CN111417719B

CN111417719B - B细胞培养方法

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Publication number: CN111417719B
Application number: CN201880077403.2A
Authority: CN
Inventors: S·奥夫纳; F·容
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: US20200399596A1; US11952586B2; EP3717632A1; JP2021503937A; CN111417719A; JP7166342B2; WO2019105864A1; EP3717632B1

Abstract

本文中报道了一种将沉积的单一B细胞(其可以为任何来源)与EL‑4 B5饲养细胞在合适的共培养用培养基中共培养的方法。在本文报道的方法中，EL‑4 B5细胞已经用小于40Gy、优选地9.5Gy或更小的剂量照射过。因而在小于6Gy的剂量，EL‑4 B5细胞具有更高活力并且维持培养下分裂的能力。

Description

B细胞培养方法

本文中报道了将B细胞与EL-4 B5饲养细胞共培养的方法，其中EL-4 B5细胞已经用小于10Gy的剂量照射过。

发明背景

为了获得分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，从免疫接种的实验动物获得的仅部分B细胞可以融合并增殖。B细胞的来源通常是免疫接种的实验动物的器官如脾。

在1984年Zubler等人开始开发获得分泌单克隆抗体的细胞的不同方法(参见，例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-63；J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中，将B细胞从免疫接种的实验动物的血液获得并且与鼠EL-4 B5饲养细胞在包含细胞因子的饲养混合物存在下共培养。采用这种方法，可以在共培养10-12天后获得至多50ng/ml抗体。

Weitkamp,J-H.等人(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了从采用荧光病毒样颗粒选择的抗原特异性单一B细胞中产生针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。US2006/0051348中报道了一种产生多种分离的针对多种同族抗原的抗体的方法。在WO 2008/144763和WO 2008/045140中，分别报道了针对IL-6的抗体及其用途和获得抗原特异性B细胞克隆性群体的培养方法。在US 2007/0269868中，报道了一种获得抗原特异性B细胞克隆性群体的培养方法。Masri等人(在Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报道了大肠杆菌中克隆和表达从针对炭疽毒素的单一人淋巴细胞获得的功能性Fab片段。WO 2007/031550中报道了一种制备免疫球蛋白文库的方法。通常，照射所用的饲养细胞以抑制其生长。

在WO 84/04458中，公开了对内毒素核芯有反应性的单克隆抗体。

Pike,B.L.和Nossal,G.J.V.报道了用于单一半抗原特异性B淋巴细胞的高效率克隆系统，所述系统适于分析推定性生长和分化因子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)3395)。

在EP 0 488 470中，公开了一种产生抗体的方法。在WO 90/003400中，公开了胞间黏附分子及其结合配体。Steenbakkers,P.G.A.等人报道了生成生产人抗体或鼠抗体的杂交瘤的新方法(J.Immunol.Meth.152(1992)69-77)。在WO 93/15205中，公开一种合成性流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)缀合物疫苗。

Steenbakkers,P.G.等人报道了从预先选择的抗原特异性B细胞高效产生人抗巨细胞病毒IgG单克隆抗体(Hum.Antibody.Hybridom.4(1993)166-173)。

在EP 0 856 520中，公开了一种制备单克隆抗体、药物组合物和诊断试剂的方法。在WO 02/14361中，公开了可用于治疗和检测癌症的名为83P2H3和CaTrF2E11的核酸和相应蛋白质。在WO 02/072785中，公开了可用于治疗和检测癌症的名为125P5C8的核酸和相应蛋白质。

在WO 2005/042019中，公开了触发B细胞凋亡的抗胸腺细胞抗血清及其用途。在WO2011/147903中，报道了单一B细胞培养方法。在US 7,807,415中，报道了用于产生稳定的永生化B淋巴细胞的方法。

WO 2017/167714公开了一种将沉积(deposited)的单一B细胞(其可以为任何来源)与饲养细胞在合适的共培养用培养基中共培养的方法。

发明简述

本文中报道了一种将沉积的单一B细胞(其可以为任何来源)与EL-4 B5饲养细胞在合适的共培养用培养基中共培养的方法。在本文报道的方法中，EL-4 B5细胞已经用小于10Gy、优选地6Gy或更小的剂量照射过。因而EL-4 B5细胞维持在培养中高活力的分裂能力。因此，为了防止单一B细胞及其后代因正在分裂的EL-4 B5细胞而过度生长，明智的是减少EL-4 B5细胞的细胞数目，尤其使用低照射剂量时如此。

本发明的方法作为产生治疗性抗体期间的第一步骤之一使用。

本发明的方法可以配合任何来源(例如血液或脾)的或来自任何动物(例如兔、小鼠、大鼠、羊或人转基因动物)的任何B细胞使用。如果来源是人转基因动物，则采用本发明方法鉴定并分离的B细胞产生的抗体可能直接用于临床试验。

本发明至少部分地基于以下结果：照射在共培养中待与沉积的单一B细胞共同使用的EL-4 B5饲养细胞的剂量可以降至0至9.5Gy，同时不干扰EL-4 B5饲养细胞刺激共培养的B细胞生长的目的。

本发明至少部分地基于以下结果：在与(沉积的单一)B细胞的共培养方法中，使用经0Gy至9.5Gy(即9.5Gy或更小)的较低照射剂量预处理的EL-4 B5细胞时，可以增加B细胞的IgG产生。

本发明至少部分地基于以下结果：连同其他，在与(沉积的单一)B细胞的共培养方法中，使用经约4Gy的照射剂量预处理的EL-4 B5细胞时，可以增加IgG-阳性孔的数目。

本发明至少部分地基于以下结果：在与(沉积的单一)B细胞的共培养方法中，也可以使用未照射过的EL-4 B5细胞。

本发明至少部分地基于以下结果：通过减少饲养细胞的照射剂量，共培养需要数目减少的饲养细胞。还必须产生饲养细胞自身。在照射之前，在附加培养中做到这点。通过减少每次共培养所需要的饲养细胞数目，可以从相同的饲养细胞培养物接种数目增加的共培养物。因而减少操作时间和费用。同样地，因为饲养细胞更有活力，可以减少饲养混合物的量，这也降低相关的费用。

本发明至少部分地基于以下结果：在EL-4 B5饲养细胞的照射剂量i)与共培养时所需细胞的数目、ii)与沉积的单一B细胞及所需饲养混合物的浓度，iii)与IgG阳性培养物的生产率和数目，以及iv)时间和费用之间存在相互关系。

连同其他，这导致需要的未照射过的EL-4 B5细胞数目和因而相关的物品费用减少。

如本文报道的各个方面是以下方法

i)从B细胞群体分离B细胞或B细胞克隆，其中分离的B细胞或B细胞克隆产生与靶特异性结合的抗体，

ii)共培养沉积的单一B细胞，和

iii)产生抗体。

与这些方法同步，还涵盖并公开了相应的用途。

如本文中报道的一个方面是一种共培养一个或多个B细胞的方法，所述方法包括步骤

-将一个或多个B细胞与EL-4 B5细胞共培养，

其中EL-4 B5细胞已经在共培养之前用9.5Gy或更小的剂量照射过。

在一个实施方案中，该方法包括步骤

-将一个或多个B细胞与EL-4 B5细胞组合，并且

-将一个或多个B细胞与EL-4 B5细胞共培养。

在一个实施方案中，EL-4 B5细胞的数目(在共培养伊始)小于5×10⁴/B细胞。

在一个实施方案中，用9.5Gy或更小和超过0Gy的剂量照射。

在本发明方法的一个实施方案中，EL-4 B5细胞的数目小于1×10⁴个EL-4 B5细胞/B细胞(因而在这个实施方案中，用0Gy照射)。在一个实施方案中，EL-4 B5细胞的数目小于7.5×10³个EL-4 B5细胞/B细胞。

在本发明方法的一个实施方案中，共培养额外地在饲养混合物存在下进行。

在一个实施方案中，饲养混合物(细胞因子混合物，CM)以下一者或多者

i)白介素-1β和肿瘤坏死因子α，

ii)白介素-2(IL-2)和/或白介素-10(IL-10)，

iii)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株Cowan细胞(SAC)，

iv)白介素-21(IL-21)和任选地白介素-2(IL-2)，

v)肿瘤坏死因子家族B细胞活化因子(BAFF)，

vi)白介素-6(IL-6)，

vii)白介素-4(IL-4)，和

viii)胸腺细胞培养上清液。

在一个实施方案中，饲养混合物包含

至多约2ng/ml(鼠)IL-1β，

至多约2ng/ml(鼠)TNFα，

至多约50ng/ml(鼠)IL-2，

至多约10ng/ml(鼠)IL-10，和

至多约10ng/ml(鼠)IL-6，

或其比例。

在一个实施方案中，饲养混合物包含

至多约2ng/ml连同5.5-14*10⁸IU/mg(鼠)IL-1β，

至多约2ng/ml连同2.3-2.9*10⁸U/mg(鼠)TNFα，

至多约50ng/ml连同6-7(优选地6.3)*10⁶IU/mg(鼠)IL-2，

至多约10ng/ml连同6-7.5*10⁵IU/mg(鼠)IL-10，和

至多约10ng/ml连同9.2-16.1*10⁸U/mg(鼠)IL-6，

或其比例。

因此，浓度是上限。

在一个实施方案中，饲养混合物的比例在IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中每者的1.0-至0.015倍范围内。

在一个实施方案中，饲养混合物的比例选自IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中每者的0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍和0.0038倍的比例。

在一个实施方案中，饲养混合物还包含约0.01ng/ml–1.0ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)。在一个实施方案中，饲养混合物还包含约0.01ng/ml至0.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

在一个实施方案中，用于共培养一个或多个B细胞的方法包括步骤

-将一个或多个B细胞与EL-4 B5细胞在饲养混合物存在下共培养，

其中EL-4 B5细胞已经在共培养之前用9.5Gy或更小的剂量照射过，

其中EL-4 B5细胞的数目(在共培养伊始)小于4×10⁴个EL-4 B5细胞/B细胞，

其中饲养混合物包含

至多约2ng/ml连同5.5-14*10⁸IU/mg(鼠)IL-1β，

至多约2ng/ml连同2.3-2.9*10⁸U/mg(鼠)TNFα，

至多约50ng/ml连同6-7(优选地6.3)*10⁶IU/mg(鼠)IL-2，

至多约10ng/ml连同6-7.5*10⁵IU/mg(鼠)IL-10，和

至多约10ng/ml连同9.2-16.1*10⁸U/mg(鼠)IL-6，

或IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中每者的0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍或0.0038倍的比例

并且

其中饲养混合物还包含约0.01ng/ml–1.0ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

在一个实施方案中，饲养混合物包含金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)和胸腺细胞培养上清液。

在一个实施方案中，该方法用于共培养一种B细胞。在一个优选的实施方案中，一种B细胞是沉积的单一B细胞。

在一个实施方案中，共培养持续5至10天。在一个优选的实施方案中，共培养持续约7天。

如本文中报道的一个方面是一种增加一个或多个B细胞的生产率的方法，所述方法包括步骤

其中取决于照射剂量，饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的以下浓度中每者的0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍或0.0038倍的比例

约2ng/ml连同5.5-14*10⁸IU/mg(鼠)IL-1β，

约2ng/ml连同2.3-2.9*10⁸U/mg(鼠)TNFα，

约50ng/ml连同6-7(优选地6.3)*10⁶IU/mg(鼠)IL-2，

约10ng/ml连同6-7.5*10⁵IU/mg(鼠)IL-10，和

约10ng/ml连同9.2-16.1*10⁸U/mg(鼠)IL-6，

并且其中饲养混合物还包含约0.01ng/ml–1.0ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

如本文中报道的一个方面是一种增加沉积和培养的单一B细胞的IgG阳性孔数目的方法，所述方法包括步骤

约2ng/ml连同5.5-14*10⁸IU/mg(鼠)IL-1β，

约2ng/ml连同2.3-2.9*10⁸U/mg(鼠)TNFα，

约50ng/ml连同6-7(优选地6.3)*10⁶IU/mg(鼠)IL-2，

约10ng/ml连同6-7.5*10⁵IU/mg(鼠)IL-10，和

约10ng/ml连同9.2-16.1*10⁸U/mg(鼠)IL-6，

如本文中报道的一个方面是一种产生抗体的方法，所述方法包括如本文中报道的共培养方法。

如本文报道的全部方法和用途包括步骤

-在已经补充有饲养混合物的共培养用培养基中，将(每种沉积的单一)B细胞(或其汇集物)(分别)与饲养细胞共培养。

共培养的结果是B细胞克隆，即作为单一B细胞的后代的B细胞群体。

在一个实施方案中，如本文报道的方法还包括在共培养步骤之前的以下步骤：

-将已经与一种至三种荧光标记的抗B细胞表面标志物抗体接触的B细胞群体中的那些B细胞，基于抗体并因而基于结合和/或不结合于B细胞的荧光团，沉积为单一细胞。

-将已经与二至四种各自与不同B细胞表面抗原特异性结合的抗体接触过的B细胞群体中用一种至三种荧光染料标记的那些B细胞沉积为单一细胞，因而每种抗体缀合于不同的荧光染料。

在一个实施方案中，通过使B细胞群体(依次或同时)与荧光标记的二至四种抗体接触，进行标记。因而获得标记的B细胞制品。每种荧光标记的抗体与不同的B细胞表面标志物/靶结合。

通过以下方式沉积：将标记的B细胞制备物引入流式细胞仪并且将那些已经用一种至三种荧光标记物标记的细胞沉积为单一细胞。由于可以将细胞与更多种荧光染料(如那些在细胞分选仪中用于选择细胞的荧光染料)孵育，可以针对特定表面标志物的存在和(任选地)同时选择其他表面标志物的不存在而选择细胞。

进行标记和单一细胞沉积，旨在通过耗尽那些不太可能产生具有预期特征的抗体的B细胞，降低B细胞群体的复杂度。标记的抗体与B细胞表面上展示的特定多肽结合并且因此提供正向选择标记物。同样，还可能选择与已经与B细胞孵育的标记抗体的数目相比，仅用减少数目的荧光染料标记的细胞，例如，具有两种荧光标记物中一者的细胞(即，已经进行与两种荧光标记的抗体孵育，但是仅其中一者与B细胞结合)。基于荧光标记的抗体与B细胞群体的各个B细胞结合/不结合，可以使用微流体分选装置，鉴定并分离靶B细胞。选择的同时，还可以确定标记物的量。

在一个实施方案中，如本文报道的方法包括步骤：在单一细胞沉积/沉积过程之前，在无饲养细胞/缺少饲养细胞情况下在共培养用培养基中孵育B细胞群体。在一个实施方案中，在约37℃孵育。在一个实施方案中，孵育持续约0.5至约两小时。在一个实施方案中，孵育持续约一小时。在一个优选的实施方案中，孵育在约37℃持续约一小时。

在一个实施方案中，如本文报道的方法还包括在沉积步骤后且在共培养步骤之前、但在添加EL-4 B5饲养细胞之后，离心沉积的单一B细胞的步骤。在不受这种理论约束的情况下，设想饲养细胞和B细胞之间的物理接触因而增加。在一个实施方案中，离心持续约1分钟至约30分钟。在一个实施方案中，离心持续约5分钟。在一个实施方案中，按约100x g至约1,000x g离心。在一个实施方案中，按约300x g离心。在一个优选的实施方案中，按约300x g离心约5分钟。

在一个实施方案中，选择/获得B细胞(克隆)的方法还包括以下步骤：

a)用(一种至五种)荧光染料标记B细胞群体的B细胞(任选地通过将B细胞群体与特异性结合二至五种不同的预定B细胞表面标志物的荧光标记的二至五种抗体孵育)，

b)任选地在共培养用培养基中孵育标记的细胞，

c)将B细胞群体中已经用至少一种(一种至五种)荧光染料标记(和任选地未用其他荧光染料标记)的那些B细胞作为单一细胞沉积在已经用9.5Gy或更小剂量照射过的EL-4B5饲养细胞上，

d)任选地离心沉积的单一B细胞/饲养细胞混合物，

e)在已经补充有饲养混合物的共培养用培养基中(单独)将每种沉积的单一B细胞与饲养细胞共培养，

f)选择步骤e)中发生增殖并分泌抗体的B细胞克隆。

在一个实施方案中，产生与靶特异性结合的抗体的方法还包括以下步骤

b)任选地在共培养用培养基中孵育细胞，

d)任选地离心沉积的单一B细胞/饲养细胞混合物，

f)选择步骤e)的分泌抗体的B细胞克隆，

g)i)从步骤g)中选择的B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸，

ii)如果B细胞克隆不是人B细胞克隆，则使可变结构域人源化并提供相应的编码性核酸，并且

iii)在一种或多种表达载体中按照符合编码恒定区的核酸序列的可读框方式引入一种或多种核酸，

h)培养已经用步骤g)的一种或多种表达载体转染的细胞(任选地选自CHO和BHK细胞)，从细胞或培养上清液回收抗体，并且因而产生该抗体。

在一个实施方案中，产生抗体的方法还包括以下步骤

a)用(一种至五种)荧光染料标记B细胞群体的B细胞(任选地通过将B细胞群体与二至五种荧光标记的与二至五种不同的预定B细胞表面标志物特异性结合的抗体孵育)，

b)任选地在共培养用培养基中孵育细胞，

d)任选地离心沉积的单一B细胞/饲养细胞混合物，

f)对每种上清单独确定在共培养的B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，

g)基于分泌型抗体的结合特性，选择步骤f)的B细胞克隆，

h)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序，从步骤g)中选定的B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸(并且因而获得编码单克隆抗体可变轻链和重链结构域的核酸)

i)如果B细胞是非人类B细胞，使可变轻链和重链结构域人源化并且提供编码人源化可变结构域的核酸，

i)在一种或多种用于表达(人或人源化)抗体的表达载体中(按照符合编码恒定区的核酸序列的可读框方式)引入编码单克隆抗体可变轻链和重链可变结构域的核酸，

k)向哺乳动物细胞(任选地选自CHO和BHK细胞)引入表达载体，

l)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液回收抗体并且因而产生该抗体。

在一个实施方案中，从B细胞克隆获得一种或多种编码分泌型抗体的可变结构域的核酸还包括以下步骤：

-从产生抗体的B细胞克隆提取总RNA，

-进行提取的聚腺苷酸⁺mRNA的单链cDNA合成/逆转录，

-用物种特异性引物集合进行PCR，

-任选地移除PCR引物/纯化PCR产物，

-任选地对PCR产物测序。

在一个实施方案中，在用于表达(人或人源化)抗体的表达载体中引入编码单克隆抗体可变轻链和/或重链可变结构域的核酸还包括以下步骤：

-可变轻链和重链可变结构域的T4聚合酶孵育，

-表达载体的线性化和扩增，

-扩增的表达载体的T4聚合酶孵育，

-将编码可变结构域的核酸不依赖序列和连接过程克隆入扩增的表达载体，并且

-从载体汇集物转化的大肠杆菌细胞制备载体。

在全部方面的一个实施方案中，该方法还包括紧邻标记步骤之前的以下步骤：

-将B细胞群体与固态表面上固定的(靶)抗原孵育并且(仅)回收与固定化抗原结合的B细胞。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是非人类动物B细胞群体。在一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体、或仓鼠B细胞群体、或兔B细胞群体、或人免疫球蛋白基因座转基因动物B细胞群体。在一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体或人免疫球蛋白基因座转基因兔B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，从免疫接种后至少4天的非人类动物的血液获得B细胞群体。在一个实施方案中，从免疫接种后4天直至最多13天的非人类动物的血液获得B细胞群体。

在一个实施方案中，B细胞群体是人B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从血液获得B细胞群体。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。

在全部方面的一个实施方案中，将单一细胞(单独)沉积入多孔板的各孔中。

在全部方面的一个实施方案中，饲养混合物是天然胸腺细胞培养上清液(TSN)或确定和/或合成的饲养混合物。在一个实施方案中，胸腺细胞培养上清液从幼龄动物的胸腺的胸腺细胞获得。

在全部方面的一个实施方案中，饲养混合物是确定的和/或合成的饲养混合物。在一个实施方案中，确定的和/或合成的饲养混合物包含

i)白介素-1β和肿瘤坏死因子α，和/或

ii)白介素-2(IL-2)和/或白介素-10(IL-10)，和/或

iii)金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞(SAC)，和/或

iv)白介素-21(IL-21)和任选地白介素-2(IL-2)，和/或

v)肿瘤坏死因子家族B细胞活化因子(BAFF)，和/或

vi)白介素-6(IL-6)，和/或

vii)白介素-4(IL-4)。

在一个实施方案中，饲养混合物包含IL-1β和TNF-α和选自以下的一者或多者：IL-10、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6。

在一个实施方案中，饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且饲养混合物是胸腺细胞培养上清液。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α和IL-2、IL-6与IL-10中任何两者组成。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10组成。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2或IL-6。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-21和IL-2、IL-10与IL-6中至少一者。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α和任选地BAFF、SAC、IL-21与IL-6中一者或多者。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、BAFF和任选地IL-4。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是小鼠B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α和IL-6。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体和饲养混合物由IL-1β、TNF-α和IL-2、IL-6与IL-10中任一者组成。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体并且饲养混合物包含IL-2或IL-10和IL-1β和TNF-α及任选地SAC、IL-21和BAFF中一者或多者。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10组成。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体并且饲养混合物由IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10和SAC组成。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是仓鼠B细胞群体并且饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-6、任选地SAC、IL-2和IL-10中至少一者和任选地IL-4。

在全部方面的一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在全部方面的一个实施方案中，对B细胞群体中B细胞的标记导致标记(总)B细胞群体中0.1％至2.5％的细胞。

在全部方面的一个实施方案中，标记是B细胞表面IgG。

在全部方面的一个优选的实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体孵育(标记是细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗轻链抗体孵育(标记是细胞表面IgG和细胞表面抗体轻链)并且选择对细胞表面IgG为阳性且对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(导致IgG⁺LC⁺B细胞的单一细胞沉积)。

在全部先前实施方案的一个实施方案中，额外与荧光标记的抗轻链抗体孵育(标记是除其他两种标记物之外的细胞表面抗体轻链)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(导致LC⁺B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个优选的实施方案中，与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体孵育(标记了细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉积)，从而B细胞群体已经与固定在固态表面上的(靶)抗原孵育，并且(仅)与固定化抗原结合的B细胞已经回收并且经历与荧光标记的抗体孵育。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体孵育(标记是细胞表面IgG)并且选择对细胞表面IgG阳性的细胞(导致IgG⁺B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个实施方案中，兔B细胞额外地与荧光标记的抗轻链抗体孵育(标记是除其他两种标记物之外的细胞表面抗体轻链)并且选择对细胞表面抗体轻链为阳性的细胞(导致LC⁺B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体孵育(标记是细胞表面IgG和细胞表面IgM)并且选择对细胞表面IgG为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个优选的实施方案中，B细胞群体是兔B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体、荧光标记的抗IgM抗体和荧光标记的抗轻链抗体孵育(标记是细胞表面IgG、细胞表面IgM和细胞表面轻链)并且选择对细胞表面IgG和轻链为阳性和对细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG⁺IgM^-B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个实施方案中，B细胞群体是鼠B细胞群体并且与荧光标记的抗IgG抗体孵育(标记是细胞表面IgG)并且选择对细胞表面IgG阳性的细胞(导致IgG⁺B细胞的单一细胞沉积)。

在全部方面的一个实施方案中，在这样的共培养基中共培养，所述共培养基包含补充10％(v/v)FCS、包含青霉素和链霉素的1％(w/v)200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI1640培养基。在一个实施方案中，共培养用培养基还包含0.05mMβ-巯基乙醇。

在一个实施方案中，动物是实验动物。在一个实施方案中，实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。在一个实施方案中，实验动物是兔。

附图简述

图1用0Gy–50Gy剂量照射后经历7天时间跨度所测定的EL-4B5细胞相对增殖(计算为第x天细胞总数和第0天细胞总数之比(dx/d0))。

图2在沉积的单一B细胞与20,000(20k)或50,000(50k)个分别用3Gy、4Gy、5Gy、8Gy、10Gy、或50Gy照射过的EL-4 B5细胞共培养后，以总孔数％计的rbIgG⁺孔频率(兔IgG阳性孔)。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图3在沉积的单一B细胞与20k或50k个分别用3Gy、4Gy、5Gy、8Gy、10Gy、或50Gy照射过的EL-4 B5细胞共培养后，以μg/ml计的分泌IgG的B细胞克隆(沉积的单一B细胞后代)的平均IgG浓度，即生产率。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图4在沉积的单一B细胞与不同计数的10k–50k/孔的EL-4 B5细胞(4Gy照射过)共培养后，以总孔数％计的rbIgG⁺孔频率。显示四块96孔板的带SD的平均数。

图5在沉积的单一B细胞与不同计数的10k–50k/孔的EL-4 B5细胞(4Gy照射过)共培养后，以μg/ml计的分泌IgG的B细胞克隆(沉积的单一B细胞后代)的平均IgG浓度，即生产率。显示四块96孔板的带SD的平均数。

图6在沉积的单一B细胞与不同细胞计数的1k–50k/孔未照射过的EL-4 B5细胞共培养后，以总孔数％计的rbIgG⁺孔频率。细胞计数为50k/孔的采用50Gy照射的EL-4 B5细胞的培养充当阳性对照。

图7在沉积的单一B细胞与不同细胞计数的10k–50k/孔的EL-4 B5细胞(4Gy照射过)共培养后，以μg/ml计的分泌IgG的B细胞克隆(沉积的单一B细胞后代)的平均IgG浓度，即生产率。显示四块96孔板的带SD的平均数。

图8饲养细胞的照射剂量和TSN(天然物种特异性饲养混合物)浓度与B细胞克隆产量的相互关系。

图8A：显示与4Gy或50Gy照射过的EL-4 B5细胞共培养的分泌IgG的B细胞克隆的频率(以总孔数％计的IgG⁺孔)。

图8B：显示与4Gy或50Gy照射过的EL-4 B5细胞共培养的分泌IgG的B细胞克隆的平均IgG浓度(以μg/ml计)，即生产率。

培养基分别补充有1.25vol-％、2.5vol-％或5vol-％TSN。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图9在沉积的单一B细胞与EL-4 B5细胞共培养后，饲养细胞的照射剂量和细胞因子浓度与以总孔数％计的rbIgG⁺孔频率的相互关系。

图9A：每孔用4Gy照射过的20k个EL-4 B5细胞的数据。向培养基补充细胞因子混合物(CM)的1x至0.1x(实验1，上部条形图)和0.1x至0.01x(实验2，下部条形图)浓度比例。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图9B：每孔用50Gy照射过的50k个EL-4 B5细胞的数据。向培养基补充细胞因子混合物(CM)的1x至0.1x(实验1，上部条形图)和0.1x至0.01x(实验2，下部条形图)浓度比例。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图10在沉积的单一B细胞与EL-4 B5细胞共培养后，饲养细胞的照射剂量和细胞因子浓度与rbIgG⁺孔中B细胞克隆的平均IgG浓度(即，生产率)的相互关系。

图10A：用4Gy照射过的EL-4 B5细胞(20k/孔)。向培养基补充细胞因子混合物(CM)的1x至0.1x(实验1，上部条形图)和0.1x至0.01x(实验2，下部条形图)浓度比例。显示三块96孔板的带SD的平均数。

图10B：用50Gy照射过的EL-4 B5细胞(50k/孔)。向培养基补充细胞因子混合物(CM)的1x至0.1x(实验1，上部条形图)和0.1x至0.01x(实验2，下部条形图)浓度比例。显示三块96孔板的带SD的平均数。

定义

术语“戈瑞”或简写“Gy”指常用的电离辐射剂量单位。其定义为每千克物质(本发明情况下细胞(细胞湿重))对一焦耳辐射能量的吸收。因而，可以测量吸收的剂量。该单元为纯物理性质，并且不依赖或不考虑生物参数，即“戈瑞”独立于它所给予的材料定义。为了换算美国所用的拉德单位，可以使用以下换算系数：1拉德＝0.01Gy。

“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。

术语“抗体”在本文中用来指天然存在的抗体，包括其天然存在的结构性变体。

例如，天然(人，小鼠，大鼠，兔)IgG抗体是分子量约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。天然IgG抗体由两条相同轻链和两条相同重链组成，包含链间和链内二硫键，从而全部四条链彼此共价连接。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中柔性铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。可以将抗体重链分配入五个类型之一，取决于其序列和结构域结构，所述五个类型称作IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(抗体的“类别”)。这些类别中的几种可以进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链轻链结构域(CL)。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。

例如，天然(驼类(camelid)，即来自胼足亚目(Tylopoda)骆驼属(Camelidae)，包括骆驼、单峰驼和羊驼)仅有重链的抗体(VHH抗体)不包含如常规IgG重链中存在的经典CH1结构域，并且因此，表达为与抗体的铰链区-CH2-CH3结构域直接融合的VHH结构域。来自羊驼衍生的VHH抗体的可变区序列例如与人可变结构域VH3家族中的序列相似(Schroeder等人,Int.Immunol.2(1989)41-50)。与IgG型抗体相比，大羊驼(L.llama)VHH结构域中的CDR3结构域氨基酸序列平均比包含重链和轻链的经典IgG型抗体的大部分CDR3结构域长。类似于经典IgG抗体，可以通过本领域熟知的方法确定VHH抗体中CDR的位置(参见，例如US 5,637,677)。残基11、37、44、45和47对形成链界面重要(参见，例如WO 99/42077)。

“抗体片段”指不同于完整抗体(IgG/VHH＝四条链/两条链)的分子，所述分子仅包含完整抗体的一部分并且结合与完整抗体结合的相同抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单结构域抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞，任选地CHO K1细胞(例如ATCC CCL-61或DSM ACC 110)，或CHO DG44细胞(也称作CHO-DHFR[-]，例如DSM ACC 126)，或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan,D.等人,Biochemistry 26(1987)2959-2963)，或CHO-S细胞，或超级CHO细胞(Pak,S.C.O.等人Cytotechnol.22(1996)139-146)，或BHK细胞，或NS0细胞，或Sp2/0细胞，或HEK 293细胞，或HEK 293EBNA细胞，或细胞，或COS细胞。如果这些细胞不适应于无血清培养基中或悬浮下生长，可以在本发明方法中使用之前进行适应。如本文所用，表述“细胞”包括主题细胞及其后代。因而，词“转化体”和“转染的细胞”包括原代主题细胞和从中衍生的培养物，而无论转移或继代培养次数是多少。还应当理解，全部后代可以在DNA含量方面不是精确地相同，原因在于有意或不经意突变。包括具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。

术语“克隆”指产生自/源自单一B细胞的正在分裂和分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆是同质B细胞群体并且产生单克隆抗体。

术语“抗体可变结构域的同族对”指从分泌抗体的单一B细胞(克隆)获得的抗体可变结构域对子，即，已经在哺乳动物免疫应答期间因接触于免疫原性分子而作为对子生成或已经在展示方法期间随机装配出的对子。

术语“实验动物”指非人类动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、羊驼、非人灵长类、羊、犬、牛、鸡、两栖类、鲨鱼和爬行类。在一个实施方案中，实验动物是兔。

如本文所用的术语“表达”指细胞内部出现的转录和/或翻译和分泌过程。细胞中目的核酸序列的转录水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量来确定。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过qPCR或RT-PCR或通过RNA印迹杂交定量(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。可以通过使用识别并与多肽结合的免疫球蛋白的各种方法，例如通过ELISA、通过分析多肽的生物学活性，或通过使用与这类活性无关的测定法，如蛋白质印迹法或放射免疫测定，定量核酸编码的多肽(参见Sambrook等人(1989)，上文)。

对于本领域技术人员，熟知是将氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)转换成编码这种氨基酸序列的相应核酸序列的程序和方法并且反之亦然。因此，核酸以其由独立核苷酸组成的核酸序列为特征并且同样地以其编码的多肽的氨基酸序列为特征。

抗体通常被产生它的细胞分泌入培养基。

术语“饲养混合物”指促进B细胞活化和/或存活和/或抗体分泌的不同添加物(如生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的组合。饲养混合物可以是天然饲养混合物，例如，获自胸腺细胞(TSN)的培养上清液，后者是不确定的细胞因子组合。备选地，饲养混合物可以是确定的和/或合成的饲养混合物，所述饲养混合物是重组产生的或化学合成的不同添加物(如促进B细胞活化和/或存活和/或抗体分泌的生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的确定组合。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”或“转染子”和“转化的细胞”及“转染的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与针对最初转化的细胞所筛选或选择的相同的功能或生物活性。

“人抗体”是这样的抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“个体”或“受试者”是脊椎动物。在一个实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。在其他实施方案中，个体或受试者是兔。

术语“标记”指用于确定表面标志物存在或不存在的方法，其中可以通过特异结合性结合和标记的抗表面标志物抗体与细胞结合/不结合，确定所述表面标志物。因此，例如在荧光标记物的情况下，依据荧光出现，确定表面标志物存在，而依据细胞或细胞群体与相应的特异结合性结合和标记的抗表面标志物抗体孵育后荧光不存在，确定表面标志物不存在。

如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从单一细胞克隆产生的基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

术语“PMA”指佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯，一种小分子化学化合物。其IPUAC名称是(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-4a,7b-二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基肉豆蔻酸酯。这种化合物还表示为TPA、12-O-十四碳酰佛波醇-13-乙酸酯、十四碳酰佛波醇乙酸酯、十四碳酰佛波醇乙酸酯、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、12-O-十四碳酰佛波醇13-乙酸酯、12-十四碳酰佛波醇13-乙酸酯、12-十四碳酰佛波醇13-单乙酸酯、13-O-乙酰基佛波醇12-肉豆蔻酸酯、4β-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，肉豆蔻酸，9-酯，连同1,1aα,1bβ,4,4a,7aα,7b,8,9,9a-十氢-4aβ,7bα,9β,9aα-四羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8α-四甲基-5H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-5-酮9a-乙酸酯、(+)-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、PMA、PMA(肿瘤助癌物)、十四碳酸(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-4a,7b二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基酯、十四碳酸9a-(乙酰氧基)-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-4a,7b-二羟-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]薁-9-基酯、[1aR(1aα,1bβ,4aβ,7aα,7bα,8α,9β,9aα)]-TPA和TPA(佛波醇衍生物)。

术语“特异性结合”和其语法等同物指，抗体以10^-7M或更小、在一个实施方案中10^-8M至10^-13M、在又一个实施方案中10^-9M至10^-13M的解离常数(KD)与其靶结合。该术语进一步用来显示抗体不与存在的其他生物分子特异性结合，即，它以10^-6M或更大，在一个实施方案中10^-6M至1M的解离常数(KD)与其他生物分子结合。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合其抗原的区域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如Kindt,T.J.等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库(参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

本发明实施方案的详细描述

本发明至少部分地基于以下结果：在B细胞共培养(BCC)方法中使用时，用9.5Gy或更小剂量的γ射线照射过的EL-4 B5细胞具备有利特性。

I.总体方面

免疫接种

为了产生治疗性抗体，用治疗靶(单独或与免疫原性刺激物组合)免疫接种非人类动物以激发免疫应答，或使用合成性方法，如噬菌体展示文库。如果使用转基因动物(即具有人类免疫系统)或人噬菌体展示文库，则获得人抗体。否则，获得后续将人源化的非人类动物抗体。获得潜在治疗性抗体的罕见可能性是来自从某疾病恢复的人类的血液。

经常使用非人类动物，如小鼠、兔、仓鼠和大鼠作为评价基于抗体疗法的动物模型。因此，正常情况下需要提供与非人类动物抗原以及人抗原结合的交叉反应性抗体。

在如本文报道的方法中，可以使用从任何来源(如人、小鼠、仓鼠或兔)获得的B细胞。取决于B细胞来源，调整/选择饲养细胞和饲养混合物。

在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZW)兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia突变品系兔、basilea突变品系兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除兔和其杂交种。

在一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(灰仓鼠(Cricetulusmigratorius))、中国仓鼠(黑线仓鼠(Cricetulus griseus))和叙利亚仓鼠(金黄地鼠(Mesocricetulus auratus))。在一个优选的实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。

B细胞的来源和分离

血液提供高度多样的产生抗体的B细胞。从其获得B细胞克隆分泌了显示高多样性的抗体。

在一个实施方案中，获得(例如从血液获得)来自免疫接种后4天直至免疫接种后最多13天或非人类动物最新强化免疫的B细胞。这种时间跨度允许如本文报道的方法中的高度灵活性。在这个时间跨度中，提供最有亲和性的抗体的B细胞多半从脾脏移行至血液(参见，例如Paus,D.等人,JEM 203(2006)1081–1091；Smith,K.G.S.等人,The EMBO J.16(1997)2996–3006；Wrammert,J.等人,Nature 453(2008)667-672)。

可以用本领域已知的任何方法从例如非人类动物的血液或从人血获得B细胞。例如，可以使用密度梯度离心(DGC)或红细胞溶解(溶胞作用)。与低渗性溶胞作用相比，密度梯度离心提供更高的总产率，即B细胞克隆数目。另外，从通过密度梯度离心获得的细胞中，较大数目的细胞在共培养步骤中分裂并生长。另外，与采用不同方法获得的细胞相比，分泌型抗体的浓度更高。因此，在一个实施方案中，通过密度梯度离心提供B细胞群体。备选方法可以同样地用于分离B细胞。

共培养之前的选择步骤

产生特异性结合抗原的抗体的B细胞可以富集自外周血单核细胞(PBMC)。因此，在全部方法的一个实施方案中，如本文报道的B细胞群体富集自外周血单核细胞(PBMC)。

在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，耗尽PBMC的巨噬细胞。对于共培养步骤，这有利于兔源B细胞。

可以通过贴附于细胞培养平板的表面，从PBMC耗尽巨噬细胞(参见预孵育步骤)。

与分离和任选从非人类动物的血液富集B细胞群体(在一个实施方案中，非人类动物是兔)后旋即单一细胞沉积相比，在单一细胞沉积之前于共培养用培养基中孵育B细胞群体增加了单一细胞沉积后获得的分泌抗体的细胞总数。具体而言，在约37℃于EL-4 B5培养基中孵育约一小时，例如使用细胞培养箱孵育。

在如本文中报道的方法的一个实施方案中，细胞来自蛋白质免疫接种的动物并且在标记之前耗尽其巨噬细胞。

可以通过使用淘选方法，分别减少或富集不产生结合抗原的抗体的细胞或同样地，产生与抗原结合的抗体的细胞。其中，呈递与表面接合的相应抗原，并且如若进一步处理结合的细胞，则在细胞群体中选择性富集与抗原结合的细胞，或如若进一步处理留在溶液中的细胞，则在细胞群体中减少与抗原结合的细胞。

在一个实施方案中，如本文所报道的方法包括一个在单一细胞沉积之前的选择步骤，其中基于细胞表面标志物和荧光激活的细胞分选法/设门，选择产生特异性和/或无交叉反应性抗体的B细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B细胞。为了选择来自不同非人类动物物种的B细胞，可以使用不同的细胞表面标志物。

通过标记非目标细胞群体和非特异结合性淋巴细胞，可以选择性地耗尽这些细胞。在这个耗尽步骤中，仅可以实现部分耗尽。尽管耗尽不是定量的，但它提供了成功荧光标记剩余细胞的优势，因为可以减少或甚至最大限度减少干扰性细胞的数目。使用标记过程，通过借助荧光激活的细胞分选法的成熟B细胞(记忆B细胞、亲和力成熟的浆母细胞和浆细胞)的单一细胞沉积，可以在共培养步骤获得更高数目的IgG⁺孔/细胞克隆。

可以通过使用不同的表面标志物，标记不同的细胞群体，如CD3⁺细胞(T细胞)、CD19⁺细胞(B细胞)、IgM细胞(成熟的初始B细胞)、IgG⁺细胞(成熟的B细胞)、CD38⁺细胞和CD138细胞(例如，浆母细胞)和IgG⁺CD38⁺CD27⁺细胞(前浆细胞)。

对成熟IgG⁺B细胞如记忆B细胞，浆母细胞和浆细胞的免疫荧光标记选择是可用的。为了选择或富集B细胞，将细胞单一标记或双重标记或三重标记。另外，需要这样的标记，其产生总细胞群体的约0.1％至2.5％标记的细胞。

在一个实施方案中，将B细胞沉积为单一细胞，其中通过标记群体中0.1％至2.5％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞，在另一个实施方案中，通过标记群体中0.3％至1.5％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞，在又一个实施方案中，通过标记群体中0.5％至1％的B细胞上存在的表面分子选择所述单一细胞。

标记CD27⁺CD138⁺细胞或CD3^-CD27⁺细胞导致分别标记细胞群体的约1.5％细胞。

对于PBMC群体内部的IgG⁺-B细胞，0.5％-1％细胞可以双标记为IgG⁺CD19⁺细胞、IgG⁺CD38⁺细胞和IgG⁺CD268⁺细胞。

对于PBMC群体内部的IgG^--B细胞，0.5％-1％细胞可以双标记为IgG^-CD138⁺细胞。

对于PBMC群体内部的IgG⁺-仓鼠B细胞，0.6％±0.1％细胞可以双标记为IgG⁺IgM^--仓鼠B细胞。

在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，将IgG⁺CD19⁺B细胞沉积为单一细胞，所述单一细胞来自从未免疫接种的非人类动物或人类获得的B细胞。

IgG⁺CD19⁺-鼠B细胞沉积为单一细胞导致后续共培养步骤中改善IgG⁺孔的数目。

IgG^-CD138⁺-鼠B细胞沉积为单一细胞导致产生最高B细胞克隆数和最高浓度IgG的细胞。

在一个实施方案中，该方法的条件是若细胞为兔源，则标记不涉及IgG⁺B细胞和/或CD138⁺B细胞。

表：确定小鼠、仓鼠和兔成熟B细胞的示例性免疫荧光法标记。

B细胞来源	B细胞分选，使用下述标记	全部活细胞的比例(％)
			小鼠	IgG⁺CD19⁺	0.5±0.2n＝14
小鼠	IgG⁺CD38⁺	0.8±0.5n＝9
			小鼠	IgG⁺CD138⁺	0.06±0.07n＝6
小鼠	IgG^-CD138⁺	0.6±0.5n＝6
			小鼠	IgG⁺CD27⁺	0.1±0.1n＝8
小鼠	CD27⁺CD138⁺	1.5±0.5n＝2
			小鼠	CD27⁺IgG⁺CD3^-	0.10±0.04n＝3
小鼠	CD3^-CD27⁺	1.33n＝1
			小鼠	IgG⁺CD268⁺	0.8n＝1
小鼠	CD38⁺CD3^-	12±7n＝2
			仓鼠	IgG⁺IgM^-	0.6±0.1n＝15
兔	IgG⁺	0.6±0.2，n＝5
			兔	IgG⁺IgM^-	0.4±0.2，n＝2
兔	IgG⁺CD138⁺	0.3±0.1，n＝5

在一个实施方案中，这些方法包括步骤：耗尽B细胞群体的巨噬细胞并富集B细胞群体中分泌特异性结合靶抗原的抗体的B细胞。

单一细胞沉积

如本文所报道的方法包含步骤：将B细胞群体的B细胞沉积为单一细胞。在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，通过荧光激活的细胞分选法(FACS)，沉积为单一细胞。用于FACS单一细胞沉积所要求的标记过程的表面标志物可以具有如本文概述的具体标志物组合。

一个在单一细胞沉积后和在共培养之前的附加离心步骤增加分泌抗体的细胞的数目并增加分泌型IgG的量。

在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，该方法包括步骤：共培养之前离心沉积的单一细胞。在一个优选的实施方案中，按300x g离心5分钟。

共培养

沉积的单一B细胞与饲养细胞在饲养混合物存在下共培养。在一个实施方案中，B细胞与作为饲养细胞的鼠EL-4 B5细胞共培养。

如上文概述，可以通过合适的免疫荧光标记实现共培养步骤中产率(IgG⁺孔/细胞克隆的数目以及IgG浓度)增加及另外从PBMC富集或分离成熟的IgG⁺-B细胞。

IgG⁺CD19⁺B细胞和/或IgG⁺CD38⁺-B细胞从新鲜分离的PBMC沉积为单一细胞导致可以获得最高数目的IgG⁺孔/细胞克隆。

在耗尽巨噬细胞或KLH特异性定细胞(匙孔戚血蓝蛋白)后IgG⁺CD19⁺-B细胞、IgG⁺CD38⁺-B细胞和/或IgG^-CD138⁺-B细胞沉积为单一细胞，可以获得良好结果。

在耗尽抗原特异性B细胞后IgG⁺CD19⁺-B细胞、IgG⁺CD38⁺-B细胞和/或IgG^-CD138⁺-B细胞沉积为单一细胞，可以获得改进的结果。

如上文概述基于标记而沉积为单一细胞导致最高比例的IgG⁺孔/细胞克隆并导致上清液中IgG-浓度最高的孔/细胞克隆。

对于每个富集和/或耗尽步骤后使IgG⁺CD19⁺细胞单一细胞沉积的鼠B细胞，可以获得共培养后最高数目的IgG⁺孔/细胞克隆。备选地，采用单一细胞沉积IgG^-CD138⁺细胞，可以获得上清液中IgG-浓度最佳的孔/细胞克隆。IgG^-CD138⁺细胞的单一细胞沉积可以用于来自免疫接种的非人类动物的B细胞。IgG⁺CD19⁺细胞的单一细胞沉积可以用于来自未免疫接种的非人类动物的B细胞。

IgG⁺IgM^-细胞的单一细胞沉积可以用于免疫接种的和未免疫接种的非人类动物的仓鼠B细胞。

IgG⁺-B细胞、和/或IgG⁺CD138⁺-B细胞、和/或CD138⁺-B细胞和/或IgG⁺IgM^--B细胞的单一细胞沉积可以用于兔B细胞。

用于从非人类实验动物的血液获得B细胞的免疫荧光标记也可以用于标记从非人类实验动物(如，例如，小鼠、仓鼠和兔)获得的脾和其他免疫器官的B细胞。对于小鼠B细胞，与IgG⁺CD19⁺细胞的0.4％相比，来自脾的IgG⁺-B细胞的比例是约0.8％。对于仓鼠B细胞，相应数目是1.9％和0.5％的IgG⁺IgM^-细胞。对于兔血液衍生的B细胞，耗尽巨噬细胞后找到0.2％的IgG⁺细胞。来自兔的Peyer’sche斑块显示，在耗尽巨噬细胞后，0.4％的IgG⁺细胞和脾显示0.3％的IgG⁺细胞。

采用如本文报道的方法，通过共培养约七(7)天后，即在5、6、7或8天后，特别地在7或8天后，可以获得约30ng/ml直至15μg/ml或更大的抗体浓度(平均值约500ng/ml)。采用因而所提供量的抗体，可以进行大量不同的分析旨在更详细地表征抗体，例如关于结合特异性方面。在筛选/选择过程中，在这个早期阶段改进抗体表征，有可能减少必须进行的所需的核酸分离和测序反应的数目。另外，B细胞克隆提供了允许利用简并PCR引物的编码单克隆轻链和重链可变区的mRNA的量，并避免要求高度特异的引物。另外，要求的PCR循环数目减少。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR采用轻链和重链可变结构域的简并PCR引物。

采用饲养细胞的共培养步骤可以先于并且还可以后继于众多附加步骤。

在全部方法的一个实施方案中，如本文报道的饲养混合物是胸腺细胞培养上清液。在一个具体实施方案中，胸腺细胞培养上清液从相应的幼龄非人类动物的胸腺的胸腺细胞获得。相比从成年非人类动物的血液分离的胸腺细胞，特别适合使用幼龄非人类动物的胸腺。术语“幼龄非人类动物”指性成熟发生之前的非人类动物。幼年仓鼠例如具有小于6周，尤其小于4周的年龄。幼龄小鼠例如具有小于8周，尤其小于5周的年龄。

归因于衍生自培养的胸腺细胞的上清液(胸腺细胞培养上清液–TSN)的饲养混合物源，出现可观的批次间变异。

为了克服这种变异性，可以使用由确定(合成)的组分组成的确定(和合成)的饲养混合物。

从Tucci,A.等人,J.Immunol.148(1992)2778-2784已知由IL-1β(白介素-1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-2(白介素-2)和IL-10(白介素-10)组成的确定(合成)的饲养混合物。

用于确定(合成)的饲养混合物的B细胞物种特异性添加物导致由相应B细胞克隆分泌的抗体的量增加。同时，高产性细胞含有更多mRNA，后者转而促进编码性核酸的逆转录和对其(例如用冗余性、非特异性引物集合)测序。

通过添加SAC(金黄色葡萄球菌菌株Cowan细胞，使用单一SAC批)，可以增加共培养后分泌抗体的B细胞数目和上清液中的平均IgG浓度。为了共培养时添加SAC，可以限定浓度范围，因为降低以及增加的SAC浓度减少分泌型抗体的量。

1:20000至1:150000的SAC比率提供增加数目的IgG⁺孔/细胞克隆，而1:50000至1:100000的比率显示最高数目。在一个实施方案中，通过提供稀释系列并且确定添加的SAC提供最高数目IgG阳性孔/细胞克隆的稀释度，确定向培养基添加的SAC的量。

通过向饲养混合物添加SAC，以如此方式改变B细胞共培养，从而仅沉积的单一B细胞具有生长获益，而使用PBL(例如，B细胞和内源T细胞)混合物用于共培养时，B细胞生长受抑制。

在全部方法的一个实施方案中，用于共培养鼠B细胞的如本文报道的确定(合成)的饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α和BAFF。在一个实施方案中，将BAFF按5ng/ml的浓度添加。

在全部方法的一个实施方案中，用于共培养仓鼠B细胞的如本文报道的确定(合成)的饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-6和SAC。在一个实施方案中，将IL-6按10ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，将SAC按1:75,000比率添加。

无IL-2情况下、无IL-10情况下以及无IL-2和IL-10情况下饲养细胞和鼠B细胞的共培养，导致IgG⁺孔产率增加，不过IgG浓度降低。无TNFα情况下，IgG浓度也降低。无IL-1β情况下，无IgG可以见于上清液中。

分别在无IL-2情况下或无IL-10情况下共培养仓鼠B细胞，导致具有可检出IgG浓度的IgG⁺孔。与之相反，在无IL-2和IL-10情况下的共培养中，几乎不能检测到B细胞生长。无TNF-α或IL-1β情况下，不能确定分泌IgG。

在EL-4 B5饲养细胞存在下，至少需要IL-1β和TNFα用于小鼠B细胞、仓鼠细胞和兔B细胞的共培养。对于鼠细胞共培养，可以省略IL-2和IL-10。可以在无IL-2或IL-10情况下培养仓鼠B细胞。可以在无IL-2或IL-10或IL-6情况下培养兔B细胞。

对于鼠B细胞和仓鼠B细胞，向饲养混合物添加IL-4，增加了IgG⁺孔/细胞克隆的数目以及上清液中的IgG浓度。因此，在全部方法的一个实施方案中，用于共培养鼠B细胞或仓鼠B细胞的如本文报道的饲养混合物包含IL-4。

为共培养鼠B细胞或仓鼠B细胞向饲养混合物添加IL-6，分别导致IgG⁺孔/细胞克隆的数目增加或IgG浓度增加。因此，在全部方法的一个实施方案中，用于共培养鼠B细胞或仓鼠B细胞的如本文报道的饲养混合物包含IL-6。在一个实施方案中，将IL-6按50ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，如果需要高IgG浓度，则将IL-6按10ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，在共培养选择的B细胞和EL-4 B5细胞三天后，添加IL-6。

在一个实施方案中，IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-10和IL-21是重组的鼠IL-1β、鼠TNF-α、鼠IL-2、鼠IL-10和鼠IL-21。

在一个实施方案中，将BAFF按5ng/ml的浓度添加。

在一个实施方案中，将IL-6按10ng/ml的浓度添加。

在一个实施方案中，将SAC按1:75,000比率添加。

在一个实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4 B5细胞。

添加某钾通道的抑制剂(＝PAP-1、5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素)按浓度依赖性方式增加B细胞的rbIgG分泌，同时不减少B细胞克隆的数目。通常，诱导rbIgG生产率的细胞因子可能与B细胞克隆的总数目减少相关。对PAP-1而言并非如此。

采用7.5％的TSN浓度，可以在上清液中获得最高IgG浓度。

在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，在具有带圆底的孔的聚苯乙烯多孔板中共培养。在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，孔的工作容积是50μl至250μl。在一个实施方案中，孔至少部分用非纤维状基材包覆，所述非纤维状基材从聚合物塑料树脂和两亲分子的掺合料制备，其中两亲分子包含亲水性部分和疏水性区域，其中疏水性区域锚定在基材内部并且亲水性部分暴露在基材上。在一个实施方案中，两亲分子选自烷基胺乙氧基化、聚(亚乙基亚胺)、辛基德洒明碱(octyldecamine)或其混合物(参见，例如EP 1860 181)。

表征共培养的细胞

为了共培养后(定性和定量)确定分泌型IgG，通常可以使用本领域技术人员已知的全部方法如ELISA。在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，使用ELISA。

根据表征结果，可以获得，即选择B细胞克隆。术语“克隆”指产生自/源自单一B细胞的正在分裂和分泌抗体的B细胞的群体。因此，B细胞克隆产生单克隆抗体。

mRNA分离、克隆和测序

可以从B细胞分离总mRNA并转录成cDNA。采用特异性引物，可以扩增编码VH区和VL区的同族核酸。几乎未获得相同的序列。该方法提供高度多样的与相同抗原结合的抗体。

用于扩增编码VH的核酸的引物可以用于获自细胞的cDNA，所述细胞来自NMRI-小鼠、亚美尼亚仓鼠、Balb/c-小鼠以及叙利亚仓鼠和兔。

在如本文报道的全部方法的一个实施方案中，氨基酸序列衍生自扩增的编码VH的核酸并且通过定位EVQL/QVQL至VSS(VH-区域)和DIVM/DIQM至KLEIK(VL-区域)的氨基酸序列，确定确切起止点。

本文中还报道了一种产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供(成熟)B细胞群体(从获得非人类实验动物的血液)、

b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中，用一种至三种、或二种至三种荧光染料)着染B细胞群体的细胞、

c)在独立容器中沉积染色的B细胞群体的单一细胞(在一个实施方案中，容器是多孔平板的孔)，

d)在饲养细胞和饲养混合物存在下，培养沉积的独立B细胞(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4 B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然TSN，在一个实施方案中，饲养混合物是确定(和/或合成)的饲养混合物)，

e)确定培养独立B细胞时分泌的抗体的结合特异性，

f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序，确定特异结合性抗体的可变轻链结构域和重链结构域的氨基酸序列，并且因而获得编码单克隆抗体可变轻链结构域和重链结构域的核酸，

g)在表达抗体的表达盒中引入编码单克隆抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的核酸，

h)在细胞中引入核酸，

i)培养细胞并从细胞或细胞培养上清液回收抗体并且因而产生该抗体。

在一个实施方案中，非人类动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、非人灵长类、羊、犬、牛、鸡、两栖类和爬行类。

II.本发明方法的示例性实施方案

本发明至少部分地基于以下结果：可以减少共培养一个或多个B细胞时施加的作为饲养细胞使用的EL-4 B5细胞的照射剂量。与减少照射剂量同步，必须降低EL-4 B5细胞对B细胞的比率，并且也必须调整饲养混合物的组分的浓度。连同其他，采用这种修改，可以增加一个或多个B细胞的生产率和/或可以防止通过EL-4 B5细胞的B细胞过度生长。

在现有技术中，如同全部饲养细胞那样，首先扩充用于共培养B细胞的EL-4 B5细胞，以获得需要数目的细胞并且此后用大剂量γ射线照射，以抑制后续与B细胞共培养时饲养细胞的生长。在现有技术中，通常向EL-4 B5细胞施加50Gy剂量的γ照射。照射后两天，仅约三分之一的细胞，且照射后七天，平均仅约15％的细胞有活力，即活的。

更详细地，EL-4 B5细胞已经用实施例6的方法扩充。在γ照射之前，将细胞密度调节至10x 10⁶个细胞/ml。使用的剂量是50Gy。在照射后，将细胞在EL-4 B5培养基中进一步培养。每日测定细胞数目和细胞活力(使用ViCell仪和台盼蓝染色法)。下表中展示用50Gyγ射线照射后相应天数时的平均活力(活细胞相对数目)(n＝数据点的数目)。

照射后天数	n	平均活力[％]	SD/2
				0	8	86.0	4.4
1	6	52.8	4.9
				2	6	33.6	4.9
4	7	22.8	4.2
				7	8	16.0	4.6

为了平均BCC，使用50,000个照射过的EL-4 B5细胞/孔。由于EL-4 B5扩充时最大细胞密度受限(根据现有技术，最大细胞密度是约0.5x 10⁶个细胞/ml)，生成所需数目未照射过的EL-4 B5细胞与高培养容积和高费用关联。例如，如果对三只实验动物免疫接种并放血四次，则需要约1x 10⁹个EL-4 B5细胞供全部沉积的单一B细胞的共培养。

现在已经发现，减少所用的γ射线剂量是可能的，因而可以显著减少所需的未照射过的EL-4 B5细胞的数目，因为可以将BCC中照射过的EL-4 B5细胞的数目减少三分之一或直至80％。

已经进一步发现，也可以完全省略对EL-4 B5细胞的照射。

通过减少所需的未照射过的EL-4 B5细胞的数目，一方面，不再需要昂贵的照射装置和同步安全负担，并且另一方面，γ照射在EL-4 B5细胞中引起的损伤减少。在不受这种理论约束的情况下，设想减少细胞损伤导致活力(生存力)增加，这转而允许减少与B细胞共培养时所用EL-4 B5饲养细胞的数目。这导致培养条件改进。

因此，如本文中报道的一个方面是一种共培养一个或多个B细胞的方法，所述方法包括步骤

-将一个或多个B细胞与EL-4 B5细胞共培养，

其中EL-4 B5细胞已经在共培养之前用9.5Gy或更小剂量的γ射线照射过

在一个实施方案中，用约3Gy至约7Gy范围内的剂量照射。在一个实施方案中，用约3Gy至约6Gy范围内的剂量照射。在一个实施方案中，用约3Gy至约5Gy范围内的剂量照射。在一个优选的实施方案中，用约4Gy的剂量照射。

在一个实施方案中，将一个或多个B细胞与30,000个或更少的EL-4B5细胞共培养。在一个实施方案中，与5,000至30,000个EL-4 B5细胞共培养。在一个实施方案中，与10,000至30,000个EL-4 B5细胞共培养。

在一个优选的实施方案中，将一个或多个B细胞与约10,000至约30,000个EL-4 B5细胞共培养，所述EL-4 B5细胞已经用剂量在约3Gy至约6Gy范围内的γ射线照射过。

在一个实施方案中，在TSN存在下共培养。在一个实施方案中，在直至5vol-％TSN存在下共培养。在一个实施方案中，在约1.25vol-％至约3.75vol-％TSN存在下共培养。在一个优选的实施方案中，在约2.5vol-％TSN存在下共培养。

在一个实施方案中，在饲养混合物(细胞因子混合物，CM)存在下共培养。

在一个实施方案中，饲养混合物包含

(至多)约2ng/ml(鼠)IL-1β，

(至多)约2ng/ml(鼠)TNFα，

(至多)约50ng/ml(鼠)IL-2，

(至多)约10ng/ml(鼠)IL-10，和

(至多)约10ng/ml(鼠)IL-6，

或其比例。

在一个实施方案中，饲养混合物包含

(至多)约2ng/ml连同5.5-14*10⁸IU/mg(鼠)IL-1β，

(至多)约2ng/ml连同2.3-2.9*10⁸U/mg(鼠)TNFα，

(至多)约50ng/ml连同6-7(优选地6.3)*10⁶IU/mg(鼠)IL-2，

(至多)约10ng/ml连同6-7.5*10⁵IU/mg(鼠)IL-10，和

(至多)约10ng/ml连同9.2-16.1*10⁸U/mg(鼠)IL-6，

或其比例。

在一个实施方案中，饲养混合物的比例选自由0.75、0.5、0.32、0.25、0.1、0.066、0.032、0.015、0.01、0.0075、0.0038组成的比例。在一个实施方案中，饲养混合物的比例在1.0至0.015范围内。在一个优选的实施方案中，饲养混合物的比例在0.1至0.015范围内。

在一个实施方案中，在约0.3ng/ml–3ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯存在下共培养。

在一个实施方案中，饲养混合物还包含约0.01ng/ml–1.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。在一个实施方案中，饲养混合物还包含约0.125ng/ml–1ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。在一个优选的实施方案中，饲养混合物还包含约0.25ng/ml–0.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

在一个实施方案中，饲养混合物的比例在0.1至0.015范围内并且饲养混合物还包含约0.01ng/ml–1.0ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。在一个优选的实施方案中，饲养混合物的比例是约0.03并且饲养混合物还包含约0.25ng/ml-0.5ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

在一个优选的实施方案中，将一个或多个B细胞与约10,000至约30,000个EL-4 B5细胞共培养，所述EL-4 B5细胞已经用剂量在约3Gy至约6Gy(优选地约4Gy)范围内的γ射线照射过，其中饲养混合物包含约0.06ng/ml(鼠)IL-1β、约0.06ng/ml(鼠)TNFα、约1.5ng/ml(鼠)IL-2、约0.3ng/ml(鼠)IL-10、约0.3ng/ml(鼠)IL-6和约0.25ng/ml–0.5ng/ml PMA。

在一个优选的实施方案中，将一个或多个B细胞与约2,500至约7,500个EL-4 B5细胞(优选地约5,000)共培养，所述EL-4 B5细胞已经用剂量在0Gy至小于3Gy范围内的γ射线照射过，其中饲养混合物比例是0.03至0.1(饲养混合物包含约0.06ng/ml至约0.2ng/ml(鼠)IL-1β、约0.06ng/ml至约0.2ng/ml(鼠)TNFα、约1.5ng/ml至约5ng/ml(鼠)IL-2、约0.3ng/ml至约1ng/ml(鼠)IL-10、约0.3ng/ml至约1ng/ml(鼠)IL-6和约0.43ng/ml–0.73ng/ml PMA(优选地0.73ng/ml))。

对于每个照射剂量，可以确定相应的饲养细胞数目、饲养混合物比例以及PMA浓度。

更详细地，EL-4 B5细胞已经用根据实施例6的方法扩充。此后，其等分试样已经经受采用0.5至50Gy的不同照射剂量的单次γ照射。另外，已经纳入未照射过的EL-4 B5细胞。全部样品均在EL-4 B5培养基中独立地培养额外7天。已经(使用ViCell仪和台盼蓝染色法)基于每日测定活力(生存力)以及绝对细胞数目。下表中显示结果(n.d.＝未测定；除3Gy、5Gy和50Gy外，全部均已经在相同实验中测定)。

生存力/活力[％]：

细胞总数[n*10⁵]：0Gy、0.5Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy(实验1)；3Gy、5Gy、50Gy(实验2)：

作为第x天细胞总数和第0天细胞总数之比(dx/d0)计算的相对增殖：

图1中显示相对增殖过程。

已经在沉积的单一B细胞(耗尽巨噬细胞)的B细胞共培养(BCC)中使用已用3Gy、4Gy、5Gy、8Gy和10Gy剂量照射的EL-4 B5细胞，所述B细胞根据实施例8从未免疫接种的野生型兔获得。每个沉积的单一B细胞所用的EL-4 B5细胞数目分别是50,000个和20,000个。下表中及图2和图3中显示平均结果(取自三块96孔板)。已经使用实施例9测定法测定上清液中的IgG。

平均值：

标准差(SD/2)：

从数据中可以见到，照射剂量较低时，与标准值50,000个EL-4 B5细胞/沉积的单一B细胞相比，必须减少EL-4 B5细胞的数目，以实现改进的生长速率和生产率。

已经在沉积的单一B细胞(耗尽巨噬细胞)的B细胞共培养(BCC)中使用已用4Gy剂量照射的EL-4 B5细胞，所述B细胞根据实施例8从未免疫接种的野生型兔获得。EL-4 B5细胞的所用数目/沉积的单一B细胞分别在10,000个和50,000个之间。下表中及图4和图5中显示平均结果(取自四块96孔板；平板的值平均数，其是平板上诸孔的平均值)。已经使用实施例9测定法测定上清液中的IgG。

平均值：

可以见到在该范围内，可以获得至多22,500个EL-4 B5个细胞/孔和B细胞可比性值，其中就生长速率而言，优选11,300个至22,500个的范围。就IgG生产而言，优选13,700个至22,500个的范围。

也已经用未照射的EL-4 B5细胞做过这个实验。下表中和图6显示结果。对于参比，显示采用50,000个用50Gy照射过的EL-4 B5细胞的示例。

平均值：

可以见到，对于未照射过的EL-4 B5细胞，必须减少每孔和每个沉积的单一B细胞的EL-4 B5细胞数至约10,000个细胞或更小。

在下一个实验中，根据实施例2和3从已经根据实施例1用人VEGF免疫接种的野生型兔获得的B细胞用于BCC中。B细胞已经根据实施例4用与生物素缀合作为捕获试剂的生物素酰化人VEGF预处理。已经在根据实施例8沉积的单一B细胞的B细胞共培养(BCC)中使用已用4Gy剂量照射的EL-4 B5细胞。每个沉积的单一B细胞使用的EL-4 B5细胞的数目分别在12,500个和30,000个之间。下表中显示平均结果(取自三块96孔板)。已经使用实施例9测定法测定上清液中的IgG。对于参比，显示采用50,000个用50Gy照射过的EL-4 B5细胞的示例。

平均值：

该实验已经用根据实施例2和3从已经根据实施例1用人血清白蛋白(HSA)免疫接种的野生型兔获得的B细胞重复，B细胞用于BCC。B细胞已经根据实施例4预处理。已经在根据实施例8沉积的单一B细胞的B细胞共培养(BCC)中使用已用4Gy剂量照射的EL-4 B5细胞。EL-4 B5细胞的所用数目/沉积的单一B细胞分别在5,000个和50,000个之间。下表和图7中显示平均结果(取自四块96孔板的孔)(生产率数据)。已经使用实施例9测定法测定上清液中的IgG。

平均值：

在接下来的实验中，已经检查饲养混合物的影响。

首先已经使用天然饲养混合物TSN。在这个实验中，分别用4Gy和50Gy剂量照射的EL-4 B5细胞已经与根据实施例8从未免疫接种的野生型兔获得的沉积的单一B细胞共培养。下表以及图8中显示结果。

可以见到，对于用减少的剂量4Gy照射过的EL-4 B5细胞，所需的TSN量可以从5％减少到1.25％至2.5％，并且仍可以获得与用剂量50Gy照射过的EL-4 B5细胞和5％TSN相同的IgG阳性孔频率以及相同的生产率/孔。因此，可以将所需量的昂贵TSN至少减少50％。

已经用未照射的EL-4 B5细胞做过相同实验。下表中显示结果(总孔数＝84)。

还已经测试确定(合成)的细胞因子混合物(CM)作为饲养混合物的影响。在这个实验中，分别用4Gy和50Gy剂量照射的EL-4 B5细胞已经与根据实施例8从未免疫接种的野生型兔获得的沉积的单一B细胞(耗尽巨噬细胞)共培养。总计，已经分析来自三块96孔平板的孔。下表以及图9和图10中显示结果。

/>

从数据中，可以见到，4Gy照射的EL-4 B5饲养细胞提供比50Gy照射的EL-4 B5细胞更高的生长速率。就单孔生产率而言，可以见到，50Gy照射的EL-4 B5细胞需要更高浓度的细胞因子混合物(1xCM时生产率最高)。用4Gy剂量照射的EL-4 B5细胞在约0.03xCM(即在降低30倍的浓度)显示最高生产率。

在接下来的实验中，已经检查PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯)的影响。

已经测试了与未免疫接种动物的沉积的单一细胞组合的不同PMA浓度。下表中显示结果。

可以见到，对于50Gy照射的EL-4 B5细胞，可以看到添加PMA的浓度依赖性影响。相反，对于4Gy照射的EL-4 B5细胞，未见这种影响。因此，在0.015ng/ml至1.3ng/ml的浓度范围内，PMA浓度不影响IgG阳性孔频率或生产率

用三只免疫接种HSA的兔重复该实验。下表中展示相应的结果。

/>

IgG⁺频率[总孔％]

全部IgG⁺孔的平均IgG生产率[μg/ml]

HSA(修正绝对值)频率/平板OD>c[总数％]

HSA(修正绝对值)频率/平板OD>c和

rbIgG⁺[％IgG]

可以见到，当使用0至8Gy照射的EL-4 B5细胞时，采用以下参数：IgG阳性孔频率、生产率和产生抗原特异性IgG的孔的频率时，对于0.03的CM比例而言，有利的PMA浓度范围在0.1ng/ml至0.5ng/ml PMA之间，优选地在0.25ng/ml至0.5ng/ml范围内。

下表显示用每孔每个沉积的单一B细胞的5,000个未照射过的EL-4B5细胞所获得的结果。

每块平板的rbIgG阳性孔频率[总数％]

每块平板的rbIgG阳性孔平均生产率[总数％]

提供以下实施例以辅助理解本发明，所附权利要求书中阐述本发明的真实范围。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。

实施例

材料和方法

重组DNA技术

如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。

细胞因子

Zubler混合物：2ng/ml小鼠IL-1β，50ng/ml小鼠IL-2，10ng/ml小鼠IL-10和2ng/ml小鼠TNFα(终浓度)

细胞因子：

兔B细胞培养基

兔B细胞培养基添加物

抗体的表型分型/分选

山羊抗兔IgG Fc抗体 AbDSerotec STAR121F

驴抗山羊IgG抗体Alexa 488 Molecular Probes A11055

实施例1

动物护理和免疫接种

从Charles River Laboratories International,Inc.获得的NZW兔用于免疫接种。根据附录A“动物膳宿和护理指南”在AAALACi认证的动物设施中圈养动物。全部动物免疫接种方案和实验均由上巴伐利亚政府批准(许可编号55.2-1-54-2532-90-14)并且根据德国动物福利法和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。

用重组人血清白蛋白(HSA；CAS RN 70024-90-7；Sigma)或重组VEGF-KLH蛋白免疫接种12-16周龄NZW兔。

在第0天，通过皮内施用，将一组兔用弗氏完全佐剂乳化的400μgHSA免疫接种，随后通过交替肌内注射和皮下注射，在第1、2、6、10和23周，用弗氏完全或不完全佐剂乳化的200μg HSA免疫接种。

对于用弗氏完全佐剂乳化的VEGF-KLH 400μg抗原免疫接种，在第0天通过皮内施用进行免疫接种，随后通过交替肌内注射和皮下注射，在第1、2、7和10周，用弗氏完全佐剂乳化的200μg VEGF-KLH免疫接种。

在免疫接种后第4、5和6天取得血液(估计总血容量的10％)，从第3次免疫接种起往后开始。制备血清用于ELISA测定免疫原特异性IgG滴度。

实施例2

取出血液(免疫接种的和未免疫接种的兔)

通常，通过穿刺耳静脉或(为了较大体积)穿刺耳动脉从兔获得血液。在第三、第四、第五和第六次免疫接种后4-6天，从免疫接种的兔采集含有EDTA的全血(16ml)并且用于FACS单细胞分选。

实施例3

分离外周血单核细胞(PBMCs)

采用根据生产商的说明书A(/>Cedarlane)通过密度梯度进行外周血单核细胞(PBMCs)的分离。

将抽取的血液用磷酸盐缓冲盐水(PBS)1:2稀释。在离心管中，将推荐体积的密度分离介质小心地覆盖以稀释的血液。将小瓶按800x g离心20分钟，无制动。从白色中间层获得淋巴细胞。将取出的细胞用PBS洗涤两次并且按800x g离心10分钟。

无菌6孔平板(细胞培养级)用来通过非特异性贴附耗尽巨噬细胞和单核细胞。各孔未包被或用KLH(匙孔戚血蓝蛋白)或用链霉亲和素包被。每个孔用1ml至(最多)2ml培养基和来自免疫接种兔的至多6x 10⁶个外周血单核细胞填充并且允许在37℃在培养箱中结合60至90分钟。此后，转移含有淋巴细胞的上清液至离心小瓶并按800x g离心10分钟。将沉淀物重悬于介质中。

实施例4

富集抗原特异性B细胞

用包被缓冲液稀释抗原至终浓度2μg/ml。将4ml这种溶液添加至6孔多孔平板的各孔并在室温孵育过夜。在使用之前，移除上清液并且将孔用PBS洗涤三次。每个孔用1ml至(最多)2ml培养基和至多6x 10⁶个外周血淋巴细胞填充。将平板在37℃孵育60分钟。弃去上清液。通过用1xPBS小心洗涤各孔1-4次，移除未贴壁的细胞。为了回收黏附的抗原特异性B细胞，将1ml胰蛋白酶/EDTA溶液添加至多孔平板的各孔并在37℃孵育5至10分钟。通过添加培养基终止孵育并且将上清液转移至离心小瓶。将孔用介质洗涤两次并将上清液与其他上清液合并。通过按800x g离心10分钟，使细胞沉淀。将细胞保留在冰上直至免疫荧光染色。将沉淀物任选地重悬于PBS中。

实施例5

产生胸腺细胞上清液(TSN)

方法1：

T细胞培养

从4-5周龄兔的胸腺分离T细胞。将细胞离心并且立即按3x10⁷个细胞等分培养或冷冻。在175cm²培养瓶中，以5x10⁵个细胞/ml EL-4 B5培养基的最小细胞密度接种胸腺细胞并且在37℃孵育48小时。

巨噬细胞培养

源自兔的血单核细胞在175cm²培养瓶的EL-4 B5培养基中按至少1x 10⁵个细胞/ml的细胞密度在37℃培养1.5小时。此后，移除培养基，并且通过用温暖的EL-4 B5培养基洗涤，从贴壁的巨噬细胞移除未贴壁的细胞，随后在35ml培养基中培养48小时。

共培养T细胞和巨噬细胞

在独立的培养瓶中培养T细胞和巨噬细胞48小时。在合并两个细胞群体之前，将T细胞按800x g离心10分钟。抛弃上清液并使细胞沉淀物重悬于10ml培养基中。将T细胞调节至最小细胞密度5x 10⁵个细胞/ml并且每ml培养基添加10ng佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)和5μg或50μg植物血凝素M(PHA-M)。从巨噬细胞移除培养基并且含有巨噬细胞的培养瓶添加T细胞悬液。在共培养36小时后，取出培养基并称作TSN溶液。为了移除剩余细胞，通过0.22μm滤器过滤TSN溶液。将TSN溶液按4ml等分试样冷冻在-80℃。

方法2：

T细胞培养

分别从3-4周龄小鼠和仓鼠的胸腺或4-5周龄兔的胸腺分离T细胞。将细胞离心并且立即按4-5x 10⁷个细胞等分培养或冷冻。在175cm²培养瓶中，以5x 10⁵个细胞/ml EL-4B5培养基的最小细胞密度接种胸腺细胞并且在37℃孵育长达48小时(40-48小时，取决于TSN产生方法，将使用巨噬细胞；参见实施例9和实施例10)。

巨噬细胞培养

分别从年龄至少三个月的小鼠和仓鼠的腹膜腔分离巨噬细胞。将源自小鼠或仓鼠的腹膜巨噬细胞或源自兔的血单核细胞在175cm²培养瓶的EL-4 B5培养基中按至少1x 10⁵个细胞/ml的细胞密度在37℃培养1.5小时。此后，移除培养基，并且通过用温暖的EL-4 B5培养基洗涤，从贴壁的巨噬细胞移除未贴壁的细胞，随后在35ml培养基中培养约48小时。

共培养T细胞和巨噬细胞

在独立的培养瓶中培养T细胞和巨噬细胞。在合并两个细胞群体之前，将T细胞按800x g离心10分钟。抛弃上清液并使细胞沉淀物重悬于10ml EL-4 B5培养基中。最终的培养基含有调节至细胞密度5x 10⁵个细胞/ml的T细胞、10ng佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)/ml培养基和5μg植物血凝素M(PHA-M)/ml培养基(＝T细胞悬液)。此后，从巨噬细胞移除培养基(＝耗尽培养基的巨噬细胞)。将某个量/体积的T细胞悬液添加至含有培养基耗尽的巨噬细胞的培养瓶，以获得从1.25-2x 10⁶个巨噬细胞/ml起的最终但确定的巨噬细胞细胞密度。在共培养30-46小时后，取出培养基并称作TSN溶液。为了移除剩余细胞，通过0.22μm滤器过滤TSN溶液。将TSN溶液按等分试样(4.2ml)冷冻在-80℃。

实施例6

培养EL-4 B5细胞

使冷冻的EL-4 B5细胞在水浴槽中在37℃快速解冻并且用10ml EL-4 B5培养基稀释。按300x g离心10分钟后，丢弃上清液并且将沉淀物重悬于1ml培养基中。

将EL-4 B5细胞按8x 10个细胞/ml的细胞密度接种在T175培养瓶中。每两天测定细胞密度并且调节至8x 10⁴个细胞/ml。细胞具有大约18小时的翻倍时间。

在抵达足够量的细胞和密度在0.5和1-2x 10⁶个细胞/ml之间后，收获细胞并用单剂来自¹³⁷Cs源的外部辐射照射。

照射后两天，仅约三分之一的细胞，且照射后七天，平均仅约15％的细胞有活力，即活的。

更详细地，EL-4 B5细胞已经用如本实施例中所述方法扩充。在γ照射之前，将细胞密度调节至10x 10⁶个细胞/ml。使用的剂量是50Gy。在照射后，将细胞在EL-4 B5培养基中进一步培养。每日测定细胞数目和细胞活力(使用ViCell仪和台盼蓝染色法)。下表中展示用50Gyγ射线照射后相应天数时的平均活力(活细胞相对数目)(n＝数据点的数目)。

实施例7

免疫荧光染色和单一细胞沉积

方案1：

取决于待染色细胞的数目，分别在100μl培养基(少于10⁶个细胞)或200μl培养基(多于10⁶个细胞)中提供细胞。分别用5％实验动物的血清和FACS缓冲液稀释荧光标记的抗体至终体积100μl或200μl。将反应混合物在辊架上于4℃黑暗下孵育40分钟。在孵育后，将细胞按300x g持续5分钟洗涤2次。将沉淀物重悬于400μl PBS并经70μm筛过滤。将过滤的溶液转移至FACS小瓶并且紧邻FACS实验之前，通过添加碘化丙啶(6.25μg/ml)着染死细胞。如果标记的抗体用生物素标记，则在第二步骤用链霉亲和素标记的Alexa Flour(R)647(抗体197)检测抗体。

方案2：

用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F,杜塞尔多夫，德国)。

为了表面染色，将细胞在4℃于黑暗中与最佳稀释的抗兔IgG FITC抗体FACS缓冲液中孵育30分钟，伴以转动。离心后，通过抽吸移除上清液。对PBMC进行二轮离心并且用冰冷的PBS洗涤。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并立即地进行FACS分析。在FACS分析之前添加浓度5μg/ml的碘化丙啶(BD Pharmingen，圣迭戈，CA，USA)以区分死细胞和活细胞。在其他实验中，染色的细胞由FACS单一沉积。

配备计算机和FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences,USA)用来归集和分析数据。

免疫荧光染色用FACS缓冲液包含1X PBS和0.1％BSA。

实施例8

共培养B细胞和EL-4 B5细胞

在培养箱中37℃于5％CO₂气氛下，将分选的单一B细胞在含200μl/孔EL-4 B5培养基的96孔板中与Pansorbin细胞(SAC)(Calbiochem(Merck)，达姆施塔特，德国)、EL-4 B5细胞(0-5×10⁴/孔)和兔胸腺细胞上清液或细胞因子混合物分别培养7天。取出B细胞培养上清液供筛查并且将细胞立即收获以克隆可变区基因或在100μl RLT缓冲液(Qiagen，希尔登，德国)中冷冻于-80℃。

实施例9

IgG定量

将0.5μg/ml生物素酰化小鼠抗兔IgG抗体(Sigma-Aldrich)和0.35μg/ml抗兔IgGHRP缀合物(Sigma-Aldrich)的混合物转移至链霉亲和素包被的384孔微量滴定板(MicroCoat Biotechnologie GmbH)。添加在补充0.5％BSA和0.05％的PBS中的B细胞上清液稀释物并且在室温孵育90分钟。用PBST(含0.2％/>的磷酸盐缓冲盐水)缓冲液反复洗涤(6x)后，将平板用BM/>HRP底物溶液显色并且依据370nm处的吸光度测量颜色形成。使用商业兔IgG(Sigma-Aldrich)作为校正标准品。

实施例10

抗原结合免疫测定法

该测定法在室温(RT)在含PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液的384孔MaxiSorp微量滴定板(Thermo Scientific)上进行，所述缓冲液补充有0.5％明胶和0.025％将平板用0.5μg/ml人血清白蛋白(HSA,Sigma-Aldrich)包被至少2小时到过夜。用PBST(含0.1％/>的PBS)缓冲液洗涤(3x)后，将各孔用含0.5％明胶和0.1％的PBS封闭。再次，将平板洗涤三次并且此后添加B细胞上清液稀释物。在育60分钟温和3个PBST洗涤步骤后，将HRP缀合的抗兔IgG抗体(Amersham)的1:4,000稀释物转移至各孔并孵育60分钟。最后，用PBST反复洗涤平板(6x)并用BM/>HRP底物溶液显色30分钟。在392-405nm测量吸光度。/>

Claims

1.用于培养一个或多个B细胞的方法，包括步骤

-将一个或多个B细胞与EL-4B5细胞共培养，

其中EL-4B5细胞已经在共培养之前用9.5Gy或更小的剂量照射过，并且

其中EL-4B5细胞的数目在共培养伊始小于5×10⁴/B细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中共培养额外地在饲养混合物存在下进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中饲养混合物包含以下一者或多者

i)白介素-1β和肿瘤坏死因子α，

ii)白介素-2和/或白介素-10，

iii)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株Cowan细胞，

iv)白介素-21和任选地白介素-2，

v)肿瘤坏死因子家族B细胞活化因子，

vi)白介素-6，

vii)白介素-4，和

viii)胸腺细胞培养上清液。

4.根据权利要求2至3中任一项所述的方法，其中饲养混合物包含2ng/ml鼠IL-1β，

2ng/ml鼠TNFα，

50ng/ml鼠IL-2，

10ng/ml鼠IL-10，和

10ng/ml鼠IL-6，

或其比例。

5.根据权利要求4所述的方法，其中饲养混合物的比例在IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的所述浓度中每者的1.0-至0.015倍范围内。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中饲养混合物还包含0.125ng/ml–1ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中方法用于培养沉积的单一B细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中共培养持续5至10天。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将一个或多个B细胞与10,000至30,000个EL-4B5细胞共培养，所述EL-4B5细胞已经用剂量在3Gy至6Gy范围内的γ射线照射过。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将一个或多个B细胞与10,000至30,000个EL-4B5细胞共培养，所述EL-4B5细胞已经用剂量在3Gy至6Gy范围内的γ射线照射过，其中饲养混合物包含0.06ng/ml IL-1β、0.06ng/ml TNFα、1.5ng/ml IL-2、0.3ng/ml IL-10、0.3ng/ml IL-6和0.25ng/ml–0.5ng/ml PMA。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将一个或多个B细胞与2,500至7,500个EL-4B5细胞共培养，所述EL-4B5细胞已经用剂量在0Gy至小于3Gy范围内的γ射线照射过。

12.根据权利要求1至8和11中任一项所述的方法，其中将一个或多个B细胞与2,500至7,500个EL-4B5细胞共培养，所述EL-4B5细胞已经用剂量在0Gy至小于3Gy范围内的γ射线照射过，其中饲养混合物包含0.06ng/ml至0.2ng/ml IL-1β、0.06ng/ml至0.2ng/ml TNFα、1.5ng/ml至5ng/ml IL-2、0.3ng/ml至1ng/ml IL-10、0.3ng/ml至1ng/ml IL-6和0.43ng/ml–0.73ng/ml PMA。