。感染効率 は、はじめのＢ１１胞の数と麗ａｂ８９、ＩＬ−４あるいは几−６の存在あるい は非存在の関数として測定された。培養は、１０’細胞培養に対しては４８穴（ 平底）プレートで行い（それぞれは、２．５Ｘ１０’の放射線照射されたＣ０ｗ ３２　Ｌｌｌ胞も含んでいる）　、　１００細胞と単細胞コロニーには９６穴（ 丸底）プレートにおいて行われた（それぞれは、５．１０”の放射線照射された ＣＤｗ３２Ｌ細胞も含んでいる）。因子の濃度は次のもの、すなわちｌ１ｇ／■ ｌのＩａｂ８９．１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および５００／■ｌのｒＬ−６を用 いた。表ＨＩは、連続的なＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統が、種々の開始条件および 培養条件で得られたところの、ウェルの割合を記載している。

培養条件　初期細胞数 （加えた品目）　（形質転換体を含むウェル／ウェルの総数）＋　−−−４８／ ４８　１／１９２　１／２８ｇ＋　十　−−４８／４８　２９／１９２　ｇ／２ ８８＋　＋　＋　−４８／４８　ｇ／１９２　０／２８ｇ＋　＋　−＋　４８／ ４８　１６／１９２　４／２８８ＥＢＶｇＤの増強１：ｍ、ｔ、ｌ１ａｂ８９／ Ｌｓｔｆ！系ハＥＢＶ感染を受けたＢ１１ｔ！１ｍよる抗体産生にも影響を与え る。１０’の休止状態のＢ１１Ｎ！は、放射線照射された、Ｃｔｋ３２を発現し ている２、　５　Ｘ　１０’のし細胞と、ｌａｇ／−１の１ａｂ８９およびＥＢ Ｖとともに培養された。

細胞は第８日めで計数され、免疫グロブリンレベルはＥＬＩＳＡ法で測定された 。表ＴＶはその結果を記載しており、また細胞がこれらの条件で非常に高レベル のＩｇＥを生産していることを示している。

濃度（ｎ　ｇ／ｍ　＋　） 培養条件　細＃！数 ｘｌＯ’　ＩｇＧ　ｒｇＡ　ｒｇＭ　ｒｇＥＬａｍ＋ＥＢＶ　Ｏ，４５６６７１ ０５９５９＜０．２Ｌ細胞＋Ｍａｂｇ９＋ＥＢＶ　３．７　１２４５　６３９　 １７１？　＜０．２抗Ｒｈ抗体の１要な臨床における利用は、Ｉｌｂ陽性の幼児 を出産直後に、続いて妊娠する幼児に対して危険となり得る、その女性による生 得の抗Ｒｈ抗体の発達を防ぐために、訃陰性の女性にそれらを注射することであ り、たとえば、ローズら纒、１１ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ　Ｅｄ、（＾５ｅｒｉｃａｎ　 ５ｏｃｆ■狽凵@ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ，１９８６）の中の、クルツクスト ン、Ｄｇｓ、　６０１−６０８に記載されている。抗１１ｈ免疫グロブリンの適 当な提供者を得るための費用と困難さに加え、こうした注射に常にともなう危険 性は、肝炎、エイズなどの血液を介した疾病の伝染である。この間層にかんがみ て、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで抗Ｒｈ抗体を供給する原が非常に必要とされているだろ う。

休止状態の８９２３球は、抗Ｒｈ抗体を含む血清を持つｔｈ陰性の提供者から雛 離される。抗１１ｈ表面免疫グロブリンを持つ休止状態のＢ細胞の部分集団は、 メイン（上述）により記載された技術を以下のように修飾して用いて、分離され た８９２３球を繰り返し選別することによつて単離できる。すなわち、抗Ｒｈ抗 体に待機的な抗体でコートした組織培養用の皿の代わりに、組織培養皿は抗ビオ チン抗体でコートされ、この組織培養皿に加える前に、分離された８９２３球が ビオチン化されたＲｈ抗原とともにインキュページ璽ンされる。ビオチン化され たＲｈ抗原を結合した細胞は、次にメイン（上述）が述べているように、選別す ることによって単離される。もう一つの方法として、休止状態の８９２３球は蛍 光標識したＲｈ抗原を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）　、ある いは、標準的な方法にしたがってロゼッティング、たとえばエリオツドら、１ｌ ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　Ｖｏｌ、１０８゜ｐｇｓ　４９−６４　（１９ ８４）、を行うことによって単離される。

単離された休止状態の抗１ｈＢＩｌｌ！は、次にマイクロタイター・プレートの ウェルに分配されるが（ウェル当たり約１０’　Ｂ細胞）、それぞれのウェルに はあらかじめ約１０’のＣＤｖ３２をトランスフェクノタンし、放射線を照射し たＬ細胞を接種してあり、また、それぞれのウェルには、０．５・ｇ／−１の１ Ｉａｂ８９および１０００／曽１のＩＬ−４を更に含む、０．４ｍｌの培地（１ ０％ウシ詑児血清および２嘗厘グルタミンを含むＲｐＨｌ１１６４０）が入れで ある。培養は大型のコンテナに拡張され、数週間後に抗Ｒｈ抗体について採取が 行われる。

図２ 要約 本発明は、因子依存性ヒトＢ細胞系統および抗原特異的部分集団を確立する方法 を提供する。この方法は、ＣＤ４０抗原および所望の特異性の免疫グロブリンを もつヒト休止型Ｂ細胞を単離し、そしてＣＤ４０抗原を架橋することのできる薬 剤の存在下にヒト休止型Ｂ細胞を培養する、過程からなる。

手続補正書 平成４年１１月ユ乙日畠

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ４０抗原および所望の特異性の免疫グロブリンを持つヒトの休止状態の Ｂ細胞を単離し；そして ＣＤ４０抗原を架橋することのできる薬剤の存在下にヒトの休止状態のＢ細胞を 培養する、 過程からなる、ヒトＢ細胞系統を作製する方法。
2. ２．該架橋剤が該ＣＤ４０抗原に対して特異的な、固定化されたモノクローナル 抗体である、請求の範囲第１項の方法。
3. ３．培養段階に、インターロイキン−４および／またはインターフェロン−γ存 在下での培養をさらに含む、請求の範囲第２項の方法。
4. ４．該固定化モノクローナル抗体が、非複製性の哺乳動物細胞によって発現され たＦｃγＲＩＩ受容体に結合している、請求の範囲第３項の方法。
5. ５．該モノクローナル抗体がＭａｂ８９およびＧ２８−５からなる群から選択さ れ、該非複製性の哺乳動物細胞がｐｃＤ−ｈＦｃγＲ−１６．２で安定に形質転 換されたマウスＬ細胞である、請求の範囲第４項の方法。
6. ６．ヒトＢ細胞を、エプシュタイン−バール・ウイルスおよびＣＤ４０抗原を架 橋できる薬剤の存在下で培養する段階からなる、エプシュタイン−バール・ウイ ルスで形質転換されたヒトＢ細胞の生産法。
7. ７．該薬剤が該ＣＤ４０抗原に特異的な固定化されたモノクローナル抗体である 、請求の範囲第６項の方法。
8. ８．該固定化されたモノクローナル抗体が非複製性の哺乳動物細胞によって発現 されたＦｃγＲＩＩ受容体に結合している、請求の範囲第７項の方法。
9. ９．該モノクローナル抗体がＭａｂ８９およびＧ２８−５からなる群から選択さ れ、該非複製性の哺乳動物細胞がｐｃＤ−ｈＦｃγＲ−１６．２で安定に形質転 換されたマウスＬ細胞である、請求の範囲第８項の方法。