JPH11502106A

JPH11502106A - 少数細胞集団を濃縮する方法

Info

Publication number: JPH11502106A
Application number: JP8527058A
Authority: JP
Inventors: サモンズ，デービッド・ダブリュー; マンリー，マイケル; ウターモーレン，ジョゼフ・ジー; トウィティ，ガーランド・イー
Original assignee: バイオセパレーションズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1999-02-23
Also published as: ATE228026T1; EP0813442A4; DE69624908T2; EP0813442A1; WO1996027420A1; EP0813442B1; ES2189869T3; DE69624908D1

Abstract

(57)【要約】全血試料を濃縮し少数細胞を得るための方法を開示する。血液試料（１２）は、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９（１４）の上に重層され、母体赤血球（１６）を除去するために遠心分離をされ、そして残りの遠心分離された血液試料は、電場の存在下で、比重ー勾配をもった、他の細胞成分から胎児有核赤血球（２６）を分離するための荷電ー流動分離装置（２０）の安定化された向流に通される。分離された胎児有核赤血球（２６）は、成熟赤血球を除去するためにアンモニア溶血をさせ（３０）、そして濃縮された胎児有核赤血球が回収される。

Description

【発明の詳細な説明】少数細胞集団を濃縮する方法関連出願との相互関係本出願は、同一人に譲渡されている係属中の出願である、１９９５年１０月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９５／１３６３１の一部継続出願である。発明の背景本発明は、一般的にいえば全血試料から少数細胞集団を分離することに関する。より特定すれば、本発明は、たとえば母体血液試料から、有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）を母体の赤血球、白血球そしてその他血液成分から分離することにより得られた胎児の有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）のような、少数細胞集団を濃縮するためのシステム及び非侵襲性の方法を提供する。当業者は、本システム及び方法が、その使用にあたって、胎児ＮＲＢＣｓを濃縮することに制限されないことを認識するであろう。すなわち、本明細書中により完全に記述するように、本方法により末梢血中に存在する多種の少数細胞集団を分離しうる。好ましい態様によれば、本発明は、ＮＲＢＣｓを細胞溶解により濃縮しそして培養あるいはその他の解析をしうる生存している少数細胞集団を回収する、ネガティブ選択の方法により、胎児由来ＮＲＢＣｓを母体血液試料から濃縮するシステム及び方法を提供する。生存している胎児由来ＮＲＢＣｓの濃縮が本システム及び方法の機能的モデルとして本明細書中に記載されているが、本発明はその効用にのみは制限されない。利用可能な方法である羊水穿刺や絨毛膜絨毛採取（ＣＶＳ）が母体及び胎児に有害なものである可能性があるため、内科医たちは長い間、出生前診断のための非侵襲的方法を開発しようと探求してきた。羊水穿刺を経験した妊娠女性の流産発生率は０．５ー１％上昇し、その数字はＣＶＳについては若干高い。羊水穿刺やＣＶＳに伴うと指摘された本来の危険性のため、これらの方法は年齢の高い女性、つまり統計学的に子どもが先天的な欠陥をもつ可能性がより高い３５歳以上の女性に対して主として提供している。いくつかの非侵襲的な方法が特定の先天的な欠陥を診断するために開発されている。たとえば、母体の血清αーフェトプロテイン、そして共役していないエストリオールとヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの濃度を、ダウン症である胎児の確率を特定するのに利用しうるが、しかし１００％の正確さではない。同様に、神経管欠損及び四肢の異常を含む先天的欠陥を確定するために、超音波診断が使用されているが、しかしその方法は妊娠１５週目以降にしか利用できない。母体末梢循環血中における胎児細胞の存在は、かなり前から知られていた。しかしながら、母体循環血中の少数細胞を代表する胎児の細胞は、１０万個に１個ないし１００万個に１個の間と推測される細胞数で存在している。胎児リンパ球（Ｗａｌｋｎｏｗｓｋａ，ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ１：１１１９（１９６９）；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ３９：１５３（１９７２）；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２７９（１９７５））、栄養膜合胞体細胞層（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）（Ｄｏｕｇｌａｓ，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７８：９６０（１９５９）；Ｇｏｏｄｆｅｌｌｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．８９：６５（１９８２）；Ｃｏｖｏｎｅ，ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ２：８４１（１９８４）；Ｋｏｚｍａ，ｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１：３３５（１９８６））、栄養膜細胞層（ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３３６：１９７（１９９０））、および赤血球（Ｆｒｅｅｓｅ，ｅｔａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２２：５２７（１９６３）；Ｃｌａｙｔｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２３：９１５（１９６４）；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２３０（１９７５）；Ｍｅｄａｒｉｓ，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１４８：２９０（１９８４））が、母体末梢血循環中に同定されている。母体血液から有核の胎児赤血球を分離することは、遺伝的疾患の出生前診断に使用するための好ましい方法と考えられてきた。細胞溶解試薬を用いたフローサイトメトリーにより（１９９４年２月１６日に公開された欧州公開特許出願第５８２７３６号）、三段階勾配不連続勾配ゲル電気泳動により（Ｂｈａｔらによる、１９９４年１月４日に発行された米国特許第５２７５９３３号）、白血球捕捉と無核赤血球の塩化アンモニウム溶解とを利用して有核細胞から分離することにより（Ｇｏｌｄｂａｒｄによる、１９９４年８月４日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４１７２０９号）、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体と磁気ビーズと蛍光インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）の使用により（Ａｈｌｅｒｔらによる、１９９３年８月１２日に公告されたドイツ特許出願公告第４２２２５７３号）あるいは胎児赤血球抗原に特異的なその他の抗体により（Ｂｉａｎｃｈｉによる、１９９１年５月３０日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１０７６６０号）、胎児ＮＲＢＣｓは母体血液から分離された。残念ながら、今日まで、母体末梢血試料を用いた出生前の遺伝的診断の目的で臨床的に利用可能な方法はなかった。羊水穿刺とＣＶＳのみがほんの少数の妊娠女性が利用可能な選択肢であり続けている。これらの女性は統計学的にみて遺伝的異常をもった子どもを妊娠する危険性が高い群に属する。母体末梢血中の胎児細胞を用いた出生前性別診断の方法に対しては、十分な注意が払われてきた。母体血液試料を採取することは羊水穿刺、ＣＶＳあるいは胎児血液採取よりもはるかに侵襲が少ないので、母体末梢血試料から胎児細胞を濃縮することができる方法は、新生児学において優れた注目点となった。母体血液中のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、出生前の性別診断について多くの研究がなされてきた（たとえば、Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３２７９−３２８３（１９９０）；Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．，１３：２９３−３００（１９９３）；Ｗａｃｈｔｅｌ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６：１４６６−１４６９（１９９１）；Ｓｕｚｅｍｏｒｉ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，８０：１５０−１５４（１９９２）を参照）。ＰＣＲ増幅を用いたいくつかの研究においては、母体血液中の胎児細胞は濃縮され、ＰＣＲにより解析された。ＰＣＲの研究において報告された方法の感度及び特異性はそれぞれ６４ー１００及び８０ー１００％と高く、ポジティブな予測値及びネガティブな予測値はそれぞれ７５ー１００及び６７ー１００％であったが、それぞれの研究において報告された診断の正確さは日常の臨床における使用の際には許容するには不十分であった（Ｈａｍａｄａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇ．，１５：７８−８１（１９９５））。フローサイトメトリーもまた、ＣＤ７１抗体（トランスフェリン受容体）陽性及びグライコフォリンーＡの結合を基礎として、胎児ＮＲＢＣｓを分離するために利用されてきた。フローサイトメトリーで分離された細胞で行われたＰＣＲにより、１００％の確実性で男の胎児が、８３％の確実性で女の胎児が同定された（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ’ｎ．２７０：２３５７−２３６１（１９９３））。免疫遺伝学的な方法は、妊娠女性から得た全血中の胎児細胞を濃縮するための蛍光標識細胞選別技術（ＦＡＣＳ）の手法と組み合わされた。Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１４５３−１４５５（１９７９））は、ウサギ抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を蛍光標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンとともに使用し、そしてＦＡＣＳを用いて蛍光が結合した細胞を解析した。蛍光インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、間期の細胞において望ましいＤＮＡを同定するための方法を提供する。従来の細胞遺伝学的方法をともなうＦＩＳＨは、母体血液試料から回収した胎児細胞に対して、性別決定のために（Ｗｅｓｓｍａｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇ．，１２：９９３−１０００（１９９２））、そして染色体異常を検出するために（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇ．，１２：Ｓ１２（Ｓｕｐｐ．１９９２）［胎児トリソミー２１］；Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，母体循環血中の胎児細胞の解析を介しての出生前診断，遺伝的疾患と胎児（ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓａｎｄｔｈｅＦｅｔｕｓ），第三版，Ｍｉｌｕｎｓｋｙ，Ａ．，ｅｄ．，ｐｐ．７５９−７７０（１９９２）［胎児トリソミー１８］）、利用されてきた。胎児の前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞もまた、固相化用媒体上へのリガンド結合により母体血液から濃縮された。ＣｅｌｌＰｒｏ，Ｉｎｃ．は、１９９４年１１月１０日に公開された国際公開第ＷＯ９４／２５８７３号において、血液試料から母体赤血球の大部分を分離することにより、母体血液から胎児赤血球前駆細胞を濃縮するための免疫選別方法を開示しており、この方法はたとえばフィコールの勾配を用いた密度勾配遠心法あるいは塩化アンモニウム、塩化カリウム及びカーボニックアンヒドラーゼ阻害薬の存在下において母体の赤血球を選択的に溶解し、その後母体血液試料を胎児前駆細胞を結合するリガンドとともにインキュベートし、そしてその後結合していない血液産物を除去すると、濃縮されリガンドと結合した胎児赤血球前駆細胞が残っているという方法である。開示されたリガンドには抗体、エリスロポエチン、トランスフェリンが含まれる。リガンドは、たとえば中空繊維、磁気ビーズ、プレート、ディッシュ、フラスコ、メッシュ、スクリーン、固形繊維、膜あるいはディップスティックなどの様々な固形の支持体のどれにでも固相化される。ＣｅｌｌＰｒｏの国際公開は、たとえば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチン−ストレプトアビジン、メトトレキセート−ジヒドロフォレート還元酵素、５−フルオロウラシル−チミジル酸シンターゼ及びリボフラビン−リボフラビン結合蛋白を含む、第一メンバー−第二メンバー結合ペアの使用について開示しており、その中で第一結合メンバーは胎児有核赤血球細胞に結合することができるリガンドと結合し、第二結合メンバーは固相化用媒体に結合し、そして第二メンバーは約１０⁸Ｍ^-1の濃度以上の第二メンバーでは一定の結合親和性がある。開示された好ましい態様には、単独であるいはお互いに組み合わせて有効である、細胞を選択するための、胎児細胞のポジティブな及びネガティブな選択の方法が含まれている。ビオチンを用いるポジティブな選択では、ビオチン化抗ＣＤ３４抗体と固相化アビジンを含む結合ペアを用いて処理した。ＣＤ３４抗原は胎児前駆細胞と造血前駆細胞とで発現されているが、しかしながら通常の成人では、造血前駆細胞は骨髄に残存し、ＣＤ３４陽性の細胞は末梢循環中には０．１％以下の割合でしか見いだされない。ネガティブな選択では、ビオチン化抗ＣＤ４５と固相化アビジンをを含む結合ペアを用いて処理した。ＣＤ４５抗原は母体赤血球で発現しているが、胎児前駆細胞では発現していない。免疫的に選別された細胞はその後、遺伝的あるいは生化学的情報を提供するために、核型、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰあるいはＦＩＳＨによる解析にかけられうる。しかしながら、ＣｅｌｌＰｒｏの方法は濃縮された細胞が臨床的には許容できない収量でしかないという欠点をもっていた。この国際公開された出願では胎児前駆細胞を１％以上の濃度に濃縮することが述べられているが、実施例において確認された濃縮の最高の濃度は、連続してＣＤ３４抗体の結合工程を用いる二重のポジティブ選択をすることにより、およそ２０００個に１個、あるいは０．５％の胎児細胞を含む試料を回収することができ、これは当初の試料からは約５００倍の濃縮をしたことになる。しかしながら現在までのところ、少数細胞集団、特に胎児有核赤血球を末梢血試料から濃縮するための、臨床的な診断を可能にするのに十分な数の細胞集団を得られるような、臨床的に許容できる方法は、発明されていない。母体全血から分離した少数の胎児細胞集団をより高収率で回収する方法の臨床的な必要性は、最近Ｈａｍａｄａ，Ｈ．ら（Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇ．１５：７８−８１（１９９５））によって強調されており、彼らは”本研究で得られたデータから、母体末梢血を用いてＦＩＳＨにより胎児の性別を同定することは可能であり、またこの診断方法はもっと多くの細胞が解析される場合には臨床的に有用なものになりうること示唆される。”と述べている。発明の概要本発明は、母体全血の構成成分から臨床的に有効な濃度の生存している培養可能な胎児の有核赤血球細胞を分離するためのシステム及び方法を提供する。濃縮された胎児ＮＲＢＣｓは、実際の細胞培養のために、それに続く従来からの細胞遺伝学的な方法による遺伝的な診断のために、さらにはＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ、ＦＩＳＨ、染色体のバンド形成及び核型分析などの新しいＤＮＡに関する方法のためには十分多い数で存在する。本発明では、ａ）全血から母体の赤血球の大画分と血漿を粗分離することを提供する全血の密度勾配遠心法、ｂ）母体の骨髄性細胞やリンパ性細胞から胎児赤血球前駆細胞を分離するための、粗分離された全血の荷電ー流動分離、ｃ）残存している母体赤血球のアンモニア溶解、そしてｄ）荷電流動分離された画分に存在する骨髄性細胞やリンパ性細胞を取り除くための補体依存性溶解により、その目的を達成する。本発明のシステム及び方法により、特に少数細胞集団である胎児赤血球の前駆細胞、特にＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位、顆粒球、赤血球、巨核球、単球）、ＢＦＵ−Ｅ（バーストフォーミング単位、赤血球）、ＣＦＵ−Ｅ（コロニー形成単位、赤血球）、前正赤芽球、正赤芽球（赤芽球）、そして網状赤血球を、求めるの細胞集団を得るためのネガティブ選択により、濃縮することを達成する。本明細書中でも参考文献として援用されている、１９９５年８月２０日に出願した、出願中のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１３６３１号（本明細書中では以後”Ｔｗｉｔｔｙら”と称する）において記載された、あるいは本明細書中で同様に参考文献として援用されている、米国特許第５３３６３８７号及び第５１７３１６４号において記載されているように、荷電ー流動分離（ＣＦＳ）装置は、アイデアとして全血から少数細胞集団を分離するために適している。ＣＳＦ装置は、好ましくは培養可能な分離細胞を得るために滅菌条件下で稼働される。荷電流動分離条件のもとでは、Ｔｗｉｔｔｙらの明細書に記載されているように、あるいは参考文献として援用されている、米国特許第５３３６３８７号あるいは第５１７３１６４号において記載されているように、胎児赤血球前駆細胞は電場において表面の荷電密度に従って一貫した移動様式を示し、これは成熟した無核赤血球の移動様式とは異なっておりそして識別することができる。本明細書でこの後もっと詳しく記載するように、前処理、後処理と組み合わせてＣＳＦ装置を使用することで、本発明は最終試料中で少数細胞集団を１２％まで濃縮することに成功した。ＣＳＦのシステム及び方法は、妊娠女性の末梢血循環から有核赤血球を回収するためにうまく使用された。回収されたＮＲＢＣｓは組織学的に同定された。ＮＲＢＣｓは、母体血液から得られたものであれ分娩時に得られたへその緒の血液から得られたものであれ、一貫した移動様式を示した。未経産の女性から採取した血液中にはＮＲＢＣｓは発見できなかった。母体血液からＮＲＢＣｓを荷電ー流動分離するという本発明のシステム及び方法は、ＮＲＢＣｓの固有の物理学的な特徴に基づいているため、母体血液試料を抗体やリガンドによりさらに調整する必要性はほとんどない。細胞は１秒間に６００００個以上あるいはそれと同等を処理されうるもので、特別な訓練は必要としない。本発明の荷電ー流動分離システム及び方法が使用されるとき、回収された細胞は生存しており、その結果、細胞培養によりさらに濃縮させる可能性が上昇する。荷電ー流動分離システム及び方法とともに、あるいはそれに加えて、本発明にはまた、母体血液試料中のその他の細胞集団からＮＲＢＣｓを分離するための親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）分離法が含まれる。本発明における吸着ーろ過親和法には、繊維性の吸着ーろ過フィルターろ過材上に母体血液を重層することが必要であり、そのろ過材は公称で約８ミクロンサイズの細孔を有し、そして４０ー８０％の白血球を捕捉することができ、洗浄後の白血球の保持率が７０ー８０％であり、そして非常に親水性で、表面張力が８５ー９０ｄｙｎｅまでの液体で濡らすことができ、単層の吸着ーろ過フィルターろ過材に対して４０ー７０μｌ／ｃｍ²の量の滞留量を有し、そしてろ過材に対するタンパク質吸着が中程度ないし低いことにより特徴づけられている。好ましい吸着ーろ過分離フィルターろ過材は、ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから”ＬＥＵＫＯＳＯＲＢ”タイプＡ及びＢの商標を付されて売られているものか、あるいはそれぞれが本明細書において参考文献として援用されている、米国特許第４９２３６２０号、米国特許第４９２５５７２号あるいは欧州特許第３１３３４８号において記載されているものである。本発明の荷電ー流動分離システム及び方法そして吸着ーろ過分離システム及び方法は、母体血液試料中の有核胎児赤血球細胞の濃縮を達成するために、別々に利用することもあるいはお互いに組み合わせても利用しうる。図面の簡単な説明図１は、赤芽球性、骨髄性及びリンパ性細胞系列の間での、造血及び分化を示した流れ図である。図２は、全血から少数の細胞集団を分離するための発明に係る濃縮工程についての流れ図である。図３は、妊娠中の胎児での造血分化と造血部位について示したグラフである。図４は、全血試料から本発明の方法を使用して分離した、赤血球前駆細胞の培養物から得られた、５１歳男性の核型の像である。図５は、本発明に伴う、付属する吸着ーろ過の結合材の第一の態様を示した流れ図である。図６は、本発明に伴う、付属する吸着ーろ過の結合材の第二の態様を示した流れ図である。図７は、本発明に伴う、付属する吸着ーろ過の結合材の第三の態様を示した流れ図である。図８は、本発明の濃縮方法に付属するものとして使用される、吸着ーろ過の結合材の第四の態様を示した流れ図である。好ましい態様の記載図１は、分化可能な造血幹細胞の共通のプールから始まり、分化の決定した赤芽球性、骨髄性及びリンパ性細胞系列を経て、独特の形態の細胞系列への、造血システム及び前駆細胞の階層を示した図面である。当業者であれば理解するであろうように、幹細胞から成熟血液細胞を産生する工程は、複雑な一連の不可逆的な細胞分化及び拡大しつつある増殖という出来事である。造血システムは、全血から少数の細胞集団を分離するためのシステム及び方法を見通しうる背景を提供する。当該技術分野でよく知られていることだが、血球分化の間に幹細胞が分化するにつれて、成熟しつつある細胞は形態的な変化を伴う。これらの形態的な変化に付随して、細胞は様々な組合せの表面分子、すなわちタンパク質、多糖類など、またたとえば表面抗原を分類する一連の分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＣＤ）を生成する。そのようなわけで様々な表面分子、たとえば一連のＣＤ、に対して特異的な抗体は、血液試料中において特定の細胞集団が存在することを特定するために使用しうる。しかしながら、たとえば赤血球生成細胞のようなそれぞれの分化ファミリーの中で個々の細胞型があるように、様々な赤芽球性、骨髄性及びリンパ性細胞はいくつかの共通のＣＤ表面分子を共有していることが知られている。これらの共有されているＣＤ表面分子は、分離の工程を面倒なものにしている。造血細胞系列において存在する既知のＣＤ分子の主要な特徴についての良い概要は、本明細書中で参考文献として援用する、Ｈｏｆｆｂｒａｎｄ，Ａ．Ｖ．ら（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，第三版，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．４１７−４１８，（１９９３））により提供されている。本発明の第一の好ましい態様に従って、そして特に図２についての参照に基づいて、全血から少数の細胞集団を濃縮する方法が提供される。自明のことであるが、男性であれ女性であれ子どもであれ大人であれ、若くても年をとっていても、血液型やＲｈ因子と関わりなく、すべての健康なヒトの血液試料は、図１に示された造血の階層にのっとった広い範囲の血液細胞型から構成されている。ヒトがたとえば乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、白血病あるいはそれに類するような細胞の疾患に苦しめられるとき、疾患の特徴である異常細胞はいつも、程度は異なるものの、末梢血循環中に少数の細胞として見いだされる。同様に、良く知られていることであるが、胎児由来細胞は、母体末梢血循環中には非常に低濃度で、すなわち１ｘ１０^-6から１ｘ１０^-7の割合でのみ見いだされうる。ネガティブ選択処置（抗体あるいはリガンド結合、ろ過あるいは手作業での選択を含めたあらゆる方法による、好ましくない細胞集団の選択として本明細書中で定義されている）及びポジティブ選択処置（抗体あるいはリガンド結合、ろ過あるいは手作業での選択を含めたあらゆる方法による、好ましい細胞集団の選択として本明細書中で定義されている）を交互に用いることにより、本発明のシステム及び方法により、全血から求める少数の細胞集団を濃縮することにより、末梢血から少数細胞が分離される。図２に示されているように、当該技術分野において知られている任意の従来からの技術によって、たとえば通常は前腕（ａｎｔｅｃｕｂｉｔａｌ）静脈で行う静脈採血により、末梢血試料１２は被験者１０から得られる。採取された血液量は、一般的には２０ー４０ｍｌの範囲であるが、しかしそれよりも多くても少なくてもよい。一般的には１種類あるいはそれ以上の抗凝固剤、望ましくは酸ークエン酸ーブドウ糖（ＡＣＤ）、エチレンジアミンー四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、そしてクエン酸ーリン酸ーブドウ糖ーアデニン（ＣＰＤＡ）が含まれる、の存在下で、血液は真空容器を用いて回収する。採取した血液試料は４℃で４日間まで保存しうる。しかしながら、採取２４時間以内に血液試料を処理し解析することが望ましい。２４時間以後には、血液試料中に存在するいくつかの造血細胞が成熟するなどの変化を受ける可能性があることが見いだされている。全血試料はＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９（ポリスクロースタイプ４００／ジアトリゾエートナトリウム、１．１１９ｇ／ｍｌ）（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１１１９，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）による密度勾配に重層され、そして４００ｘＧで４０分間遠心分離される。遠心の後、血漿は一番上に層を形成し、有核赤芽球やリンパ球を含む有核細胞の白いバンドが血漿の層のすぐ下にあり、白い層よりも密度が高くしかし成熟赤血球よりは密度が低いその他の有核赤芽球や未成熟赤血球を含む広い範囲の細胞が拡散したＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９のバンドが、有核細胞のすぐ下に位置し、そして赤血球の沈殿が遠心管の一番底に存在する。血漿画分は捨て、そして有核の画分は有核の画分を乱さないようにデカントによりあるいは吸引により回収する。有核の細胞層は別の滅菌された遠心管に回収され、リン酸緩衝塩類溶液で洗浄され、そして荷電流動分離装置２０の上にのせられるために調整され、そして参考文献として援用されているＴｗｉｔｔｙらの特許出願及び米国特許第５３３６３８７号及び第５１７３１６４号においてより完全な形で開示されているように、滅菌環境を保つような条件下で荷電流動分離にかけられる。電場における胎児ＮＲＢＣｓの移動度は、もっとも早い無核赤血球細胞ともっとも遅い白血球との中間であることが見いだされた。それによりたとえば、無核赤血球細胞２２が画分４ー７に溶出されそして白血球が画分６ー８に溶出されるような場合には、有核胎児赤血球細胞は画分７をピークとして画分５ー８に溶出することが見いだされた。これらの知見をもとに、胎児ＮＲＢＣｓ２６は、赤血球２２あるいは大多数の顆粒球２９あるいはその他の骨髄由来の細胞よりも、Ｔリンパ球やＢリンパ球などのリンパ性由来細胞２８の多くの単核球細胞と同じような電気泳動的移動度をもつことが確認された。以上よりピークの画分だけでなくピークの画分の隣の二つの画分、つまり画分６と８も回収することが望ましい。このようにＣＦＳ装置から溶出される有核の画分は、当初の血液試料中の成熟赤血球、顆粒球そしてその他の骨髄性細胞由来の細胞という主要画分から分離される。臨床的診断や性別決定などのために細胞を提供するための、臨床的に許容される分離の手段としてのＣＦＳ分離の適切さを試験するために、蛍光インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）がＣＦＳで分離された有核細胞画分に対して行われた。ＦＩＳＨ解析により、上記に記載したＣＦＳ濃縮法により臨床的に信頼性のある診断をするために十分な濃縮濃度が得られることが裏付けられた。Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９の密度勾配遠心法とそれに続いてＣＦＳ分離だけを行うことで、１／２０ないし１／５０の範囲の頻度で胎児ＮＲＢＣｓが、あるいは胎児ＮＲＢＣｓが約２ー５％の割合で回収された。以下の表１は、妊娠２０ー３０週の５人の妊娠女性から得られた血液試料からのデータとともに未経産の女性対照及び男性対照の血液試料から得られたデータをまとめたものである。すべての試料は上記に記載した様に処理され、Ｙ染色体に特異的なＤＹＺ１／ＤＹＺ３プローブを用いてＦＩＳＨにより解析された。臨床的出生前遺伝子診断のためのＣＦＳ濃縮された胎児ＮＲＢＣｓの適合性は、死産の分娩をした出産後２日たった女性一人と、以前にそれぞれ１６週目と１９週目とに羊水穿刺をし結果が分かっている二人の女性から採取した全血試料を処理することにより確認された。死産した胎児の血液試料の核型は、核型が４７、ＸＸ、＋１８という陽性の胎児トリソミー１８であることが確認され、一方で第二の被験者での羊水穿刺から胎児の核型が４７、ＸＸ、＋２１であることが示され、第三の被験者は胎児の核型が４７、ＸＹ、＋２１＋ｍであることが示され、どちらも陽性の胎児トリソミー２１であることが確認された。正常成人男子から得られた血液試料が対照として使用された。正常成人男子から得られた核型の例が図４として示されている。被験者の血液試料及び対照は、Ｆｉｃｏｌｌ−１１１９の勾配遠心の後、上記に記載したＣＦＳ分離により処理された。荷電流動分離した後に、トリソミー１８陽性試料と最初の男性対照試料とが染色体１８に特異的なプローブを用いてＦＩＳＨで解析され、そしてトリソミー２１陽性の試料と二番目の男性対照試料とが染色体２１特異的プローブを用いて解析された。既知の胎児トリソミー１８試料についてのデータを以下の表２に示し、そして既知の胎児トリソミー２１試料にについてのデータを以下の表３に示した。以下の表４は、本明細書の日付の時点で、Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．のＦＩＳＨキットを使用するためにＯｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．から発行され配布されている、本明細書中でも参考文献として援用されているＦＩＳＨのプロトコルに従って、ＦＩＳＨにより解析された、ＣＦＳ処理された胎児細胞の遺伝的検出の結果をまとめたものである。リンパ球と胎児ＮＲＢＣｓの相対的な移動度が同様であることから、荷電流動分離により得られた胎児ＮＲＢＣｓ集団をさらに濃縮することが望ましいと考えられている。荷電流水により分離された試料はその後、残っている赤血球や骨髄性細胞集団のネガティブ選択により、さらに濃縮された。ＣＦＳ装置から溶出された濃縮された有核細胞画分には、一般的には成熟赤血球の小画分、Ｂ及びＴリンパ球などの単核のリンパ性細胞の大画分、胎児ＮＲＢＣｓの小画分そして骨髄性系列細胞の小画分が含まれている。アンモニアによる溶血３０により、濃縮された有核のＣＦＳ胎児細胞溶出物から成熟赤血球が選択的に排除される。アンモニアによる溶血の律速因子は、細胞中のカーボニックアンヒドラーゼの濃度である。胎児赤芽球はカーボニックアンヒドラーゼを成熟した赤血球の１／５しかもっていない。カーボニックアンヒドラーゼ濃度におけるこの相違の結果として、成熟赤血球の選択的なアンモニアによる溶血が、時間ー割合の関数として調節されている、すなわちどんな時間をとっても成熟赤血球は胎児細胞よりも５倍早く溶解するだろう。ＪａｃｏｂｓａｎｄＳｔｅｗａｒｔ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５：５３９−５５２（１９４２））あるいはＭａｒｅｎａｎｄＷｉｌｅｙ（Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：４３０−４４０（１９７０））に記載されているように、アンモニアあるいはアンモニア塩、たとえば塩化アンモニウムなど、塩素イオン、たとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムあるいは塩化カルシウムなど、そしてカーボニックアンヒドラーゼ阻害薬、たとえばアセタゾールアミド、シアニド、シアネート、一価の硫化物あるいはスルフォンアミドなどの存在下で、アンモニウムイオンが細胞内に運搬されうるための条件下でそして十分な時間をかけて、濃縮された有核のＣＦＳ溶出物をインキュベートし、その後試料中の成熟赤血球を選択的に溶解するためにアンモニアと二酸化炭素の存在下でインキュベートする。溶解された赤血球は遠心により分離され、そして沈殿はＰＢＳに再懸濁される。結果の産物は実質上母体の赤血球を含まないが、しかし胎児有核赤血球細胞と母体の骨髄性細胞とリンパ性細胞を含む。試料中に残っているたくさんの母体骨髄性細胞とリンパ性細胞を取り除くために、骨髄性細胞とリンパ性細胞の補体溶解工程３２を行った。たとえば抗ヒトＣＤ３７ＩｇＭをＰＢＳ懸濁液に添加し、試料中に存在するヒトリンパ球に結合させる。結合の後、ウサギの補体が添加され、生じた試料をインキュベートする。インキュベートの後に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）のみを含んだ不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液を試料に添加し、そして試料を遠心分離する。生じるペレット（沈殿）は、当該技術分野においてよく知られている解析プロトコルに従って、記載されるように、培養３４、ＰＣＲ３６、ＦＩＳＨ３８あるいはその他の解析方法のために調整されうる。望ましくは、ペレットはＦＣＳだけを含むＩｓｃｏｖｅの培養液中で再懸濁し、そして回収し、そして試料の一部を赤血球を溶解しそして核を染色するために、３％酢酸とクリイスタルバイオレットを用いて処理する。試料の一部に含まれる有核の細胞の計測は、光学顕微鏡下で行いうる。本発明のさらに好ましい態様によると、再懸濁された細胞は、ＦＣＳの存在下で不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液により細胞を希釈することで、０．１ｍＬあたりに４ｘ１０⁵の有核細胞が含まれるように、細胞培養のために調整される。４ｘ１０⁵の有核細胞を含む不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液０．１ｍＬにその後１．０ｍＬの完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液（成長因子やメチルセルロースが含まれる）が添加され、それがその後３５ｍｍペトリ皿に加えられ、そして本明細書中で参考文献として援用されている”メチルセルロース培地を用いた造血細胞のコロニーアッセイ”（ＣｏｌｏｎｙＡｓｓａｙｓｏｆＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＣｅｌｌｓＵｓｉｎｇＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅＭｅｄｉａＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ，ＴｅｒｒｙＦｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉａＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ，１９９２編集）において記載されているような、標準的な細胞培養プロトコルに従って培養される。培養皿は１０ー１２日目そして１８ー２１日目に再びコロニーを計測する。１０ー１２日目には、ＣＦＵ−Ｅと成熟したＢＦＵ−Ｅのコロニーが顕著であるが、１８ー２１日目には未成熟なＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、そしてＣＦＵ−ＧＥＭＭのコロニーが存在し計測されうる。コロニー成長のどんな好ましい時点においても、有糸分裂している細胞が存在する間は、５ーフルオロウラシルによる阻止と５ーフルオロウラシルによる阻止のためのチミジン放出により成長は同期される。５ーフルオロウラシルによる阻止の手法については、たとえば本明細書中で参考文献として援用する、Ｆｒａｓｅｒ，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４：１−６（１９８７）を参照されたい。その後、細胞の成長は、コルセミド、コルヒチンあるいは同様な物質を使用することで、有糸分裂の中期において発育停止させ、それにより、高率の有糸分裂のインデックスが得られる可能性があり、そして核型が調整される。成長同期は選択肢の一つであるが、好ましい選択肢であり、そして高率の有糸分裂のインデックスが得られる。実施例４０ｍＬの全血が静脈採血により妊娠女性から採取された。血液試料はＣＰＤ（１００ｍＬの蒸留水に２．５５ｇのｄ−グルコース、２．６３ｇのクエン酸ナトリウム、０．３２７ｇのクエン酸及び０．２２２ｇのリン酸ナトリウム一塩基（ｍｏｎｏｂａｓｉｃｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を溶かしたもの）で抗凝固処理され、５０ｍＬの滅菌された遠心管に静置された。５０ー１００μ ｌの試料の一部が赤血球数及びリンパ球数の測定のために使用された。ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１１１９（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９、ポリシュークロースタイプ４００／ジアトリゾエートナトリウム、１．１１９ｇ／ｍｌ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、カタログ番号１１１９−１）は、水浴槽で３７℃に暖められた。血液は室温あるいは３７℃の水浴槽に保存しうる。２０ｍＬのＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１１１９を無菌状態で滅菌された２本の５０ｍＬ遠心管のそれぞれに入れ、そして２０ｍＬの血液をそれぞれの遠心管内のＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１１１９の表面に注意深く重層した。もし２本の２０ｍＬ画分を回収するには使用できる血液の量が十分でないならば、滅菌したリン酸緩衝塩類溶液を使用してそれぞれの遠心管の血液量を２０ｍＬにしてもよい。血液ーＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥが重層した遠心管を、４３０ｘＧでｓｏｒｗａｌｌＨＳ−４スウィングタイプバケット型ローターにおいて４０分間室温で遠心分離した。遠心分離の後、それぞれの遠心管の上の方の血漿の層はデカントして取り除いた。ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥー１１１９の層のすぐ上に位置する有核白血球細胞のバンドは、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥー１１１９の中に散在する赤血球細胞とともに、ピペットを用いて回収され、そして別々の滅菌した５０ｍＬの遠心管の中で混和した。成熟した赤血球の沈殿は廃棄した。３７℃の滅菌ＰＢＳがピペットで別の滅菌された５０ｍＬ遠心管に移された有核の画分に添加されて５０ｍＬにされ、そして１７５０ＲＰＭで２０分間遠心分離された。上清はデカントされ、そして得られたペレットは５０ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁されそして１５００ＲＰＭで２０分間遠心分離された。上清はデカントされ、ペレットは５ｍＬの緩衝液（トリエタノールアミン、５ｍＭ；グリシン、２８０ｍＭ；グルコース、２２ｍＭ；酢酸でｐＨ７．３に調整）で再懸濁した。再懸濁された細胞は、１２の分離チャンネル、１０の向流入力チャンネルそして４の向流出力チャンネルをもつように形成されたＣＦＳ装置で分析された。５ｍＬの緩衝液に再懸濁された細胞は、３２５Ｖ、５０ー５５ｍＡの適用電場の存在下で、試料緩衝液入力は流速０．２２０ｍｌ／ｍｉｎ／チャンネルの状態で、緩衝液出力は流速０．３７０ｍｌ／ｍｉｎ／チャンネルの状態そして向流ポンプは４．０ｍｌ／ｍｉｎの状態で、試料入力流に導入された。ＣＦＳを起動させた後、１２画分が５０ｍＬ遠心管に回収された。画分４ー６には細胞が含まれていることがわかり、遠心管４ー６に回収された画分は１７５０ＲＰＭで２０分間遠心分離し、上清はデカントしそして結果として得られた沈殿は５ー１０ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁しそして１５００ＲＰＭで１０分間再遠心した。上清はデカントし、１０ｍＬのアンモニウム溶解液（１ｍＬ１０^-3のアセタゾールアミド、９ｍＬのＮａＣｌそして０．１８４４の９０ｍＬＮＨ₄Ｃｌ）がそれぞれの遠心管に添加され、そして室温で３分間インキュベートされた。インキュベーションの後、２ｍＬの３ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃がそれぞれの遠心管に添加され、さらに室温で４分間インキュベートされた。遠心管はその後１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離され、上清はデカントされた。ペレットは０．９ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁され、そして１ｕｐの抗ヒトＣＤ３７ＩｇＭ（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）がそれぞれの遠心管に添加され、そしてそれぞれの遠心管は、抗体が完全に分配されるまで震とうされる。抗体が分散された後は、１００μｌの低毒性のヒトリンパ球に対するウサギ補体（ＬｏｗＴｏｘＲａｂｂｉｔＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｏｒｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）（ＡｃｃｕｒａｔｅＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＣｅｄａｒＬａｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）がそれぞれの遠心管に添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。抗体及び補体とのインキュベートの後、２％ＦＣＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ）添加不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液１２ｍＬがそれぞれの遠心管に添加され、遠心管は１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離された。上清は取り除かれ、ペレットは０．５ー５ｍＬの２％ＦＣＳ添加不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液で再懸濁された。一部を採取し、赤血球を溶解し核を染色するために３％酢酸とクリスタルバイオレットで固定された。各採取試料について、有核細胞数がカウントされた。再懸濁された細胞はその後、０．１ｍＬあたり４ｘ１０⁵の有核細胞の濃度になるように２％ＦＣＳ添加不完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液で再希釈された。０．１ｍＬの再希釈された細胞には、成長因子およびメチルセルロースを含んだ完全Ｉｓｃｏｖｅの培養液１．０ｍＬが添加され、そしてこの量、１．１ｍＬが３５ｍｍペトリ皿に添加され、メチルセルロース培地を用いた造血細胞のコロニーアッセイ”（ＣｏｌｏｎｙＡｓｓａｙｓｏｆＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＣｅｌｌｓＵｓｉｎｇＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅＭｅｄｉａＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ，ＴｅｒｒｙＦｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉａＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎａｄａ，１９９２編集）に従って培養された。培養皿は１０日目と１８日目に再びコロニーを計測された。１０日目にはＣＦＵ−Ｅと成熟ＢＦＵ−Ｅのコロニーが存在していたが、１８日目には未成熟なＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭそしてＣＦＵ−ＧＥＭＭのコロニーが存在していた。１８日目に５０μｌのコルセミド（Ｇｉｂｃｏ、１／１０に希釈）ａオートピペットを用いて培養皿に均一に添加された。コルセミドを添加された培養皿は、４５ー６０分間、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で培養された。１００μｌの低張溶液が何本かのマイクロフュージチューブに添加された。コロニーは培養皿からピペッティングされ、それぞれのコロニーは低張溶液を含むそれぞれのマイクロフュージチューブに混和され、２０分間インキュベートされた。それぞれのマイクロフュージチューブの内容物は、その後ポリーＬ−リジンコートをされたスライド上に静置され、５分間インキュベートされた。２０μｌの２０％固定液（３：１メタノール／酢酸）がその後それぞれのスライドに添加された。スライドはその後、完全強度の固定液に５分間ずつ２回浸され、その後３７℃で一晩乾燥される。培養した細胞はその後、Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．のＦＩＳＨキットを使用するために、本明細書の日付の時点でＯｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．から発行され配布されている、ＦＩＳＨのプロトコルに従って、Ｙ染色体のプローブであるＤＹＺ１／ＤＹＺ３（Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＦＩＳＨにより解析された。ＦＩＳＨ分析の結果を表５に記載する。上記図５においてまとめられているように、一被験者（ＣＳ３）から採取し、培養しＦＩＳＨにより解析されたシスター（ｓｉｓｔｅｒ）細胞は、上記に記載されたプロトコルに従って濃縮され培養された。１２のコロニーが培養１８日目のｓｉｓｔｅｒ細胞系列から得られた。ＣＦＳ溶出物中のＹの配列を調べるＰＣＲは、ＳＴＹ２及びＳＲＹ３プライマーを用いて行われ、これら二つのプライマーはＳＲＹの保存的なモチーフにある２５８塩基対を構成している。ＰＣＲは、本明細書中でも参考文献として援用されているＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより公開されたＰＣＴのプロトコルに従って行われた。レーン３とレーン１９には１２３塩基対のマーカーが流された。１２のコロニーのうち６と８の２コロニーにおいてＳＲＹ陽性の胎児細胞が存在していることがＰＣＲにより確認された。合計１２のコロニーのうち２例の陽性が存在するということは、６例に１例あるいは１６．６７％という濃縮程度であることを示している。ＰＣＲの結果は以下の表６にまとめてある。最後にアンモニア溶解及び補体溶解処置の両方が、上記に記載されているように、溶液中で行われうるか、あるいはたとえばＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ及びＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような非少数の細胞を結合する固相化媒体を用いてネガティブ選択法を用いて行ってもよい。本明細書中で参考文献として援用されているＴｗｉｔｔｙらの特許出願においてより完全に記載されているように、ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ及びＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢは主として有核細胞に対して結合親和性があるが、しかし成熟した無核赤血球細胞とは親和性がない。このように、上記の補体溶解の工程は、最初は不必要な結合した細胞を結合材を除去するために利用されうるが、その後有核細胞集団に対して結合親和性をもつ親和性媒体上でアンモニウム溶解工程が行われうる。求める細胞はその後、塩濃度をあげることにより、あるいはタンパク質分解酵素により結合材から回収される。吸着ーろ過親和法の結合材の、アンモニウム溶解及び補体溶解をするための固相支持体としての付属的な使用には、繊維性の吸着ーろ過フィルターろ過材上にＣＦＳ分離した画分を重層することが必要であり、そのろ過材は公称で約８ミクロンサイズの細孔を有し、そして４０ー８０％の白血球の固定を行うことができ、洗浄後に白血球の７０ー８０％が保持され、そして非常に親水性で、８５ー９０ダインにまでの表面張力の液体でぬらすことができ、単層の吸着ーろ過フィルターろ過材に対して４０ー７０μｌ／ｃｍ²の量の滞留量を有し、そしてろ過材に対するタンパク質吸着が低いないし中程度であることにより特徴づけられている。好ましい吸着ーろ過分離フィルターろ過材は、ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから”ＬＥＵＫＯＳＯＲＢ”タイプＡ及びＢの商標を付されて売られているものか、あるいはそれぞれが本明細書において参考文献として援用されている、米国特許第４９２３６２０号、米国特許第４９２５５７２号あるいは欧州特許第３１３３４８号において記載されているものである。図５ー８に目を転じると、本明細書中でも参考文献として援用されている米国特許第４９２５５７２号あるいはＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１７２０９号に記載されているように、吸着、ろ過そして親和性のうちの少なくとも一つにより選択的に白血球を捕捉する、少なくとも一種の白血球は結合するような結合材の使用を開示する。好ましい白血球を捕捉する結合材としては、”ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ”１１０及び”ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ”１１２があり、どちらもＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造販売されている。説明のために、図５ー８において示された白血球を結合するような結合材としてＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ１１０及びＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ１１２を挙げたが、しかし図５ー８において記載されたような方法で有核赤血球あるいは白血球そして赤血球を選択的に通過させるという機能もつ、どんなタイプの吸着材、ろ過材そして親和性材でも利用できるものとして企図されている。図５ー８において、ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ１１０あるいはＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ１１２のどちらかを通過する主要な画分は、大型頭文字で、一方通過している及び吸着している少数の画分はより小型の頭文字で示されている。図５は、本発明に従った吸着ーろ過工程の最初の態様１００を示している。赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）そして有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含む全血試料を、前記のようにＦｉｃｏｌｌの勾配１０２の上に重層する。Ｆｉｃｏｌｌの勾配による密度勾配遠心法により、ＮＲＢＣとＷＢＣと若干のＲＢＣ成分が含まれた主要な画分１０４が分離された。ＮＲＢＣ／ＷＢＣ画分はＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ１１０あるいはＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ１１２吸着ーろ過媒体のどちらかを通過する１０６、１０８。工程１０６においてＮＲＢＣ／ＷＢＣ画分１０４をＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ１１０に通過させると、ＮＲＢＣ１２４の主要な画分とそれに伴うＷＢＣとＲＢＣの少数の画分が含まれる画分は通過するが１１６、ＷＢＣ１２２の主要な画分やそれに伴うＮＲＢＣとＲＢＣの少数の画分１２２はＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ１１０に吸着される。別の方法の工程１０８では、ＮＲＢＣ／ＷＢＣ画分１０４はＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ１１２媒体を通過させてもよく、ＮＲＢＣとＷＢＣとＲＢＣの一部の画分１２８は通過するが、一方でＮＲＢＣとＷＢＣ１２６の主要な画分とそれに伴うＲＢＣの少数の画分は吸着される。工程１０６から得られたＮＲＢＣ画分１２４は、求める少数の細胞集団の調整物１４０をさらに濃縮するため、その後上記のＣＦＳ６０に通される。さらに、吸着画分１３０は、求める細胞集団の調整物１４０を得るために吸着した細胞集団に適した抽出液を使って脱離させることにより抽出物１３０となりうる。別の方法として、工程１０８が後に続くならば、ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ１１２を通過した画分１２８は、上記のように廃物１３２として捨てられるか、あるいはＣＦＳ６０により濃縮される。吸着画分１２６は、求める細胞集団の調整物１４０を得るために脱離させるか１３０、あるいは求める細胞集団の調整物１４０を得るために上記のようにＣＦＳ６０により濃縮される。図６ー８は、吸着ーろ過工程２００の第二の態様、吸着ーろ過工程３００の第三の態様及び吸着ーろ過工程４００の第四の態様をそれぞれ示している。態様２００、３００及び４００のそれぞれにおいて、作業工程を行う順番が図に示されたように態様間で異なる以外は、基本的な作業工程は同一である。たとえば、図６においては、試料はＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ媒体１１０上におかれ、その後密度勾配遠心法のためにそして求める細胞の分離のためにＦｉｃｏｌｌ勾配に通されるか、あるいは通過した画分がＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ媒体１１２上におかれ、そして通過した画分は求める調整物２４０を得るために密度勾配遠心法２１０にかけられる。ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ媒体１１２に吸着した画分は求める産物２４０を得るために抽出される２２２。ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ媒体１１０に吸着した画分は抽出され２２２、そして求める細胞集団２４０を得るためにＣＦＳ６０により濃縮されうる。図７においては、試料はＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ媒体１１２上におかれ、通過した画分は密度勾配遠心法３１０にかけられるかあるいは廃物３１２となる一方、吸着した画分３０４は抽出され３１４、そして求める細胞集団３４０を得るためにＣＦＳ６０により濃縮をかけられるか、あるいは抽出された画分は、求める産物３４０をポジティブにあるいはネガティブに選択するためにさらに吸着３１８あるいはろ過３１６させるために、ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ媒体１１０上にかけられる。最後に、図８においては、上記に示された実施例においても示されているように、試料は最初にＣＦＳ６０にかけられるか、あるいは密度勾配遠心法４０４にかけられその後にＣＦＳ６０にかけられる。ＣＦＳ６０から得られた濃縮された試料は、その後求める細胞集団４４０をポジティブに（通過）あるいはネガティブに（吸着）のどちらかで得るために、ＬＥＵＫＯＳＯＲＢＡ媒体１１０あるいはＬＥＵＫＯＳＯＲＢＢ媒体１１２にかけられる。母体全血試料からＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ−１１１９を用いてその後図８に示されているように荷電流動分離により、少数の胎児有核赤血球細胞を濃縮することにより、２ー７％の濃度の少数細胞集団が得られることが見いだされた。それに続くアンモニア溶解とその後の補体溶解という工程を用いることで、本発明のシステム及び方法は、少数細胞集団の回収率を濃度としておよそ１７％まで上昇させる。濃縮のこれらの濃度は、末梢血循環から少数細胞集団を回収する際における実質的かつ重要な進歩を意味し、そして、はじめて臨床的診断が可能でそして意味のあるものとするための十分な数の少数細胞がえられた。当業者は上述のことから、本発明がその好ましい態様に基づいて記載されているけれども、それによって本発明の精神及び範囲は制限されることはなく、本発明は請求の範囲の記載によって特定されることを理解するであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】１９９６年９月３０日【補正内容】１．下記工程からなる全血液試料中の望みの細胞集団を増加させる方法：ａ）全血試料を、少なくとも約１．１１９ｇ／mlの密度のフィコール勾配の存在下で、約５００ｇまたはそれ以下で、密度勾配遠心分離に付し；ｂ）密度勾配遠心分離からの所望の分画を回収し、そして所望分画を向流安定化荷電−流動分離装置に通過させ、血液試料中の各細胞成分の移動性が、適用される電場の存在下で、緩衝液の向流によって阻害され、これにより所望画分の濃縮が行われ；ｃ）荷電−流動分離装置から溶出された、工程ｂからの濃縮された所望画分を有する少なくとも一つの画分を得；ｄ）上記濃縮された所望画分から不要細胞を減少させ；およびｅ）濃縮された所望細胞集団を分析のために回収する。２．荷電−流動分離装置から有核血液細胞の分離された細胞集団を得、そして該分離された細胞集団試料を、白血球を減少させるアフィニティーマトリックスに通過させる工程をさらに含む、請求項１の方法。３．荷電−流動分離装置から有核血液細胞の分離された細胞集団を得、そして該分離された細胞集団試料を、白血球を減少させる吸着−濾過マトリックスに通過させる工程をさらに含む、請求項１の方法。４．不要細胞を減少させる工程が、さらに無核赤血球の実質量を溶解するが、所望細胞集団を実質的量で溶解しない条件下でのアンモニウム溶解の工程を含む、請求項１の方法。５．不要細胞を減少させる工程が、さらにアンモニウム溶解の後に、実質的量のリンパ球および骨髄細胞を溶解するが、所望細胞集団を実質的量で溶解しない条件下での補体溶解工程を含む、請求項４の方法。６．下記の工程からなる、全血試料から所望細胞集団を回収する方法：ａ）全血試料から不所望細胞の主要画分を減少させて、所望細胞集団を濃縮し；ｂ）濃縮された所望細胞集団を向流安定化荷電−流動分離装置に通過させ、血液試料中の各細胞成分の移動性が、適用される電場の存在下で、緩衝液の向流によって阻害され、これにより他の血液細胞成分からの所望細胞集団の濃縮が行われ；ｃ）荷電−流動分離装置から溶出された、濃縮された所望細胞集団を有する少なくとも一つの画分を得；そしてｄ）濃縮された所望細胞集団を分析のために回収する。７．不所望血液細胞を減少させる工程が、さらに無核赤血球の実質量を溶解するが、所望細胞集団を実質的量で溶解しない条件下でのアンモニウム溶解の工程を含む、請求項６の方法。８．不要細胞を減少させる工程が、さらにアンモニウム溶解の後に、実質的量のリンパ球および骨髄細胞を溶解するが、所望細胞集団を実質的量で溶解しない条件下での補体溶解工程を含む、請求項７の方法。９．不所望血液細胞を減少させる工程が、さらに所望細胞に対する親和性が全血試料中の不所望細胞集団に対する親和性より大きい固相吸着マトリックス上に所望細胞を吸着させる工程を含む、請求項７の方法。１０．不所望血液細胞を減少させる工程が、さらに全血試料中の不所望細胞集団に対する親和性が所望細胞に対する親和性より大きい固相吸着マトリックス上に不所望細胞を吸着させる工程を含む、請求項７の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者ウターモーレン，ジョゼフ・ジーアメリカ合衆国アリゾナ州85711，トゥーソン，イースト・ナインティーンス・ストリート 5357 (72)発明者トウィティ，ガーランド・イーアメリカ合衆国アリゾナ州85715，トゥーソン，イースト・リー・ストリート 8340

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を含む、全血試料から少数細胞を濃縮する方法：ａ）１．１１９ｇ／ｍｌの密度のＦｉｃｏｌｌの存在下で、５００ｇ以下で全血の密度勾配遠心を行い；ｂ）密度勾配遠心から求める少数細胞集団を回収し、及び適用電場の存在下で血液試料中のそれぞれの細胞成分の移動が緩衝液の向流により妨害されている、比重ー勾配をもつ、向流安定化荷電ー流動分離装置に血液試料を通し、それにより他の細胞性の血液成分から少数細胞集団の濃縮を引き起こし；ｃ）荷電ー流動分離装置から溶出される濃縮された少数細胞集団が存在する、少なくとも一画分を回収し；ｄ）濃縮された少数細胞集団から、不要な血液細胞をネガティブに選択し；ｅ）解析に供するため少数細胞集団を採取する。２．荷電ー流動分離装置から得られる有核血液細胞である分離された細胞集団を得、そして分離された細胞集団の試料を白血球を捕捉する親和性結合材に通す工程をさらに含む、請求項１の方法。３．荷電ー流動分離装置から得られる有核血液細胞である分離された細胞集団を得、そして分離された細胞集団の試料を白血球を捕捉する吸着ーろ過結合材に通すという工程をさらに含む、請求項１の方法。４．ネガティブ選択工程が、成熟赤血球を選択的に溶解するために十分な時間行われるアンモニウム溶解の工程をさらに含む、請求項１の方法。５．ネガティブ選択工程が、リンパ性細胞及び骨髄性細胞を選択的に溶解するためのアンモニウム溶解の工程の後に補体溶解の工程をさらに含む、請求項４の方法。