ES2591230T3

ES2591230T3 - Co-diferenciación y activación de monocitos procedentes de donantes alogénicos para producir células dendríticas pro-inflamatorias

Info

Publication number: ES2591230T3
Application number: ES15161369.2T
Authority: ES
Inventors: Alex Karlsson-Parra; Bengt Andersson
Original assignee: Immunicum AB
Current assignee: Mendus AB
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2016-11-25
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: JP6529439B2; DK2913394T3; PL2913394T3; MX357491B; EP2913394B1; US10626371B2; WO2014096033A1; KR20150122624A; US20170321189A1; DK2788474T3; SI2788474T1; CN105452449B; ES2548229T3; KR102148051B1; RU2668816C2; RU2015119164A; AU2013360793B2; BR112015014270B1; CA2895280C; CA2895280A1

Abstract

Un método para producir células dendríticas (CD) pro-inflamatorias, que comprende las etapas de: - proporcionar una mezcla de leucocitos alogénicos, dichos leucocitos alogénicos han sido obtenidos de al menos dos donantes alogénicos diferentes; - a partir de dicha mezcla de leucocitos alogénicos, aislar monocitos alogénicos, para ofrecer leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos; - generar CD inmaduras, no agotadas, procedentes de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, en donde la generación de CD inmaduras, no agotadas, se lleva a cabo por co-cultivo de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos durante 2 a 7 días en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano, en donde dicho medio se suplementa con interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y - activar las CD inmaduras, no agotadas para obtener CD pro-inflamatorias.

Description

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CSF en combinación con IL-4, dado que ha demostrado prevenir la alorreactividad y la activación prematura cuando se utiliza en combinación con un medio libre de suero no humano.

Los expertos en la técnica están familiarizados con medios de cultivo celular y sus componentes. Típicamente, el medio de cultivo celular usado comprende:

al menos una sal tal como NaCl, KCl, MgSO4 y/o Ca(NO3)2;

al menos un azúcar tal como glucosa;

uno o múltiples aminoácidos tales como L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, Ltriptófano, L-tirosina, L-valina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido Lglutámico, glicina, L-histidina, L-hidroxiprolina, L-isoleucina y/o L-lisina;

una o múltiples vitaminas y otros nutrientes vitales tales como glutatión, biotina, vitamina B12, Dpantotenato de Ca, cloruro de colina, ácido fólico, mioinositol, nicotinamida, ácido p-amino-benzoico, piridoxina, riboflavina y/o tiamina; y

al menos una sustancia tampón tal como sal de fosfato (por ejemplo, Na2HPO4) y/o una sal de carbonato (por ejemplo, NaHCO3).

Según una realización, el medio de cultivo comprende al menos una sal tal como NaCl, al menos un azúcar tal como glucosa, uno o múltiples aminoácidos, una o múltiples vitaminas, y una sustancia tampón tal como una sal de fosfato (por ejemplo, Na2HPO4) y/o una sal de carbonato (por ejemplo, NaHCO3).

Adicionalmente, aunque el medio de cultivo celular está además libre de un suero no humano, típicamente comprende al menos un polipéptido humano. Según una realización, el medio de cultivo celular comprende al menos un polipéptido humano seleccionado del grupo que consiste en transferrina, albúmina e insulina; preferiblemente, el medio de cultivo celular comprende los tres. El polipéptido humano se puede obtener de plasma humano. Además, pueden ser producidos de manera recombinante. Por ejemplo, la insulina se puede producir de forma recombinante en células de levadura.

Por ejemplo, el medio de cultivo celular libre de suero no humano puede ser CellGro®, que es un medio acorde con las GMP, libre de suero, para cultivo de células dendríticas (CD) comercializado por CellGenix GmbH. En los EE.UU. el medio está disponible en el comercio bajo la marca registrada CellGenix®.

Tal como podrán reconocer los expertos en la técnica y como se explica en este documento, el término “aislado” no necesariamente se refiere a una pureza de 100%, sino a monocitos obtenidos por un proceso de aislamiento que muestra preferencia por los monocitos. Los monocitos obtenidos por un proceso de este tipo se pueden designar como leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, puesto que, además de los monocitos, estarán presentes otros leucocitos.

Según una realización, los monocitos alogénicos se enriquecen a partir de la mezcla de leucocitos alogénicos. Los leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos comprenden, además de los monocitos, también típicamente neutrófilos alogénicos. Adicionalmente, pueden comprender otros granulocitos.

Al contrario que la opinión predominante, no se observaron signos de activación prematura cuando los monocitos alogénicos se co-cultivaron en medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano y suplementado con GM-CSF/IL-4, a pesar del hecho de que se obtuvieron CD inmaduras de una mezcla de leucocitos alogénicos. En consecuencia, estas CD inmaduras no están agotadas y, por lo tanto, son capaces de producir de manera sostenida, tras la retirada de los factores de activación, cantidades sustanciales tales como más de 2.000, 5.000 o 7.000 pg/mL de quimiocinas pro-inflamatorias que incluyen MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES y MIG, y cantidades sustanciales tales como más que 500, 1.500 o 3.000 pg/mL de citoquinas pro-inflamatorias que incluyen IL-12p70 y TNF-alfa.

Según una realización, por “inmadura” se dan a entender CD que expresan solamente niveles bajos de los marcadores de maduración de CD, CD83 y CD86, y que son capaces de producir grandes cantidades de quimiocinas y citoquinas pro-inflamatorias tras su activación. Según la invención, por “niveles bajos” se debe interpretar un incremento de al menos 3 veces, por ejemplo de al menos 5 veces, de la expresión de CD83 registrada tras la activación, y un aumento de al menos 5 veces, por ejemplo de al menos 8 veces, de la expresión de CD86 registrada tras la activación.

Puesto que se había previsto que se registraría una activación prematura, en algunos experimentos se agregó el inhibidor de ciclooxigenasa-2, NS-398, un factor conocido por impedir el agotamiento mediado por la prostaglandina E2 (PGE2) de las CD activadas. Sin embargo, durante la propagación de monocitos en CD, la presencia de NS-398 no aumentó, sino más bien redujo la producción inducida por la activación de MIG e IL-12p70. Por consiguiente, no hay signos de agotamiento mediado por PGE2 de las CD inmaduras diferenciadas a partir de co-cultivos de monocitos alogénicos mezclados.

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Una realización adicional se refiere a una mezcla de estas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas, o a una composición de este tipo que comprende dichas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas, para usar en el tratamiento del cáncer. De manera similar, una realización se refiere a una mezcla de este tipo de células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Otra realización adicional hace referencia a un método para tratar el cáncer, en el que se administra una mezcla de células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas a un paciente que requiere dicho tratamiento, en una dosis suficiente para activar las CD del propio paciente para el desarrollo de CD migratorias cargadas con el tumor.

A continuación, se describen otras realizaciones numeradas adicionales.

1. Un método de producción de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de leucocitos alogénicos, los cuales han sido obtenidos de al menos dos donantes alogénicos diferentes;

a partir de dicha mezcla de leucocitos alogénicos, aislar monocitos alogénicos, para ofrecer leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos; y

generar CD inmaduras, no agotadas, procedentes de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, en donde la generación de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, se lleva a cabo por el co-cultivo de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos durante 2 a 7 días en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano, en donde dicho medio se suplementa con interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

2.: El método según la realización 1, en el que dicho medio de cultivo celular comprende al menos un polipéptido humano.

3.: El método según la realización 2, en el que dicho polipéptido humano se selecciona del grupo que consiste en transferrina, albúmina e insulina.

4.: El método según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en el que dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos comprenden neutrófilos alogénicos.

5.: La realización según una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en la que dicha mezcla de leucocitos alogénicos se consigue combinando al menos dos capas leuco-plaquetarias que comprenden leucocitos, en donde dichas capas leuco-plaquetarias que se deben combinar se han obtenido de al menos dos donantes alogénicos diferentes.

6.: El método según la realización 5, en el que dichas capas leuco-plaquetarias combinadas contienen plaquetas o éstas han sido retiradas.

7.: El método según una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que dicha mezcla de leucocitos alogénicos se obtiene por:

elusión de leucocitos a partir de al menos dos filtros de depleción leucocitaria, los cuales han sido utilizados, previamente, para retirar leucocitos desde la sangre entera, en donde dicha sangre entera se ha obtenido de al menos dos donantes alogénicos diferentes; y

combinación de los leucocitos obtenidos para conseguir dicha mezcla de leucocitos alogénicos;

o por:

elusión de leucocitos a partir de un filtro de depleción leucocitaria, el cual se ha utilizado para retirar leucocitos de capas leuco-plaquetarias combinadas, en donde las capas leuco-plaquetarias proceden de al menos dos donantes alogénicos diferentes.

8.: El método según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que dichos monocitos alogénicos se aíslan por elutriación o por aislamiento de anticuerpos/perlas.

9.: El método según una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que dicho co-cultivo se lleva a cabo durante aproximadamente 5 días.

10.: El método según una cualquiera de las realizaciones anteriores, que comprende, además, la etapa de cargar las CD inmaduras, no agotadas, con un antígeno.

11.: Una mezcla de células dendríticas (CD) alogénicas, no agotadas e inmaduras, procedentes de al menos dos donantes alogénicos diferentes, en donde dichas células dendríticas (CD) se pueden obtener por un método según una cualquiera de las realizaciones 1 a 10.

12.: Un método para producir CD pro-inflamatorias, que comprende las etapas de:

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En los sobrenadantes se llevó a cabo un análisis ELISA, según se describe más adelante, con el objetivo de estudiar los niveles de quimiocinas pro-inflamatorias y de citoquinas pro-inflamatorias.

Evaluación por ELISA de los niveles de quimiocinas pro-inflamatorias y citoquinas pro-inflamatorias

Con el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), empleando el Sistema de Desarrollo de ELISA Duo Set de R&D Systems, Minneapolis, EE.UU. se midieron las quimiocinas pro-inflamatorias CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES y CXCL9/MIG, así como las citoquinas pro-inflamatorias IL-12p70 y TNF-α, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Examen fenotípico por citometría de flujo

Los monocitos y las CD derivadas de monocitos se generaron de la forma descrita anteriormente. La frecuencia de monocitos CD14+ tras el aislamiento de monocitos se determinó mediante la tinción de las células con el anticuerpo CD14-FITC antihumano. Después de 5 días de incubación en CellGro suplementado con IL-4 y GM-CSF, se lavaron las CD inmaduras y se tiñeron a continuación con CD86 antihumano acoplado a PE combinado con CD83 antihumano acoplado a FITC. Asimismo, las CD inmaduras que se activaron subsiguientemente durante 18 h con factores de activación, se tiñeron con CD86 antihumano acoplado a PE combinado con CD83 antihumano acoplado a FITC. Se usaron IgG1 e IgG2 de ratón, teñidas con FITC y PE, como controles de isotipo (todas de BD Biosciences, California, EE.UU.). Las muestras se analizaron por citometría de flujo (FACS) usando el software Cell Quest (BD Biosciences, California, EE.UU.).

Resultados

A continuación, se comentan los resultados de la parte experimental.

Las CD derivadas de co-cultivos de leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos no se activan/maduran fenotípicamente cuando se co-cultivan en medio de cultivo celular acuoso libre de suero no humano y suplementado con GM-CSF e IL-4.

La propagación de monocitos procedentes de donantes individuales de sangre en medio de cultivo celular acuoso libre de suero no humano y suplementado con GM-CSF e IL-4 durante 4 a 7 días da lugar a CD no agotadas con un fenotipo típicamente “inmaduro”, incluida una baja expresión del marcador de maduración CD83 y baja expresión de la molécula co-estimuladora CD86. Como se ve en las Figuras 1a y b, la expresión media tanto de CD83 como de CD86 para tres diferentes CD “individuales” fue similar, en comparación con la expresión de CD83 (Fig. 1a) y CD86 (Fig. 1b) de CD derivadas de una mezcla de los tres donantes. Como se ve en las Figuras 1c y d, la expresión media, fuertemente incrementada, de los marcadores de activación/maduración CD83 y CD86 para CD “individuales” (CD de 3 donantes diferentes de sangre periférica analizados), tras la propagación en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano y suplementado con GM-CSF e IL-4 durante 4 días y posterior activación persistente con factores de estimulación durante 18 horas, fue similar en comparación con la expresión de CD83 (Fig. 1c) y CD86 (Fig. 1d) en CD activadas, derivadas de una mezcla de leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos de los tres donantes.

Considerados de manera conjunta, estos hallazgos indican que las CD derivadas de monocitos de la población monocitaria alogénica mixta son inmaduras después del cultivo en GM-CSF e IL-4 durante 5 días y, por consiguiente, no han experimentado ninguna señal de activación/maduración durante su diferenciación desde monocitos en CD inmaduras. Es más, las CD inmaduras procedentes de la población monocitaria alogénica mixta, fenotípicamente al menos no están agotadas, puesto que responden de forma intensa con maduración fenotípica cuando son estimuladas con factores de activación.

Datos obtenidos con citometría de flujo. El correspondiente eje Y muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) para CD83 y CD86 antes y después de la estimulación persistente con factores de activación durante 18 horas. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.

Las CD inmaduras derivadas de co-cultivos de monocitos de sangre periférica alogénicos mixtos no están funcionalmente agotadas.

Es sabido que la propagación de monocitos (de un único donante de sangre) en medio de cultivo suplementado con GM-CSF e IL-4 durante 4 a 7 días da lugar a CD no agotadas que responden con una vigorosa producción de quimiocinas pro-inflamatorias (MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES y MIG) y de citoquinas pro-inflamatorias (IL-12p70 y TNF-alfa) tras la estimulación con ciertos factores de activación.

Como se ve en la Figura 2, los elevados niveles medios de MIP-1 alfa (Fig. 2a), MIP-1 beta (Fig. 2b), RANTES (Fig. 2c) y MIG (Fig. 2d) producidos por CD “individuales” (CD de los tres donantes diferentes de sangre periférica analizados) durante la activación persistente con factores de estimulación durante 18 horas fueron similares, en comparación con las CD derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes. De manera notable, se observa una variación sustancial en la producción de quimiocinas, inducida por la activación, entre las diferentes CD de donantes individuales. Como se ve en la Figura 4, los elevados niveles medios de IL-12p70 (Fig. 3a) y TNF-alfa

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(Fig. 3b) producidos por CD “individuales” activadas fueron similares, en comparación con las CD derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes. En especial, se observa una variación sustancial en la producción de IL12p70 y TNF-alfa entre las diferentes CD de donantes individuales.

Los datos se obtuvieron de un análisis con ELISA. Los resultados que se muestran son valores medios ± DT (desviación típica) de tres individuos y el valor obtenido de la mezcla de los tres donantes. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la sustancia correspondiente producida en pg/mL/1 x 106 células durante 18 horas de estimulación/activación persistentes. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.

Se ha indicado que la prostaglandina E2 (PGE2) podría desempeñar una función importante en el agotamiento, inducido por la activación, de las CD inmaduras (Rieser C. et al., “Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization: Role of Tumor Necrosis Factor-α and Prostaglandin E2”, Blood, 91 (1998), 31123117). Por lo tanto, los autores investigaron si la adición del inhibidor de Cox-2, NS-398 (dirigido a inhibir la producción potencial de PGE2), durante el co-cultivo de monocitos alogénicos incrementaría la producción de quimiocinas pro-inflamatorias (representadas por la producción de MIG) o de citoquinas pro-inflamatorias (representadas por la producción de IL-12p70) tras la subsiguiente activación. Como se ve en la Figura 4, la presencia del inhibidor de Cox-2, NS-398, durante la propagación de monocitos en CD no aumentó, sino más bien redujo la producción de MIG e IL-12p70 inducida por la activación. Por consiguiente, no hubo señales de agotamiento mediado por PGE2 de las CD inmaduras diferenciadas de los co-cultivos de monocitos alogénicos mixtos.

Los datos se obtuvieron de un análisis con ELISA. Los resultados que se muestran corresponden a un experimento con la mezcla de los tres donantes. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la sustancia correspondiente producida en pg/mL/1 x 106 células durante 18 horas de estimulación/activación persistentes. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.

Las CD derivadas de co-cultivos de leucocitos alogénicos mixtos de capas leuco-plaquetarias, enriquecidos con monocitos, no están funcionalmente agotadas.

Como se ve en la Figura 5, los elevados niveles medios de las quimiocinas pro-inflamatorias inducidas por la activación, MIP-1 alfa (Fig. 5a), MIP-1 beta (Fig. 5b), RANTES (Fig. 5c) y MIG (Fig. 5d), producidas por las CD “individuales” (CD de los tres diferentes donantes de capas leuco-plaquetarias analizados) durante la activación persistente con factores de estimulación durante 18 horas fueron similares, en comparación con las CD derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes. En particular, se aprecia una variación sustancial en la producción de quimiocinas entre las CD de los diferentes donantes individuales.

Como se ve en la Figura 6, los elevados niveles medios, inducidos por la activación, de IL-12p70 (Fig. 6a) y TNF-alfa (Fig. 6b) producidos por CD “individuales” fueron similares, en comparación con las CD derivadas de una mezcla de leucocitos enriquecidos con monocitos procedente de los tres donantes. En particular, se observa una variación sustancial en la producción de IL-12p70 y TNF-alfa entre las CD de diferentes donantes individuales.

Los datos se obtuvieron por análisis con ELISA. Los resultados se muestran como valores medios ± DT de tres individuos y el valor obtenido de la mezcla de los tres donantes. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la correspondiente sustancia producida, en pg/mL/1 x 106 células, durante 18 horas de estimulación/activación persistentes. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.

Las CD PI derivadas de co-cultivos de monocitos alogénicos mixtos procedentes de sangre periférica exhiben una producción sostenida de quimiocinas y citoquinas pro-inflamatorias.

Al objeto de inyectar CD pro-inflamatorias (CD PI) activadas en el paciente, habitualmente es necesario lavarlas antes de la administración. De lo contrario, pueden surgir efectos adversos inducidos por la administración simultánea de agentes de estimulación (dirigidos a inducir CD PI ex vivo). Por lo tanto, las CD inmaduras deben ser activadas en CD PI con una producción sostenida de factores deseables también después del cese de los factores inductores de la activación. Como se ve en la Figura 7, los niveles medios de MIP-1 alfa (Fig. 7a), MIP-1 beta (Fig. 7b), RANTES (Fig. 7c) y MIG (Fig. 7d), producidas por las CD PI “individuales” tras la retirada de los factores de activación (CD PI de monocitos de sangre periférica de los tres donantes diferentes analizados) fueron similares, en comparación con las CD PI derivadas de una mezcla de monocitos procedentes de los tres donantes de sangre periférica. En particular, se observa una variación sustancial en la producción de quimiocinas entre las diferentes CD PI de donantes individuales. La producción media de IL-12p70 (Fig. 8a) y TNF-alfa (Fig. 8b) suministrada por CD PI “individuales” tras la retirada de los factores de activación también fue similar, en comparación con CD PI lavadas derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes. En particular, se observa una variación sustancial en la producción de citoquinas entre diferentes CD PI de donantes individuales tras la retirada de los factores de activación.

Los datos se obtuvieron por análisis con ELISA. Los resultados se muestran como valores medios ± DT de tres individuos y el valor obtenido de la mezcla de los tres donantes. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la correspondiente sustancia producida, en pg/mL/1 x 106 células, durante 24 horas después de la retirada de los factores de activación. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.

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Las CD PI derivadas de co-cultivos de leucocitos alogénicos mixtos, enriquecidos con monocitos, de capas leucoplaquetarias de sangre periférica exhiben una intensa producción sostenida de quimiocinas y citoquinas proinflamatorias.

Como se ve en la Figura 9, el nivel medio de MIP-1 alfa (Fig. 9a), MIP-1 beta (Fig. 9b), RANTES (Fig. 9c) y MIG (Fig. 9d) producidas por CD PI “individuales” tras la retirada de los factores de activación (CD PI procedentes de monocitos de capas leuco-plaquetarias de los tres donantes diferentes analizados) fueron similares, en comparación con las CD PI derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes de capas leuco-plaquetarias. En particular, se observa una variación sustancial en la producción de quimiocinas entre las diferentes CD PI de donantes individuales. La producción media de IL-12p70 (Fig. 10a) y TNF-alfa (Fig. 10b) suministrada por CD PI “individuales” tras la retirada de los factores de activación también fue similar, en comparación con CD PI lavadas derivadas de una mezcla de monocitos de los tres donantes de capas leuco-plaquetarias. En particular, se observa una variación sustancial en la producción de citoquinas entre diferentes CD PI de donantes individuales.

Las CD inmaduras mixtas derivadas de leucocitos enriquecidos con monocitos producen cantidades sustanciales de quimiocinas y citoquinas pro-inflamatorias tras su activación.

Como se ve en la Figura 11, las CD mixtas activadas, derivadas de leucocitos de filtro, enriquecidos con monocitos (la población inicial de leucocitos se eluyó a partir de un filtro de depleción leucocitaria de 4 capas leucoplaquetarias), produjeron cantidades sustanciales de MIP-1 alfa (Fig. 11a), MIP-1 beta (Fig. 11b), RANTES (Fig. 11c) y MIG (Fig. 11d). Tal como se ve en la Figura 12, se produjeron también cantidades sustanciales de IL-12p70 (Fig. 12a) y TNF-alfa (Fig. 12b).

Los datos se obtuvieron de un análisis con ELISA. Los resultados que se muestran son valores de un experimento. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la sustancia producida correspondiente, en pg/mL/1 x 106 células, durante 18 horas de estimulación/activación persistentes.

Las CD PI mixtas derivadas de leucocitos de filtro enriquecidos con monocitos exhiben una producción sustancial de quimiocinas y citoquinas pro-inflamatorias tras la retirada de los factores de activación.

Tal como se ve en la Figura 13, las CD mixtas activadas, derivadas de monocitos de filtro (la población inicial de leucocitos se eluyó a partir de un filtro de depleción leucocitaria de 4 capas leuco-plaquetarias), produjeron cantidades sustanciales de MIP-1 alfa (Fig. 13a), MIP-1 beta (Fig. 13b), RANTES (Fig. 13c) y MIG (Fig. 13d) tras la retirada de los factores de activación. Como se ve en la Figura 14, se produjeron también cantidades sustanciales de IL-12p70 (Fig. 14a) y TNF-alfa (Fig. 14b). Los datos se obtuvieron de un análisis con ELISA. Los resultados que se muestran son valores de un experimento. El correspondiente eje Y muestra la cantidad de la sustancia producida correspondiente, en pg/mL/1 x 106 células, durante 24 horas después de la retirada de los factores de activación.

Claims

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