KR102148051B1

KR102148051B1 - 동종이계 공여자로부터 단핵세포의 동시-분화

Info

Publication number: KR102148051B1
Application number: KR1020157015766A
Authority: KR
Inventors: 알렉스 칼손-파라; 벵트 앤더슨
Original assignee: 이뮤니쿰 에이비
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2020-08-25
Also published as: JP6529439B2; DK2913394T3; PL2913394T3; MX357491B; EP2913394B1; US10626371B2; WO2014096033A1; KR20150122624A; US20170321189A1; DK2788474T3; SI2788474T1; CN105452449B; ES2548229T3; RU2668816C2; RU2015119164A; AU2013360793B2; BR112015014270B1; CA2895280C; CA2895280A1; PL2788474T3

Abstract

2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)의 생성 방법을 개시한다. 상기 방법에서, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득된 동종이계 백혈구의 혼합물을 제공한다. 후속으로, 상기 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 동종이계 단핵세포를 단리한다. 그 후에, 상기 단리된 동종이계 단핵세포로부터 비-소모성 미성숙 DC를 생성시킨다.

Description

동종이계 공여자로부터 단핵세포의 동시-분화{CO-DIFFERENTIATION OF MONOCYTES FROM ALLOGENEIC DONORS}

본 발명은 비-소모성(non-exhausted) 미성숙 단핵세포-유래된 인간 수지상 세포(DC)의 생성 방법에 관한 것이다.

전통적인 암 치료법, 예를 들어 수술, 방사선치료 및 화학요법은 종종 환자의 치료에 불충분하며 대개는 심한 부작용을 유발한다. 면역요법은 부정적인 부작용이 적은 대체 치료 방법으로서 가망을 보여왔다.

면역계가 종양 세포를 인식하여 잠재적으로 살해할 수 있는 세포, 특히 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)를 가짐은 현재 잘 확립되어 있다. 그럼에도 불구하고, 큰 문제는 상기 T 세포의 살해 능력이 암 환자에서 유도되지 않거나 또는 단지 약하게 유도된다는 것이다. 한 가지 가능성은 암 환자에서 부적합한 종양 항원 제공, 및 기능 및 종양-특이성 T 세포 면역성을 이끌어내기 위한 "천연 항원보강제"인 수지상 세포(DC)에 의한 동시-자극이 존재한다는 것이다.

기존의 암 면역요법 전략들은 주로 항원-부하된 자가유래, 환자-유래된 DC에 집중하며, 상기 세포는 생체외에서 분화되고 항원-부하되었다. 이러한 접근법의 근원적인 전제는 상기 DC의 생체외 조작에 의해 제공된 효율 및 조절이, 강한 항원-제공 및 동시-자극 능력을 갖는 DC를 생성시킨다는 것이다. 상기 T 세포 반응의 성질은 배액 림프절에서 MHC-제한된 방식으로 T 세포에 종양 항원을 제공하고 따라서 종양-특이성 T 세포 반응을 생성시키는 상기 자가유래 DC의 능력에 의존한다(DC 및 T 세포는 동일한 개체로부터의 것이어야 한다).

순환하는 혈액으로부터 백혈구를 분리시키는 고되고 시간-소모적인 과정인 백혈구성분채집술에 의해 채집된 말초 혈액 백혈구로부터 수십억 개의 단핵세포를 수득할 수 있기 때문에, 단핵세포-유래된, 자가유래 DC는 파일럿 연구에 가장 통상적으로 사용되는 DC이다. 여러 방법들을 후속의 단핵세포 농축에 이용할 수 있으며 이들 방법 중 2개, 유출(elutriation) 및 항체/비드 단리를 또한 우수 의약품 제조관리 기준(GMP) 지침에 따라 수행할 수 있다.

상기 단핵세포를 후속으로 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 배지에서 4 내지 7일 동안 배양하여 미성숙 DC로 분화되게 하였으며, 상기 미성숙 DC는 몇몇 유형의 활성화 인자로 후속 자극시 다량의 염증전 케모킨 및 사이토킨을 생산하는 현저한 능력을 특징으로 한다(Sallusto et al, Eur J Immunol,1999. 29:1617; Napolitani et al, Natuer Immunology 2005. 6:769). 상기 자극된 DC를 대개는 관련된 종양 항원(들)에 의해 예비-펄스화하고 백신접종 전 1 내지 2일 동안 활성화시킨다. 그러나, 상기와 같은 DC-기본 백신에 대한 면역 반응은 종종 약하며, 임상 반응은 좀처럼 완전하지 않고 오래 지속되지 않는다.

생체외에서 발생된 자가유래 DC는 주사 후 그의 운명 및 기능에 관해서 거의 알려져 있지 않다. 인간 환경에서, 주사된 백신 DC의 이동 패턴이 최근 생체내에서 추적되었으며, 현저하게도, 상기 주사된 DC의 5% 미만이 배액 림프절에 도달한 반면 대부분의 DC는 주사 부위에 남아있었다. 이들 국소적으로 갇힌 백신 DC는 그들의 생육력을 빠르게 상실하며 보충된 항원-제공 세포에 의해 후속으로 제거되었다.

현재 데이터는 제한된 기간(즉 6 내지 18 시간) 동안 생체외에서 활성화된 주사된 백신 DC가 프로-염증(pro-inflammatory, PI) DC로 되며, 이는 순수한 국소 면역 항원보강제로서 작용함으로써 고유 CD8+ T 세포를 생체내에서 간접적으로 초회 항원자극(prime)할 수 있음을 제공하였다. 이러한 주사된 PI-DC의 항원보강제 기능은 엄격하게는, 투여시(활성화 인자 제거 후) 케모킨을 보충하는 몇몇 DC 및 NK-세포의 진행중인 분비에 의존한다. 상기와 같은 PI-DC는 또한 백신접종 부위에서, 보충된 내인성 NK-세포 및 DC의 활성화를 유도하는 인자들을 발현/분비한다. PI-DC와 대조적으로, 임상 시험에서 통상적으로 사용되어 온 장시간(즉 >24 시간) 활성화된 DC는 그의 "소모된" 상태를 특징으로 하며(Langenkamp et al 2000), 따라서 투여시 바람직한 케모킨 및 DC-활성화 인자를 분비할 수 없다.

결론적으로, PI-DC는 MHC-적합한 자가유래 T 세포의 직접적인 자극제로서 작용할 뿐만 아니라 투여시 다량의 프로-염증 케모킨 및 사이토킨을 생산하는 항원보강제로서 작용할 수 있다. PI-DC의 국소 주사는 순환하는 NK 세포 및 DC-전구체를 포함하여, 다른 면역 세포의 보충 및 활성화를 이끌어낼 것이다. 상기 주사된 PI-DC가 관련된 종양 항원과 함께 사전-부하되거나 기존의 종양 병변에 직접 주사되는 경우, 보충된 내인성 DC는 관련된 종양 항원을 발현하는 죽어가는 백신 세포 또는 죽어가는 항원-발현 종양 세포를 각각 삼켜버릴 것이다. 활성화 후 이들 보충되고 후속으로 항원-부하된 내인성 DC는 배액 림프절로 이동할 것이며 MHC-제한된 방식으로 종양-특이성 T 세포를 초회 항원자극할 것이다(Liu et al, 2008). 이러한 결론은, 종양 성장이, 비-소모성 MHC-부적합한 동종이계 PI-DC에 의한 치료학적 백신접종에 의해 현저하게 감소되었다는 다수의 최근의 전-임상 연구들로부터의 데이터에 의해 지지된다(Alder et al 2008, Siders et al 2009, Edlich et al 2010).

따라서, PI-DC와 환자 T 세포간의 MHC-적합성을 중요하게 요하지 않는, PI-DC에 의한 강한 항원보강 기능은, 사전-생산되고 동결-보관된 MHC-부적합성 동종이계 PI-DC를 "기성 제품" 백신(이는 현행의 주문-제조된, 환자-특이성 DC 백신에 대해 실행 가능한, 실용적인 대안을 나타낸다)으로서 사용할 가능성을 도입시킨다. 상기와 같은 MHC-부적합성 동종이계 PI-DC의 용도는 EP 1 509 244 B1 및 WO 2011/098516에 개시되어 있다.

윤리적인 이유로, 오직 임상적인 용도의 상업적인 대규모 백신 생산을 목적으로 백혈구성분채집술에 의해 정상적인 혈액 제공자로부터 단핵세포를 대규모로 조달받는 것은 실행가능하지 않다. 따라서 실제로, PI-DC 생산을 위해 입수할 수 있는 원료 물질, 즉 단핵세포는 상이한 전혈 성분으로부터 불필요한 백혈구를 분리하는 과정에서 폐기물(버피 코트(buffy coat) 및/또는 사용된 백혈구 고갈 필터)로부터 수득된 단핵세포 또는 혈액 은행에서 버피 코트로부터 수득된 단핵세포로 제한된다.

그러나, 각각의 버피 코트 또는 각각의 혈액 주머니-백혈구 고갈 필터로부터 단리할 수 있는 단핵세포의 총수는 대개 2억개 미만이며(Ebner S et al., Generation of large numbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters: an alternative to standard buffy coats J Immunol Methods 252 (2001)), 이는 당해 분야에 따른 우수 의약품 제조 관리 기준(GMP) 지침에 따른 방법으로 별도의 단핵세포 배치들(각각의 배치는 한 명의 단일 공여자로부터 유래된다)의 농축 및 후속 DC-분화에 허용될 수 없는 높은 비용을 도출해 낸다.

따라서, 당해 분야에서는 혈액 은행으로부터 유래된 단핵세포-함유 폐기물로부터 비-소모성 미성숙 수지상 세포를 대규모, 비용-효과적인 임상 등급으로 생성시키는 방법이 필요하다.

결과적으로, 본 발명은 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)를 생성시키는 방법을 제공함으로써 당해 분야에서 상기-확인된 잠재적인 결함들 및 단점들 중 하나 이상을 단독으로 또는 임의의 조합으로 완화시키거나, 경감시키거나, 제거하거나 피하고자 한다. 상기 방법에서, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여체로부터 수득된 동종이계 백혈구들의 혼합물을 제공한다. 후속으로, 동종이계 단핵세포를 동종이계 백혈구들의 혼합물로부터 단리하여 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구를 제공한다. 그 후에, 상기 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구들을 비-인간 혈청이 없는 수성 세포 배양 배지에서 2 내지 7일 동안 동시-배양함으로써 상기 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구로부터 비-소모성 미성숙 DC를 생성시킨다. 상기 배지는 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된다.

만연하는 편견과 대조적으로, 상기 생성된 단핵세포-유래된 미성숙 수지상 세포는 비-소모성이며, 따라서 프로-염증 DC로의 활성화에 이어서 상당량의 프로-염증 케모킨 및 프로-염증 사이토킨을 지속적인 방식으로 생산할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 비-소모성 미성숙 수지상 세포의 대규모, 비용-효과적인 임상 등급 생산 방법을 나타낸다.

본 발명의 추가의 태양은 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 동종이계 비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)의 혼합물에 관한 것이다. 상기와 같은 혼합물을 개시된 방법에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 추가의 태양은 프로-염증 DC의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 비-소모성 미성숙 DC를 활성화시킴으로써 프로-염증 DC를 수득한다. 상기와 같은 방법에 의해, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 동종이계 프로-염증 수지상 세포의 혼합물을 수득할 수 있다. 상기 혼합물을, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 상기 혼합물 및 상기 약학 조성물을 각각 암 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 추가의 유리한 특징들을 종속항들에서 정의한다. 또한, 본 발명의 유리한 특징들을 본 발명에 개시된 실시태양에서 상세히 설명한다.

도 1은 단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래된 미성숙 DC 및 PI-DC상의 활성화/성숙화 마커 CD86 및 CD83의 발현을 예시한다.
도 2는 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 미성숙 DC(단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 케모킨 생산("능동 생산")을 예시한다.
도 3은 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 미성숙 DC(단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 사이토킨 생산("능동 생산")을 예시한다.
도 4는 활성화 인자 +/- 사이클로옥시게나제-2(Cox-2) 억제제 NS-398의 첨가에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 미성숙 DC(단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 사이토킨 생산을 예시한다.
도 5는 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 미성숙 DC(단일 또는 혼합된 버피 코트 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 케모킨 생산("능동 생산")을 예시한다.
도 6은 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 미성숙 DC(단일 또는 혼합된 버피 코트 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 사이토킨 생산("능동 생산")을 예시한다.
도 7은 PI-DC(단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 케모킨 생산을 예시한다. 상기 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").
도 8은 PI-DC(단일 또는 혼합된 말초 혈액 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 사이토킨 생산을 예시한다. 상기 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").
도 9는 PI-DC(단일 또는 혼합된 버피 코트 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 케모킨 생산을 예시한다. 상기 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").
도 10은 PI-DC(단일 또는 혼합된 버피 코트 단핵세포 배양물로부터 유래됨)에 의한 프로-염증 사이토킨 생산을 예시한다. 상기 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").
도 11은 필터 단핵세포로부터 유래된 혼합된 미성숙 DC가 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 상당량의 프로-염증 케모킨을 생산함을 예시한다("능동 생산").
도 12는 필터 단핵세포로부터 유래된 혼합된 미성숙 DC가 활성화 인자에 의한 18시간의 지속적인 자극 동안 상당량의 프로-염증 사이토킨을 생산함을 예시한다("능동 생산").
도 13은 필터 단핵세포로부터 유래된 혼합된 PI-DC가 활성화 인자의 회수 후 프로-염증 케모킨의 상당한 생산을 나타냄을 예시한다. 이들 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").
도 14는 필터 단핵세포로부터 유래된 혼합된 PI-DC가 활성화 인자의 회수 후 프로-염증 사이토킨의 상당한 생산을 나타냄을 예시한다. 이들 PI-DC는 18시간 동안 활성화 인자로 자극 후 세척되었고 후속으로 활성화 인자의 첨가 없이 24시간 동안 재-배양되었다("수동 생산").

본 발명은 버피 코트에 존재하거나 전혈로부터 백혈구의 고갈에 사용되는(적혈구의 농축에 사용되는) 백혈구 제거 필터 또는 풀링된(pooled) 버피 코트로부터 백혈구의 고갈에 사용되는(혈소판의 농축에 사용되는) 백혈구 제거 필터에 포집된 단핵세포-함유 백혈구 집단을 비-소모성 미성숙 수지상 세포의 대규모, 비용-효과적인 생성에 잠재적으로 사용할 수 있음을 구상하였다.

앞서 나타낸 바와 같이, 상이한 유형의 백혈구 제거 필터에 의해 유지된 백혈구를 적합한 배지에 의한 역-플러싱에 의해 회수한 다음 단핵세포 농축시킬 수 있다(Ebner S et al., Generation of large numbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters : an alternative to standard buffy coats J Immunol Methods 252 (2001) 93-104; 및 Meyer T P H et al., Filter Buffy Coats (FBC): A source of peripheral blood leukocytes recovered from leukocyte depletion filters. J Immunol Methods 307 (2005) 150-166).

버피 코트는 전혈의 밀도 구배 원심분리에 따라, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵세포 및 림프구, 및 혈소판을 포함하여, 백혈구의 대부분을 함유하는 응고-억제된 혈액 샘플의 분획이다. 버피 코트는 통상적으로 혈소판 생산을 위한 원료 물질로서 사용된다. 상기 과정 동안, 백혈구 고갈 필터에 의한 백혈구 감소가 4 내지 8개의 버피 코트 풀링 후 수행된다. 전형적으로, 버피 코트로부터 혈소판의 단리에 TACSI 장비 또는 OrbiSac 시스템이 사용된다.

풀링된 버피 코트로부터 혈소판 제조를 위한 TACSI 장비는 시스템 박스(로터 상에 고정됨) 및 상기 TACSI 키트의 적재를 위해 제거될 수 있는 삽입물을 함유한다. 각각의 시스템 박스에는 개별적인 마이크로프로세서에 의해 조절되고 모니터되는 프레스 시스템이 제공된다. 첫 번째 시퀀스에서, 상기 풀링 용기내에 풀링된 버피 코트를 수직 위치로 원심분리에 의해 침강시킨다. 다음 단계에서, 상기 풀링된 버피 코트 상등액의 혈소판-풍부 층(단핵세포 및 림프구를 포함하여, 상당량의 백혈구를 또한 함유한다)을 각 박스 중의 상기 프레스 시스템의 활성화에 의해 보관 용기내로 이동시킨다. 또한, 백혈구고갈용 필터를 상기 TACSI 키트 중에서 처리 주머니 및 최종 보관 용기 사이에 통합시킨다. 이어서 상기 백혈구 고갈 필터 및 상기 버피 코트 풀링 용기내 버피 코트의 나머지(모두 상당량의 단핵세포를 함유한다)를 방출시킨다.

자동화된 혈소판 농축을 위한 또 다른 OrbiSac 시스템에서, 상기 버피 코트 풀링 용기는 고리-형상이다. 원심분리 후에, 상기 상등액의 혈소판-풍부 중심 부분은 상기 원심분리기의 가운데에 놓인 용기로 이동되며, 상기 이동은 통합된 백혈구 고갈 필터를 통해 이루어진다. 이어서 상기 백혈구 고갈 필터 및 상기 버피 코트 풀링 용기내 버피 코트의 나머지(모두 상당량의 단핵세포를 함유한다)를 방출시킨다.

요약하면, 버피 코트로부터 혈소판 농축을 위한 당해 분야의 방법은 2개의 가능한 단핵세포 공급원, 즉 혈소판이 고갈된 상기 버피 코트의 나머지(또한 혈소판 고갈된 버피 코트를 나타냄), 및 백혈구 고갈 필터를 제공한다. 상기 혈소판 고갈된 버피 코트 및 상기 백혈구 고갈 필터는 각각 10억 개 이하의 단핵세포를 포함하여, 백혈구들의 혼합물을 함유한다. 그러나, 이들 단핵세포는 상기 혈소판 고갈 전에 버피 코트의 풀링으로 인해, 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하기 때문에, 서로에 대해 동종이계이다.

혈소판을 함유하는, 풀링되지 않은 버피 코트, 또는 전혈의 백혈구 고갈 후 수득된 필터는 버피 코트 또는 필터당 최대로 단지 약 1억 내지 2억 개의 단핵세포만을 제공할 것이다. 따라서 비-소모성 미성숙 DC의 비용-효과적인 GMP-생산에 충분한 수를 제공하기 위해서는 이들을 풀링해야 한다.

혈소판 생성으로부터 수득된 백혈구와 유사하게, 혈소판을 함유하는 버피 코트 또는 백혈구로부터 전혈을 고갈시키기 위해 사용되는 필터로부터 풀링된 백혈구는 또한 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 혼합된 세포 집단으로 이루어질 것이다.

적어도 5 내지 10개의 버피 코트로부터의 백혈구의 풀링 또는 적어도 5 내지 10개의 전혈 백혈구 필터로부터 용리된 백혈구의 풀링은, 적어도 이론적으로는, 비-소모성 미성숙 DC의 대규모, 비용-효과적인 임상 등급 생성에 충분한 수의 백혈구를 제공하는 문제를 해결할 것이다.

유사하게, 풀링된, 혈소판 고갈된 버피 코트 및/또는 버피 코트로부터 혈소판 농축에 사용되는 백혈구 고갈 필터를 잠재적으로는, 비-소모성 미성숙 DC의 대규모, 비용-효과적인 임상 등급 생성에 충분한 수의 백혈구를 제공하는데 사용할 수 있다.

앞서 나타낸 바와 같이, 백혈구 고갈 필터에 의해 유지된 백혈구를 적합한 배지에 의한 역-플러싱에 의해 회수한 다음 단핵세포 농축시킬 수 있다(Ebner S et al., Generation of large numbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters : an alternative to standard buffy coats J Immunol Methods 252 (2001) 93-104; 및 Meyer T P H et al., Filter Buffy Coats (FBC): A source of peripheral blood leukocytes recovered from leukocyte depletion filters. J Immunol Methods 307 (2005) 150-166).

그러나, 상이한 동종이계 공여자로부터 유래된 단핵세포-농축된 백혈구의 후속의 동시-배양과 관련된 직면한 문제는, 주 조직적합성 복합체(MHC) 부류 I 및 부류 II 항원에 대한 이들의 부적합성이, 또 다른 공여자로부터의 동종반응성 T 세포 및/또는 천연 살해 세포를 오염시킴으로써 한 명의 공여자로부터의 단핵세포/미성숙 DC의 조기 활성화를 이끌어내는 것으로 생각된다는 것이다.

2명의 동종이계 공여자로부터의 단핵세포, 림프구 및 NK-세포를 포함한 단핵 세포의 표준 세포 배양 배지, 예를 들어 송아지 태아 혈청을 갖는 RPMI-1640(RPMI = 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute), 이 연구소에서 원 배지가 무어(Moore) 등에 의해 개발되었다), 또는 무혈청 세포 배양 배지, 예를 들어 X-VIVO 15에서의 공동-배양이, 잘-알려진 DC-활성화 인자들, 예를 들어 TNF-알파의 생산을 유도하는 것으로 공지되어 있다(Laurin et al, Transplantation 2004; 77:267; Wallgren et al, Scand J Immunol 2005;62:234). 더욱이, 동종이계 단핵 세포의 송아지 태아 혈청이 있는 표준 RPMI-1640 배지 또는 표준 무혈청 배지 중의 상기와 같은 공동-배양물로부터의 배양 상등액의 첨가는 단핵세포-유래된, 미성숙 DC의 활성화/성숙화를 유도하는 것으로 반복적으로 입증되었다(Laurin et al, Transplantation 2004;77:267; Wallgren et al, Scand J Immunol 2005;62:234).

더욱 또한, 단핵세포의 미성숙 DC로의 분화에 사용되는 GM-CSF 및 IL-4 보충된 표준 RPMI-1640 배지에의 TNF-알파의 첨가는 분화된 DC의 조기 활성화 및 후속 소모(허용성)를 유도하는 것으로 입증되었다(Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-α and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112-3117).

T 세포 및 NK 세포의 오염에 대한 문제는, 오염성 T 세포 및 NK 세포가 필수적으로 없는 단핵세포 집단의 제조의 어려움으로 인해, 풀링된 버피 코트 또는 백혈구 고갈 필터로부터 단핵세포의 GMP-농축(유출 및 항체/비드 단리) 후에조차 관련성을 갖는다(Schwanke et al, Journal of Clinical Apheresis 21: 153-157 (2006); Meyer et al, Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166).

더욱 또한, 중요하게, 표준 배지에서 동종이계 림프구와의 공동-배양뿐만 아니라, 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 동종이계 호중구와의 단핵세포의 공동-배양은, 메기오반니(Meggiovanni) 등(cf. Journal of Leukocyte Biology , 2006;79; 977-988)에 의해 입증된 바와 같이, DC상의 막 CD40, CD86, 및 인간 백혈구 항원(HLA)-DR의 상향 조절, 즉 조기 활성화를 생성시킨다. 유출(Schwanke et al, Journal of Clinical Apheresis 21: 153-157 (2006)) 또는 항체/비드 단리(Meyer et al, Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166)를 사용하여 풀링된 버피 코트내 단핵세포 또는 용리된 필터 백혈구로부터 호중구의 실질적인 제거는 매우 어려운 것으로 나타났다. 대개 상기와 같은 단핵세포-농축된 생성물은 상당량(즉 존재하는 세포의 총수를 기준으로 25 내지 40%)의 호중구를 함유한다. 그러나, 안전성의 견지로부터, 상기 호중구 오염은 문제가 되지 않는다.

더욱이, 100% 순수한 단핵세포 집단을 제조하는 것이 가능하더라도, 상이한 동종이계 공여자로부터의 단핵구들간의 활성 상호작용으로 인한 조기 활성화의 위험을 제거하지는 못할 것이다. 최근 성공한 저명한 면역학자들인 파디 지 라키스(Fadi G. Lakkis)와 로버트 아이 레흘러(Robert I. Lechler)에 의한 "동종이계 반응의 기원과 생물학"이란 표제의 고찰 논문(cf. Cold Spring Harbor perspectives in medicine, Vol. 3, No. 8, 2013)에서, 선천성 동종인식 기전이 실제로 존재하는 것으로 결론이 내려졌다. 상기 저자들은 "동종이식편 거부는 타고난 적응 면역계를 갖는 척추동물들로 제한되는 것이 아니고, 적응 면역성의 진화가 예상되는 다수의 무척추 유기체들(T 및 B 림프구, NK 세포, 체세포 유전자 재배열 효소, 및 MHC가 결여된 동물들)에 통상적이다"라고 서술하고 있다.

더욱 또한, 아마도 더욱 직접적으로, 동종이계 반응이 또한 림프구 세포가 없는 마우스에서 보인다. 단핵세포의 활성화는 수용자 단핵세포 및 주사된 동종이계 공여자 백혈구(동종이계 단핵세포 포함)간의 비-MHC 항원의 차이에 따른다(Zecher D et al., An Innate Response to Allogeneic Nonself Mediated by Monocytes. J Immunol 83 (2009) 7810-7816). 제커(Zecher) 등은 동종이계 백혈구를 T 및 B 림프구가 결여된 RAG2/2 마우스의 귓바퀴에 주사하는 것이, 동계 백혈구를 주사하는 경우보다 숙주 골수세포를 갖는 피부의 현저하게 더 큰 팽창 및 침윤을 이끌어냄을 보였다. 상기 동종이계 백혈구에 대한 반응은 NK 세포와 무관하게 발생하였으며 단핵세포에 의해 매개되었다. 더욱이, 상기 단핵세포 반응은 상기 MHC와 관련되지 않은 동종결정기에 대한 것이었다.

훨씬 더 최근의 논문에서(Zeng Q, et al. "Innate recognition of allogeneic non - self induces monocyte differentiation to mature dendritic cells in vivo." Am J Transplant 12: 148-148, 2012), 저자들은 gc2/2RAG2/2 마우스(T, B 및 NK 세포가 결여됨)에 이식된 심장 동종이식편이, 성숙한 IL-12-발현 수지상 세포(DC)로 분화하는 숙주 단핵세포에 의해 빠르게 침윤됨을 보였다. 그러나, 숙주 단핵세포 성숙을 촉발하는 동종이계 세포상의 결정기 및 이를 인식하는 추정적인 단핵세포 수용체는 아직 공지되어 있지 않다.

따라서 포유동물 단핵세포는 T, B 및 NK 세포와 무관하게 동종이계 세포상의 비-MHC 결정기에 직접 반응한다는 분명한 증거가 존재한다. 따라서, 상기 일반적으로 만연하는 견해에 따라, 동종반응성은 단핵세포의 일반적인 성질인 것으로 생각된다.

종합하면, 상기는 상이한 동종이계 공여자로부터 유래된 단핵세포-농축된 세포 집단의 공동-배양이, 상기 단핵세포가 단핵세포-유래된 DC로 분화되는 동안 그의 사전-활성화 및 후속의 소모를 유도한다는 예견을 암시한다. 이에 의해 상기 DC는 관련된 활성화 인자들로 재-자극시 지속되는 방식으로 필요한 항원보강 인자들을 생산하는 PI-CD로 될 수 없을 것이다.

이렇게 예견된 활성화-유도된 소모는 TNF-α와 같은 염증인자(Park et al, Nat Immunol. 2012; 12: 607-615) 또는 미생물 리포폴리사카라이드(LPS)에 의한 조기 활성화에 의해 유도되는 단핵세포, 대식세포 및 DC의 널리-공지된 소모와 유사하다(Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-α and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112-3117; Langenkamp A et al., Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nature Immunol. 1 (2000) 311-316).

그러나 본 발명자들은 놀랍게도, 비-소모성 미성숙 DC가 실제로, 상이한 동종이계 공여자로부터의 동종이계 단핵세포-농축된 백혈구들의 혼합물로 이루어지는 초기 세포 집단으로부터, 하나의 단일 공여자로부터 유래된 농축된 단핵세포로부터 비-소모성 미성숙 DC를 전파하는데 사용되는 방식과 유사한 방식으로(cf. WO 2011/098516), 즉 비-인간 혈청은 없지만 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된 수성 세포 배양 배지의 사용에 의해 전파될 수 있음을 발견하였다.

상기 만연하는 편견과 대조적으로, 일정한 조건하에서 농축된 단핵세포 혼합물의 상이한 동종이계 공여자로부터 미성숙 DC로의 전파는 놀랍게도 상기 DC의 조기 활성화 및 후속 소모를 생성시키지 않는 것으로 나타났다. 상기 조건은 비-인간 혈청이 없고 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 수성 세포 배양 배지에서의 공동-배양을 포함한다.

그러나, 비-인간 혈청이 없고 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극이 보충되지 않은 수성 세포 배양 배지에서의 공동-배양뿐만 아니라 비-인간 혈청, 예를 들어 송아지 태아 혈청을 포함하고 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니가 보충된 수성 세포 배양 배지에서의 공동 배양은, 당해 분야에서 예상되고 인식하는 바와 같이, 상기 DC의 조기 활성화 및 후속 소모를 생성시킨다.

따라서, 단핵세포를 상이한 동종이계 공여자로부터의 풀링된 백혈구 집단으로부터 단리할 수 있으며, 이는 단핵세포의 대규모, 비용-효과적인 GMP-농축, 예를 들어 유출(Elutra) 또는 항체/비드-단리(CliniMacs)를 수행할 수 있게 한다. 후속으로, 비-소모성 미성숙 DC를 조기 활성화 없이 상기 단리된 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구로부터 생성시킬 수 있다.

상기와 같은 비-소모성 미성숙 DC를 사용하여, 종양내 주사시 항-종양 백신으로서 기능을 목표로 하는 프로-염증 DC를 전파할 수 있다(cf. WO2011/098516). 더욱이, 상이한 부위들, 예를 들어 종양내, 피하, 상피, 근육내 및/또는 정맥내 부위내로 주사될 수 있는 "완전한" 세포 동종이계 항암 백신(cf. EP 1 509 244 B1)을 생산하기 위해서, 활성화 전에 상이한 동종이계 공여자로부터의 비-소모성 미성숙 DC에 종양 항원(들)을 부하할 수 있다.

따라서 하나의 실시태양은 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 비-소모성 미성숙 DC를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법에서, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득한, 동종이계 백혈구의 혼합물을 제공한다. 하나의 실시태양에 따라, 2명의 상이한 동종이계 공여자는, 백혈구를 공여하는 2명의 개인이 동일한 종이지만, 상이한 유전자 구성을 갖는, 즉 항원적으로는 다른 것을 의미하고자 한다. 이미 개시한 바와 같이, 동종이계 백혈구는 풀링된 버피 코트로부터 수득되거나 또는 사용된 백혈구-고갈 필터로부터 백혈구를 용리시킴으로써 수득될 수 있다. 이어서 동종이계 단핵세포를 상기 제공된 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 단리시킨다. 후속으로, 비-소모성 미성숙 DC를 상기 단리된 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구로부터 생성시킨다.

단핵세포의 대규모, 비용-효과적인 GMP-농축을 수행하는 능력을 제외하고, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 유래된 동종이계 단핵세포의 혼합물로부터 기원하는 비-소모성 미성숙 DC의 추가의 이점은, 상이한 공여자들로부터의 PI-DC 사이에 존재하는 것으로 공지된, 활성화시 상이한 프로-염증 인자들의 생산에 관한 통상적인 생물 변이가 감소할 것이라는 것이다.

바람직한 실시태양에서, 상기 동종이계 백혈구는 백혈구를 포함하여, 적어도 2개의 버피 코트의 풀링에 의해 제공된다. 상기 풀링된 버피 코트는 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득된다. 상기 풀링된 버피 코트는 혈소판을 함유하거나 혈소판이 고갈될 수도 있다.

동종이계 백혈구를 또한 적어도 2개의 백혈구 고갈 필터로부터 백혈구를 용리시킴으로써 제공할 수 있으며, 상기 필터는 각각 앞서, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터의 전혈로부터 백혈구를 고갈시키는데 사용되었었다. 상기 용리 후에, 상기 수득된 백혈구들을 풀링하여 동종이계 백혈구의 혼합물을 수득한다. 분명히, 그러나 덜 바람직하게, 상기 전혈을 또한 백혈구 고갈에 앞서 풀링할 수도 있다. 앞서, 전혈로부터 백혈구의 제거에 사용되었던 고갈 필터로부터 백혈구를 용리시키는 과정은 에브너(Ebner) 등에 의해 개시되었다(cf. Journal of Immunological Methods 252 (2001) 93-104).

유사하게, 동종이계 백혈구가 또한 백혈구를, 풀링된 버피 코트로부터 백혈구를 고갈시키는데 사용되었던 백혈구 고갈 필터로부터 용리시킴으로써 제공될 수 있으며, 여기에서 상기 풀링된 버피 코트는 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원한다. 앞서, 백혈구를 버피 코트로부터 제거하는데 사용되었던 고갈 필터로부터 백혈구를 용리시키는 과정은 메이어(Meyer) 등에 의해 개시되었다(cf. Journal of Immunological Methods 307 (2005) 150-166).

백혈구 고갈 필터로부터 수득된 상기와 같은 동종이계 백혈구를 또한 비-소모성 미성숙 DC의 생성에 사용할 수 있지만, 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득된, 적어도 2개의 버피 코트의 풀링에 의해 제공된 동종이계 백혈구를 사용하는 것이 바람직한 것으로 보인다. 백혈구 고갈 필터로부터 용리된 동종이계 백혈구는 풀링된 말초 혈액 샘플 또는 풀링된 버피 코트로부터 직접 유래된 동종이계 단핵세포에 비해, 성숙화에 이어서 다소 보다 적은 양의 케모킨(MIG 및 사이토킨 제외)을 생산할 수도 있다.

상이한 백혈구의 혼합물로부터 단핵세포의 단리는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 하나의 실시태양에 따라, 단핵세포를 확립된 GMP-생산 방법에 의해 상기 제공된 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 단리시킨다. 따라서, 단핵세포를 유출 또는 항체/비드 단리에 의해 상기 제공된 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 단리할 수 있다.

유출은 연속적인 역류 유출이 세포를 다수의 분획들로 분리시키는 기법이다. 간단히, 상기 세포를 밀도에 의해 분리시키는 일정한 원심력이, 상기 세포를 크기에 의해 분산시키는 침강을 통해 흐르는 연속적으로 증가하는 배지 흐름에 반대한다. 따라서, 가장 작은/가장 가벼운 것이 먼저 및 가장 큰/가장 무거운 것이 마지막으로, 상기 배지 흐름이 상기 세포를 여러 생성물들로 분출시킨다.

단핵세포의 항체/비드 단리는 (면역)-자기 활성화된 세포 분류(MACS)에 의해 수행된다. MACS는 전혈, 버피 코트 또는 WBC 분리반출물로부터 세포를 선택적으로 단리시키기 위해 널리 사용되는 기법이다. 간단히, Fc-말단에 강자성 비드를 갖는 CD-특이성 항체를 필요한(양성 선택) 또는 불필요한(음성 선택) 세포에 결합시킨다. 상기와 같이 처리된 세포는 강한 자기장에 노출될 때 다공성의 금속 코팅된 컬럼내에 유지될 수 있다.

상기 단리에 이어서, 상기 단핵세포는 미성숙 DC로 분화된다, 즉 미성숙 DC가 생성된다. 미성숙 DC는 상기 동종이계 단핵세포를, 비-인간 혈청이 없고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된 수성 세포 배양 배지 중에서 인터류킨-4(IL-4)와 함께 2 내지 7일 동안, 예를 들어 약 5일 동안 공동-배양하고, 이에 의해 상기 단핵세포를 미성숙 DC로 분화시킴으로써 생성된다.

송아지 태아 혈청을 포함하는 세포 배양 배지는 GM-CSF 및 IL-4가 보충됨에도 불구하고 조기 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 상기 사용된 배지는 비-인간 혈청이 없는 것이 중요하다.

미성숙 DC를 또한, 상기 동종이계 단핵세포를 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-15(IL-15) 또는 인터페론과 함께 GM-CSF를 포함하는 수성 배지 중에서 2 내지 7일 동안, 예를 들어 5일 동안 배양하고, 이에 의해 상기 단핵세포를 미성숙 DC로 분화시킴으로써 생성시킬 수 있다. 그러나, GM-CSF를 IL-4와 함께 사용하는 것이, 비-인간 혈청이 없는 배지와 함께 사용될 때 동종반응성 및 조기 활성화를 방지하는 것으로 나타났기 때문에 바람직하다.

당해 분야의 숙련가는 세포 배양 배지 및 그의 성분들에 대해 친숙하다. 전형적으로, 상기 사용되는 세포 배양 배지는 하기를 포함한다:

적어도 하나의 염, 예를 들어 NaCl, KCl, MgSO₄ 및/또는 Ca(NO₃)₂;

적어도 하나의 당, 예를 들어 글루코스;

하나 또는 다수의 아미노산(들), 예를 들어 L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-쓰레오닌, L-트립토판, L-타이로신, L-발린, L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파트산, L-시스틴, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-하이드록시프롤린, L-아이소류신, L-류신 및/또는 L-리신;

하나 또는 다수의 비타민(들) 및 다른 필수 영양소, 예를 들어 글루타치온, 비오틴, 비타민 B12, D-Ca-판토테네이트, 콜린 클로라이드, 폴산, 마이오-이노시톨, 니코틴아미드, p-아미노 벤조산, 피리독신, 리보플라빈, 및/또는 티아민; 및

적어도 하나의 완충제, 예를 들어 포스페이트 염(예를 들어 Na₂HPO₄), 및/또는 카보네이트 염(예를 들어 NaHCO₃).

하나의 실시태양에 따라, 상기 배양 배지는 적어도 하나의 염, 예를 들어 NaCl, 적어도 하나의 당, 예를 들어 글루코스, 하나 또는 다수의 아미노산(들), 하나 또는 다수의 비타민(들), 및 완충제, 예를 들어 포스페이트 염(예를 들어 Na₂HPO₄) 및/또는 카보네이트 염(예를 들어 NaHCO₃)을 포함한다.

더욱이, 상기 세포 배양 배지는 추가로 비-인간 혈청이 없지만, 전형적으로는 적어도 인간 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 실시태양에 따라, 상기 세포 배양 배지는 트랜스페린, 알부민 및 인슐린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 인간 폴리펩티드를 포함하고; 바람직하게는 상기 세포 배양 배지는 상기 3개를 모두 포함한다. 상기 인간 폴리펩티드를 인간 혈장으로부터 수득할 수 있다. 더욱이, 상기를 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 일례로서 인슐린을 효모 세포에서 재조합적으로 생성시킬 수 있다.

일례로, 비-인간 혈청이 없는 세포 배양 배지는 셀그로(CellGro)(등록상표)일 수 있으며, 이는 셀제닉스(CellGenix) GmbH에 의해 제공되는 GMP 무혈청 수지상 세포 배지(DC)이다. 미국에서 상기 배지는 상표명 셀제닉스(상표)로 판매된다.

숙련가에 의해 인식되고 본 발명에서 설명되는 바와 같이, 단리된이란 용어는 반드시 100% 순도를 지칭하는 것은 아니며, 단핵세포에 선호를 나타내는 단리 과정에 의해 수득된 단핵세포를 지칭한다. 상기와 같은 과정에 의해 수득된 단핵세포를, 단핵세포 외에 다른 백혈구들이 존재할 것이므로, 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구라 칭할 수 있다.

하나의 실시태양에 따라, 상기 동종이계 단핵세포를 동종이계 백혈구들의 혼합물로부터 농축시킨다. 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구는 단핵세포 외에 전형적으로 동종이계 호중구를 또한 포함한다. 더욱이, 상기는 다른 과립구들을 포함할 수도 있다.

상기 만연하는 편견과 대조적으로, 상기 동종이계 단핵세포를 비-인간 혈청이 없고 GM-CSF/IL-4가 보충된 수성 세포 배양 배지에서 공동-배양할 때, 미성숙 DC가 동종이계 백혈구들의 혼합물로부터 수득되었다는 사실에도 불구하고, 조기 활성화의 징후가 나타나지 않았다. 따라서, 상기와 같은 미성숙 DC는 비-소모성이며, 따라서 상당량, 예를 들어 2000, 5000, 또는 7500 pg/㎖ 초과의 프로-염증 케모킨, 예를 들어 MIP-1 알파, MIP-1베타, RANTES 및 MIG, 및 상당량, 예를 들어 500, 1500 또는 3000 pg/㎖ 초과의 프로-염증 사이토킨, 예를 들어 IL-12p70 및 TNF-알파를, 상기 활성화 인자의 회수에 이어서 지속적인 방식으로 생산할 수 있다.

하나의 실시태양에 따라, 미성숙은 단지 낮은 수준의 DC 성숙화 마커 CD83 및 CD86을 발현하고 활성화 시 다량의 염증전 케모킨 및 사이토킨을 생산할 수 있는 DC를 의미하고자 한다. 낮은 수준은, 실시태양에 따라, 상기 CD83-발현의 적어도 3배, 예를 들어 적어도 5배 증가가 활성화시 나타나고, 상기 CD86-발현의 적어도 5배, 예를 들어 적어도 8배 증가가 활성화시 나타나는 것으로 해석된다.

조기 활성화가 나타난 것에 직면했을 때, 일부 실험에서, 활성화된 DC의 프로스타글란딘 E2(PGE2)-매개된 소모를 방해하는 것으로 공지된 인자인 사이클로옥시게나제-2 억제제 NS-398을 가하였다. 그러나, 단핵세포의 DC로의 전파 중 NS-398의 존재는 MIG 및 IL-12p70의 활성화-유도된 생성을 증가시키지 않고, 오히려 감소시켰다. 따라서, 혼합된 동종이계 단핵세포의 공동-배양물로부터 분화된 미성숙 DC의 PGE2-매개된 소모에 대한 징후는 없다.

숙련가에 의해 인식되는 바와 같이(cf. 예를 들어 EP 1 509 244 B1 및 WO 2011/098516), 비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)는 암 치료용 약학 조성물의 생성에 유용하다. 따라서, 하나의 실시태양은 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 동종이계 비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)의 혼합물에 관한 것이다. 상기와 같은 수지상 세포(DC)는 본 발명에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다. 미성숙 DC로의 분화에 이어서, 상기 미성숙 DC를 활성화시켜 프로-염증 DC가 되게 할 수 있다. 활성화는 여러 방식으로 유도될 수 있다. 다수의 신호들이 DC 활성화의 적어도 일부 태양을 유도하는 것으로 나타났다. 이중 가장 강력한 것은 미생물 및 바이러스 산물(병원체-관련된 분자 패턴(PAMP))이며, 이는 톨형 수용체(TLR) 과의 구성원을 포함한 패턴-인식 수용체(PRR)에 의해 직접 인식된다. PRR은 다수의 선천적인 반응 유전자의 발현을 조절하며 DC 활성화를 직접 신호할 수 있다. 또한, 면역 및 비-면역 세포 모두에서 PRR 신호화는 종종 염증성 사이토킨, 예를 들어 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터류킨 1(IL-1)의 합성을 유도하며, 이들은 또한 DC 활성화를 촉진할 수 있다. 따라서, 염증성 사이토킨의 첨가가 또한 미성숙 DC의 활성화에 기여할 수 있다.

하나의 실시태양에 따라, 세포로 된 동종이계 항암 백신을 제공하기 위해서, 활성화 전에 또는 상기 활성화와 동시에 상기 미성숙 DC에 항원을 부하한다. 항원-부하는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며(cf. 예를 들어 EP 1 509 244 B1) 펄스화, 형질감염, 감염 또는 융합과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 일례로서, 상기 항원을 전형적으로는 종양으로부터 수득할 수 있으며; 전형적으로 상기 종양 유형에 대해 백신이 지시된다. 항원의 수득에 있어서, 관심 암 유형의 전형적인 시편이 사용된다.

바람직한 실시태양에 따라, 상기 미성숙 DC의 활성화를 WO 2011/098516에 개시된 방법에 따라 수행한다. 따라서 성숙화는 톨형 수용체 3(TLR3)-리간드 폴리-I:C, TLR7/8-리간드, 예를 들어 R848(레시퀴모드(Resiquimod)) 및 사이토킨 인터페론 감마(IFN-γ)의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 상기 톨형 수용체 3(TLR3)-리간드 폴리-I:C는 폴리(C)의 가닥에 어닐링된 폴리(I)의 가닥을 포함하는 dsRNA의 합성 유사체이다. 상기 가닥의 크기는 다양할 수 있다. 상기 크기는 200 염기쌍 내지 8000 염기쌍, 예를 들어 200 내지 1500 또는 1500 내지 8000 염기쌍일 수 있다. 상기 TLR7/8-리간드 R848을 또한 당해 분야에서는 레시퀴모드로 나타낸다. 레시퀴모드에 대한 대안으로서, 가디퀴모드(Gardiquimod) 또는 이미퀴모드(Imiquimod)를 TLR7/8-리간드로서 사용할 수 있다. 전형적으로, 상기 미성숙 DC를 8 내지 24 시간, 예를 들어 18 시간 동안 활성화 인자에 노출시킨다.

상기 활성화는 TLR2-리간드, TLR4-리간드, 예를 들어 세균성 리포폴리사카라이드 및 모노포스포릴 지질 A, TLR9-리간드, 예를 들어 미생물 DNA를 포유동물 DNA와 구별시키는 CpG 올리고뉴클레오티드(ODN) 서열, 인터페론 알파(IFN-α), 인터류킨 1β(IL-1β), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 물질의 첨가를 또한 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 활성화는 바람직하게는, 성숙한 DC가 이동성 DC(상기는 주사 부위(종양)를 급하게 떠날 것이며, 이는 본 발명의 상황내에서 단점이 될 수 있다)가 되는 것을 방지하기 위해서, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 첨가를 포함하지 않는다.

상기 활성화에 이어서, 생성되는 프로-염증 DC를 세척하여 필수적으로 상기 활성화 인자들을 모두 제거할 수 있다. 따라서, 상기 활성화 인자를 전형적으로는, 상기 프로-염증 DC를 백신으로서 사용하기 전에 씻어낸다. 상기 활성화 인자의 제거는 활성화 인자들의 동시-투여(프로-염증 DC를 생체외에서 유도할 목적으로)를 피한다. 활성화 인자의 동시-투여는 가장 그럴듯하게는 종양내 보충된 미성숙 DC의 강하고 지속적인 활성화를 또한 이끌어내고, 이는 상기 DC의 이동성 성숙한 DC로의 목적하는 분화보다는 프로-염증 성숙한 DC로 분화되게 할 것이다.

이미 개시한 바와 같이(cf. WO 2011/098516), 프로-염증 수지상 세포는 환자 자신의 DC를 활성화시켜 종양-부하된 이동성 DC로 발생시킬 수 있기 때문에, 암 치료에 유용하다. 따라서 하나의 실시태양은 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 동종이계 프로-염증 수지상 세포의 혼합물에 관한 것이다. 상기와 같은 동종이계 프로-염증 수지상 세포는 본 발명에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 활성화에 이은 상기 프로-염증 수지상 세포를 동결시킴으로써 보관할 수 있다. 전형적으로 상기 프로-염증 수지 세포를 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 혈청 또는 혈장을 함유하는 배지에서 동결시킨다. 사용 전에, 상기 동결된 세포를 해동시키고 상기 DMSO를 씻어낸다.

암 치료에 사용하기 위해서, 상기와 같은 동종이계 프로-염증 수지상 세포를 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수 용액, 물 및 유화액, 예를 들어 오일/수 또는 수/오일 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함할 수 있다. 더욱이, 상기는 약학적으로 허용 가능한 보조제, 부형제, 안정제 보존제, 및/또는 당해 분야에 공지된 다른 성분들을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 담체는 인간 혈청 알부민을 포함하는 염수 용액일 수 있다.

추가의 실시태양은 암 치료에 사용하기 위한, 상기와 같은 동종이계 프로-염증 수지상 세포의 혼합물, 또는 상기와 같은 동종이계 프로-염증 수지상 세포를 포함하는 상기와 같은 조성물에 관한 것이다. 유사하게, 하나의 실시태양은 암 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기와 같은 동종이계 프로-염증 수지상 세포의 혼합물의 용도에 관한 것이다. 추가의 실시태양은 암의 치료 방법에 관한 것이며, 여기에서 동종이계 프로-염증 수지상 세포의 혼합물을 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 상기 환자 자신의 DC를 활성화시켜 종양-부하된 이동성 DC로 발생시키기에 충분한 용량으로 투여한다.

추가의 고생스러운 노력 없이도, 당해 분야의 숙련가는 선행의 설명 및 하기의 실험 부분을 사용하여, 본 발명을 최대한으로 이용할 수 있을 것이라 생각된다. 따라서, 본 발명에 개시된 바람직한 특정한 실시태양들을 단지 예시적인 것으로 해석해야 하며, 상기 설명의 나머지를 어떠한 식으로도 제한해서는 안 된다. 더욱이, 본 발명을 상기 특정한 실시태양을 참조하여 개시하였지만, 본 발명을 본 발명에 설명된 특정한 형태로 제한하고자 하지 않는다. 오히려, 본 발명은 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되며, 상기에 명시된 바와 다른 실시태양들, 예를 들어 상술한 것들과 상이한 실시태양들은 이들 첨부된 특허청구범위의 범위내에서 동등하게 가능하다.

특허청구범위에서, "포함하다/포함하는"이란 용어는 다른 요소들 또는 단계들의 존재를 제외하는 것이 아니다. 추가로, 개별적인 특징들을 상이한 특허청구범위에 포함시킬 수도 있지만, 이들을 가능하게는 합하는 것이 유리할 수 있으며, 상이한 특허청구범위에의 포함이, 특징들의 조합이 실행가능하지 않고/않거나 유리하지 않음을 암시하는 것은 아니다.

또한, 단수의 지시대상은 복수를 제외하지 않는다. "하나", "제1", "제2" 등의 용어들은 복수를 제외하는 것이 아니다.

실험

하기의 실시예들은 단지 예일 뿐이며 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 오히려, 본 발명은 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

다양한 기원의 백혈구

백혈구 고갈 필터(TACSI 필터)로부터 백혈구의 단리

백혈구 필터(혈소판 생산 중 4개의 풀링된 버피 코트의 통상적인 백혈구 고갈에 사용되는 TACSI 백혈구 고갈 필터)를 코텐부르크 잘그렌스카 대학 병원 수혈 내과 성분 실험실에서 채집하고, 얼음상에서 실험실(잘그렌스카 대학 병원 임상 면역학과)로 운반하였다.

상기 실험실에서, 주사기(테루모(Terumo))를 50 ㎖의 PBS/EDTA 완충제(CliniMACS)로 충전하고 루어락 용구를 통해 상기 TACSI 필터에 연결시켰다. 상기 필터를 멸균 유리 플라스크내로, 3회(총 150 ㎖의 PBS/EDTA 완충제) 역-플러싱시켰다. 상기 용리된 세포 현탁액을 최종적으로 PBS(PAA, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)로 팔콘 튜브(피셔 브랜드, 피셔 사이언티픽) 중에서 1:2 농도로 희석하였다.

버피 코트

건강한 헌혈자로부터의 버피 코트를 수혈 내과에서 채집하고 실온에서 실험실로 운반하였다.

말초 혈액

건강한 헌혈자로부터 말초 혈액을 수혈 내과에서 채집하고 실온에서 실험실로 운반하였다. 상기 실험실에서, 상기 혈액을 실온 PBS와 팔콘 튜브에서 1:2 농도로 혼합하였다.

말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 단리

건강한 헌혈자로부터 말초 혈액을 수혈 내과에서 채집하고 실온에서 실험실로 운반하였다. 상기 실험실에서, 상기 혈액을 실온 PBS와 팔콘 튜브에서 1:2 농도로 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 3 ㎖의 림포프렙(Lymphoprep)(액시스-쉴드(Axis-Shield))을 함유하는 10 ㎖ 원심분리 튜브(눙크(Nunc))로 서서히 옮겼다. 5 내지 6 ㎖을 각 튜브로 옮긴 다음 2000 rpm에서, 실온에서 20분, 중단 없이 원심분리시켰다. 상기 단리된 PBMC를 예비-냉각시킨 10 ㎖ 튜브로 옮겼다. 상기 세포를, 상기 튜브를 저온 PBS로 채워 2회 세척한 다음 4 ℃에서 1450 rpm에서 10분 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠릿을 1 ㎖의 저온 PBS 중에 재-현탁시켰다. 추가로 9 ㎖을 각 튜브에 가하였다.

단핵세포 단리

용리된 필터 백혈구/버피 코트 백혈구 또는 전체 말초 혈액 10 내지 20 ㎖로부터 단리된 PBMC의 5 ㎖ 분획들을 4 ℃에서, 1450 rpm에서 10분 원심분리시켰다. 상등액을 완전히 제거하고 세포 펠릿을 10⁷ 세포당 80 ㎕의 PBS/EDTA(밀테니(Miltenyi)에 재-현탁시켰다. 20 ㎕의 CD14 미세비드(밀테니)를 10⁷ 세포당 가하였다. 상기 세포를 혼합하고 4 ℃에서 15분간 배양하고 후속으로 1 내지 2 ㎖의 PBS/EDTA를 가하여 세척한 다음 300xg에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 완전히 제거하고 남은 세포를 500 ㎕의 PBS/EDTA에 재-현탁시켰다.

MidiMACS 분리기(밀테니)를 자기 멀티스탠드(밀테니)에 놓고 3 ㎖의 PBS/EDTA로 세정하였다. 상기 세포 현탁액을 상기 MidiMACS 분리기상에 놓아 상기 세포가 통과되게 하였다. 상기 MidiMACS 분리기를 3 ㎖의 PBS/EDTA로 3회 세척하였다. 표지되지 않은 세포를 갖는 유출물 분획은 버렸다. 상기 MidiMACS 분리기를 상기 자기 멀티스탠드로부터 제거하고 팔콘 튜브상에 놓았다. 5 ㎖의 PBS/EDTA 완충제를 상기 컬럼상에 피펫팅하고 세포를 플런저로 즉시 강제로 통과시켰다.

세포 농도를 뷔르커(Burker) 챔버에서 측정하였다. 단핵세포를 함유하는 세포 현탁액을 4 ℃에서 1450 rpm에서, 10 분 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 세포를 셀그로(CellGro) DC-배지(셀제닉스)에 재-현탁시켰다. 모든 단핵세포-단리된 세포 배양물내 CD14+ 단핵세포의 순도는 FACS-분석에 의해 측정된 바와 같이 >80%이었으며, 하기를 참조하시오.

미성숙 DC의 생성

상기 TACSI 필터로부터 기원하는 백혈구를 비-인간 혈청이 없는 배지인 셀그로 DC-배지 중에 300 000 세포/㎖의 농도로 재-현탁시키고, 24-웰 플레이트에 도말하였다(1 ㎖/웰). 버피 코트 및 말초 혈액으로부터 단핵세포-농축된 백혈구를 먼저 셀그로 배지 중에 5 x 10⁵ 단핵세포/㎖의 농도로 재-현탁시켰다. 400 ㎕의 셀그로 배지(세포 없이)를 먼저 24-웰 플레이트 중의 12 웰(A1-6, B1-3, C1-3)에 가하였다. 600 ㎕의 공여자 A(각각 버피 코트 또는 말초 혈액)로부터의 단핵세포-농축된 세포 현탁액을 웰 A1-3으로 옮겼다. 600 ㎕의 공여자 B(버피 코트 또는 말초 혈액)로부터의 단핵세포-농축된 세포 현탁액을 웰 B1-3으로 옮겼다. 600 ㎕의 공여자 C로부터의 단핵세포-농축된 세포를 웰 C1-3(버피 코트 또는 말초 혈액)으로 옮겼다. 웰 A4-6에서, 200 ㎕의 단핵세포-농축된 세포 현탁액을 3명의 공여자(버피 코트 또는 말초 혈액) 모두로부터 옮겼다. 모든 웰 중의 최종 세포수는 300 000 세포였다(웰당 1 ㎖ 셀그로 배지의 부피 중).

상기 단핵세포를 미성숙 DC로 분화시키기 위해서, 상기 배양 배지에 1000 U/㎖의 재조합 인간 IL-4 및 1000 U/㎖의 재조합 인간 GM-CSF(모두 독일 프라이부르크 셀제닉스로부터)를 보충하고 세포를 5일 동안 후속적으로 배양하였다.

미성숙 DC의 활성화/ 성숙화

IL-4 및 GM-CSF가 보충된 셀그로 배지에서 5일 배양한 다음, 미성숙 DC의 활성화/성숙화를, 폴리이노신산:폴리시티딜산 또는 폴리이노신산-폴리시티딜산 나트륨염으로서 또한 공지된 TLR-3 수용체에 특이적인 면역자극제, 폴리I:C(시그마, 독일 스타인하임 소재) 20 ㎍/㎖, 레시퀴모드로서 또한 공지된 톨-형 수용체 7/8-리간드, R848(시그마, 독일 스타인하임 소재) 2.5 ㎍/㎖, 및 인터페론 감마(IFN-γ, R&D 시스템스, 미국 미네아폴리스 소재) 1000 U/㎖을 가함으로써 유도하였다. 18시간의 배양 후에, 상기 세포를 3회 세척하고 24시간 동안 신선한 AIM-V 배지(외인성 활성화 인자의 첨가 없이) 중에서 추가로 배양하였다. 상기 배양물로부터의 배양 상등액을 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 수확하였다.

프로-염증 케모킨 및 프로-염증 사이토킨의 수준을 분석하기 위해서, 하기에 개시된 바와 같이 ELISA 분석을 상등액상에서 수행하였다.

ELISA에 의한 프로-염증 케모킨 및 프로-염증 사이토킨 수준의 평가

프로-염증 케모킨 CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES 및 CXCL9/MIG 및 프로-염증 사이토킨 IL-12p70 및 TNF-α를 미국 미네아폴리스 소재의 R&D 시스템스로부터의 듀오 셋 ELISA 디벨로프먼트 시스템(Duo Set ELISA Development System)을 사용하여 제조사의 설명에 따라 효소-결합된 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 측정하였다.

유식 세포측정에 의한 표현형 검사

단핵세포 및 단핵세포-유도된 DC를 상술한 바와 같이 생성시켰다. 단핵세포 단리 후 CD14+ 단핵세포의 빈도를, 세포를 FITC-항 인간 CD14로 염색함으로써 평가하였다. IL-4 및 GM-CSF가 보충된 셀그로에서 5일의 배양 후에, 미성숙 DC를 세척하고 후속으로 FITC 항-인간 CD83과 함께 PE 항-인간 CD86으로 염색하였다. 후속으로 활성화 인자에 의해 18시간 동안 활성화된 미성숙 DC를 또한 FITC 항-인간 CD83과 함께 PE 항-인간 CD86으로 염색하였다. FITC 및 PE로 염색한 마우스 IgG1 및 IgG2를 아이소타입 대조군(모두 미국 캘리포니아 소재의 BD 바이오사이언시즈(Biosciences)로부터)으로서 사용하였다. 상기 샘플들을 셀 퀘스트(Cell Quest) 소프트웨어(미국 캘리포니아 소재의 BD 바이오사이언스)를 사용하여 유식 세포측정(FACS)에 의해 분석하였다.

결과

하기에, 상기 실험 부분으로부터의 결과들을 언급한다.

단핵세포-농축된 동종이계 백혈구의 공동-배양물로부터 유래된 DC는, 비-인간 혈청이 없고 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 수성 세포 배양 배지에서 공동-배양될 때 표현형적으로 활성화/성숙되지 않는다.

4 내지 7일 동안 비-인간 혈청이 없고 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 세포 배양 배지 중의 단일 혈액 공여자로부터의 단핵세포의 전파는, 상기 성숙화 마커 CD83의 낮은 발현 및 상기 공동자극 분자 CD86의 낮은 발현을 포함하여, 전형적인 "미성숙" 표현형을 갖는 비-소모성 DC를 생성시킨다. 도 1a 및 b에서 보이는 바와 같이, 3개의 상이한 "단일" DC에 대한 CD83 및 CD86 모두의 평균-발현은 3명의 공여자 모두의 혼합물로부터 유래된 DC의 CD83(도 1a) 및 CD86(도 1b) 발현과 비교할 때 유사하였다. 도 1c 및 d에서 보이는 바와 같이, 4일 동안 비-인간 혈청이 없고 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 수성 세포 배양 배지에서의 전파 및 18시간 동안 자극 인자들에 의한 후속의 지속적인 활성화 후에 "단일" DC(분석된 3명의 상이한 말초 혈액 공여자들로부터의 DC)에 대한 활성화/성숙화 마커 CD83 및 CD86의 강하게 증가된 평균-발현은, 3명의 공여자 모두로부터의 동종이계 단핵세포-농축된 백혈구의 혼합물로부터 유래된 활성화된 DC상에서의 CD83(도 1c) 및 CD86(도 1d)과 비교할 때 유사하였다.

종합하면, 이러한 발견들은 상기 혼합된 동종이계 단핵세포 집단으로부터의 단핵세포-유래된 DC가 5일 동안 GM-CSF 및 IL-4에서 배양 후 미성숙하고 따라서 단핵세포에서 미성숙 DC로의 분화 도중 어떠한 활성화/성숙화 신호도 경험하지 않았음을 가리킨다. 더욱이, 상기 혼합된 동종이계 단핵세포-집단으로부터의 미성숙 DC는 활성화 인자에 의해 자극될 때 표현형적 성숙화에 강하게 반응하므로 적어도 표현형적으로 비-소모성이다.

유식 세포측정에 의해 데이터를 획득하였다. 각각의 Y-축은 18시간 동안 활성화 인자에 의한 지속적인 자극 전후의 CD83 및 CD86에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 상기 X-축은 측정된 상이한 조합들을 나타낸다.

혼합된 동종이계 말초 혈액 단핵세포의 공동-배양물로부터 유래된 미성숙 DC는 기능상 소모되지 않는다.

4 내지 7일 동안 GM-CSF 및 IL-4 보충된 배양 배지에서 단핵세포(하나의 단일 혈액 공여자로부터)의 전파는 몇몇 활성화 인자에 의해 자극시 프로-염증 케모킨(MIP-1알파, MIP-1베타, RANTES 및 MIG) 및 프로-염증 사이토킨(IL-12p70 및 TNF-알파)의 왕성한 생산에 반응하는 비-소모성 DC를 생성시키는 것으로 공지되어 있다.

도 2에서 보이는 바와 같이, 18시간 동안 자극 인자로 지속적인 활성화 동안 "단일" DC(분석된 3명의 상이한 말초 혈액 공여자로부터의 DC)에 의해 생산된 높은 평균 수준의 MIP-1 알파(도 2a), MIP-1 베타(도 2b), RANTES(도 2c), MIG(도 2d)는 상기 3명의 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 DC간에는 활성화-유도된 케모킨 생산의 상당한 변화가 존재한다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 활성화된 "단일" DC에 의해 생산된 IL-12p70(도 3a) 및 TNF-알파(도 3b)의 높은 평균 수준은 상기 3명의 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 DC간에는 IL-12p70과 TNF-알파 생산의 상당한 변화가 존재한다.

데이터를 ELISA 분석으로부터 획득하였다. 나타낸 결과는 3명의 개인으로부터의 평균값±SD 및 상기 3명의 공여자 모두의 혼합물로부터 획득된 값이다. 각 Y-축은 18시간의 지속적인 자극/활성화 동안 pg/㎖/1 x 10⁶ 세포로 생산된 각 물질의 양을 나타낸다. X-축은 측정된 상이한 조합들을 나타낸다.

프로스타글란딘 E2(PGE2)는 미성숙 DC의 활성화-유도된 소모에서 중심 역할을 하는 것으로 제안되었다(Rieser C et al., Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-α and Prostaglandin E2. Blood 91 (1998) 3112-3117). 따라서 우리는 동종이계 단핵세포의 공동배양 동안 Cox-2 억제제 NS-398의 첨가(PGE2의 잠재적인 생산을 억제할 목적으로)가 후속 활성화시 염증전 케모킨(MIG-생산에 의해 나타남) 또는 염증전 사이토킨(IL-12p70 생산에 의해 나타남)의 생산을 증가시키는 지를 조사하였다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 단핵세포의 DC로의 전파 동안 상기 Cox-2 억제제 NS-398의 존재는 MIG 및 IL-12p70의 활성화-유도된 생산을 증가시키지 않고, 오히려 감소시켰다. 따라서, 혼합된 동종이계 단핵세포의 공동배양물로부터 분화된 미성숙 DC의 PGE2-매개된 소모의 징후가 없다.

데이터를 ELISA 분석으로부터 획득하였다. 나타낸 결과는 3명의 공여자 모두의 혼합물로부터의 하나의 실험으로부터의 것이다. 각 Y-축은 18시간의 지속적인 자극/활성화 동안 pg/㎖/1 x 10⁶ 세포로 생산된 각 물질의 양을 나타낸다. X-축은 측정된 상이한 조합들을 나타낸다.

혼합된 동종이계 단핵세포-농축된 버피 코트 백혈구의 공동-배양물로부터 유래된 미성숙 DC가 기능상 소모되지 않는다.

도 5에서 보이는 바와 같이, 18시간 동안 자극 인자로 지속적인 활성화 동안 "단일" DC(분석된 3명의 상이한 버피 코트 공여자로부터의 DC)에 의해 생산된 높은 평균 수준의 활성화-유도된 프로-염증 케모킨 MIP-1 알파(도 5a), MIP-1 베타(도 5b), RANTES(도 5c), MIG(도 5d)는 상기 3명의 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 DC간에는 케모킨 생산의 상당한 변화가 존재한다.

도 6에서 보이는 바와 같이, "단일" DC에 의해 생산된 IL-12p70(도 6a) 및 TNF-알파(도 6b)의 높은, 활성화-유도된, 평균 수준은 상기 3명의 공여자 모두의 단핵세포-농축된 백혈구 혼합물로부터 유래된 DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 DC간에는 IL-12p70과 TNF-알파 생산의 상당한 변화가 존재한다.

혼합된 동종이계 말초 혈액 단핵세포의 공동-배양물로부터 유래된 PI-DC는 프로-염증 케모킨 및 사이토킨의 지속적인 생산을 나타낸다.

환자에게 활성화된 프로-염증 DC(PI-DC)를 주사하기 위해서, 상기를 대개는 투여 전에 세척해야 한다. 그렇지 않는 경우, 자극제(생체외에서 PI-DC를 유도할 목적으로)의 동반 투여에 의해 유도되는 불필요한 부작용이 발생할 수도 있다. 따라서 미성숙 DC는 상기 활성화-유도 인자의 중지 후에도 또한 바람직한 인자들의 지속적인 생산과 함께 PI-DC로 활성화됨에 틀림없다. 도 7에서 보이는 바와 같이, 활성화 인자의 회수 후에 "단일" PI-DC(분석된 3명의 상이한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵세포로부터의 PI-DC)에 의해 생산된 평균 수준의 MIP-1 알파(도 7a), MIP-1 베타(도 7b), RANTES(도 7c), MIG(도 7d)는 상기 3명의 말초 혈액 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 PI-DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 활성화 인자의 회수 후에 상이한 단일 공여자 PI-DC간에는 케모킨 생산의 상당한 변화가 존재한다. 활성화 인자의 회수 후에 "단일" PI-DC에 의해 생산된 IL-12p70(도 8a) 및 TNF-알파(도 8b)의 평균 생산은 또한 상기 3명의 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 세척된 PI-DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 활성화 인자의 회수 후에 상이한 단일 공여자 PI-DC간에는 사이토킨 생산의 상당한 변화가 존재한다.

데이터를 ELISA 분석으로부터 획득하였다. 나타낸 결과는 3명의 개인으로부터의 평균값±SD 및 상기 3명의 공여자 모두의 혼합물로부터 획득된 값이다. 각 Y-축은 활성화 인자의 회수 후 24시간 동안 pg/㎖/1 x 10⁶ 세포로 생산된 각 물질의 양을 나타낸다. X-축은 측정된 상이한 조합들을 나타낸다.

혼합된 동종이계 단핵세포-농축된 말초 버피 코트 백혈구의 공동-배양물로부터 유래된 PI-DC는 프로-염증 케모킨 및 사이토킨의 지속적인 강한 생산을 나타낸다.

도 9에서 보이는 바와 같이, 활성화 인자의 회수 후에 "단일" PI-DC(분석된 3명의 상이한 공여자로부터의 버피 코트 단핵세포로부터의 PI-DC)에 의해 생산된 평균 수준의 MIP-1 알파(도 9a), MIP-1 베타(도 9b), RANTES(도 9c), MIG(도 9d)는 상기 3명의 버피 코트 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 PI-DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 PI-DC간에는 케모킨 생산의 상당한 변화가 존재한다. 활성화 인자의 회수 후에 "단일" PI-DC에 의해 생산된 IL-12p70(도 10a) 및 TNF-알파(도 10b)의 평균 생산은 또한 상기 3명의 버피 코트 공여자 모두로부터의 단핵세포의 혼합물로부터 유래된 세척된 PI-DC와 비교할 때 유사하였다. 현저하게, 상이한 단일 공여자 PI-DC간에는 사이토킨 생산의 상당한 변화가 존재한다.

단핵세포-농축된 필터 백혈구로부터 유래된 혼합된 미성숙 DC는 활성화시 상당량의 프로-염증 케모킨 및 사이토킨을 생산한다.

도 11에서 보이는 바와 같이, 단핵세포-농축된 필터 백혈구(초기 백혈구 집단은 4-버피 코트 백혈구 고갈 필터로부터 용리되었다)로부터 유래된 활성화된 혼합된 DC는 상당량의 MIP-1 알파(도 11a), MIP-1 베타(도 11b), RANTES(도 11c), MIG(도 11d)를 생산하였다. 도 12에서 보이는 바와 같이, 상당량의 IL-12p70(도 12a) 및 TNF-알파(도 12b)가 또한 생산되었다.

데이터를 ELISA 분석으로부터 획득하였다. 나타낸 결과는 하나의 실험으로부터의 값이다. 각 Y-축은 18시간의 지속적인 자극/활성화 동안 pg/㎖/1 x 10⁶ 세포로 생산된 각 물질의 양을 나타낸다.

단핵세포-농축된 필터 백혈구로부터 유래된 혼합된 미성숙 PI-DC는 활성화 인자의 회수 후에 프로-염증 케모킨 및 사이토킨의 상당한 생산을 나타낸다.

도 13에서 보이는 바와 같이, 필터 단핵세포(초기 백혈구 집단은 4-버피 코트 백혈구 고갈 필터로부터 용리되었다)로부터 유래된 활성화된 혼합된 DC는 활성화 인자의 회수 후에 상당량의 MIP-1 알파(도 13a), MIP-1 베타(도 13b), RANTES(도 13c), MIG(도 13d)를 생산하였다. 도 14에서 보이는 바와 같이, 상당량의 IL-12p70(도 14a) 및 TNF-알파(도 14b)가 또한 생산되었다. 데이터를 ELISA 분석으로부터 획득하였다. 나타낸 결과는 하나의 실험으로부터의 값이다. 각 Y-축은 활성화 인자의 회수 후에 24시간 동안 pg/㎖/1 x 10⁶ 세포로 생성된 각 물질의 양을 나타낸다.

Claims

비-소모성(non-exhausted) 미성숙 수지상 세포(DC)의 생성 방법으로서,
-적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득한 동종이계 백혈구의 혼합물을 제공하는 단계;
-상기 동종이계 백혈구의 혼합물로부터 동종이계 단핵세포를 단리하여 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구를 제공하는 단계; 및
-상기 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구로부터 비-소모성 미성숙 DC를 생성하는 단계를 포함하고,
비-소모성 미성숙 수지상 세포(DC)의 생성을, 비-인간 혈청이 없고, 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된 수성 세포 배양 배지에서 2 내지 7일 동안 상기 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구를 공동-배양함으로써 수행하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 배양 배지가 트랜스페린, 알부민 및 인슐린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 인간 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단핵세포-농축된 동종이계 백혈구가 동종이계 호중구를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 동종이계 백혈구의 혼합물이 백혈구를 포함하는 적어도 2개의 버피 코트(buffy coat)의 풀링(pooling)에 의해 제공되고, 풀링되는 상기 버피 코트가 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득되는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 동종이계 백혈구의 혼합물이
-적어도 2개의 백혈구 고갈 필터로부터 백혈구를 용리시키는 단계로서, 각각의 필터가 이전에 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 수득되는 전혈로부터 백혈구를 고갈시키기 위해 사용되었던 것인, 단계 ; 및
-상기 수득된 백혈구를 풀링하여 상기 동종이계 백혈구의 혼합물을 수득하는 단계에 의해 제공되거나; 또는
-백혈구 고갈 필터로부터 백혈구를 용리시키는 단계로서, 필터가 적어도 2명의 상이한 동종이계 공여자로부터 기원하는 풀링된 버피 코트로부터 백혈구를 고갈시키기 위해 사용되었던 것인 단계에 의해 제공되는,
방법.
제1항에 있어서,
상기 동종이계 단핵세포가 유출(elutriation) 또는 항체/비드 단리에 의해 단리되는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 공동-배양이 5일 동안 수행되는, 방법.
제1항에 있어서,
비-소모성 미성숙 DC에 항원을 부하하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
전염증성(pro-inflammatory) DC의 생성 방법으로서,
-제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 비-소모성 미성숙 DC를 제공하는 단계; 및
-상기 비-소모성 미성숙 DC를 활성화시켜 전염증성 DC를 수득하는 단계
를 포함하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 활성화가 톨형 수용체 3(TLR3)-리간드 폴리-I:C, TLR7/8-리간드, 및 인터페론 감마(IFN-γ)의 첨가에 의해 수행되어 활성화를 유도하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 TLR7/8-리간드가 레시퀴모드, 가디퀴모드, 및 이미퀴모드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 활성화가, TLR2-리간드, TLR4-리간드, TLR9-리간드, 인터페론 알파(IFN-α), 인터류킨 1β(IL-1β), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 첨가하여 활성화를 유도하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 활성화가 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 첨가를 포함하지 않는, 방법.
제9항에 있어서,
미성숙 DC를 8 내지 24시간 동안 활성화 인자에 노출시키고, 그 후에 모든 상기 활성화 인자를 필수적으로 씻어내는, 방법.
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