ES2548229T3 - Co-diferenciación de monocitos procedentes de donantes alogénicos - Google Patents
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Abstract
Un método de producción de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, que comprende las etapas de: - proporcionar una mezcla de leucocitos alogénicos, los cuales han sido obtenidos de al menos dos donantes alogénicos diferentes; - a partir de dicha mezcla de leucocitos alogénicos, aislar monocitos alogénicos, para ofrecer leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos; y - generar CD inmaduras, no agotadas, procedentes de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, en donde la generación de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, se lleva a cabo por co-cultivo de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos durante 2 a 7 días en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano, en donde dicho medio se suplementa con interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
Description
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E13814106
23-09-2015
familia de receptores tipo Toll (TLR)). Los PRR controlan la expresión de muchos genes de respuesta innata y pueden señalizar directamente una activación de CD. Además la señalización de PRR tanto en células inmunitarias como no inmunitarias da lugar, con frecuencia, a la síntesis de citoquinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina-1 (IL-1), las cuales pueden estimular también la activación de CD. De esta forma, la adición de citoquinas inflamatorias puede contribuir también a la activación de las CD inmaduras.
Según una realización, las CD inmaduras se cargan con antígenos antes de la activación o simultáneamente con ella, con el fin de proporcionar una vacuna celular alogénica contra el cáncer. En la técnica son bien conocidos los procedimientos para cargar antígenos (véase, por ejemplo, el documento EP 1.509.244 B1) y se pueden llevar a cabo con métodos tales como pulsación, transfección, infección o fusión. Por ejemplo, el antígeno se puede obtener típicamente de un tumor; típicamente, del tipo de tumor contra el que irá dirigida la vacuna. Típicamente, en la obtención de antígenos se utiliza una muestra representativa del tipo de tumor que interesa.
De acuerdo con una realización preferida, la activación de las CD inmaduras se lleva a efecto según el método descrito en el documento WO 2011/098516. Así, se puede inducir la maduración agregando el ligando PoliI:C del receptor tipo Toll 3 (TLR3), un ligando de TLR 7/8 tal como R848 (Resiquimod) y la citoquina interferón gamma (IFNγ). El ligando PoliI:C del receptor tipo Toll 3 (TLR3) es un análogo sintético de ARN de doble cadena que comprende una cadena de poli(I) hibridada con una cadena de poli(C). El tamaño de la cadena puede variar. El tamaño puede ser de 200 pares de bases hasta 8.000 pares de bases, por ejemplo 200 a 1.500 o 1.500 a 8.000 pares de bases. El ligando de TLR7/8 R848 también se denomina Resiquimod en la técnica. Como alternativa a Resiquimod, se pueden utilizar Gardiquimod o Imiquimod como ligandos de TLR7/8. Típicamente, las CD inmaduras permanecen expuestas a los factores de activación durante 8 a 24 horas, por ejemplo, 18 horas.
La activación puede incluir, además, la adición de al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en ligandos de TLR2, ligandos de TLR4 tales como lipopolisacáridos bacterianos y monofosforil lípido A, ligandos de TLR9 tales como secuencias de oligonucleótidos (ODN) CpG, que distinguen el ADN microbiano del ADN de mamíferos, interferón alfa (IFN-α), interleuquina 1β (IL-1β) y factores de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Adicionalmente, la activación preferiblemente no comprende la adición de prostaglandina E2 (PGE2) con el fin de evitar que las CD maduras se conviertan en CD migratorias que abandonarán rápidamente el sitio de inyección (tumor), lo que sería un inconveniente en el contexto de esta invención.
Después de la activación, las CD pro-inflamatorias resultantes se pueden lavar para eliminar esencialmente todos los factores de activación. Por lo tanto, los factores de activación se eliminan típicamente por lavado antes del uso de las CD pro-inflamatorias como vacuna. La retirada de los factores de activación evita la co-administración de factores de activación (dirigidos a la inducción de CD pro-inflamatorias ex vivo). La co-administración de factores de activación dará lugar, con mucha probabilidad, a una activación potente y persistente también de las CD inmaduras reclutadas de forma intratumoral, lo cual conduce a su diferenciación en CD maduras pro-inflamatorias en lugar de la diferenciación deseada en CD maduras migratorias.
Tal como se ha descrito anteriormente (véase el documento WO 2011/098516), las células dendríticas proinflamatorias son útiles en el tratamiento del cáncer dado que pueden activar las CD del propio paciente para desarrollar CD migratorias cargadas con el tumor. De este modo, una realización se refiere a la mezcla de células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas procedentes de al menos dos donantes alogénicos diferentes. Estas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas se pueden obtener por los métodos descritos en este documento. La congelación de las células dendríticas pro-inflamatorias tras la activación permite su almacenamiento. Típicamente, las células dendríticas pro-inflamatorias se congelan en un medio que contiene dimetilsulfóxido (DMSO) y suero o plasma. Antes de usarlas, las células congeladas se descongelan y se retira el DMSO por lavado.
Para el uso en el tratamiento del cáncer, estas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas se pueden formular en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato, agua, y emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. Además, puede comprender adyuvantes, excipientes, estabilizadores, conservantes y/u otros componentes farmacéuticamente aceptables, conocidos en la técnica. Por ejemplo, el vehículo puede ser una solución salina que comprende albúmina de suero humano.
Una realización adicional se refiere a una mezcla de estas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas, o a una composición de este tipo que comprende dichas células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas, para usar en el tratamiento del cáncer. De manera similar, una realización se refiere a una mezcla de este tipo de células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Otra realización adicional hace referencia a un método para tratar el cáncer, en el que se administra una mezcla de células dendríticas pro-inflamatorias alogénicas a un paciente que requiere dicho tratamiento, en una dosis suficiente para activar las CD del propio paciente para el desarrollo de CD migratorias cargadas con el tumor.
Sin entrar en más detalles, se cree que el experto en la técnica, basándose en la descripción anterior y la parte experimental siguiente, puede usar la presente invención en su máxima expresión. Por lo tanto, se considera que las realizaciones específicas preferidas que se describen en este documento solamente ilustran, pero no limitan de
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forma alguna el resto de la descripción. Además, aun cuando la presente invención se ha descrito en el texto precedente haciendo referencia a realizaciones específicas, ésta no se halla limitada a las formas concretas expuestas en este documento. Por el contrario, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas, por lo que, dentro del alcance de estas reivindicaciones adjuntas, resultan igualmente posibles otras realizaciones, por ejemplo diferentes de las mencionadas anteriormente.
En las reivindicaciones, el término “comprende/que comprende” no excluye la presencia de otros elementos o etapas. Adicionalmente, aunque pueden incluirse características individuales en diferentes reivindicaciones, existe la posibilidad de combinarlas de manera ventajosa, y la inclusión en diferentes reivindicaciones no implica que una combinación de características no sea factible y/o conveniente.
Además, las referencias en singular no excluyen una pluralidad. Las expresiones “un”, “una”, “primero”, “segundo·”, etc. no descartan la pluralidad.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 ilustra la expresión de los marcadores de activación/maduración CD86 y CD83 en CD inmaduras y CD PI derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de sangre periférica.
Fig. 2 ilustra la producción de quimiocinas pro-inflamatorias por parte de CD inmaduras (derivadas de cultivos únicos
o mixtos de monocitos de sangre periférica) durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 3 ilustra la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de CD inmaduras (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de sangre periférica) durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 4 ilustra la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de CD inmaduras (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de sangre periférica) durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación +/-la adición del inhibidor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), NS-398.
Fig. 5 ilustra la producción de quimiocinas pro-inflamatorias por parte de CD inmaduras (derivadas de cultivos únicos
o mixtos de monocitos de capas leuco-plaquetarias) durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 6 ilustra la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de CD inmaduras (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de capas leuco-plaquetarias) durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 7 ilustra la producción de quimiocinas pro-inflamatorias por parte de CD PI (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de sangre periférica). Estas CD PI han sido lavadas tras la estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Fig. 8 ilustra la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de CD PI (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de sangre periférica). Estas CD PI han sido lavadas tras la estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Fig. 9 ilustra la producción de quimiocinas pro-inflamatorias por parte de CD PI (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de capas leuco-plaquetarias). Estas CD PI han sido lavadas tras la estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Fig. 10 ilustra la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de CD PI (derivadas de cultivos únicos o mixtos de monocitos de capas leuco-plaquetarias). Estas CD PI han sido lavadas tras la estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Fig. 11 demuestra que las CD inmaduras mixtas, derivadas de monocitos de los filtros, producen cantidades sustanciales de quimiocinas pro-inflamatorias durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 12 demuestra que las CD inmaduras mixtas, derivadas de monocitos de los filtros, producen cantidades sustanciales de citoquinas pro-inflamatorias durante 18 horas de estimulación persistente con factores de activación (“producción activa”).
Fig. 13 demuestra que las CD PI mixtas, derivadas de monocitos de filtros, exhiben una producción sustancial de quimiocinas pro-inflamatorias tras la retirada de los factores de activación. Estas CD PI han sido lavadas tras la
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estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Fig. 14 demuestra que las CD PI mixtas, derivadas de monocitos de filtros, exhiben una producción sustancial de citoquinas pro-inflamatorias tras la retirada de los factores de activación. Estas CD PI han sido lavadas tras la estimulación con factores de activación durante 18 horas y, subsiguientemente, se han cultivado nuevamente durante 24 horas, sin agregar factores de activación (“producción pasiva”).
Sección experimental
Los siguientes son solamente ejemplos y no se debe interpretar que limitan el alcance de la invención. Por el contrario, la invención está limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Leucocitos de diverso origen
Aislamiento de leucocitos a partir de filtros de depleción leucocitaria (filtros TACSI)
En el Laboratorio de Componentes del Departamento de Medicina de Transfusión del Hospital Universitario de Sahlgrenska, Goteburgo, se recolectaron los filtros de leucocitos (filtros TACSI de depleción leucocitaria, usados para la eliminación rutinaria de leucocitos de 4 capas leuco-plaquetarias durante la producción de plaquetas) que se llevaron, conservados en hielo, al laboratorio (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario de Sahlgrenska).
En el laboratorio, una jeringuilla (Terumo) se cargó con 50 mL de tampón PBS/EDTA (CliniMACS) y se acopló al filtro TACSI mediante un conector luer-lock. El filtro se sometió tres veces a un retrolavado en un matraz de vidrio estéril (en total, 150 mL de tampón PBS/EDTA). Por último, la suspensión celular eluida se diluyó con PBS (PAA, Fisher Scientific) en una concentración de 1:2 en un tubo tipo Falcon (marca Fisher, Fisher Scientific).
Capas leuco-plaquetarias
En el Departamento de Medicina de Transfusión se recolectaron capas leuco-plaquetarias de donantes de sangre sanos y se llevaron al laboratorio a temperatura ambiente.
Sangre periférica
En el Departamento de Medicina de Transfusión se recolectó sangre periférica de donantes de sangre sanos y se llevó al laboratorio a temperatura ambiente. En el laboratorio, la sangre se mezcló con PBS a temperatura ambiente, a una concentración de 1:2 en un tubo tipo Falcon.
Aislamiento de células mononucleadas de sangre periférica (PBMC)
En el Departamento de Medicina de Transfusión se recolectó sangre periférica de donantes de sangre sanos y se llevó al laboratorio a temperatura ambiente. En el laboratorio, la sangre se mezcló con PBS a temperatura ambiente, a una concentración de 1:2 en un tubo tipo Falcon. La suspensión celular se transfirió con cuidado a tubos de centrifugación de 10 mL (Nunc) que contenían 3 mL de Lymphoprep (Axis-Shield). Se transfirieron 5 a 6 mL a cada tubo y se centrifugó a 2.000 rpm durante 20 min a temperatura ambiente, en ausencia de freno. Las PBMC aisladas se transfirieron a tubos de 10 mL pre-enfriados. Las células se lavaron dos veces llenando los tubos con PBS frío, seguido de centrifugación a 1.450 rpm durante 10 min a 4ºC. Se descartaron los sobrenadantes y los granulados se resuspendieron en 1 mL de PBS frío. Se agregaron otros 9 mL adicionales a cada tubo.
Aislamiento de monocitos
Fracciones de 5 mL de los leucocitos de filtro/leucocitos de capa leuco-plaquetaria eluidos, o de PBMC aisladas de 10 a 20 mL de sangre periférica entera, se centrifugaron en tubos a 1.450 rpm durante 10 min a 4ºC. Se retiraron los sobrenadantes en su totalidad y los granulados celulares se resuspendieron en 80 μL de PBS/EDTA (Miltenyi) por 107 células. Se agregaron 20 μL de microperlas CD14 (Miltenyi) por 107 células. Las células se mezclaron e incubaron durante 15 min a 4ºC y, a continuación, se lavaron agregando 1 a 2 mL de PBS/EDTA, seguido de centrifugación a 300xg durante 10 min. Se eliminaron por completo los sobrenadantes y las células remanentes se resuspendieron en 500 μL de PBS/EDTA.
En un multisoporte magnético (Miltenyi) se depositaron separadores MidiMACS (Miltenyi) y se lavaron con 3 mL de PBS/EDTA. Las suspensiones celulares se situaron sobre los separadores MidiMACS, permitiendo el paso de las células. Los separadores MidiMACS se lavaron tres veces con 3 mL de PBS/EDTA. Se descartaron las fracciones efluentes que contuvieron células no marcadas. Se retiraron los separadores MidiMACS del multisoporte magnético y se depositaron en un tubo tipo Falcon. Se pipetearon 5 mL de tampón PBS/EDTA en la columna e, inmediatamente después, se hicieron pasar las células empujando con un émbolo.
La concentración celular se determinó en una cámara Bürker. Las suspensiones celulares que contuvieron monocitos se centrifugaron a 1.450 rpm durante 10 min a 4ºC. Se descartaron los sobrenadantes y las células se
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