CN108642005B - 一种含连接剂的淋巴细胞分离液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其中的连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不具有细胞毒性的树脂或橡胶。本发明细胞分离液在淋巴细胞分离的过程中，可将粒细胞与其他密度不同的物质带出淋巴细胞层，从而减少淋巴细胞层中被激活的粒细胞的数量，延长最佳分离时间，是一种显著提高人外周血存放时间的淋巴细胞分离液。

Description

一种含连接剂的淋巴细胞分离液
技术领域
本发明涉及一种试剂，尤其涉及用于从人外周血中分离提纯PBMC细胞的分离试剂。
背景技术
PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T/B)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
使用外周血单个核细胞模拟体外的血液免疫环境，可以更方便更安全的进行许多的科研工作与医学工作。因此，从人外周血中分离提纯外周血单个核细胞是许多科研与医学工作重要的基本工作。然而现有的各种淋巴细胞分离液都存在采集到人外周血后需要第一时间分离的问题，限制时间在4-8个小时不等。由于限制时间较短，对无法第一时间从人外周血中分离淋巴细胞的用户造成了极大不便。因此存在延长分离淋巴细胞限制时间的需求。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其可保证人外周血从采集起至多32小时内分离均可获得大量的、高纯度的外周血单个核细胞。其中连接剂不会对分离的性能与效果有任何负面影响。
本发明的目的之一在于提供一种含连接剂的淋巴细胞分离液。
本发明的另一目的在于提供一种从外周血中分离淋巴细胞的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其为在现有淋巴细胞分离液中加入连接剂，使连接剂浓度为5*106～1*108个/ml，即得；
所述连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不具有细胞毒性的树脂或橡胶。
进一步的，所述连接剂粒径不超过50μm。
进一步的，所述树脂为不饱和聚酯树脂。
进一步的，所述不饱和聚酯树脂为间苯二甲酸型，并将甲基氧化为羧基用于结合抗体。
进一步的，所述粒细胞特异性抗体为抗CD66b抗体。
进一步的，所述现有淋巴细胞分离液为聚蔗糖与泛影酸的水溶液。
进一步的，上述含连接剂的淋巴细胞分离液的密度介于血浆与血细胞之间、且渗透压与血浆渗透压相同。
上述含连接剂的淋巴细胞分离液在从外周血中分离出淋巴细胞中的应用。
一种从外周血中分离出淋巴细胞的方法，包括以下步骤：将采集的外周血加入上述所述的含连接剂的淋巴细胞分离液中，1200～2500r/min离心，吸取云雾层细胞，加入培养基中，再经300～1200r/min离心，所得沉淀即淋巴细胞。
进一步的，外周血与含连接剂的淋巴细胞分离液的体积比为0.8～1.2：1。
本发明的有益效果是：
(1)在现有技术中，人外周血中存在大量粒细胞，随着外周血离体时间的增加、质量降低，外周血中的粒细胞会被激活、密度降低至与外周血单个核细胞接近。使用现有淋巴细胞分离液无法将这部分粒细胞与淋巴细胞分离，而这部分被激活的粒细胞释放出的各种酶类以及吞噬素会对淋巴细胞造成氧化胁迫，影响淋巴细胞的功能，导致后续实验与检测的结果不准确。本发明提供了一种含特定连接剂的淋巴细胞分离液，在淋巴细胞分离的过程中，可将粒细胞与其他密度不同的物质带出淋巴细胞层，从而减少淋巴细胞层中被激活的粒细胞的数量，延长最佳分离时间。可见本发明提供了一种显著提高人外周血存放时间的淋巴细胞分离液。
(2)本发明含有特定连接剂的淋巴细胞分离液对新鲜外周血与放置了32小时的外周血均能进行很好的淋巴细胞分离，表现出很好的淋巴细胞得率和纯度；而现有淋巴细胞分离液只对新鲜外周血具有较好的分离效果，对放置了32小时的外周血，其淋巴细胞纯度显著降低。
附图说明
图1为现有淋巴细胞分离液与本发明含连接剂的淋巴细胞分离液对采集的新鲜外周血进行淋巴细胞分离的得率情况；
图2为现有淋巴细胞分离液与本发明含连接剂的淋巴细胞分离液对采集的新鲜外周血进行淋巴细胞分离的纯度情况；
图3为现有淋巴细胞分离液与本发明含连接剂的淋巴细胞分离液对放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的得率情况；
图4为现有淋巴细胞分离液与本发明含连接剂的淋巴细胞分离液对放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的纯度情况；
图5为现有淋巴细胞分离液分别对新鲜外周血、放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的得率情况；
图6为现有淋巴细胞分离液分别对新鲜外周血、放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的纯度情况；
图7为本发明含连接剂的淋巴细胞分离液分别对新鲜外周血、放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的得率情况；
图8为本发明含连接剂的淋巴细胞分离液分别对新鲜外周血、放置32h的外周血进行淋巴细胞分离的纯度情况；
图9为本发明方法在分离淋巴细胞过程中细胞分层情况。
具体实施方式
一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其为在现有淋巴细胞分离液中加入连接剂，使连接剂浓度为5*106～1*108个/ml，即得；
所述连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不具有细胞毒性的树脂或橡胶。
优选的，所述连接剂粒径不超过50μm。
优选的，所述树脂为不饱和聚酯树脂。
优选的，所述不饱和聚酯树脂为间苯二甲酸型，并将甲基氧化为羧基用于结合抗体。
优选的，所述粒细胞特异性抗体为抗CD66b抗体。
优选的，所述现有淋巴细胞分离液为聚蔗糖与泛影酸的水溶液。
优选的，上述含连接剂的淋巴细胞分离液的密度介于血浆与血细胞之间、且渗透压与血浆渗透压相同。
上述含连接剂的淋巴细胞分离液在从外周血中分离出淋巴细胞中的应用。
一种从外周血中分离出淋巴细胞的方法，包括以下步骤：将采集的外周血加入上述所述的含连接剂的淋巴细胞分离液中，1200～2500r/min离心，吸取云雾层细胞，加入培养基中，再经300～1200r/min离心，所得沉淀即淋巴细胞。
优选的，外周血与含连接剂的淋巴细胞分离液的体积比为0.8～1.2：1。
优选的，所述1200～2500r/min离心15～25min。
优选的，所述300～1200r/min离心8～12min。
优选的，所述培养基为1640培养基。
通过以下具体实施例进一步进行说明本发明，然而应当理解，除非另外特别指出，包含的这些具体实施例仅用于说明的目的，并不意在限制本发明的范围。
实施例1一种含有连接剂的淋巴细胞分离液
一种含有连接剂的淋巴细胞分离液为在现有淋巴细胞分离液中加入连接剂，使连接剂浓度为1*107个/ml，即得。
所述连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不饱和聚酯树脂微粒(也可以是其它没有细胞毒性的树脂、橡胶)，粒径约为22μm()。
所述不饱和聚酯树脂微粒均为间苯二甲酸型，并将甲基氧化为羧基用于结合抗体。
所述粒细胞特异性抗体为鼠抗人抗CD66b抗体；将抗体连接至具有羧基的固相载体的技术是本领域实验人员所熟知的。
所述现有淋巴细胞分离液为聚蔗糖与泛影酸的水溶液，通过调整聚蔗糖与泛影酸的量使最终所得的含连接剂的淋巴细胞分离液密度介于血浆与血细胞之间、且渗透压与血浆渗透压相同。
实施例2一种分离淋巴细胞的方法
样本收集：
本研究共采用了52例个体；其中32例男性、20例女性，年龄在21～69岁之间；每例个体使用肝素钠采血管采集2管每管不少于4ml的外周血，共8ml，颠倒混匀。
淋巴细胞分离：
使用市售现有淋巴细胞分离液与本发明含有连接剂的淋巴细胞分离液分别分离52例样本中的淋巴细胞。取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、1800r/min离心20min。吸取云雾层细胞，即图9所示的淋巴细胞层。并用1640培养基将吸取的云雾层细胞补足至12ml，室温600r/min离心10分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
使用流式细胞仪对分离提纯后的细胞悬浮液进行计数分析；使用血细胞计数仪对外周血进行技术分析。计算淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，结果显示于图1～2。
统计学分析结果：
使用统计学分析软件对该研究中产生的数据进行对比分析，针对淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，研究了不同分离液之间的统计学差异。数据显示，使用现有一般分离液与本发明添加了连接剂的分离液分离淋巴细胞的淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度均不存在显著性差异(图1～2)。因此，添加连接剂不影响淋巴细胞分离液的性能指标。
实施例3一种分离淋巴细胞的方法
样本收集：
本研究共采用了52例个体；其中32例男性、20例女性，年龄在21～69岁之间；每例个体使用肝素钠采血管采集2管每管不少于4ml的外周血，共8ml，颠倒混匀。
淋巴细胞分离：
将采集的外周血放置32小时后，使用市售淋巴细胞分离液与本发明含有连接剂的淋巴细胞分离液分别分离52例样本中的淋巴细胞。取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、1800r/min离心20min。吸取云雾层细胞并用1640培养基补足至12ml，室温600r/min离心10分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
使用流式细胞仪对分离提纯后的细胞悬浮液进行计数分析；使用血细胞计数仪对外周血进行技术分析。计算淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，结果显示于图3～4。
统计学分析结果：
使用统计学分析软件对该研究中产生的数据进行对比分析，针对淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，研究了不同分离液之间的统计学差异。数据显示，使用现有一般分离液与本发明添加了连接剂的分离液分离淋巴细胞的淋巴细胞得率不存在显著性差异，淋巴细胞纯度存在极显著差异(图3～4)。因此，本发明添加连接剂的淋巴细胞分离液能有效提高长时间放置的外周血中淋巴细胞分离效果。
实施例4一种分离淋巴细胞的方法
样本收集：
本研究共采用了52例个体；其中32例男性、20例女性，年龄在21～69岁之间；每例个体使用肝素钠采血管采集1管不少于4ml的外周血，颠倒混匀，32小时后，再次使用肝素钠采血管采集1管不少于4ml的外周血，颠倒混匀。
淋巴细胞分离：
使用本发明添加了连接剂的淋巴细胞分离液分离52例样本中的淋巴细胞。取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、1800r/min离心20min。吸取云雾层细胞并用1640培养基补足至12ml，室温600r/min离心10分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
使用流式细胞仪对分离提纯后的细胞悬浮液进行计数分析；使用血细胞计数仪对外周血进行技术分析。计算淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，结果显示于图7～8。
统计学分析结果：
使用统计学分析软件对该研究中产生的数据进行对比分析，针对淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，研究了使用添加了连接剂的淋巴细胞分离液分离采集之后不同放置时间的外周血之间的统计学差异。数据显示，新鲜的外周血与放置了32小时后的外周血分离淋巴细胞的淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度均不存在显著性差异(图7～8)。因此，使用本发明添加了连接剂的淋巴细胞分离液分离采集之后不同放置时间的外周血在32小时内可保证没有负面影响。
对比例
样本收集：
本研究共采用了52例个体；其中32例男性、20例女性，年龄在21～69岁之间；每例个体使用肝素钠采血管采集1管不少于4ml的外周血，颠倒混匀，32小时后，再次使用肝素钠采血管采集1管不少于4ml的外周血，颠倒混匀。
淋巴细胞分离：
使用市售淋巴细胞分离液分离52例样本中的淋巴细胞。取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、1800r/min离心20min。吸取云雾层细胞并用1640培养基补足至12ml，室温600r/min离心10分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
使用流式细胞仪对分离提纯后的细胞悬浮液进行计数分析；使用血细胞计数仪对外周血进行技术分析。计算淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，结果显示于图5～6。
统计学分析结果：
使用统计学分析软件对该研究中产生的数据进行对比分析，针对淋巴细胞得率和淋巴细胞纯度，研究了使用市售淋巴细胞分离液分离采集之后不同放置时间的外周血之间的统计学差异。数据显示，新鲜的外周血与放置了32小时后的外周血分离淋巴细胞的淋巴细胞得率不存在显著性差异，淋巴细胞纯度存在极显著差异(图5～6)。因此，使用市售淋巴细胞分离液分离采集之后不同放置时间的外周血随着采集后放置时间的增加对分离结果有负面影响。
实施例5一种分离淋巴细胞的方法
取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至本发明含有连接剂的淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、1200r/min离心25min，吸取云雾层细胞。并用1640培养基将吸取的云雾层细胞补足至12ml，室温300r/min离心12分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
实施例6一种分离淋巴细胞的方法
取4ml生理盐水与4ml外周血混匀，并缓慢加入至本发明含有连接剂的淋巴细胞分离液中。室温下、最低升降速、2500r/min离心15min，吸取云雾层细胞。并用1640培养基将吸取的云雾层细胞补足至12ml，室温1200r/min离心8分钟。弃上清，用1640培养基补足至5ml并轻轻混匀，室温350r/min离心10分钟。使用合适的培养基或缓冲剂重悬细胞，既得经分离提纯的淋巴细胞。
综上所述，上述评价了添加了本发明连接剂(连有粒细胞特异性抗体的不饱和聚酯树脂微粒，粒径约为22μm)的淋巴细胞分离液与未添加连接剂的淋巴细胞分离液从新鲜外周血中分离淋巴细胞的性能指标，其淋巴细胞得率、淋巴细胞纯度与未添加连接剂组不存在显著差异。
上述评价了添加了连接剂的淋巴细胞分离液与未添加连接剂的淋巴细胞分离液从采集后放置了32小时的外周血中分离淋巴细胞的性能指标，使用的连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不饱和聚酯树脂微粒，粒径约为22μm。其淋巴细胞纯度存在显著差异，添加了连接剂的淋巴细胞分离液分离出的淋巴细胞纯度显著高于未添加连接剂的淋巴细胞分离液。
在多个实施方案中，评价了添加了连接剂的淋巴细胞分离液分别从新鲜外周血以及采集后放置了32小时的外周血中分离淋巴细胞的性能指标，使用的连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不饱和聚酯树脂微粒，粒径约为22μm。二者淋巴细胞得率、淋巴细胞纯度不存在显著差异。含有连接剂的淋巴细胞分离液对新鲜外周血与放置了32小时的外周血均具有很好的淋巴细胞得率和纯度。
上述评价了未添加连接剂的淋巴细胞分离液分别从新鲜外周血以及采集后放置了32小时的外周血中分离淋巴细胞的性能指标，二者淋巴细胞纯度存在显著差异，新鲜的外周血分离出的淋巴细胞纯度显著高于采集后放置了32小时的外周血。
本发明提供了一种含特定连接剂的淋巴细胞分离液，在淋巴细胞分离的过程中，可能通过将粒细胞与其他密度不同的物质(可能是外周血中本就存在的物质，如红细胞；也可能是外来物质，如橡胶、树脂微粒等)粘接在一起，带出淋巴细胞层；如，可能将粒细胞与红细胞相连，使粒细胞被红细胞带入红细胞层，从而减少淋巴细胞层中被激活的粒细胞的数量，延长最佳分离时间。可见本发明提供了一种显著提高人外周血存放时间的淋巴细胞分离液。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，其为在现有淋巴细胞分离液中加入连接剂，使连接剂浓度为5*106～1*108个/mL，即得；
所述连接剂为连有粒细胞特异性抗体的不具有细胞毒性的树脂或橡胶；
其中，所述淋巴细胞分离液的密度介于血浆与血细胞之间、且渗透压与血浆渗透压相同。
2.根据权利要求1所述的一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述连接剂粒径不超过50μm。
3.根据权利要求2所述的一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述树脂为不饱和聚酯树脂。
4.根据权利要求3所述的一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述不饱和聚酯树脂为间苯二甲酸型，并将甲基氧化为羧基用于结合抗体。
5.根据权利要求1所述的一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述粒细胞特异性抗体为抗CD66b抗体。
6.根据权利要求1所述的一种含连接剂的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述现有淋巴细胞分离液为聚蔗糖与泛影酸的水溶液。
7.权利要求1～6任一项所述的含连接剂的淋巴细胞分离液在从外周血中分离出淋巴细胞中的应用。
8.一种从外周血中分离出淋巴细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将采集的外周血加入权利要求1～6任一项所述的含连接剂的淋巴细胞分离液中，1200～2500r/min离心，吸取云雾层细胞，加入培养基中，再经300～1200r/min离心，所得沉淀即淋巴细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，外周血与含连接剂的淋巴细胞分离液的体积比为0.8～1.2：1。
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"The Interplay Between Neutrophils and CD8+ T Cells Improves Survival in Human Colorectal Cancer";Valeria Governa 等;《Clin Cancer Res》;20170120;第1-13页 *
"T-Iymphocyte function from peripheral blood stem-cell donors is inhibited by activated granulocytes";ZFM Vasconcelos 等;《Cytotherapy》;20031231;第5卷(第4期);第336-345页 *
"三种分离人外周血单核细胞方法的比较";陈丹 等;《天津医科大学学报》;20141130;第20卷(第6期);第483-485页 *
"不同标本放置时间对外周血红细胞和粒细胞形态的影响";李斌 等;《国际检验医学杂志》;20140630;第35卷(第12期);第1647-1648页 *
"分离外周血单个核细胞的条件优化";蔡敏敏 等;《国际检验医学杂志》;20160131;第37卷(第1期);第1-3页 *

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