BR112015014270B1 - co-diferenciação de monócitos a partir de doadores alogênicos - Google Patents

Abstract

resumo da patente de invenção para: “co-diferenciação de monócitos a partir de doadores alogênicos”. a presente invenção descreve um método de produção de células dendríticas imaturas não esgotadas (dcs) proveniente de dois doadores alogênicos diferentes. no método, uma mistura de leucócitos alogênicos, em que os leucócitos alogênicos foram obtidos a partir de pelo menos dois doadores alogênicas diferentes é fornecido. subsequentemente, monócitos alogênicos são isolados a partir da mistura de leucócitos alogênicos. depois disso, as dcs imaturas não esgotadas são geradas a partir dos referidos monócitos alogénicos isolados.

Description

(54) Título: CO-DIFERENCIAÇÃO DE MONÓCITOS A PARTIR DE DOADORES ALOGÊNICOS (73) Titular: IMMUNICUM AB. Endereço: GRAFISKA VÀGEN 2, 412 63 GÕTEBORG, SUÉCIA(SE) (72) Inventor: ALEX KARLSSON-PARRA; BENGT ANDERSSON.

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 18/12/2013, observadas as condições legais

Expedida em: 04/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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CO-DIFERENCIAÇÃO DE MONÓCITOS A PARTIR DE DOADORES ALOGÊNICOS.

Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a um método para a produção de células dendríticas humanas (DC) derivadas de monócitos imaturos não esgotados.

Antecedentes da Invenção [002] Terapias de câncer tradicionais, tais como cirurgia, radiação e quimioterapia, são muitas vezes insuficientes no tratamento de pacientes e, geralmente, causam efeitos colaterais graves.

[003] A imunoterapia tem se mostrado promissora como um método de tratamento alternativo com menos efeitos secundários negativos.

[004] Está agora bem estabelecido que o sistema imune tem células, em particular, linfócitos T citotóxicos CD8 + (CTLs), que podem reconhecer e matar as células potencialmente tumorais. No entanto, um problema importante é que a capacidade de matança destas células T são induzidas ou não ou apenas fracamente induzida em pacientes com câncer. Uma possibilidade é que não é inadequada a apresentação de antígenos tumorais e a co-estimulação por células dendríticas (DC), Adjuvante naturais para provocar uma imunidade funcional de células T e específicos do tumor em pacientes com câncer.

[005] Existentes estratégias de imunoterapia cancerígenas que focam principalmente em antígenos autólogos carregados, as DCs derivadas de pacientes, que foram diferenciadas e antígenos carregados ex vivo. A premissa

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2/46 subjacente a esta abordagem é que a eficiência e controle fornecido por manipulação ex vivo de DC gera DCs com forte antígeno e apresentando a capacidade de co-estimulação. A qualidade da resposta de células T depende da capacidade destas DC autólogas para apresentar antígenos tumorais para células T de uma forma restrita às moléculas MHC (DCs e células T tem que ser a partir do mesmo indivíduo) , em gânglios linfáticos de drenagem e, assim, criam uma resposta de células T tumor-específico.

[006] As DCs autólogas, monócitos-derivados são as DCs mais comumente utilizadas em estudos-piloto, uma vez que é possível obter bilhões de monócitos a partir de leucócitos de sangue periférico recolhidos por leucaferese, um processo laborioso e demorado, em que as células brancas do sangue são separadas do sangue circulante. Vários métodos estão disponíveis para posteriormente enriquecer os monócitos e dois destes métodos, elutriação e isolamento anticorpo / grânulo, também pode ser realizado em conformidade com as Diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (GMP).

[007] Os monócitos são subsequentemente cultivados em meio suplementado com GM-CSF e IL-4 durante 4 a 7 dias, levando a sua diferenciação dentro de DC imaturas, as quais DC imaturas são caracterizadas pela sua excelente capacidade para produzir grandes quantidades de quimiocinas próinflamatórios e citocinas mediante a subsequente estimulação com certos tipos de fatores (Sallusto et al, Eur J Immunol,1999. 29: 1617; Napolitani et al, Natuer Immunology 2005. 6:769). As DC estimuladas são geralmente pré-pulsadas com antígeno de tumor relevante (s) e ativada por 1 a 2 dias

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3/46 antes da vacinação. No entanto, as respostas imunes a estas vacinas baseadas em DC são muitas vezes fracas, e as respostas clínicas são raramente completas e de longa duração.

[008] Pouco tem sido conhecido sobre o destino e função de DC autólogas ex vivo geradas depois de terem sido injetadas. Na configuração humana, o padrão de migração de vacinas DC injetadas foi recentemente rastreado in vivo e, em particular, menos de 5% da DC injetadas atingiram os nódulos linfáticos de drenagem, enquanto a maioria das DCs permaneceram no local da injeção. Estas vacinas DCs presas localmente rapidamente perdem a sua viabilidade e foram subsequentemente liberadas por células apresentadoras de antígeno recrutadas.

[009] Os dados foram agora fornecidos, que vacinas injetadas de DCs que foram ativadas ex vivo durante um período de tempo limitado (ou seja, 6 a 18 h) tornam-se próinflamatória (PI) as DCs, que são capazes de indiretamente promover células T CD8 + nativas in vivo atuando como um adjuvante imune local puro. Esta função de adjuvante injetado PI-DCS é estritamente dependente da sua secreção contínua de certas quimiocinas CC e recrutamento de células NK no momento da administração (após a remoção dos fatores de ativação). Tal PI-DCs também expressa / secretam fatores que induzem a ativação de células NK e DCs recrutados endogenamente no local da vacinação. Em contraste com PI-DCs, de longo prazo (isto é, > 24 horas) ativado DCs, que têm sido utilizadas em ensaios clínicos, são caracterizados pelo seu estado esgotados (Langenkamp et al., 2000), e, portanto, incapazes

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4/46 de secretar quimiocinas e fatores de ativação de DC desejáveis no momento da administração.

[0010] Em conclusão, a PI-DC não só pode agir como estimuladores diretos de células T autólogas de MHCcompatíveis, mas também atuar como um adjuvante a produção de grandes quantidades de quimiocinas pró-inflamatórias e citocinas no momento da administração. A injeção local de PIDC irá conduzir ao recrutamento e ativação de outras células imunes, incluindo células NK e DC-precursores circulantes. Se as PI-DCs injetadas foram pré-carregado com antígenos tumorais relevantes ou injetado diretamente em uma lesão tumoral existente, DCs endógenos recrutados englobará as células vacinais que morrem expressando antígenos tumorais relevantes ou matando as células tumorais expressando antígeno, respectivamente. Após a ativação, essas DCs endógenas recrutadas e subsequentemente carregadas com antígeno migrarão para os linfonodos de drenagem se forem células T específicas para tumores em um modo restrito ao MHC (Liu et al, 2008) . Esta conclusão é apoiada por dados de vários estudos pré-clínicos recentes, em que o crescimento do tumor foi significativamente reduzido em vacinas terapêuticas com MHC-incompatível não-esgotados, alogênico PI-DCs (Alder et al 2008, Siders et al 2009, Edlich et al 2010) .

[0011] A forte função adjuvante por PI-DCs, que não requerem compatibilidade com MHC entre PI-DCs e células T de pacientes, portanto, introduz a possibilidade de usar PI-DCs pré-produzidas e armazenadas congeladas em MHC, alogênicos Prontas, representando uma alternativa viável e prática às atuais vacinas DC específicas para pacientes, feitas sob

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5/46 medida. 0 uso de tais MHC-incompatível, alogênico, PI-DCs é divulgado no Documento EP 1 509 244 BI e Documento WO 2011/098516 .

[0012] Por razões éticas, compras em larga escala de monócitos a partir de doadores de sangue normais por leucoforese com o único propósito de produção de vacinas em grande escala comercial para utilização clínica não é viável. Na prática, a matéria-prima disponível, isto é, monócitos, para a produção de PI-DC é, portanto, restrita a monócitos obtidos a partir de resíduos do produto (tampão leucocitário e/ou utilizados filteers leucócitos depeltion) no decurso de separar leucócitos não desejados a partir de diferentes componentes do sangue inteiro ou monócitos obtidos a partir de tampão leucocitário nos bancos de sangue.

[0013] No entanto, o número total de monócitos, que podem ser isolados a partir de cada tampão leucocitário ou de cada bolsa de sangue por filtro de leucócitos de depleção é geralmente menos do que 200 milhões de pessoas (Ebner S et al., Generation of large em umbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters: an alternative to standard tampão leucocitários J Immunol Methods 252 (2001), que conduzem a custos elevados inaceitáveis para o enriquecimento e subsequente DCdiferenciação de lotes separados de monócitos (cada lote derivado de um único doador) com métodos que estão em conformidade com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF) de acordo com o estado da técnica.

[0014] Assim, existe uma necessidade no estado da técnica de um método para a produção em grande escala e grau

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6/46 clínico eficaz em termos de custos de células dendríticas imaturas não esgotadas a partir de monócitos contendo-produto residual derivado de bancos de sangue.

Sumário da Invenção [0015] Por conseguinte, a presente invenção visa mitigar, aliviar, eliminar ou contornar uma ou mais das deficiências potenciais acima identificadas no estado da técnica e desvantagens isoladamente ou em qualquer combinação, fornecendo um método de produção de células dendríticas imaturas não esgotadas (DCs) provenientes de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos. No método, uma mistura de leucócitos alogênicos, em que os leucócitos alogênicos foram obtidos a partir de pelo menos dois doadores diferentes alogênicos é fornecido. Subsequentemente, monócitos alogênicos são isolados a partir da mistura de leucócitos alogênicos para fornecer leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos. Depois disso, as DCs imaturas não esgotadas são geradas a partir dos leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos, por co-cultura de leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos durante 2 a 7 dias de cultura de células em meio aquoso isento de soro não-humano. O meio é suplementado com interleucina-4 (IL-4) e fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

[0016] Em contraste com a desvantagem prevalecente, as células dendríticas imaturas não esgotadas derivadas de monócitos são geradas, e, assim, capaz de produzir quantidades substanciais de quimiocinas pró-inflamatórias e citocinas pró-inflamatórias de forma sustentada subsequente à ativação em DCs pró-inflamatórias. Assim, o método representa

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7/46 um método de produção econômico em escala clínica e em larga escala de células dendríticas imaturas não esgotadas.

[0017] Um aspecto adicional da invenção relaciona-se com uma mistura de células dendríticas alogênicas imaturas não esgotadas (DC) provenientes de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos. Uma tal mistura pode ser obtida pelo método descrito.

[0018] Um outro aspecto da invenção se refere a um método de produção de DCs pró-inflamatórias. Ao ativar as DCs imaturas não esgotados DCs pró-inflamatórias são obtidos. Por um tal método, uma mistura de células dendríticas próinf lamatórias alogênicas provenientes de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos pode ser obtido. A mistura pode ser formulada em uma composição farmacêutica que compreende ainda pelo menos um veículo farmacêutico aceitável. A mistura e a composição farmacêutica, respectivamente podem ser utilizadas para o tratamento do câncer.

[0019] Outras características vantajosas da invenção estão definidas nas reivindicações dependentes. Além disso, as características vantajosas da invenção são elaboradas pelas concretizações aqui divulgadas.

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas [0020] Os presentes inventores contemplam que populações de leucócitos contendo monócitos estão presentes em tampãos leucocitários ou preso em filtros de remoção de leucócitos utilizados para esgotar os leucócitos do sangue total (utilizado para o enriquecimento de células vermelhas do sangue) ou filtros de remoção de leucócitos utilizados

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8/46 para esgotar os leucócitos a partir de tampão leucocitário (utilizados para enriquecimento de plaquetas), pode potencialmente ser usado em larga escala e produção rentável de células dendríticas imaturas não esgotadas.

[0021] Como mostrado anteriormente, os leucócitos retidos por diferentes tipos de filtros de remoção de leucócitos pode ser recuperado por lavagem com um meio de back- adequado, seguido de enriquecimento de monócitos (Ebner S et al., Generation of large em umbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters: an alternative to standard tampão leucocitários J Immunol Methods 252 (2001) 93-104; e Meyer T P H et al, Filter Tampão leucocitários (FBC): A source of peripheral blood leukocytes recovered from leukocyte depletion filters. J Immunol Methods 307 (2005) 150-166).

[0022] Um tampão leucocitário é a fração de uma amostra de sangue anti-coagulado que contém a maioria dos leucócitos, incluindo os neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos e linfócitos e plaquetas seguintes densidade gradiente de centrifugação de sangue total. Os tampões leucocitários são normalmente usados como matéria-prima para a produção de plaquetas. Durante este processo, a redução de

leucócitos por	um filtro	de	depleção de	leucócitos é
realizada após	a partilha	de	4-8 tampões	leucocitários.
Tipicamente, o	equipamento	ou	sistema Tacsi	theOrbiSac é
utilizado para o	isolamento	de	plaquetas a partir de tampões

leucocitários.

[0023] O equipamento Tacsi para preparação de plaquetas a partir de tampão leucocitário reunidos contém um

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9/46 sistema de caixa (fixo no rotor) e uma inserção que pode ser removida para a montagem do kit Tacsi. Cada caixa de sistema é fornecido com um sistema de pressão, controlado e monitorado por um microprocessador individual. Em uma primeira sequência, um grupo de tampão leucocitário dentro do recipiente de agrupamento é sedimentado por centrifugação em uma posição vertical. Na etapa seguinte, a camada rica em plaquetas (também contendo uma quantidade substancial de leucócitos, incluindo monócitos e linfócitos) do sobrenadante de tampão leucocitário reunido é transferido para um recipiente de armazenamento através da ativação do sistema de press em cada caixa. Além disso, o filtro para leucodepleção está integrado no kit Tacsi entre o saco de processamento e o recipiente de armazenamento final. 0 filtro de remoção de leucócitos e o resto do tampão leucocitário dentro do recipiente de tampão leucocitário agrupado, ambos contendo uma quantidade substancial de monócitos, em seguida, são descarregados.

[0024] No sistema alternativo OrbiSac para o enriquecimento de plaquetas automatizado, o contentor de tampão leucocitário agrupados está em forma de anel. Após centrifugação, a parte central rica em plaquetas do sobrenadante é transferido para um recipiente colocado no centro da centrífuga e a transferência é efetuada por meio de um filtro depleção de leucócitos integrada. O filtro de remoção de leucócitos e o resto do tampão leucocitário agrupado dentro do recipiente de tampão leucocitário, ambos contendo uma quantidade substancial de monócitos, é, então, descarregada.

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10/46 [0025] Em resumo, os métodos do estado da técnica para enriquecimento de plaquetas a partir de tampão leucocitário fornecem duas fontes possíveis de monócitos, isto é, o resto do tampão leucocitário a ser esvaziado de plaquetas, também denotado tampão leucocitário de plaquetas empobrecidas, e o filtro de depleção de leucócitos. A depleção de plaquetas de tampão leucocitário e o filtro de depleção de leucócitos cada um contém uma mistura de leucócitos, incluindo até 1 bilhão de monócitos. No entanto, estes monócitos são alogênicos em relação uns aos outros, uma vez que de origem a partir dos diferentes doadores alogênicos, devido ao agrupamento de tampão leucocitário antes da depleção de plaquetas.

[0026] Tampão leucocitário agrupado, contendo plaquetas, ou filtros obtidos após a remoção de leucócitos do sangue completo irá maximamente só se fornece a cerca de 100 a 200 milhões de monócitos por tampão leucocitário ou filtro. Por isso, eles devem ser tratados em conjunto a fim de proporcionar um número suficiente para a relação custoeficácia da produção de GMP-DC imaturas não esgotadas.

[0027] Semelhante a leucócitos obtidos a partir da produção de plaquetas a partir de leucócitos de tampões leucocitários agrupados, contendo plaquetas, ou filtros usados para esgotar o sangue total a partir de leucócitos também irá consistir de uma população mista de células provenientes de diferentes doadores alogênicos.

[0028] Agrupamento de leucócitos de pelo menos 5 a 10 do tampão leucocitário ou agrupamento de leucócitos eluídos a partir de pelo menos 5 a 10 filtros de leucócitos no sangue

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11/46 total iria, pelo menos teoricamente, resolve o problema de proporcionar um número suficiente de leucócitos para produção de baixo custo e em grande escala de grau clínico de DCs imaturas não esgotadas.

[0029] Da mesma forma, tampão leucocitário agrupado, empobrecido em plaquetas e/ou filtros de depleção de leucócitos utilizados para o enriquecimento de plaquetas a partir de tampão leucocitário podem potencialmente ser utilizado para proporcionar um número suficiente de leucócitos para grande escala e produção de grau clínico eficaz em termos de custos de DCs imaturas não esgotadas.

[0030] Como mostrado anteriormente, os leucócitos retidos por filtros de depleção de leucócitos podem ser recuperados por lavagem com um meio de back-adequado, seguido de enriquecimento de monócitos (Ebner S et al., Generation of large em umbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters: an alternative to standard buffy coats J Immunol Methods 252 (2001) 93-104; and Meyer T Ρ H et al, Filter Buffy Coats (FBC) : A source of peripheral blood leukocytes recovered from leukocyte depletion filters. J Immunol Methods 307 (2005) 150-166).

[0031] No entanto, um problema associado com a prevista a subsequente co-cultura de leucócitos enriquecida de monócitos, os quais são derivados de diferentes doadores, alogênicos, é que a sua incompatibilidade, como a do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e antígenos da classe II é considerada para conduzir a uma ativação prematura de monócitos / DC imaturas a partir de um doador de células T alorreativas contaminante e/ou células

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12/46 assassinas naturais a partir de outro doador.

[0032] A co-cultura em meio de cultura celular padrão, tais como RPMI-1640 (= RPMI Roswell Park Memorial Institute, neste instituto o meio original foi desenvolvido por Moore et. Al.) com soro fetal de vitelo, ou em meio de cultura celular livre de soro, tal como X-Vivo 15, de células mononucleares, incluindo linfócitos, monócitos e células NK, a partir de dois doadores alogênicos é conhecido por induzir a produção de fatores de DC-activadores bem conhecidos, incluindo o TNF-alfa (Laurin et al, Transplantation 2004; 77: 267; Wallgren et al, Scand J Immunol 2005; 62: 234) . Além disso, a adição de sobrenadantes de cultura, tais co-culturas em meio RPMI-1640 padrão com soro de vitelo fetal ou meio isento de soro padrão de células mononucleares alogenênicas têm sido repetidamente demonstrados a induzir ativação / maturação de derivados de monócitos, imaturos, as DCs (Laurin et al, Transplantation 2004; 77: 267; Wallgren et al, Scand J Immunol 2005; 62:234).

[0033] Além disso, a adição de TNF-alfa para meio RPMI-1640 padrão suplementado com GM-CSF e IL-4 usado para a diferenciação de monócitos em DCs imaturas foi mostrado para induzir a ativação prematura e subsequente exaustão (tolerância) de DC diferenciadas (Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-a and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112 - 3117).

[0034] O problema com contaminação das células T e as células NK é de relevância, mesmo depois de GMPenriquecimento (elutriação e isolamento de anticorpo /

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13/46 grânulo) de monócitos a partir de tampão leucocitário ou reunidos a partir de filtros de supressão de leucócitos (Schwanke et al, Journal of Clinicai aférese 21: 153-157 (2006); Meyer et al, Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166), devido à dificuldade em preparar as populações de células de monócitos essencialmente livres de contaminar células T e células NK.

[0035] Além disso, e, mais importante, não só a cocultura com linfócitos alogênicos em meio padrão, mas também a co-cultura de monócitos alogênicos com neutrófilos em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal de vitelo, resulta em super-regulação de membrana CD40, CD86, e o antígeno de leucócitos humanos (HLA) -DR em DCs, isto é, a ativação prematura, como tem sido demonstrado por Meggiovanni et al (cf. Journal of Leukocyte Biology, 2006; 79; 977-988). Remoção substancial dos neutrófilos dos monócitos dentro de tampões leucocitários comuns, seja filtro de leucócitos eluídos utilizando elutriação (Schwanke et al, Journal of Clinicai aférese 21: 153-157 (2006)) ou isolamento de anticorpo / isolamento talão (Meyer et al, Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166) demonstrou ser muito difícil. Normalmente, tal produto enriquecido em monócitos contém uma quantidade significativa (isto é, 25 40% com base no número total de células presentes) de neutrófilos. A partir de uma perspectiva de segurança esta contaminação de neutrófilos não é, contudo, um problema.

[0036] Além disso, mesmo que fosse possível preparar 100% populações de células de monócitos puros, isto não elimina o risco de ativação prematura devido às interações

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14/46 ativas entre monócitos de doadores diferentes, alogênicos. Em um artigo de revisão recente intitulado Origin and biology of the allogeneic response”, pelos imunologistas ilustres e renomados Fadi G. Lakkis e Robert I. Lechler (cf. Cold Spring Harbor perspectives in medicine, Vol. 3, No. 8, 2013) era concluir que um mecanismo inato de alorreconhecimento de fato existe. Os autores afirmam que: rejeição do aloenxerto não é restrita a animais vertebrados dotados com sistemas imunes adaptativos, mas é comum a muitos organismos invertebrados gue antecedem a evolução da imunidade adaptativa (animais gue não possuem linfócitos T e B, células NK, genes somáticos enzimas de rearranjo e o MHC .

[0037] Além disso, e talvez mais diretos, respostas alogênicas são também vista em camundongos desprovidos de células linfóides. Ativação de monócitos depende de diferenças de antígenos não-MHC entre monócitos beneficiários e injetado leucócitos de doadores alogênicos, incluindo monócitos alogênicos (Zecher D et al, An inata Response to alogênico não-eu Mediada por monócitos. J Immunol 83 (2009) 7810-7816). Zecher et al., mostrou que a injeção de leucócitos alogênicos no pavilhão auricular de RAG2 / 2 mouses, falta linfócitos T e B, provoca significativamente maior inchaço e infiltração da pele com células mielóides de acolhimento do que injetar leucócitos singêneicos. A resposta para os leucócitos alogênicos ocorreu independentemente de células NK e foi mediada por monócitos. Além disso, a resposta de monócitos foi allodeterminants não ligado ao MHC.

[0038] Em um papel ainda mais recente (Zeng Q, et al. Innate recognition of allogeneic non-self induces monocyte

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15/46 differentiation to mature dendritic cells in vivo. Am J Transplant 12: 148-148, 2012), os autores mostraram que aloenxertos cardíacos transplantados para camundongos GC2 / 2RAG2 / 2, que carecem de células T, B e NK, são rapidamente infiltrados por monócitos do hospedeiro que se diferenciam em, IL-12 que expressam as células dendriticas maduras (DC). Os determinantes de células alogênicas que provocam maturação monócitos hospedeiros, e os receptores de monócitos putativos que eles reconhecem, no entanto, ainda não são conhecidos.

[0039] Existe, assim, uma clara evidência de que os monócitos de mamífero respondem diretamente a determinantes não-MHC nas células alogênicas independentemente de células T, Β, NK e. Assim, de acordo com a percepção geral vigente, aloreatividade é considerada ser uma propriedade geral de monócitos.

[0040] Tomados em conjunto, isto implica que a cocultura das populações de células enriquecidas em monócitos derivadas a partir de diferentes doadores alogênicos claramente que está previsto para conduzir a pré-ativação e subsequente exaustão dos monócitos durante a sua diferenciação em DCs derivadas de monócitos. Deste modo, a DC será incapaz de se tornar PI-DCs produzindo fatores necessários adjuvantes de uma forma sustentada quando reestimuladas com fatores ativadores relevantes.

[0041] Esta previsão de ativação induzida por exaustão é semelhante ao esgotamento bem conhecido de monócitos, macrófagos e células dendriticas que é induzida por uma ativação prematura com os agentes inflamatórios, como o TNF-a (Park et al, Nat Immunol 2012; 12:607 - 615) ou

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16/46 lipopolissacarídeos (LPS) microbianos (Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-a and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112-3117; Langenkamp A et al., Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nature Immunol. 1 (2000) 311-316) .

[0042] Os presentes inventores verificaram, surpreendentemente, que, no entanto, DC imaturas não realmente esgotadas podem ser propagadas a partir de uma população de células iniciais que consiste de uma mistura de leucócitos enriquecidos de monócitos alogênicos, a partir de diferentes doadores alogênicos, de um modo semelhante ao usado para propagar DC imaturas não-esgotada a partir de monócitos enriquecidos, que são derivados de um único doador (documento WO 2011/098516), ou seja, através da utilização de uma cultura de células de meio aquoso isento de soro nãohumano, mas complementado com interleucina-4 (IL-4) e de fator estimulador de colônias granulócitos-macrófagos (GMCSF) .

[0043] Em contraste com a desvantagem prevalecente, a propagação de uma mistura de monócitos enriquecidos a partir de diferentes doadores alogênicos, em DC imaturas sob certas condições foi surpreendentemente demonstrado que não resultam na ativação precoce e subsequente exaustão das DCs. Estas condições incluem a co-cultura em cultura de células aquosa meio isento de soro não-humano e suplementado com GM-CSF e IL-4.

[0044] No entanto, a co-cultura em cultura de células

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17/46 aquosa de meio isento de soro não humano e não complementado com interleucina-4 (IL-4) e de fator estimulador de colônias granulócitos-macrófagos, bem como da co-cultura em meio de cultura celular aquosa compreendendo soro não humano, por exemplo, soro de vitelo de bovino, e suplementado com interleucina-4 (IL-4) e fator estimulador de colônias granulócitos-macrófagos, conforme o esperado e reconhecido no estado da técnica resultar em ativação prematura e exaustão posterior das DCs.

[0045] Assim, os monócitos podem ser isolados a partir de populações de leucócitos obtidos a partir de diferentes doadores alogênicos, tornando-se possível realizar em larga escala e de baixo custo GMP-enriquecimento de monócitos, tais como elutriação (Elutra) ou isolamento anticorpo / grânulo (CliniMacs). Posteriormente, DC imaturas não esgotadas podem ser geradas a partir dos isolados leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos na ausência de ativação prematura.

[0046] Estas DCs imaturas não esgotados podem ser usadas para propagar DCs-pró-inflamatório, que são destinadas a funcionar como uma vacina anti-tumoral quando injetados intratumoralmente (ver documento WO 2011/098516). Além disso, as DCs imaturas não esgotadas de diferentes doadores, alogênicos, pode ser carregado com antígeno (s) tumorais antes da ativação, a fim de produzir uma vacina celular alogênica completa anti-câncer (ver EP 1 509 244 Bl) que pode ser injetado em locais diferentes, incluindo intratumoral, subcutânea, epicutânea, intramuscular e/ou locais intravenosos.

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18/46 [0047] Uma concretização se refere, assim, a um método para produzir DC imaturas não esgotadas a partir de uma mistura de leucócitos alogênicos enriquecida de monócitos. Em tal método, uma mistura de leucócitos alogênicos, obtido a partir de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos, é fornecida. De acordo com uma concretização, dois doadores diferentes, alogênicos pretende significar que os dois indivíduos que doam leucócitos, são da mesma espécie, mas de diferente constituição genética, isto é, antigenicamente distinto. Como já foi descrito, os leucócitos alogênicos podem ser obtidos a partir de tampão leucocitário agrupados ou por eluição a partir de filtros de leucócitos de leucócitos-exaustão utilizados. Monócitos alogênicos são então isolados a partir da mistura fornecida de leucócitos alogênicos. Posteriormente, DC imaturas não esgotados são geradas a partir dos isolados leucócitos alogênicos enriquecida de monócitos.

[0048] Exceto para a capacidade de realizar em larga escala e de baixo custo GMP-enriquecimento de monócitos, uma outra vantagem de DCs imaturas não esgotadas, proveniente de uma mistura de monócitos alogênicos derivados de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes, é que a variação normal biológica quanto à produção de diferentes fatores próinflamatórias no momento da ativação, conhecida por existir entre a PI-DCs de doadores diferentes, será reduzida.

[0049] Em uma concretização preferida, os leucócitos alogênicos são fornecidos através do agrupamento de, pelo menos, dois tampões leucocitários, compreendendo leucócitos. Os tampões leucocitários para serem agrupados são obtidos a

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19/46 partir de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos. Os tampões leucocitários combinados podem conter plaquetas ou podem ser depletados em plaquetas.

[0050] Leucócitos alogênicos também pode ser fornecidos por eluição a partir de leucócitos, pelo menos, dois filtros de depleção de leucócitos, que filtra, respectivamente, foram anteriormente utilizados para esgotar os leucócitos do sangue total, a partir de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes. Depois da eluição, os leucócitos obtidos são reunidos para se obter uma mistura de leucócitos alogênicos. Evidentemente, mas menos preferido, o sangue completo pode também ser combinado antes da depleção de leucócitos. Um procedimento para a eluição a partir de leucócitos de um filtro de depleção, que o filtro tenha sido previamente utilizado para eliminar leucócitos a partir de sangue total, tem sido descrito por Ebner et al (cf. Journal of Immunological Methods 252 (2001) 93-104).

[0051] Da mesma forma, os leucócitos alogênicos também podem ser fornecidos por eluição a partir de leucócitos de um filtro de depleção de leucócitos, que o filtro tem sido utilizado para esgotar os leucócitos a partir de tampão leucocitário reunido, em que o tampão leucocitário combinado originado a partir de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes. Um procedimento para a eluição de leucócitos a partir de um filtro de depleção, que anteriormente foi usado para eliminar leucócitos do sangue total foram descritas por Meyer et al (ver Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166).

[0052] Embora tais leucócitos alogênicos, obtidos a

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20/46 partir do filtro de depleção de leucócitos, também pode ser utilizado para produzir DC imaturas não esgotados, parece que é preferível usar leucócitos alogênicos fornecidos por conjugação de pelo menos dois tampãos leucocitários, obtidos a partir de pelo menos dois diferentes doadores, alogênicos. Leucócitos alogênicos eluídos a partir do filtro de depleção de leucócitos, podem produzir valores ligeiramente mais baixos de quimiocinas, com excepção para MIG, e citocinas, a maturação subsequentes, em comparação com os monócitos alogênicos derivada diretamente a partir de amostras reunidas ou de sangue periférico a partir de tampão leucocitário combinado.

[0053] Isolamento de monócitos a partir de uma mistura de diferentes leucócitos é bem conhecido no estado da técmica. De acordo com uma concretização, os monócitos são isolados a partir da mistura fornecida de leucócitos alogênicos, por métodos de produção de GMP-estabelecidos. Assim, os monócitos podem ser isolados a partir da mistura fornecida de leucócitos alogênicos por elutriação ou por isolamento de anticorpo / grânulos.

[0054] Elutriação é uma técnica, em que elutriação contínua de contra-fluxo separa células em várias frações. Em resumo, uma força centrífuga constante que separa as células por densidade contraria a um fluxo contínuo de meio que flui através do sedimento, dispersando as células por tamanho. Assim, o menor / mais leve primeiro e o maior / mais pesado por último, o fluxo de meio libera as células em vários produtos. Assim, o menor / mais leve sai primeiro e o maior e mais pesado por último, o fluxo / meio libera as células de

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21/46 distância em vários produtos.

[0055] Isolamento de anticorpo / grânulos de monócitos é realizada por separação de células (Imuno) magnética ativado (MACS). MACS é uma técnica amplamente utilizada para seletivamente isolar células a partir de sangue total, tampãos leucocitários, ou aferesatos WBC. Em resumo, os anticorpos específicos para CD que carregam grânulos de ferro-magnéticos nas suas extreminadas Fcterminal estão acoplados a quis (seleção positiva) ou células indesejadas (selecção negativa). Tais células tratadas podem ser retidas dentro de, uma coluna revestida de metal poroso quando expostos a um campo magnético forte.

[0056] Subsequente ao isolamento, os monócitos são diferenciados em DC imaturas, isto é, são geradas DC imaturas. DCs imaturas são geradas por co-cultura dos monócitos alogênicos em uma cultura de células aquosa meio isento de soro não-humano e suplementado com factor de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) em conjunto com a interleucina-4 (IL-4), para 2 a 7 dias, tal como cerca de 5 dias, diferenciando, assim, os monócitos em DCs imaturas.

[0057] Como meio de cultura celular que compreende soro de vitela fetal foi encontrada para induzir a ativação prematura apesar de ser suplementado com GM-CSF e IL-4, é importante que o meio utilizado seja isento de soro nãohumano .

[0058] DCs imaturas podem também ser gerada por cultura dos monócitos alogênicos em um meio aquoso que compreende GM-CSF em combinação com interleucina-2 (IL-2),

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22/46 interleucina-15 (IL-15) ou de interferon alfa, durante 2 a 7 dias, tal como 5 dias, diferenciando assim os monócitos em DCs imaturas. A utilização de GM-CSF em combinação com a IL-4 é, no entanto, preferida, uma vez que tem sido demonstrado para evitar a ativação da aloreatividade prematura e, quando usado em combinação com um meio isento de soro não-humano.

[0059] O técnico versado no assunto está familiarizado com meios de cultura de células e seus componentes. Tipicamente, o meio de cultura celular utilizado compreende:

pelo menos um sal, tal como NaCl, KC1, MgS04 e/ou Ca(N0₃)₂;

pelo menos um açúcar, tal como glicose;

um ou mais ácido (s) amino, tal como a L-metionina, Lfenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, L-arginina, L-asparagina , L-aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, Lhistidina, L-hidroxiprolina, L-isoleucina, L-leucina, e/ou L-lisina;

uma ou mais vitamina (s) e outros nutrientes vitais (s), tais como a glutationa, a biotina, a vitamina B12, D-Capantotenato de cloreto cholin, ácido fólico, mio-inositol, nictoninamid, ácido p-amino benzóico, piridoxina, riboflavina, e / ou de tiamina; e pelo menos um tampão, tal como sal de fosfato (por exemplo, Na₂HP04) e/ou um sal de carbonato (por exemplo NaHCOs) .

[0060] De acordo com uma concretização, o meio de cultura compreende pelo menos um sal, tal como NaCl, pelo

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23/46 menos, um açúcar, tal como glucose, um ou mais ácido (s) amino, um ou mais vitamina (s), e um tampão, tal como sal de fosfato (por exemplo, Na2HP0₄) e / ou um sal de carbonato (por exemplo NaHCCh) .

[0061] Além disso, enquanto o meio de cultura celular é ainda livre de soro não-humano que compreende, tipicamente, pelo menos polipeptídeo humano. De acordo com uma concretização, o meio de cultura celular compreende pelo menos um polipeptídeo humano selecionado a partir do grupo que consiste em transferrina, albumina e insulina. De preferência, o meio de cultura de células compreende todos os três. O polipeptídeo humano pode ser obtido a partir de plasma humano. Além disso, eles podem ser produzidos de forma recombinante. Como um exemplo, a insulina pode ser produzida de forma recombinante em células de levedura.

[0062] Como exemplo, o meio de cultura celular livre de soro não-humano pode ser CellGro®, que é uma forma dendrítica deli GMP isento de soro (DC) fornecida pela CellGenix GmbH. Em os EUA a forma é vendida sob a marca registada CellGenix ™.

[0063] Tal como reconhecido pelo técnico versado no assunto e tal como explicado neste documento, o termo isolado não se refere necessariamente a 100% de pureza, mas a monócitos obtidos por um processo de isolamento de uma preferência para os monócitos. Os monócitos obtidos por um tal processo podem ser designados por leucócitos alogênicos enriquecida em monócitos, como outros leucócitos para além de monócitos estará presente.

[0064] De acordo com uma concretização, os monócitos

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24/46 alogênicos são enriquecidos a partir da mistura de leucócitos alogênicos. Leucócitos alogênicos enriquecida de monócitos em adição aos monócitos tipicamente compreendem também neutrófilos alogênicos. Além disso, eles podem compreender outros granulócitos.

[0065] Em contraste com a previsão prevalecente, não há sinais de ativação prematura foi visto, quando os monócitos alogênicos foram co-cultivados em meio de cultura de células aquosa livre de soro humano e não-suplementado com GM-CSF / IL-4, apesar do fato de que as DCs imaturas foram obtidos a partir de uma mistura de leucócitos alogênicos. Por conseguinte, tais DC imaturas são não-exausto, sendo assim capaz de produzir quantidades substanciais, tais como mais de 2 000, 5 000, 7 ou 500 pg / ml, de quimioquinas proinflamatórias, incluindo a MIP-1 alfa, a ΜΙΡ-lbeta, RANTES e MIG, e quantidades substanciais, tais como mais de 500, 1500 ou 3000 pg / mL, de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a IL-12p70 e TNF-alfa de uma forma sustentada a subsequente retirada dos fatores de ativação.

[0066] De acordo com uma concretização, DCs imaturas pretende significar que expressam apenas níveis baixos de DC a maturação marcadores CD83 e CD86 e que são capazes de produzir grandes quantidades de quimiocinas proinflamatórias e citocinas depois da ativação. Os baixos níveis são, de acordo com a concretização, deve ser interpretado de modo a que uma vezes, pelo menos 3, tal como pelo menos 5 vezes, aumento na expressão de CD83-se visto após a ativação, e que pelo menos um de 5 vezes, tal como pelo menos 8 vezes, aumento na expressão de CD86-se visto após a ativação.

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25/46 [0067] Tal como foi previsto que a ativação prematura era para ser visto, o inibidor de cicloxigenase-2 NS-398, um fator conhecido para dificultar a prostaglandina E2 (PGE2) exaustão mediada de DCs ativado foi adicionado em alguns experimentos.

[0068] No entanto, a presença de NS-398 durante a propagação dos monócitos em DCs não aumenta, diminui, mas sim, a produção induzida por ativação de MIG e IL-12p70. Assim, não há sinais de exaustão mediada por PGE2 de DCs imaturas diferenciadas de co-culturas de monócitos alogênicos mistos.

[0069] Como reconhecido pelo técnico versado no assunto (ver, por exemplo, documento EP 1 509 244 BI e o documento WO 2011/098516), células dendriticas imaturas não esgotadas (DCs) são úteis na produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer. Assim, uma concretização se refere a uma mistura de células dendriticas imaturas não esgotadas alogênicas (DC) provenientes de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos. Tais células dendriticas (CDs) são obteníveis por um método tal como aqui divulgado. Após a diferenciação em DC imaturas, as DC imaturas podem ser ativadas para se tornarem próinflamatórias DCs. A ativação pode ser induzida de várias maneiras. Muitos sinais de ter sido mostrado para induzir, pelo menos, alguns aspectos da ativação DC. Entre o mais poderoso destes são produtos microbianos e virais (padrões moleculares associados a agentes patogênicos (PAMPs), que são reconhecidos diretamente por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), incluindo os membros da família de receptores

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Toll-like (TLR). PRRs controlam a expressão de muitos genes de resposta inata e pode sinalizar diretamente para a ativação DC. Além disso, a sinalização PRR em ambas as células imunes e não imunes, muitas vezes conduz à síntese de citoquinas inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina 1 (IL-1), o que também pode promover a ativação DC. Assim, a adição de citoquinas inflamatórias também podem contribuir para a ativação de DCs imaturas.

[0070] De acordo com uma concretização, as DC imaturas são carregadas com antígenos antes de, ou simultaneamente com, a ativação, de modo a proporcionar uma vacina anti-câncer alogénica celular. Carregamento de antígeno é bem conhecida no estado da técnica (ver, por exemplo, documento EP 1 509 244 Bl) e pode ser realizada com métodos, tais como a pulsação, transfecção, infecção ou fusão. Como um exemplo, o antígeno pode, tipicamente, ser obtido a partir de um tumor; tipicamente, o tipo de tumor os quais a vacina está a ser dirigida. Na obtenção de antígenos, um exemplar representativo de câncer de interesse normalmente é usado.

[0071] De acordo com uma concretização preferida, a ativação da DC imatura é realizada em conformidade com o método descrito no documento WO 2011/098516. A maturação pode, assim, ser induzida por adição do receptor de tipo Toll 3 (TLR3) -ligand poli-I: C, uma TLR7 / 8-ligando, tal como R848 (Resiquimod) e a citocina gama interferon (IFN-γ). O receptor de tipo Toll 3 ligante poli-I: C é um análogo sintético de RNAcd que compreende uma cadeia de poli (I)

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27/46 anelada a uma cadeia de poli (C). 0 tamanho da cadeia pode variar. 0 tamanho pode ser de 200 pares de bases a 8 000 pares de bases, tais 200-1500 ou 1500-8000 pares de bases. O ligante R848 TLR7 / 8- é também indicado por Resiquimod no estado da técnica. Como uma alternativa para Resiquimod, Gardiquimod ou imiquimod pode ser usado ligante tipo TLR7 / 8-. Tipicamente, as DC imaturas são expostas aos fatores de ativação de 8 a 24 horas, tal como 18 horas.

[0072] A ativação pode ainda incluir a adição de pelo menos uma substância selecionada a partir do grupo consistindo de TLR2-ligantes, TLR4-ligantes, tais como o lipopolissacarídeo bacteriano e monofosforil-lipídio A, TLR9ligantes, tais como sequências microbianas de DNA de CpG oligonucleotídeos (ODN) que distinguem a partir do DNA de mamíferos, interferon alfa (IFN-a), interleucina 1β (IL-Ιβ), e factor de necrose tumoral alfa (TNF-a). Além disso, a ativação de preferência não inclui a adição de prostaglandina E2 (PGE2), a fim de evitar que as DCs maduras de tornar-se DCs migratórias que rapidamente se deixa o local de injeção (de tumor), o que seria desvantajoso, no contexto da presente invenção.

[0073] Após a ativação, as DCs pró-inflamatórias resultantes podem ser lavados para remover essencialmente todos os fatores de ativação. Assim, os fatores de ativação tipicamente são lavados antes de utilização das DCs próinf lamatórias como vacina.

[0074] A remoção dos fatores de ativação evita a coadministração de fatores de ativação (destinado a induzir DCs pró-inflamatórias ex vivo). A co-administração de fatores de

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28/46 ativação mais provavelmente vai levar a uma ativação forte e persistente DC imaturas também de intratumoralmente recrutados, levando a sua diferenciação em DCs maduras próinflamatórias, em vez de a diferenciação desejado em DCs maduras migratórias.

[0075] Como já foi descrito (ver documento WO 2011/098516), células dendríticas pró-inflamatórias são úteis no tratamento do câncer, uma vez que podem ativar um paciente possui DCs evoluam no sentido de DCs carregadas-tumorais migratórias. Uma concretização, portanto, refere-se a mistura de células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas provenientes de pelo menos dois doadores diferentes, alogênicos. Tais células dendríticas alogênicas próinf lamatórias são obteníveis por um método, tal como aqui divulgado. Ao congelar as células dendríticas próinf lamatórias à ativação subsequente que pode ser armazenado. Tipicamente, as células dendríticas pró-inflamatória são congeladas em um meio contendo dimetilsulfóxido (DMSO) e soro ou plasma. Antes da utilização, as células congeladas são descongeladas e o DMSO é removido por lavagem.

[0076] Para uso no tratamento de câncer, tais células dendríticas alogênicas pró-inflamatórias pode ser formulado em uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode compreender pelo menos um transportador farmacêutico aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tais como uma emulsão óleo / água ou uma emulsão água / óleo, e vários tipos de agentes molhantes. Além disso, pode incluir adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, estabilizantes conservantes e/ou

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29/46 outros componentes conhecidos na arte. Como um exemplo, o transportador pode ser uma solução salina compreendendo albumina de soro humano.

[0077] Uma outra concretização refere-se a uma tal mistura de células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas, ou uma tal composição compreendendo essas células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas para utilização no tratamento de câncer. De um modo semelhante, uma concretização refere-se à utilização de uma tal mistura de células dendríticas próinf lamatórias alogênicas para utilização na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. Uma outra concretização refere-se a um método de tratamento de câncer, em que uma mistura de células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas são administrada a um doente necessitado desse tratamento numa dose suficiente para ativar as DCs dos pacientes para se desenvolverem em DCs migratórias tumorcarregado.

[0078] Sem mais elaboração, acredita-se que um técnico versado no assunto possa, utilizando a descrição precedente e a seguinte parte experimental, utilizar a presente invenção na sua máxima extensão. As concretizações específicas preferidas aqui descritas são, portanto, para ser interpretadas como meramente ilustrativas e não limitativas do restante da descrição em qualquer forma que seja. Além disso, embora a presente invenção tenha sido descrita acima com referência a concretizações específicas, não se destina a ser limitada à forma específica aqui estabelecida. Em vez disso, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas, e outras concretizações específicas além das

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30/46 descritas acima são igualmente possíveis dentro do escopo destas reivindicações anexas, por exemplo, diferente do que as descritas acima.

[0079] Nas reivindicações, o termo compreende / compreendendo não exclui a presença de outros elementos ou etapas. Além disso, embora as características individuais podem ser incluídas em diferentes reivindicaes, estas podem, possivelmente, ser vantajosamente combinadas, e a inclusão em diferentes reivindicações não implica que uma combinação de características não é viável e/ou vantajosa.

[0080] Além disso, as referências singulares não excluem uma pluralidade. Os termos um, uma, primeiro, segundo etc. não se opõem a uma pluralidade.

Breve Descrição dos Desenhos [0081] A Fig. 1 ilustram a expressão da ativação / maturação marcadores CD86 e CD83 em DC imaturas e PI-DCs derivadas de culturas de monócitos do sangue periférico simples ou mistas.

[0082] A Fig. 2 ilustra a produção de quimiocinas pró-inflamatória por DCs imaturas (derivado de uma única cultura ou mistos de monócitos do sangue periférico) durante 18 horas de estimulação persistente com fatores de ativação (produção Ativa).

[0083] A Fig. 3 ilustra a produção de citocina próinflamatória por DC imaturas (derivada a partir de culturas de monócitos do sangue periférico simples ou mistos) durante 18 horas de estimulação com fatores de ativação persistente (produção Ativa) [0084] A Fig. 4 ilustra a produção de citocina próPetição 870180128278, de 10/09/2018, pág. 39/59

31/46 inflamatória por DC imaturas (derivada a partir de culturas de monócitos do sangue periférico simples ou mistos) durante 18 horas de estimulação com fatores de ativação persistente +/- adição do inibidor cicloogigenase-2 (COX-2) de NS-398 [0085] A Fig. 5 ilustra a produção de quimiocinas pró-inflamatória por DCs imaturas (derivado de uma única cultura ou misturados tampão leucocitário monócitos) durante 18 horas de estimulação persistente com fatores de ativação (produção Ativa);

[0086] A Fig. 6 ilustra a produção de citocinas próinf lamatórias por DCs imaturas (derivado de uma única cultura ou misturados tampão leucocitário monócitos) durante 18 horas de estimulação persistente com fatores de ativação (produção Ativa) [0087] A Fig. 7 ilustra a produção de quimioquina pro-inflamatória pela PI-DC (derivada a partir de culturas de monócitos do sangue periférico simples ou mistas). Estas DCsPI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição de fatores de ativação (produção passiva).

[0088] A Fig. 8 ilustra a produção de citocina próinflamatória pela PI-DC (derivada a partir de culturas de monócitos do sangue periférico simples ou mistas). Estas DCsPI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição de fatores de ativação (produção passiva).

[0089] A Fig. 9 ilustra a produção de quimioquina

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32/46 pro-inflamatória pela PI-DC (derivada a partir de culturas de monócitos tampão leucocitário simples ou mista). Estas DCs-PI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição de fatores de ativação (produção passiva).

[0090] A Fig. 10 ilustra a produção de citocina próinflamatória pela PI-DC (derivada a partir de culturas de monócitos tampão leucocitário simples ou mista). Estas DCs-PI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição de fatores de ativação (produção passiva).

[0091] A Fig. 11 ilustra que a DC imaturas derivadas de monócitos mistos de filtro produzir quantidades substanciais de quimioquinas pro-inflamatórias durante 18 horas de estimulação persistente com ativação dos fatores (produção ativa) [0092] A Fig. 12 ilustra que a DC imaturas derivadas de monócitos mistos de filtro produzindo quantidades substanciais de citocinas pró-inflamatórias, durante 18 horas de estimulação persistente com ativação dos fatores (produção ativa) [0093] A Figura 13 ilustra que a PI-DCS mistas derivadas de monócitos de filtro apresentando uma produção substancial de quimioquinas pro-inflamatórias após a retirada de fatores de ativação. Estas DCs-PI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição

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33/46 de fatores de ativação (produção passiva).

[0094] A Fig. 14 ilustra que a PI-DCS mistas derivadas de monócitos de filtro apresentando uma produção substancial de citocinas pró-inflamatórias após a retirada de fatores de ativação. Estas DCs-PI ter sido lavada após estimulação com fatores de ativação durante 18 horas e, subsequentemente, re-cultivadas durante 24 horas, sem adição de fatores de ativação (produção passiva).

Experimental [0095] Os exemplos seguintes são meros exemplos e não devem de modo significativo ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Em vez disso, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas.

Leucócitos de origem diversa

Isolamento de leucócitos a partir de filtros de depleção de leucócitos (filtros TACS1) [0096] Filtros de leucócitos (filtros remoção de leucócitos TACSI utilizados para remoção rotineira de leucócitos de 4 tampões leucocitários agrupados durante a produção de plaquetas) foram coletados no Laboratório de componentes no Departamento de Medicina Transfusional, Hospital Universitário Sahlgrenska, Gotemburgo, e transportados para o laboratório (Departamento de Imunologia Clínica, Sahlgrenska University Hospital) em gelo.

[0097] No laboratório, um Seringa (Terumo) foi cheia com 50 ml de tampão PBS / EDTA (CliniMACS) e ligado ao filtro TACSI através de um encaixe luer-lock. O filtro foi novamente lavado em um frasco de vidro estéril, três vezes (150 ml de tampão / EDTA PBS no total) . A suspensão de células foi

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34/46 finalmente eluída, diluída com PBS (PAA, Fisher Scientific) em uma concentração de 1:2, em um tubo Falcon (marca Fisher, Fisher Scientific).

Tampões leucocitários [0098] Tampões leucocitários de doadores de sangue saudáveis foram coletadas no departamento de Medicina de Transfusão e transportadas para o laboratório à temperatura ambiente.

Sangue periférico [0099] O sangue periférico de doadores saudáveis foi recolhido no Departamento de Medicina de Transfusão e transportadas para o laboratório à temperatura ambiente. No laboratório, o sangue foi misturado em temperatura ambiente com PBS a uma concentração de 1:2, em um tubo Falcon.

Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) [00100] O sangue periférico de doadores saudáveis foram coletados no departamento de Medicina de Transfusão e transportadas para o laboratório à temperatura ambiente. No laboratório, o sangue foi misturado em temperatura ambiente com PBS a uma concentração de 1:2, em um tubo Falcon. A suspensão de células foi suavemente transferida para tubos de centrífuga de 10 ml (Nunc) contendo 3 mL de Lymphoprep (AxisShield) . 5-6 ml foi transferida para cada um dos tubos seguido por centrifugação a 2000 rpm, 20 min à temperatura ambiente e sem travão. As PBMC isoladas foram transferidas em tubos pré-resfriados de 10 ml. As células foram lavadas duas vezes por enchimento dos tubos com PBS frio seguido por centrifugação a 1450 rpm, 10 minutos a 4° C. Os sobrenadantes

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35/46 foram descartados e os peletes foram re-suspensas em 1 ml de PBS frio. Outros 9 mL de foi adicionado a cada tubo.

Isolamento de monócitos [00101] Frações de 5 ml de leucócitos do filtro eluídos / leucócitos tampões leucocitário ou PBMCs isoladas foram 10-20 mL de sangue periférico inteiro centrifugadas em tubos a 1450 rpm, 10 minutos a 4 ° C. Os sobrenadantes foram completamente removidos e os sedimentos celulares foram resuspensos em 80 μΐ de PBS / EDTA (Miltenyi) por 10⁷ células. 20 μΐ de microesferas de CD14 (Miltenyi) foi adicionado por 10⁷ células. As células foram misturadas e incubadas durante 15 minutos a 4° C e subsequentemente lavou-se por adição de 1-2 ml de PBS / EDTA seguido por centrifugação a 300xg durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram completamente removidos e as células restantes foram ressuspensas em 500 μΐ de PBS / EDTA.

[00102] Separadores MidiMACS (Miltenyi) foram colocados em um multistand magnética (Miltenyi) e lavado com 3 ml de PBS / EDTA. As suspensões de células foram colocadas em separadores MidiMACS permitindo que as células passem através. Os separadores MidiMACS foram lavadas três vezes com 3 ml de PBS / EDTA. As frações efluentes com células não marcadas foram descartadas. Os separadores MidiMACS foram removidos a partir do multistand magnético e colocado sobre um tubo Falcon. 5 ml de tampão / EDTA PBS foram pipetados sobre a coluna e as células foram imediatamente empurrada através de um êmbolo.

[00103] A concentração celular foi determinada em uma câmara de Biirker. As suspensões de células contendo

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36/46 monócitos foram centrifugadas a 1450 rpm, 10 minutos a 4 ° C. Os sobrenadantes foram rejeitados e as células foram resuspensas em meios Cellgro DC-(CellGenix). A pureza dos monócitos CD 14+ em todas as culturas de células de monócitos -isolated era > 80%, como determinado por análise FACS, ver abaixo.

Geração de DCs imaturas [00104] Os leucócitos provenientes dos filtros TACSI foram ressuspensos para a concentração de 300.000 células / ml em meio Cellgro DC, sendo um meio isento de soro nãohumano, e plaqueadas em placas de 24 cavidades (1 mL por cavidade). Leucócitos enriquecida de monócitos a partir de tampão leucocitário e sangue periférico foram primeiro ressuspensos a uma concentração de 5 x 10⁵ monócitos / mL em meio Cellgro. 400 μΐ de meio Cellgro (whithout células) foi adicionado primeiro a 12 poços (al-6, BL-3, 3-C1) em uma placa de 24 poços. 600 μΐ da suspensão de células enriquecida em monócitos do doador A (tampão leucocitário ou sangue periférico, respectivamente) foi transferido para o poço Al3. 600 μΐ de suspensão de células enriquecida em monócitos do doador B (tampão leucocitário ou sangue periférico) foi transferido para o poço Bl-3. 600 μΐ da suspensão de células enriquecida em monócitos do doador C foi transferido para o poço Cl -3 (tampão leucocitário ou sangue periférico). Em bem A4-6, 200 μΐ de suspensão de células enriquecida em monócitos foi transferido de todos os três doadores (tampão leucocitário) ou sangue periférico. O número final de células em todos os poços era de 300.000 células (em um volume de 1 ml por poço meio Cellgro).

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37/46 [00105] De modo a diferenciar os monócitos em DCs imaturas, o meio de cultura foi suplementado com 1000 U / ml de recombinante IL-4 e 1000 U / mL de recombinante humano de GM-CSF (todos da CellGenix, Freiburg, Alemanha) e células de humano foram subsequentemente cultivadas durante 5 dias.

Ativação / maturação de DC imaturas [00106] Após 5 dias de cultura em meio Cellgro suplementado com IL-4 e GM-CSF, a ativação / maturação das DC imaturas foi induzida pela adição de 20 ug / mL PolyLC (Sigma, Steinheim, Alemanha), um imunoestimulante específico para o receptor TLR-3 também conhecido como ácido poliinosinic: policitidílico ou sal de sódio do ácido poliinosinic: policitidílico, 2,5 pg/mL de R848 (Sigma, Steinheim, Alemanha), receptor de tipo Toll 7/8-ligante também conhecido como resiquimod, e 1.000 U / mL de interferon gama (IFN sistemas -γ, R & D, Minneapolis, EUA). Após 18 h de incubação, as células foram lavadas três vezes e foram ainda incubadas em meio AIM-V fresco (sem adição de fatores exógenos de ativação) durante 24 horas a partir de sobrenadantes de cultura, as culturas foram colhidas de acordo com protocolos bem conhecidos de u técnico versado no assunto.

[00107] A análise de ELISA foi realizada nos sobrenadantes como descrito abaixo, a fim de análise dos níveis de quimiocinas pró-inflamatórias e as citocinas próinf lamatórias

Avaliação dos níveis de quimiocinas pró-inflamatórias e as citocinas pró-inflamatórias, por ELISA

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38/46 [00108] As quimiocinas pró-inflamatórias CCL3/MIP-1oí, CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES e CXCL9/MIG e as citoquinas próinf lamatórias IL-12p70 e TNF-α foram medidas por ensaio adsorvente imunológico ligado a enzima (ELISA) usando Duo Set Sistema de Desenvolvimento de ELISA de R & D Systems, Minneapolis, EUA, de acordo com as instruções do fabricante.

Exame Fenotípico por citometria de fluxo [00109] Os monócitos e células dendríticas derivadas de monócitos foram gerados como descrito acima. A frequência de monócitos CD 14+ após isolamento de monócitos foi estimada por coloração de células com FITC anti-humano de CD 14. Após 5 dias de incubação em Cellgro suplementado com IL-4 e GMCSF, as DC imaturas foram lavadas e em seguida coradas com PE CD86 anti-humano, em combinação com CD83 anti-humano FITC. DC imaturas que tinham sido subsequentemente activadas durante 18 horas com fatores activadores também foram coradas com com PE anti-CD86 humano, em combinação com CD83 anti-humano FITC. Camundongo IgGl e IgG2 corados com FITC e PE foram utilizados como controles de isotipo (todos da BD Biosciences, Califórnia, EUA). As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACS) utilizando o software Cell Quest (BD Bioscience, Califórnia, EUA).

Resultados [00110] A seguir, os resultados a partir da parte experimental são comentados.

DC derivadas de co-culturas de leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos não são fenotipicamente ativado / maduro quando co-cultivadas em meio de cultura de células aquoso isento de soro não-humano e suplementado com GM-CSF e

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IL-4.

[00111] A propagação de monócitos a partir de doadores de sangue individuais em meio de cultura celular livre de soro não-humano e suplementadas com GM-CSF e IL-4 durante 4-7 dias para dar origem DCs não esgotados com um fenótipo típico imaturo, incluindo baixa expressão do marcador CD83 maturação e baixa expressão da molécula co-estimuladora CD86. Como visto na Figura la e lb, a-expressão de ambos CD83 e CD86 significativo para 3 diferentes DCs único foi semelhante, em comparação com CD83 (Fig. la) e CD86 (Fig. lb) expressão de DCs derivadas de uma mistura de todos os três doadores. Como pode ser visto na Figura lc e d, o forte aumento da-expressão significativo da ativação / maturação de marcadores CD83 e CD86 para as DCs simples (DC a partir de 3 doadores de sangue periférico diferentes analisados) após propagação em cultura celular livre de meio aquoso não-humano de soro e suplementado com GM-CSF e IL-4 durante 4 dias e subsequente ativação persistente com outros fatores estimuladores durante 18 horas foi semelhante em comparação a expressão com a CD83 (Fig. lc) e CD86 (Fig. ld) em DC ativadas derivadas a partir de uma mistura de de leucócitos enriquecida de monócitos alogênicos de todos os três doadores.

[00112] Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as DCs derivadas de monócitos na população de monócitos mista alogênica são imaturas após cultura em GM-CSF e IL-4 durante 5 dias, e têm, por conseguinte, não tiveram quaisquer sinais de ativação / maturação durante a sua diferenciação de monócitos em DC imaturas. Além disso, população mista de DC

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40/46 imaturas do monócitos-alogênico são, pelo menos, fenotipicamente não esgotados como elas respondem fortemente com maturação fenotípica quando estimulados com fatores de ativação.

[00113] Dados obtidos com a citometria de fluxo. O respectivo eixo dos Y mostra a intensidade fluoredscence média (IFM) de CD83 e CD86, antes e após a estimulação persistente com fatores de ativação durante 18 horas. O eixoX mostram as diferentes combinações medidas.

DC imaturas derivadas de co-culturas de monócitos de sangue periférico alogênicos mistos não são funcionalmente esgotadas.

[00114] A propagação dos monócitos (de um único doador de sangue) em meio de cultura suplementado GM-CSF e IL-4 durante 4-7 dias é conhecido por dar origem a DCs não esgotados que respondem com uma produção vigorosa de quimioquinas pro-inflamatórias (MIP 1 alfa, a MIP-1 beta, RANTES e MIG) e citoquinas pró-inflamatórias (IL-12p70 e TNFalfa) após estimulação com determinados fatores de ativação.

[00115] Como pode ser visto na Figura 2, os elevados níveis médios de MIP-1 alfa (Fig.2a), MIP-1 beta (Fig. 2b), a RANTES (Fig. 2c), MIG (Figura 2d) produzido pelas DCs simples (DCs de três doadores de sangue periférico diferentes analisados) durante a ativação persistente com fatores durante 18 horas estimulante foi semelhante, em comparação com as DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores. Notavelmente, há uma variação substancial na produção de quimiocina induzida por ativação entre diferentes DCs único doador. Como pode ser

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41/46 visto na Figura 4, os elevados níveis médios de IL-12p70 (Fig. 3a) e TNF-alfa (Fig. 3b) produzido por DCs activadas único foi semelhante, em comparação com as DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos três doadores. Notavelmente, há uma variação substancial nos níveis de IL12p70 e TNF-alfa de produção entre as diferentes DCs único doador [00116] Os dados foram obtidos a partir da análise ELISA. Os resultados apresentados são valores médios ± DP de três indivíduos e o valor obtido a partir da mistura de todos os três doadores. O respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 x 10⁶ células, durante 18 horas de estimulação persistente / ativação. O eixo-X mostram as diferentes combinações medidos.

[00117] A prostaglandina E2 (PGE2) tem sido sugerida para desempenhar um papel central na exaustão induzida por ativação de DC imaturas (Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-a and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112-3117). Por isso investigaram se a adição de inibidor de Cox-2 NS-398 (destinado a inibir a produção de PGE2 potencial) durante a co-cultura de monócitos alogênicos iria aumentar a produção de quimiocinas pró-inflamatórias (representados por MIGprodução) ou citoquinas pró-inflamatórias (representado por produção de IL-12p70) após ativação subsequente. Como pode ser visto na Figura 4, a presença do inibidor de Cox-2 NS-398 durante a propagação dos monócitos em DCs não aumentou, mas em vez diminuída, a produção induzida por ativação de MIG e

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IL-12p70. Assim, não há sinais de exaustão mediada por PGE2 de DCs imaturas diferenciadas de co-culturas de monócitos alogênicos mistos.

[00118] Os dados foram obtidos a partir da análise ELISA. Os resultados mostrados são de uma expreiment a partir da mistura de todos os três doadores. O respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 x 10 ⁶ células, durante 18 horas de estimulação persistente / ativação. O eixo-X mostram as diferentes combinações medidas.

DC imaturas derivadas de co-culturas de leucócitos alogênicos de tampão leucocitário enriquecida de monócitos misturados não são funcionalmente esgotados.

[00119] Como pode ser visto na Figura 5, os elevados níveis médios das quimiocinas MIP-1 alfa pró-inflamatórias induzida por ativação (Fig. 5a), MIP-1 beta (Fig. 5b), a RANTES (Fig. 5c), MIG (Fig. 5d) produzido pelas DCs unico (DCs de três doadores diferentes analisados tampão leucocitário) durante a ativação persistente com outros fatores estimuladores de 18 horas foi semelhante em comparação com as DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores. Notavelmente, há uma variação substancial na produção de quimiocina entre diferentes DCs único doador.

[00120] Como pode ser visto na Figura 6, os altos níveis de IL-12p70 induzida por ativação, (Fig. 6a) e TNFalfa (Fig. 6b) produzido pelas DCs único foi semelhante, em comparação com as DCs derivadas de um monocyte- mistura

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43/46 enriquecida de leucócitos de todos os três doadores. Notavelmente, há uma variação substancial nos níveis de IL12p70 e TNF-alfa de produção entre as diferentes DCs único doador.

[00121] Os dados foram obtidos a partir da análise ELISA. Os resultados apresentados são valores médios ± DP de três indivíduos e o valor obtido a partir da mistura de todos os três doadores. O respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 x 10⁶ células, durante 18 horas de estimulação persistente / ativação. O eixo-X mostram as diferentes combinações medidos.

PI-DCs derivadas de co-culturas mistas de monócitos alogênicos de sangue periférico exibem uma produção sustentada de guimiocinas pró-inflamatórios e citocinas [00122] A fim de injetar DCs pró-inflamatórias ativadas (PI-DCS) em doentes, que normalmente tem que ser lavada antes da sua administração. Se não, efeito colateral indesejável induzida pela administração concomitante de agentes estimuladores (destinado a induzir PI-DC ex vivo) pode ocorrer. DCs imaturas deve ser ativado em PI-DC com produção sustentada de fatores desejáveis também após a cessação dos fatores induzir ativação. Como pode ser visto na Figura 7, os níveis médios de MIP-1 alfa (Fig.7a), MIP-1 beta (Fig. 7b), a RANTES (Fig. 7c), MIG (Fig 7d) produzido por único PI-DCs após a retirada da ativação dos fatores (PIDCs a partir de monócitos do sangue periférico de três doadores diferentes analisados) foi semelhante, em comparação com PI-DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores de sangue periférico. Notavelmente, há

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44/46 uma variação substancial na produção de quimiocina entre diferentes doadores único PI-DCS após a retirada de fatores de ativação. A produção média de IL-12p70 (Fig. 8a) e TNFalfa (Fig. 8b) produzidos por único PI-DC após a retirada de fatores de ativação também foi semelhante, em comparação com PI-lavadas DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores. Notavelmente, há uma variação substancial na produção de citocinas entre diferentes doadores único PI-DCS após a retirada de fatores de ativação.

[00123] Os dados foram obtidos a partir da análise ELISA. Os resultados apresentados são valores médios ± DP de três indivíduos e o valor obtido a partir da mistura de todos os três doadores. O respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 x 10⁶ células durante 24 horas após a retirada de fatores de ativação. O eixo-X mostram as diferentes combinações medidos.

PI-DCs derivadas de co-culturas de leucócitos alogênicos de tampão leucocitário periférica mistos enriquecida de monócitos exibem uma forte produção sustentada de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias [00124] Como pode ser visto na Figura 9, o nível médio de MIP-1 alfa (Fig. 9a), MIP-1 beta (Fig. 9b), a RANTES (Fig. 9c) , MIG (Fig 9d) produzido por único PI-DCs após a retirada da ativação dos fatores (PI-DC a partir de tampão leucocitário monócitos a partir de três doadores diferentes analisados) foi semelhante, em comparação com PI-DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores de camada leuco-plaquetária. Notadamente, há

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45/46 uma variação substancial na produção de quimiocinas entre diferentes único doador PI-DCs. A produção média de IL-12p70 (Fig. 10-A) e TNF-alfa (Fig. 10b), produzida por single PIDCs após a retirada dos fatores de ativação também foi semelhante, em comparação com PI-lavadas DCs derivadas de uma mistura de monócitos a partir de todos os três doadores de

camada leuco-plaquetária.	Notavelmente,	há uma variação
substancial na produção	de	citocinas	entre	diferentes
doadores único PI-DCS.
[00125] Os dados foram	obtidos a	partir	da análise

ELISA. Os resultados apresentados são valores médios ± DP de três indivíduos e o valor obtido a partir da mistura de todos os três doadores. O respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 x 10 ⁶ células durante 24 horas após a retirada de fatores de ativação. O eixo-X mostram as diferentes combinações medidos.

DC imaturas mistas derivadas de leucócitos de filtro enriquecidos de monócitos produz quantidades substanciais de quimiocinas pró-inflamatórias e citocinas sobre ativação [00126] Como pode ser visto na Figura 11, as DCs derivadas mistas de leucócitos do filtro enriquecida de monócitos ativadas (a população inicial de leucócitos foi eluída a partir de uma 4- filtro de depleção de leucócitos de tampão leucocitário) produziram quantidades substanciais de MIP-1 alfa (figura 1 Ia), a MIP-1 beta (Fig. 1 £), a RANTES (Fig. 11c), MIG (Fig 1 ID). Como pode ser visto na Figura 12, uma quantidade substancial de IL-12p70 (Fig. 12a) e TNF-alfa (Fig. 12b) também foi produzido.

[00127] Os dados foram obtidos a partir da análise

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ELISA. Os resultados apresentados são valores de um experimento. 0 respectivo eixo Y mostra o montante da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 χ 10⁶ células, durante 18 horas de estimulação persistente / ativação de PIDCs mistas derivadas de filtros de leucócitos enriquecida de monócitos exibem uma produção substancial de quimiocinas próinf lamatórios e citocinas depois da retirada de fatores de ativação [00128] Como pode ser visto na Figura 13, as DCs mistas derivadas de monócitos de filtro ativadas (da população inicial de leucócitos foi eluída a partir de uma 4tampão leucocitário filtro de depleção de leucócitos) produziram quantidades substanciais de MIP-1 alfa (Fig.13a), MIP-1 beta (Fig. 13b), RANTES (Fig. 13-C), MIG (Fig 13d) após a retirada de fatores ativadores. Como pode ser visto na Figura 14, uma quantidade substancial de IL-12p70 (Fig. 14a) e TNF-alfa (Fig. 14b) também foi produzida. Os dados foram obtidos a partir da análise ELISA. Os resultados apresentados são valores de um experimento. O respectivo eixo Y mostra a quantidade da respectiva substância produzida em pg / mL / 1 χ 10⁶ células durante 24 horas após a retirada dos fatores de ativação.

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Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de produção de células dendríticas imaturas não esgotados (DCs) caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   - fornecer uma mistura de leucócitos alogênicos, os quais os leucócitos alogênicos foram obtidos a partir de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes;

   - isolar os monócitos alogênicos a partir da referida mistura de leucócitos alogênicos para fornecer leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos; e

   - Gerar DC imaturas não esgotadas a partir dos referidos leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos, em que a geração de células dendríticas imaturas não esgotados (DCS) é realizada por co-cultura dos referidos leucócitos alogênicos enriquecidos de monócitos de 2 a 7 dias em meio de cultura de células aquosa isenta de soro não-humano, sendo o referido meio de cultura suplementado com interleucina-4 (IL-4) e fator estimulador de colônias de granulócitosmacrófagos (GM-CSF).
2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida mistura de leucócitos alogênicos é fornecida por agrupamento de pelo menos dois tampões leucocitários compreendendo leucócitos, os ditos tampões leucocitários a ser agrupados sendo obtidos a partir de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes.

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3. 3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a referida mistura de leucócitos alogênicos é fornecida por:

   - eluir leucócitos a partir de pelo menos dois filtros de depleção de leucócitos, filtros esses que, respectivamente, foram previamente utilizados para reduzir os leucócitos do sangue total, o dito sangue total sendo

   obtido de pelo menos dois diferentes doadores alogênicos; e

   - reunir os leucócitos obtidos para obter a referida mistura de leucócitos alogênicos;

   ou por

   - eluir leucócitos a partir de um filtro de depleção de leucócitos, qual filtro foi utilizado para esgotar os leucitos de camadas leucocitias agrupadas, em que os tampões leucocitários agrupados se originam de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes.
4. 4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os referidos monócitos alogênicos são isolados por elutriação ou por isolamento de anticorpo / pérolas.
5. 5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida co-cultura é realizada durante 5 dias.
6. 6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que

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   3/4 compreende ainda a etapa de carregar as DC imaturas não esgotadas com um antígeno.
7. 7. Processo de produção de DCs pró-inflamatórias, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   - fornecer DC imaturas não esgotadas conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e

   - ativar as DCs imaturas não esgotados para obter DCs pró-inflamatórias;

   em que a referida ativação é realizada por adição do receptor de tipo Toll 3 (TLR3) -ligante poli-I:C, um ligante TLR7 / 8-, o ligante TLR7 / 8- sendo selecionado do grupo que consiste em Resiquimod e Gardiquimod e Imiquimod e gama interferon (IFN -γ) para induzir a ativação.
8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida ativação compreende adicionalmente a adição de pelo menos uma substância selecionada a partir do grupo que consiste em ligantes TLR4, ligantes TLR2, ligantes TLR9, o interferon alfa (IFN-α), interleucina 1 β (IL-Ιβ) , e fator de necrose tumoral alfa (TNF-oí) para induzir a ativação.
9. 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida ativação é isenta de inclui a adição de prostaglandina E2 (PGE2).
10. 10. Processo, de acordo com qualquer uma das

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    Μ reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que as DC imaturas são expostas a fatores de ativação por 8 a 24 horas, após o que, essencialmente, todos os fatores de ativação são lavados.
11. 11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de células dendríticas próinf lamatórias alogênicas originárias de pelo menos dois doadores alogênicos diferentes, sendo as referidas células dendríticas obtidas por um processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 7 a 10 e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável não é água.
12. 12. Uso da composição conforme definido pela reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

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    CD83 — DCs imaturas

    Média de intensidade de Média de intensidade de fluorescência (MFi) fluorescência (MFi)

    1400

    1200

    1000

    800

    GOO

    400

    200

    3000

    2500

    2000

    1500

    1000

    500

    T

    Valores médios de doadores individuais