CN115340981A - 用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外扩增的培养基 - Google Patents

用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外扩增的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，属于造血干细胞的体外培养技术领域。所述培养基是由以下浓度的组分组成的：SCF，80～120ng/mL；TPO，80～120ng/mL；Flt‑3，80～120ng/mL；IL‑6，80～120ng/mL；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。所述培养基在体外扩增脐带血CD34阳性造血干细胞中的应用，具体应用时，使用本发明的培养基培养CD34阳性造血干细胞，每3～4天换液一次，培养7～14天。使用本发明的培养基培养脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，可使其在较短时间内得到大量扩增。

Description

用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基
技术领域
本发明涉及用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，属于造血干细胞的体外培养技术领域。
背景技术
造血干/祖细胞(Hematopoietic stem cells/progenitor cells，HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一种异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。随着科技的快速发展，HSCs现已被广泛用于造血重建、基因治疗、肿瘤净化及免疫治疗等方面的研究；也被用于疾病的临床治疗中，如白血病、地中海贫血症、血友病等。造血干细胞移植是目前有效治愈白血病和唯一治愈地中海贫血症的治疗手段。
目前临床获得造血干细胞的途径有3种，分别是取自骨髓、新生儿脐带血和人动员后外周血。然而，这3种途径各有不足之处：脐带血中具有重建能力的HSCs数量极低，单份脐带血来源的HSCs数量不足以支持成年人和体重较大儿童的治疗；人外周血中的HSCs数量同样极低，需要采用粒细胞集落刺激因子刺激骨髓释放造血干细胞到外周血中，但临床中常出现刺激效果不佳的情况，释放的HSCs数量无法达到治疗要求；直接从骨髓中采集HSCs，同样会出现采集数量有限的困难，同时也会有手术难度大、创伤面大等问题。因此，有必要研发一种有效扩增HSCs的方法，以造福更多的患者。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，使用该培养基，可以使脐带血来源的CD34阳性造血干细胞在较短时间内得到大量扩增。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，是由以下浓度的组分组成的：SCF，80～120ng/mL；TPO，80～120ng/mL；Flt-3，80～120ng/mL；IL-6，80～120ng/mL；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基；
或：是由以下浓度的组分组成的：SCF，80～120ng/mL；TPO，80～120ng/mL；Flt-3，80～120ng/mL；IL-6，80～120ng/mL，3～7nM的17-AAG；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
优选的，是由以下浓度的组分组成的：SCF，100ng/mL；TPO，100ng/mL；Flt-3，100ng/mL；IL-6，100ng/mL；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
优选的，是由以下浓度的组分组成的：SCF，100ng/mL；TPO，100ng/mL；Flt-3，100ng/mL；IL-6，100ng/mL，5nM的17-AAG；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
所述STEM Span SFEMⅡ培养基是一种造血干细胞无血清培养基，是现有技术中的商品化培养基，可常规市场购买得到。所述生长因子SCF、TPO、Flt-3、IL-6，17-AAG，均为本领域的常用生长因子，可常规市场购买得到。
所述用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基在培养脐带血CD34阳性造血干细胞中的应用。具体应用时，使用上述培养基培养CD34阳性造血干细胞，每3～4天换液一次，培养7～14天。
一种脐带血CD34阳性造血干细胞的体外培养方法：使用上述培养基培养CD34阳性造血干细胞，每3～4天换液一次，培养7～14天。
进一步地，所述CD34阳性造血干细胞是使用密度梯度离心和磁珠分选的方式从脐带血中分离得到的。
本发明的用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，是在STEM SpanSFEMⅡ培养基的基础上添加特定浓度的SCF、TPO、Flt-3和IL-6而成的，使用此培养基培养脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，可使其在较短时间内得到大量扩增。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：总细胞数目统计示意图示意图，其中，1、2、3、4分别代表实验组1、2、3、4。
图2：CD34阳性细胞数目统计示意图，其中，1、2、3、4分别代表实验组1、2、3、4。
图3：流式检测CD34阳性造血干细胞所占比例结果示意图(培养7天时)。其中，Blank为空白对照，ISO为阴性对照，S1为实验组1，S2为实验组2，S3为实验组3，S4为实验组4。
图4：流式检测CD34阳性造血干细胞所占比例结果示意图(培养18天时)。其中，Blank为空白对照，ISO为阴性对照，S1为实验组1，S2为实验组2，S3为实验组3，S4为实验组4。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1脐带血CD34阳性造血干细胞的体外培养
步骤如下：
(一)单个核细胞分离
(1)将加有抗凝剂的血样移至离心管中。
(2)1800rpm(750g)离心15分钟，升速9，降速7。
(3)离心结束后，将上层血浆转移至新的离心管中，并用封口膜封口。
(3)按照1:1的体积比加入PBS缓冲液稀释下层血细胞，轻轻混匀。
(4)取干净的50mL离心管，加入20mL室温淋巴细胞分离液。
(5)用25mL移液管取稀释过的血液样品25mL，贴壁缓慢加入，使血液样品置于淋巴细胞分离液上层(不可搅浑淋巴细胞分离液)。
(6)小心放入离心机中，700g离心30分钟，升速3，降速3。
(7)小心取出离心管，切记不可晃动。
(8)离心后离心管中液体自上至下分为4层：最上层为血浆层，第二层为淋巴细胞层，第三层为淋巴细胞分离液层，最底层为红细胞层(红色沉淀)。
(9)用10mL移液管轻轻吸走白色环状层以上三分之二血浆液，不可搅动白色环状层。
(10)将第二层的淋巴细胞转移至干净的50mL离心管中，尽量少的吸取血浆层和淋巴细胞分离液层。
(11)向淋巴细胞悬液中加入PBS缓冲液至体积为50mL，轻柔上下颠倒混匀。
(12)将离心管置于离心机中，转速设置为300g，升降速度均设置为6，离心时间为10分钟，离心结束后，淋巴细胞分布于离心管底层。
(13)小心吸弃离心后的上清，并向离心管中加入5mL PBS，将淋巴细胞重悬混匀。继续向离心管中加入40mL PBS并上下颠倒混匀。
(14)将离心管置于离心机中离心，转速设置为200g，升降速度均设置为6，离心时间为10分钟，离心结束后，淋巴细胞分布于离心管底层。
(二)单个核细胞中磁珠分离CD34阳性造血干细胞
(1)配置Buffer溶液：44.2mL PBS(pH7.2)+0.25g BSA+5.8mL 5％EDTA，0.22μm过滤后待用。
(2)300μL Buffer溶液重悬PBMC。108个细胞最多用300μL Buffer溶液重悬。
(3)加入100μL FcR Blocking Reagent。
(4)加入100μL CD34 MicroBeads。
(5)混匀后，2～8℃孵育30min。
(6)加入10mL Buffer洗细胞。300g，10min，4℃离心。弃上清。
(7)加入500μL Buffer重悬细胞。
(8)MS柱子放磁力架上。MS柱用500μL Buffer溶液洗一遍。
(9)细胞悬液加到MS柱中，收集流出液。
(10)用Buffer洗柱子3次。每次500μL。收集流出液。
(11)MS柱子离开磁力架，放到无菌管上方。
(12)加入1mL的buffer溶液到柱子中，用活塞用力推将细胞挤到无菌管中，管中即为CD34阳性造血干细胞。
(三)细胞培养
在37℃、5％二氧化碳培养箱中使用不同的培养基培养脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，每3天换一次液。根据细胞数量将细胞传代到合适大小的培养瓶中培养。具体如下：
每个实验组(共设4个实验组，每组设3个平行)初始1×105个造血干细胞加入1mL的培养基中，培养在24孔板，在37℃、5％二氧化碳条件下培养。每3天更换一次培养基。更换培养基时，1000rpm、5min离心，弃上清后，使用新的培养基重悬后，继续培养。当细胞密度达到70％以上时，更换为更大的细胞培养器皿。每组实验培养基成分如下：
实验组1：StemSpanTM SFEMⅡ(StemCell，Catalog#09655)培养基添加100ng/mL的SCF，100ng/mL的Flt-3L，100ng/mL的TPO，20ng/mL的IL-6，50ng/mL的TGF-β，50ng/mL的Notch配体，350nM的UM 171(造血干细胞激动剂)。
实验组2：StemSpanTM SFEMⅡ培养基(StemCell，Catalog#09655)添加100ng/mL的SCF，100ng/mL的Flt-3L，100ng/mL的TPO，100ng/mL的IL-6，5nM的17-AAG。
实验组3：X-VIVO 15(lonza，Catalog#:BE02-060F)培养基添加100ng/mL的SCF，100ng/mL的Flt-3L，100ng/mL的TPO。
实验组4：StemSpanTM SFEMⅡ培养基(StemCell，Catalog#09655)添加100ng/mL的SCF，100ng/mL的Flt-3L，100ng/mL的TPO，100ng/mL的IL-6。
第4、7、11、14、18、21天统计的总细胞数和CD34阳性造血干细胞数如表1、表2、图1、图2所示。可见，实验组2的效果最佳，明显优于实验组1和实验组3，在CD34阳性造血干细胞数方面，明显优于实验组4。
表1
Figure BDA0003856877660000051
表2
Figure BDA0003856877660000052
图3和图4为体外培养第7、18天流式检测的CD34阳性细胞结果，随着培养时间的延长，CD34阳性细胞所占比例会逐渐下降，因此，建议培养天数不超过14天。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (8)

1.一种用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，其特征在于，是由以下浓度的组分组成的：SCF，80～120ng/mL；TPO，80～120ng/mL；Flt-3，80～120ng/mL；IL-6，80～120ng/mL；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
2.根据权利要求1所述的用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，其特征在于，是由以下浓度的组分组成的：SCF，100ng/mL；TPO，100ng/mL；Flt-3，100ng/mL；IL-6，100ng/mL；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
3.一种用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，其特征在于，是由以下浓度的组分组成的：SCF，80～120ng/mL；TPO，80～120ng/mL；Flt-3，80～120ng/mL；IL-6，80～120ng/mL，3～7nM的17-AAG；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
4.根据权利要求3所述的用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外扩增的培养基，其特征在于，是由以下浓度的组分组成的：SCF，100ng/mL；TPO，100ng/mL；Flt-3，100ng/mL；IL-6，100ng/mL，5nM的17-AAG；余量为STEM Span SFEMⅡ培养基。
5.权利要求1～4中任一项所述的培养基在体外扩增脐带血CD34阳性造血干细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体应用时，使用权利要求1～4中任一项所述的培养基培养CD34阳性造血干细胞，每3～4天换液一次，培养7～14天。
7.一种脐带血CD34阳性造血干细胞的体外培养方法，其特征在于：使用权利要求1～4中任一项所述的培养基培养CD34阳性造血干细胞，每3～4天换液一次，培养7～14天。
8.根据权利要求7所述的脐带血CD34阳性造血干细胞的体外培养方法，其特征在于：所述CD34阳性造血干细胞是使用密度梯度离心和磁珠分选的方式从脐带血中分离得到的。
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