JP2021503937A - B細胞培養法 - Google Patents
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Abstract
Description
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るためには、KoehlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、免疫化実験動物から採取されたB細胞のごく一部のみが融合および増殖され得るにすぎない。B細胞の供給源は一般的に、免疫化実験動物の脾臓などの臓器である。
(i) 単離されたB細胞またはB細胞クローンが、標的に特異的に結合する抗体を産生する、B細胞の集団からのB細胞またはB細胞クローンの単離、
(ii) 単一の置かれたB細胞の共培養、および
(iii) 抗体の生成
のための方法である。
‐ 1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、
EL-4 B5細胞が、共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されている、方法である。
‐ 1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と混合する段階、および
‐ 1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む。
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む。
約2 ng/mlまでの(マウス)IL-1β、
約2 ng/mlまでの(マウス)TNFα、
約50 ng/mlまでの(マウス)IL-2、
約10 ng/mlまでの(マウス)IL-10、および
約10 ng/mlまでの(マウス)IL-6、
またはそれらの一部分を含む。
5.5〜14*108 IU/mgを有する約2 ng/mlまでの(マウス)IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約2 ng/mlまでの(マウス)TNFα、
6〜7(好ましくは6.3)*106 IU/mgを有する約50 ng/mlまでの(マウス)IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約10 ng/mlまでの(マウス)IL-10、および
9.2〜16.1 *108 U/mgを有する約10 ng/mlまでの(マウス)IL-6、
またはそれらの一部分を含む。
- フィーダー混合物の存在下で1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含み、ここで、
EL-4 B5細胞は、共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されており、
EL-4 B5細胞の数(共培養する段階の開始時)は、B細胞1個当たりEL-4 B5細胞4×104個未満であり、
フィーダー混合物フィーダー混合物は、
5.5〜14*108 IU/mgを有する約2 ng/mlまでの(マウス)IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約2 ng/mlまでの(マウス)TNFα、
6〜7(好ましくは6.3)*106 IU/mgを有する約50 ng/mlまでの(マウス)IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約10 ng/mlまでの(マウス)IL-10、および
9.2〜16.1 *108 U/mgを有する約10 ng/mlまでの(マウス)IL-6、
またはIL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の該濃度の各々の0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍、もしくは0.0038倍の割合
を含み、
かつ
フィーダー混合物は、約0.01 ng/ml〜1.0 ng/mlのホルボールミリステートアセテートをさらに含む。
- フィーダー混合物の存在下で1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む、1個または複数個のB細胞の生産性を高めるための方法であり、ここで、
EL-4 B5細胞は、共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されており、
EL-4 B5細胞の数(共培養する段階の開始時)は、B細胞1個当たりEL-4 B5細胞4×104個未満であり、
フィーダー混合物フィーダー混合物は、照射線量に応じて、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の以下の濃度:
5.5〜14*108 IU/mgを有する約2 ng/mlの(マウス)IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約2 ng/mlの(マウス)TNFα、
6〜7(好ましくは6.3)*106 IU/mgを有する約50 ng/mlの(マウス)IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約10 ng/mlの(マウス)IL-10、および
9.2〜16.1 *108 U/mgを有する約10 ng/mlの(マウス)IL-6、
の各々の0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍、または0.0038倍の割合
を含み、
かつ、フィーダー混合物は、約0.01 ng/ml〜1.0 ng/mlのホルボールミリステートアセテートをさらに含む。
- フィーダー混合物の存在下で1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む、単一の置かれたかつ培養されたB細胞のIgG陽性ウェルの数を増加させるための方法であり、ここで、
EL-4 B5細胞は、共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されており、
EL-4 B5細胞の数(共培養する段階の開始時)は、B細胞1個当たりEL-4 B5細胞4×104個未満であり、
フィーダー混合物フィーダー混合物は、照射線量に応じて、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の以下の濃度:
5.5〜14*108 IU/mgを有する約2 ng/mlの(マウス)IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約2 ng/mlの(マウス)TNFα、
6〜7(好ましくは6.3)*106 IU/mgを有する約50 ng/mlの(マウス)IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約10 ng/mlの(マウス)IL-10、および
9.2〜16.1 *108 U/mgを有する約10 ng/mlの(マウス)IL-6、
の各々の0.75倍、0.5倍、0.32倍、0.25倍、0.1倍、0.066倍、0.032倍、0.015倍、0.01倍、0.0075倍、または0.0038倍の割合
を含み、
かつ、フィーダー混合物は、約0.01 ng/ml〜1.0 ng/mlのホルボールミリステートアセテートをさらに含む。
- (単一の置かれた各)B細胞またはB細胞(のプール)を、フィーダー混合物が補充された共培養用培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階
を含む。
‐ 1〜3種類の蛍光標識抗B細胞表面マーカー抗体と接触させ、該抗体に基づいてかつそれによりフルオロフォアがB細胞に結合しているおよび/または結合していないB細胞の集団のB細胞を、単一B細胞として置く段階
をさらに含む。
‐ 異なるB細胞表面抗原にそれぞれが特異的に結合し、1〜3種類の蛍光色素で標識されている2〜4種類の抗体と接触させたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階であって、各抗体が異なる蛍光色素にコンジュゲートされている、段階
をさらに含む。
(a) (任意で、B細胞集団を、2〜5種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜5種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を(1〜5種類の)蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、標識細胞を共培養用培地中でインキュベートする段階、
(c) 少なくとも1種類(1〜5種類)の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されたEL-4 B5フィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞/フィーダー細胞混合物を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養用培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 段階(e)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階
をさらに含む。
(a) (任意で、B細胞集団を、2〜5種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜5種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を(1〜5種類の)蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養用培地中でインキュベートする段階、
(c) 少なくとも1種類(1〜5種類)の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されたEL-4 B5フィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞/フィーダー細胞混合物を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養用培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 抗体を分泌する、段階(e)のB細胞クローンを選択する段階、
(g)(i) 段階(g)において選択されたB細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階、
(ii) B細胞クローンがヒトB細胞クローンではない場合、可変ドメインをヒト化し、各コード核酸を提供する段階、および
(iii) 1つまたは複数の核酸を、定常領域をコードする核酸配列とインフレームで、1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(h) 段階(g)の1つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトした細胞(任意で、CHO細胞およびBHK細胞より選択される)を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
をさらに含む。
(a) (任意で、B細胞集団を、2〜5種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜5種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を(1〜5種類の)蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養用培地中でインキュベートする段階、
(c) 少なくとも1種類(1〜5種類)の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されたEL-4 B5フィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞/フィーダー細胞混合物を遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養用培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 共培養されたB細胞の培養用培地中に分泌された抗体の結合特異性を、各上清について個々に決定する段階、
(g) 分泌された抗体の結合特性に基づいて、段階(f)のB細胞クローンを選択する段階、
(h) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、段階(g)において選択されたB細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る、(およびそれによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る)段階、
(i) B細胞が非ヒトB細胞である場合、可変軽鎖および重鎖ドメインをヒト化し、ヒト化可変ドメインをコードする核酸を提供する段階、
(j) モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、(ヒトまたはヒト化)抗体の発現のために、(抗体定常ドメインをコードする核酸配列とインフレームで)1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(k) 発現ベクターを哺乳動物細細胞(任意で、CHO細胞およびBHK細胞より選択される)に導入する段階、
(l) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
をさらに含む。
‐ 抗体産生B細胞クローンからの全RNAを抽出する段階、
‐ 抽出されたポリA+ mRNAの一本鎖cDNA合成/逆転写を実施する段階、
‐ 1組の種特異的プライマーを用いたPCRを実施する段階、
‐ 任意で、PCRプライマーを除去/PCR産物を精製する段階、
‐ 任意で、PCR産物を配列決定する段階
をさらに含む。
‐ 可変軽鎖および重鎖可変ドメインのT4ポリメラーゼインキュベーション段階、
‐ 発現ベクターの線状化および増幅の段階、
‐ 増幅された発現ベクターのT4ポリメラーゼインキュベーション段階、
‐ 増幅された発現ベクター中への、可変ドメインをコードする核酸の配列決定およびライゲーション非依存的クローニングの段階、ならびに
‐ ベクターで形質転換された大腸菌 (E. coli) 細胞のプールからのベクターの調製段階
をさらに含む。
‐ B細胞の集団を、固体表面上に固定化されている(標的)抗原と共にインキュベートし、固定化抗原に結合しているB細胞(のみ)を回収する段階
をさらに含む。
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびに/または
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/もしくはインターロイキン-10 (IL-10) 、ならびに/または
(iii) 黄色ブドウ球菌株Cowan細胞 (SAC)、ならびに/または
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、ならびに/または
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、ならびに/または
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、ならびに/または
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)
を含む。
「グレイ」または省略形の「Gy」という用語は、電離放射線量の一般的に使用される単位を示す。それは、1キログラムの物質、今回の例では1キログラムの細胞(湿潤細胞重量)当たりの1ジュールの放射エネルギーの吸収と定義される。それによって、吸収された線量が測定され得る。この単位は純粋に物理的であり、生物学的パラメータに依存せず、または生物学的パラメータを考慮に入れず、すなわち、「グレイ」は、それが付与される物質とは無関係に定義される。米国で用いられるラド単位の変換に関しては、以下の変換係数を用いることができる:1ラド=0.01 Gy。
本発明は、少なくとも一部は、9.5 Gyまたはそれ未満の線量のγ線照射で照射されたEL-4 B5細胞が、B細胞共培養 (BCC) 法において用いられる場合に有利な特性を有するという知見に基づく。
免疫化
治療用抗体の作製については、非ヒト動物を治療標的で免疫化して(単独で、または免疫原性刺激と組み合わせて)免疫応答を誘発するか、またはファージディスプレイライブラリーなどの合成アプローチを使用するかのいずれかである。トランスジェニック動物(すなわち、ヒト免疫系を有する)またはヒトファージディプレイライブラリーが用いられる場合には、ヒト抗体が得られる。そうでなければ、非ヒト動物抗体が得られ、これはその後ヒト化される。潜在的な治療用抗体を得るための稀な可能性は、疾患から回収されたヒトの血液によるものである。
血液は、高度な多様性の抗体産生B細胞を提供する。それから採取されたB細胞クローンは、高度な多様性を示す抗体を分泌する。
抗原と特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮することができる。したがって、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、B細胞集団は末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮される。
本明細書において報告される方法は、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く段階を含む。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、単一細胞として置く段階は蛍光活性化細胞選別 (FACS) による。FACSで単一細胞を置く段階に必要な標識化のために用いられる表面マーカーは、本明細書において概説されるような特異的マーカー組み合わせであってよい。
単一の置かれたB細胞をフィーダー混合物の存在下でフィーダー細胞と共培養する。1つの態様において、単一の置かれたB細胞を、フィーダー細胞としてのマウスEL-4 B5細胞と共培養する。
共培養後の分泌されたIgGの(定性的および定量的)測定には、一般的に、ELISAなどの当業者に公知のすべての方法を用いることができる。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、ELISAが用いられる。
B細胞から全mRNAを単離し、cDNAに転写することができる。特異的プライマーを用いて、同族のVH領域およびVL領域コード核酸を増幅することができる。同一の配列はほとんど得られない。前記方法は、同一抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
(a) (実験用非ヒト動物の血液から採取された)(成熟)B細胞の集団を提供する段階、
(b) B細胞の集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素で(1つの態様においては、1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素で)染色する段階、
(c) 個々の容器(1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に、染色されたB細胞の集団の単一細胞を置く段階、
(d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物(1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は天然のTSNであり、1つの態様においてフィーダー混合物は規定(および/または合成)のフィーダー混合物である)の存在下で培養する段階、
(e) 個々のB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を測定する段階、
(f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
(g) モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
(h) 該核酸を細胞に導入する段階、
(i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階
を含む、抗体を生成するための方法もまた報告される。
本発明は、少なくとも一部は、9.5 Gyまたはそれ未満の線量のγ線照射で照射されたEL-4 B5細胞が、B細胞共培養 (BCC) 法において用いられる場合に有利な特性を有するという知見に基づく。
‐ 1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、
EL-4 B5細胞が、共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量のγ線放射で照射されている、方法である。
約2 ng/ml(まで)の(マウス)IL-1β、
約2 ng/ml(まで)の(マウス)TNFα、
約50 ng/ml(まで)の(マウス)IL-2、
約10 ng/ml(まで)の(マウス)IL-10、および
約10 ng/ml(まで)の(マウス)IL-6、
またはそれらの一部分を含む。
5.5〜14*108 IU/mgを有する約2 ng/ml(まで)の(マウス)IL-1β、
2.3〜2.9*108 U/mgを有する約2 ng/ml(まで)の(マウス)TNFα、
6〜7(好ましくは6.3)*106 IU/mgを有する約50 ng/ml(まで)の(マウス)IL-2、
6〜7.5*105 IU/mgを有する約10 ng/ml(まで)の(マウス)IL-10、および
9.2〜16.1 *108 U/mgを有する約10 ng/ml(まで)の(マウス)IL-6、
またはそれらの一部分を含む。
組換えDNA法
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) に記載されているような標準方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
動物の管理および免疫化
免疫化には、Charles River Laboratories International, Inc.から入手したNZWウサギを使用した。動物は、AAALACiによって認可された動物施設において、Appendix A 「Guidelines for accommodation and care of animals」に従って収容した。動物の免疫化プロトコールおよび実験はすべて、オーバーバイエルンの政府によって承認され(許可番号55.2-1-54-2532-90-14)、ドイツ動物福祉法 (German Animal Welfare Act) ならびに欧州議会および理事会 (European Parliament and Council) の指令2010/63に従って実施した。
血液の取り出し(免疫化および非免疫化ウサギ)
一般的に、ウサギ由来の血液は、耳静脈、またはより大量の場合には耳動脈の穿刺によって採取した。免疫化ウサギから、3度目、4度目、5度目、および6度目の免疫化の4〜6日後に、EDTAを含む全血 (16 ml) を収集し、FACSによる単一細胞選別に使用した。
末梢血単核細胞 (PBMC) の単離
末梢血単核細胞 (PBMC) の単離は、製造業者の説明書A(Lympholyte(登録商標)-mammal、Cedarlane)に従ってLympholyte(登録商標)を用いて密度勾配分離により行った。
抗原特異的B細胞の濃縮
抗原を、最終濃度2μg/mlまでコーティング緩衝液で希釈した。この溶液4 mlを6ウェルマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用する前に上清を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。各ウェルを、1 ml〜(最大)2 mlの培地および最大で6×106個までの末梢血リンパ球で満たした。プレートを37℃で60分間インキュベートした。上清を廃棄した。ウェルを1×PBSで1〜4回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。付着性の抗原特異的B細胞を回収するため、1 mlのトリプシン/EDTA溶液をマルチウェルプレートのウェルに添加し、37℃で5〜10分インキュベートした。培地を添加することによりインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルを培地で2回洗浄し、この上清を他の上清と混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。任意で、ペレットをPBSに再懸濁した。
胸腺細胞上清 (TSN) の生成
手法1:
T細胞の培養
4〜5週齢のウサギの胸腺からT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または細胞3×107個の一定分量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、細胞5×105個/EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で48時間インキュベートした。
ウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中、細胞 少なくとも1×105個/mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を除去し、温めたEL-4 B5培地で洗浄することにより付着したマクロファージから付着しなかった細胞を除去し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で48時間培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを培地10 mlに再懸濁した。T細胞を細胞5×105個/mlの最小細胞密度に調整し、培地1 ml当たり10 ngホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA) および5μgまたは50μgフィトヘマグルチニンM (PHA-M) を添加した。マクロファージから培養用培地を除去し、マクロファージを含むフラスコにT細胞懸濁液を添加した。36時間の共培養後に培養用培地を取り出し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を除去するため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を4 mlの一定分量で-80℃で凍結した。
T細胞の培養
それぞれ3〜4週齢のマウスおよびハムスターまたは4〜5週齢のウサギの胸腺からT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または細胞4〜5×107個の一定分量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、細胞5×105個/EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で最長48時間まで(マクロファージが用いられるTSN生成法に応じて40〜48時間;実施例9および10を参照されたい)インキュベートした。
それぞれ少なくとも3ヵ月齢のマウスおよびハムスターの腹腔からマクロファージを単離した。マウスもしくはハムスター由来の腹腔マクロファージ、またはウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中、細胞 少なくとも1×105個/mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を除去し、温めたEL-4 B5培地で洗浄することにより付着したマクロファージから付着しなかった細胞を除去し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをEL-4 B5培地10 mlに再懸濁した。最終培養用培地は、細胞5×105個/mlの細胞密度に調整されたT細胞、培地1 ml当たり10 ngホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA)、および培地1 ml当たり5μgフィトヘマグルチニンM (PHA-M) を含んだ(=T細胞懸濁液)。その後、マクロファージから培養用培地を除去した(=培地枯渇マクロファージ)。培地枯渇マクロファージを含むフラスコにある量/容積のT細胞懸濁液を添加して、マクロファージ1.25〜2×106個/mlの最終的なしかし規定されたマクロファージ細胞密度を得た。30〜46時間の共培養後に培養用培地を取り出し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を除去するため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を(4.2 mlの)一定分量で-80℃で凍結した。
EL-4 B5細胞の培養
凍結EL-4 B5細胞を37℃の水浴中で迅速に融解し、EL-4 B5培地10 mlで希釈した。300×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを培地1 mlに再懸濁した。
免疫蛍光染色および単一細胞デポジション
プロトコール1:
染色しようとする細胞の数に応じて、細胞をそれぞれ培地100μl(細胞106個未満)または培地200μl(細胞106個超)中に提供した。蛍光標識抗体を実験動物の5%血清およびFACS緩衝液で、それぞれ100μlまたは200μlの最終量に希釈した。反応混合物をローラーラック上で、暗所で4℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を300×gで5分間、2回洗浄した。ペレットをPBS 400μlに再懸濁し、70μmふるいを通して濾過した。濾過した溶液をFACSバイアルに移し、FACS実験の直前に、死細胞をヨウ化プロピジウム (6.25μg/ml) の添加により染色した。標識抗体がビオチンで標識されている場合には、該抗体はストレプトアビジン標識Alexa Fluor(登録商標)647(抗体197)を用いて第2段階で検出した。
単一細胞選別のために使用した抗ウサギ IgG FITCは、AbD Serotec(STAR121F、Dusseldorf, Germany)から入手した。
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
単一細胞選別したB細胞を96ウェルプレート中で、Pansorbin細胞 (SAC)(Calbiochem (Merck)、Darmstadt, Deutschland)、EL-4 B5細胞(0〜5×104個/ウェル)、およびウサギ胸腺細胞上清またはサイトカイン混合物を有する200μl/ウェルEL-4 B5培地を用いて、それぞれ、インキュベーター内の5% CO2の雰囲気中37℃で7日間培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を取り出し、細胞は可変領域遺伝子クローニングのために直ちに回収するか、またはRLT緩衝液(Qiagen、Hilden, Germany)100μl中-80℃で凍結した。
IgGの定量化
0.5μg/mlのビオチン化マウス抗ウサギIgG抗体 (Sigma-Aldrich) および0.35μg/ml抗ウサギIgG HRPコンジュゲート (Sigma-Aldrich) の混合物を、384ウェル ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート (MicroCoat Biotechnologie GmbH) に移した。0.5% BSAおよび0.05% Tween(登録商標)-20が補充されたPBS中のB細胞上清の希釈物を添加し、RTで90分間インキュベートした。PBST(0.2% Tween(登録商標)-20を含むリン酸緩衝生理食塩水)緩衝液で繰り返し洗浄した後 (6×)、プレートをBM blue(登録商標)HRP基質溶液で発色させ、色形成を370 nmにおける吸光度によって測定した。市販のウサギIgG (Sigma-Aldrich) を較正標準として使用した。
抗原結合免疫アッセイ
アッセイは、0.5%ゼラチンおよび0.025% Tween(登録商標)-20が補充されたPBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液を用いて、384-ウェルMaxiSorpマイクロタイタープレート (Thermo Scientific) において室温 (RT) で行った。プレートを0.5μg/mlのヒト血清アルブミン(HSA、Sigma-Aldrich)で少なくとも2時間から一晩コーティングした。PBST(0.1% Tween(登録商標)-20を含むPBS)緩衝液で洗浄した後 (3×)、0.5%ゼラチンおよび0.1% Tween(登録商標)-20を含むPBSでウェルをブロッキングした。再度、プレートを3回洗浄し、その後B細胞上清の希釈物を添加した。60分のインキュベーションおよびPBSTによる3回の洗浄段階の後、HRP結合抗ウサギIgG抗体 (Amersham) の1:4,000希釈物をウェルに移し、60分間インキュベートした。最後に、プレートをPBSTで繰り返し洗浄し (6×)、BM blue(登録商標)HRP基質溶液で30分間発色させた。392〜405 nmで吸光度を測定した。
Claims (12)
- ‐ 1個または複数個のB細胞をEL-4 B5細胞と共培養する段階
を含む、1個または複数個のB細胞を培養するための方法であって、
該EL-4 B5細胞が、該共培養の前に9.5 Gyまたはそれ未満の線量で照射されており、かつ
該共培養する段階の開始時のEL-4 B5細胞の数が、B細胞1個当たり5×104個未満である、
該方法。 - 前記共培養する段階がさらにフィーダー混合物の存在下である、請求項1に記載の方法。
- 前記フィーダー混合物が、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記フィーダー混合物が、
約2 ng/mlの(マウス)IL-1β、
約2 ng/mlの(マウス)TNFα、
約50 ng/mlの(マウス)IL-2、
約10 ng/mlの(マウス)IL-10、および
約10 ng/mlの(マウス)IL-6、
またはそれらの一部分
を含む、請求項2または3に記載の方法。 - 前記フィーダー混合物の割合が、IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10、およびIL-6の前記濃度の各々の1.0〜0.015倍の範囲内である、請求項4に記載の方法。
- 前記フィーダー混合物が、約0.125 ng/ml〜1 ng/mlのホルボールミリステートアセテートをさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 単一の置かれたB細胞の培養のためのものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共培養する段階が5〜10日間である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1個または複数個のB細胞を共培養する段階が、約3 Gy〜約6 Gyの範囲内の線量のγ線放射で照射されたEL-4 B5細胞 約10,000〜約30,000個を伴う、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1個または複数個のB細胞を共培養する段階が、約3 Gy〜約6 Gyの範囲内の線量のγ線放射で照射されたEL-4 B5細胞 約10,000〜約30,000個を伴い、前記フィーダー混合物が、約0.06 ng/mlのIL-1β、約0.06 ng/mlのTNFα、約1.5 ng/mlのIL-2、約0.3 ng/mlのIL-10、約0.3 ng/mlのIL-6、および約0.25 ng/ml〜0.5 ng/mlのPMAを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1個または複数個のB細胞を共培養する段階が、0 Gy〜3 Gy未満の範囲内の線量のγ線放射で照射されたEL-4 B5細胞 約2,500〜約7,500個を伴う、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1個または複数個のB細胞を共培養する段階が、0 Gy〜3 Gy未満の範囲内の線量のγ線放射で照射されたEL-4 B5細胞 約2,500〜約7,500個を伴い、前記フィーダー混合物が、約0.06 ng/ml〜約0.2 ng/mlのIL-1β、約0.06 ng/ml〜約0.2 ng/mlのTNFα、約1.5 ng/ml〜約5 ng/mlのIL-2、約0.3 ng/ml〜約1 ng/mlのIL-10、約0.3 ng/ml〜約1 ng/mlのIL-6、および約0.43 ng/ml〜0.73 ng/mlのPMAを含む、請求項1〜8および11のいずれか一項に記載の方法。
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