CN114015650A - 一种从脐血中诱导培养cik细胞的试剂盒及诱导培养cik细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒，包含三种试剂组分，具体为：试剂1：诱导培养基为500ml的X‑VIVO15培养基；试剂2：扩增培养基；试剂3：基础培养基。本发明还公开了一种从健康产妇的脐带血中诱导培养CIK细胞的方法，通过将脐带血中单个核细胞进行诱导，并经过相关体系培养，得到的CIK细胞不含胎牛血清等异源动物物质，细胞增殖倍数高，在培养第18天，可以达到细胞数量增殖90倍，并且细胞活率在90％以上。

Description

一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒及诱导培养CIK细胞 的方法

技术领域

本发明细胞培养技术领域，具体涉及一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒及诱导培养CIK细胞的方法。

背景技术

CIK细胞是将人体单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞具有增殖能力强、杀瘤活性强、杀瘤谱广、对正常骨髓造血前体细胞毒性小等特点。CIK细胞有多种杀瘤机制，可以对肿瘤进行直接杀伤，通过Fas/FasL信号通路诱导肿瘤细胞凋亡，CIK活化后产生大量细胞因子的抑制杀瘤作用,激活机体免疫系统，提高机体免疫功能，CIK细胞在治疗恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等均有应用。

脐带血具有免疫源性低，细胞更加原始受病毒污染小等优势，相关实验表明，脐带血来源的CD56^+X细胞群表达的细胞毒性颗粒蛋白、凋亡因子明显高于外周血。脐血CIK细胞体外扩增快、杀伤活性强，对肿瘤细胞的作用明显优于外周血CIK细胞，脐血CIK细胞以诱导肿瘤细胞坏死为主而外周血CIK细胞以诱导肿瘤细胞凋亡为主，所以从脐带血中分离CIK细胞具有极为重要的意义，从脐带血中诱导CIK细胞避免了临床患者受到第二次伤害，并且因为脐带血中背景纯净，消除从外周血中引入病毒和肿瘤细胞的风险，并且相对于外周血CIK有更强的杀瘤作用，比骨髓CIK有更强的增殖能力。

发明内容

为此，本发明的目的是，提供一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒及诱导培养CIK细胞的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒，包含三种试剂组分，具体为：

试剂1：诱导培养基为500ml的X-VIVO 15培养基，包括2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为5％自体血浆试剂；

试剂2：扩增培养基为500ml的X-VIVO 15培养基、2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为1％的自体血浆试剂；

试剂3：基础培养基为X-VIVO 15培养基，包括质量分数为5％的自体血浆试剂。

本发明还提供一种从健康产妇的脐带血中诱导培养CIK细胞的方法，包括以下操作步骤：

(1)从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞；

(2)第一天将计数后的单个核细胞悬液用基础培养基稀释成2×10⁶个/ml，转入到75cm²培养瓶，添加CD3 McAb和γ干扰素，CD3 McAb终浓度100ng/ml，γ干扰素终浓度1000IU/ml，放入培养箱培养，进行CIK诱导，所述CD3 McAb为可以识别CD3分子的单克隆抗体；

(3)第二天再向步骤(2)的培养细胞中加入白细胞介素-2，使得其终浓度为2000IU/ml后，进行CIK诱导；

(4)第五天添加诱导培养基扩大培养体积，使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml；

(5)每隔3天添加诱导培养基使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml，当细胞体积大于200ml时换成扩增培养基培养；

(6)第18天收获。

具体地，所述从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞的方法，包括以下操作步骤：

(1)将新鲜脐带血血袋，表面消毒后，移入生物安全柜，旋下注射器针头或三通管将全血注入250mL离心管中，室温1200rpm离心10min,分离出血浆和血细胞；

(2)准备盛有聚蔗糖试剂试剂和用于盛装血浆的离心管，并将管盖拧松，按如下公式计算聚蔗糖试剂量：

(3)离心结束后，用10mL移液管将上层血浆转入新的50mL离心管中；

(4)用生理盐水稀释血细胞沉淀，生理盐水与原全血体积的体积比为1:1，用移液管吹打混匀，稀释血细胞；

(5)将血细胞悬液缓慢加到聚蔗糖试剂层上，保持界面保持清晰，每管加35mL，室温2000rpm离心20min；

(6)离心结束后，共有四层：最上一层为盐水、血浆；其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成；第三层为聚蔗糖试剂；最下一层是沉淀的红细胞和粒细胞，将血细胞各组分分离出来；

(7)用10mL移液管先吸弃最上层液体，每管25mL；

(8)吸取第二层交界细胞层，转移至50mL离心管中，一般每两管Ficoll分离到的细胞合并至一管，但每管细胞悬液不得超过25mL，用RPMI-1640培养基补充至50mL，颠倒混匀，室温1200rpm离心10min，吸出淋巴细胞和单核细胞，并洗去聚蔗糖试剂；

(9)倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mL RPMI-1640培养基悬浮合并为一管，补RPMI-1640培养基至50mL，颠倒混匀后，室温1200rpm离心10min，继续清洗细胞；

(10)单个核细胞制备完成，备用。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒，通过将脐带血中单个核细胞进行诱导，并经过相关体系培养，得到的CIK细胞不含胎牛血清等异源动物物质，细胞增殖倍数高，在培养第18天，可以达到细胞数量增殖90倍，并且细胞活率在90％以上。CIK细胞纯度高，在第18天细胞纯度(CD3⁺CD56⁺)可以达到20％以上，方法重复度高，不加入其他动物成分。

附图说明

图1为细胞表型流式检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒，包含三种试剂组分，具体为：

试剂1：诱导培养基为500ml的X-VIVO 15培养基，包括2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为5％自体血浆试剂；

试剂2：扩增培养基为500ml的X-VIVO 15培养基、2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为1％的自体血浆试剂；

试剂3：基础培养基为X-VIVO 15培养基，包括质量分数为5％的自体血浆试剂。

本实施例还提供一种从健康产妇的脐带血中诱导培养CIK细胞的方法，包括以下操作步骤：

(1)从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞；

(2)第一天将计数后的单个核细胞悬液用基础培养基稀释成2×10⁶个/ml，转入到75cm²培养瓶，添加CD3 McAb和γ干扰素，CD3 McAb终浓度100ng/ml，γ干扰素终浓度1000IU/ml，放入培养箱培养，进行CIK诱导，所述CD3 McAb为可以识别CD3分子的单克隆抗体；

(3)第二天再向步骤(2)的培养细胞中加入白细胞介素-2，使得其终浓度为2000IU/ml后，进行CIK诱导；

(4)第五天添加诱导培养基扩大培养体积，使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml；

(5)每隔3天添加诱导培养基使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml，当细胞体积大于200ml时换成扩增培养基培养；

(6)第18天收获。

具体地，所述从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞的方法，包括以下操作步骤：

(1)将新鲜脐带血血袋，表面消毒后，移入生物安全柜，旋下注射器针头或三通管将全血注入250mL离心管中，室温1200rpm离心10min,分离出血浆和血细胞；

(2)准备盛有聚蔗糖试剂试剂和用于盛装血浆的离心管，并将管盖拧松，按如下公式计算聚蔗糖试剂量：

(3)离心结束后，用10mL移液管将上层血浆转入新的50mL离心管中；

(4)用生理盐水稀释血细胞沉淀，生理盐水与原全血体积的体积比为1：1，用移液管吹打混匀，稀释血细胞；

(5)将血细胞悬液缓慢加到聚蔗糖试剂层上，保持界面保持清晰，每管加35mL，室温2000rpm离心20min；

(6)离心结束后，共有四层：最上一层为盐水、血浆；其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成；第三层为聚蔗糖试剂；最下一层是沉淀的红细胞和粒细胞，将血细胞各组分分离出来；

(7)用10mL移液管先吸弃最上层液体，每管25mL；

(8)吸取第二层交界细胞层，转移至50mL离心管中，一般每两管Ficoll分离到的细胞合并至一管，但每管细胞悬液不得超过25mL，用RPMI-1640培养基补充至50mL，颠倒混匀，室温1200rpm离心10min，吸出淋巴细胞和单核细胞，并洗去聚蔗糖试剂；

(9)倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mL RPMI-1640培养基悬浮合并为一管，补RPMI-1640培养基至50mL，颠倒混匀后，室温1200rpm离心10min，继续清洗细胞；

(10)单个核细胞制备完成，备用。

试验1：细胞表型流式检测

细胞表型流式检测：细胞培养18天后，生理盐水重悬后计数。调节细胞悬液浓度后取150uL细胞悬液，分别加入抗体5uL避光孵育15分钟；抗体分别为小鼠抗人CD3-PE、CD56-FITC；孵育结束后，加入200uL流式鞘液中，用流式细胞仪检测，如图1所示，细胞符合CIK细胞的特征。

试验2：细胞增殖数量检测

细胞培养第18天混匀后，新鲜培养基重悬后计数，根据细胞计数结果绘制细胞数量表格，实验证明细胞活率大于90％，细胞数量大于10⁹。

样本编号

d0

d3

d5

d6

d8

d10

d12

d15

d18

样本1

3*10^7

2.43*10^7

7.56*10^7

1.27*10^8

2.29*10^8

3.45*10^8

7.86*10^8

9.45*10^8

1.02*10^9

样本2

3*10^7

2.66*10^7

9.23*10^7

1.30*10^8

2.47*10^8

4.83*10^8

1.30*10^9

1.88*10^9

2.70*10^9

试验3：细胞形态学特征

细胞生长及形态学特征：培养过程中，发现这种CIK细胞形态相对均一，增殖速度快，细胞悬浮生长状态，细胞较明亮，细胞状态好，培养18day后其形态及生长特点亦无明显改变。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (3)

1.一种从脐血中诱导培养CIK细胞的试剂盒，其特征在于，包含三种试剂组分，具体为：

试剂1：诱导培养基为500ml的X-VIVO 15培养基，包括2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为5％自体血浆试剂；

试剂2：扩增培养基为500ml的X-VIVO 15培养基、2000IU/ml的白细胞介素-2、质量分数为1％的自体血浆试剂；

试剂3：基础培养基为X-VIVO 15培养基，包括质量分数为5％的自体血浆试剂。

2.一种从健康产妇的脐带血中诱导培养CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞；

(2)第一天将计数后的单个核细胞悬液用基础培养基稀释成2×10⁶个/ml，转入到75cm²培养瓶，添加CD3 McAb和γ干扰素，CD3 McAb终浓度100ng/ml，γ干扰素终浓度1000IU/ml，放入培养箱培养，进行CIK诱导，所述CD3 McAb为可以识别CD3分子的单克隆抗体；

(3)第二天再向步骤(2)的培养细胞中加入白细胞介素-2，使得其终浓度为2000IU/ml后，进行CIK诱导；

(4)第五天添加诱导培养基扩大培养体积，使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml；

(5)每隔3天添加诱导培养基使细胞终浓度在2×10⁶～5×10⁶个/ml，当细胞体积大于200ml时换成扩增培养基培养；

(6)第18天收获。

3.根据权利要求1所述的一种从健康产妇的脐带血中诱导培养CIK细胞的方法，其特征在于，所述从新鲜脐带血血袋中制备脐带血单个核细胞的方法，包括以下操作步骤：

(1)将新鲜脐带血血袋，表面消毒后，移入生物安全柜，旋下注射器针头或三通管将全血注入250mL离心管中，室温1200rpm离心10min,分离出血浆和血细胞；

(2)准备盛有聚蔗糖试剂试剂和用于盛装血浆的离心管，并将管盖拧松，按如下公式计算聚蔗糖试剂量：

(3)离心结束后，用10mL移液管将上层血浆转入新的50mL离心管中；

(4)用生理盐水稀释血细胞沉淀，生理盐水与原全血体积的体积比为1:1，用移液管吹打混匀，稀释血细胞；

(5)将血细胞悬液缓慢加到聚蔗糖试剂层上，保持界面保持清晰，每管加35mL，室温2000rpm离心20min；

(6)离心结束后，共有四层：最上一层为盐水、血浆；其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成；第三层为聚蔗糖试剂；最下一层是沉淀的红细胞和粒细胞，将血细胞各组分分离出来；

(7)用10mL移液管先吸弃最上层液体，每管25mL；

(8)吸取第二层交界细胞层，转移至50mL离心管中，一般每两管Ficoll分离到的细胞合并至一管，但每管细胞悬液不得超过25mL，用RPMI-1640培养基补充至50mL，颠倒混匀，室温1200rpm离心10min，吸出淋巴细胞和单核细胞，并洗去聚蔗糖试剂；

(9)倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mL RPMI-1640培养基悬浮合并为一管，补RPMI-1640培养基至50mL，颠倒混匀后，室温1200rpm离心10min，继续清洗细胞；

(10)单个核细胞制备完成，备用。

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