CN111117957A - 一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法 - Google Patents

一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，具体涉及生物医药领域，S1、分离管制备：先将密度为1.075至1.0796g/ml的Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液2至6ml加入离心管，吸取密度为1.06至1.07g/ml的分离胶0.5至1.5ml加到离心管的管口，800至1200g离心力下室温水平离心1至3分钟，使分离胶在Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的液面形成隔离层即完成分离管制备；S2、外周血单个核细胞的分离：将抗凝全血2至6ml加入到制备好的分离管中，800至1200g离心力下室温水平离心8至12分钟；吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，直接将隔离层以上液体倾倒至收集管中，600至1000g离心力下室温离心4至6分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞。本发明可确保加入抗凝全血后绝对不与细胞分离介质混和，保证收获外周血单个核细胞时不污染其它细胞。

Description

一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法。
背景技术
外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)是指外周血中具有单个核的细胞，主要包含淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞、吞噬细胞和其他少量细胞类型。外周血单个核细胞是参与机体免疫应答功能的重要细胞，其细胞亚群的频率存在个体差异。70％-90％为淋巴细胞，单核细胞占10％-30％，仅1％-2％为树突状细胞。在淋巴细胞亚群中，70％-85％为CD3+T细胞，5％-20％是B细胞，NK细胞占5％-20％。外周血单个核细胞是感染性疾病、血液系统疾病，抗体药物和疫苗研发、肿瘤免疫治疗以及移植免疫等领域经常需要的研究材料，也可应用于单个亚群细胞特性或者亚群之间相互关系的研究。
目前分离外周血单个核细胞的经典方法是基于细胞分离介质Ficoll的密度梯度离心法。由于红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底。外周血单个核细胞比重小于或等于Ficoll比重，离心后位于Ficoll液面上。吸取Ficoll液面的细胞即可收获外周血单个核细胞。该方法具有两个明显缺点：1、操作繁琐：需逐层仔细加入Ficoll和抗凝全血以形成界限分明的分离介质层与血液层，离心前分离介质层与血液层的混合将导致分离失败；2、分离结束后需用吸管吸取外周血单个核细胞，此过程很容易受到其它细胞的污染。
鉴于现有技术的不足，现需要一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，不仅方便、高效，且可完全避免收获外周血单个核细胞细胞时受到其它细胞的污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，不仅方便、高效，且可完全避免收获外周血单个核细胞细胞时受到其它细胞的污染。
本发明提供了如下的技术方案：
一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，
S1、分离管制备：先将密度为1.075至1.0796g/ml的Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液2至6ml加入离心管，吸取密度为1.06至1.07g/ml的分离胶0.5至1.5ml加到离心管的管口，800至1200g离心力下室温水平离心1至3分钟，使分离胶在Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的液面形成隔离层即完成分离管制备；
S2、外周血单个核细胞的分离：将抗凝全血2至6ml加入到制备好的分离管中，800至1200g离心力下室温水平离心8至12分钟；吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，直接将隔离层以上液体倾倒至收集管中，600至1000g离心力下室温离心4至6分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞。
优选的，S1步骤中，将密度为1.075至1.0796g/ml的Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液4ml加入容积为15ml的离心管内，吸取密度为1.06至1.07g/ml的分离胶1ml加到离心管的管内，1000g离心力下室温水平离心2分钟。
优选的，S1步骤中，分离胶与Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的体积比为1:4至1:3，分离胶和细胞分离液总体积与分离管的体积比为1:2至1:1.5。
优选的，S2步骤中，将抗凝全血4ml加入到制备好的分离管中，抗凝全血与Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的体积比为1:1；1000g离心力下室温水平离心10分钟；吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，并将隔离层以上液体倾倒至收集管中，800g离心力下室温离心5分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞。
优选的，S2步骤中，吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，吸弃液体积与抗凝全血的体积比为1:3。
本发明的有益效果：
(1)本发明分离管制备简便：离心管加入一定密度的分离介质后，在离心管管口加入一定密度的分离胶经水平离心后就可制备；由于分离胶形成的不通透隔离层的存在，可运用吸取或倾倒等方式直接获得高纯度的外周血单个核细胞，方便、高效，并可完全避免收获外周血单个核细胞细胞时受到其它细胞的污染；
(2)本发明先加入Percoll分离介质后再加入具有触变性特点的分离胶，经离心后分离胶在Percoll分离介质液面形成不通透的隔离层，通过本方法制备的分离管可保证加入抗凝全血后绝对不与Percoll分离介质混和；通过离心分离后，隔离层将上方的外周血单个核细胞层与其它细胞有效分开，可通过直接倾倒等方式方便获得高纯度的外周血单个核细胞；
(3)本发明的外周血单个核细胞分离管有分离胶预先将细胞分离介质完全隔离，保证加入的抗凝全血在离心前绝对不会与分离介质发生混匀；且本发明Percoll的密度为1.075-1.0796g/ml，经离心后，红细胞、粒细胞等沉于管底，而外周血单个核细胞则位于血浆与Percoll分离液的交界面；使用具有触变性特点的分离胶，其密度为1.06-1.07g/ml；经离心后，在外周血单个核细胞细胞层下方形成一个不通透的隔离层，将外周血单个核细胞与非目的细胞有效分开。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的流程示意图；
图2为传统的经典方法与分离管方法收获外周血单个核细胞数量对比图；
图3为分离管分离外周血单个核细胞细胞形态；
图4为传统的经典方法分离外周血单个核细胞细胞形态。
具体实施方式
本申请的方法实施例：
采用同一来源的人外周抗凝全血重复三次，具体如下：
首先进行分离管制备:15ml离心管中先加入4ml密度为1.075-1.0796g/ml的Percoll细胞分离液，吸取1ml密度为1.06-1.07g/ml的分离胶加到离心管管口，1000g室温水平离心2分钟，分离胶在Percoll细胞分离液液面形成隔离层；
然后进行外周血单个核细胞的分离：吸取4ml抗凝全血加入到制备好的15ml分离管中，此时上下颠倒分离管，可见抗凝全血与分离介质绝对不会发生混匀；1000g室温水平离心10分钟后，在邻近分离胶层上方形成肉眼可见的外周血单个核细胞细胞层，而红细胞则完全沉积于管底；吸弃最上面1ml液体后可直接将隔离层以上液体倾倒至收集管中，不会导致其它细胞对外周血单个核细胞造成污染；800g室温离心5分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞；
传统经典方法实施例：
同一来源的人外周抗凝全血分别用经典方法重复三次，具体如下：
经典方法是逐层仔细加入4ml Ficoll和4ml抗凝全血后，400g室温水平离心25分钟，小心吸取Ficoll分离液液面上的外周血单个核细胞层，800g室温离心5分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞；将两种方法收获的外周血单个核细胞用血细胞计数板计数。
经典方法与本申请的分离管分离外周血单个核细胞细胞形态以及收获效率比较如下：
经典方法4ml外周抗凝全血收获外周血单个核细胞细胞数量为1.5267×106，分离管4ml外周抗凝全血收获外周血单个核细胞细胞数量为2.3867×106。两组比较有显著性差异(T＝6.56，p<0.01，n＝3)(参见图2)，提示该分离管可明显提高外周血单个核细胞的收获效率。两种方法分离得到的外周血单个核细胞在光镜下观察细胞形态一致，几乎没有其它非目的细胞的污染(参见图3和图4)。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于：S1、分离管制备：先将密度为1.075至1.0796g/ml的Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液2至6ml加入离心管，吸取密度为1.06至1.07g/ml的分离胶0.5至1.5ml加到离心管的管口，800至1200g离心力下室温水平离心1至3分钟，使分离胶在Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的液面形成隔离层即完成分离管制备；
S2、外周血单个核细胞的分离：将抗凝全血2至6ml加入到制备好的分离管中，800至1200g离心力下室温水平离心8至12分钟；吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，直接将隔离层以上液体倾倒至收集管中，600至1000g离心力下室温离心4至6分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于：S1步骤中，将密度为1.075至1.0796g/ml的Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液4ml加入容积为15ml的离心管内，吸取密度为1.06至1.07g/ml的分离胶1ml加到离心管的管内，1000g离心力下室温水平离心2分钟。
3.根据权利要求1所述的一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于：S1步骤中，分离胶与Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的体积比为1:4至1:3，分离胶和细胞分离液总体积与分离管的体积比为1:2至1:1.5。
4.根据权利要求1所述的一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于：S2步骤中，将抗凝全血4ml加入到制备好的分离管中，抗凝全血与Percoll或聚蔗糖或泛影葡胺细胞分离液的体积比为1:1；1000g离心力下室温水平离心10分钟；吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，并将隔离层以上液体倾倒至收集管中，800g离心力下室温离心5分钟，用PBS重悬细胞后即可获得外周血单个核细胞。
5.根据权利要求1所述的一种用于分离外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于：S2步骤中，吸弃最上面液体以去除细胞碎片和血小板，吸弃液体积与抗凝全血的体积比为1:3。
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