CN105452449A - 来自异源供体的单核细胞的共分化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于产生源自两种不同异源供体的非耗竭未成熟树突细胞(DC)的方法。在该方法中，提供异源白细胞的混合物，其中所述异源白细胞已从至少两种不同的异源供体中获得。随后，将异源单核细胞从异源白细胞的混合物中分离出来。最后，从所述分离的异源白细胞中生成非耗竭未成熟DC。

Description

来自异源供体的单核细胞的共分化
技术领域
本发明涉及一种用于产生非耗竭未成熟单核细胞衍生的人类树突细胞(dendriticcell,DC)的方法。
背景技术
传统的癌症疗法，例如手术、放疗和化疗，往往不足以治疗患者，且常常导致严重的副作用。免疫疗法已显示出有望成为一种替代疗法，且具有较少的副作用。
现在公认，免疫系统具有细胞，特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)，它可识别并潜在地杀死肿瘤细胞。然而，一个主要的问题是，这些T细胞的杀伤能力要么不被诱发，要么只是在癌症患者体内被微弱地诱发。一种可能性是，肿瘤抗原呈递和由树突细胞(DC)引起的共刺激不足，而二者是用于引发癌症患者体内的功能性和肿瘤特异性T细胞免疫的“自然佐剂”。
现有的癌症免疫治疗策略主要集中在负载抗原的自体患者衍生的DC，其已被分化和在体外负载抗原。这种方法的基本前提是，通过DC的体外操作而提供的效率和控制，产生具有很强抗原呈递和协同刺激能力的DC。T细胞反应的质量取决于这些自体DC在引流淋巴结方面以MHC限制的方式而向T细胞呈递肿瘤抗原的能力(DC和T细胞必须来自同一个体)，从而产生肿瘤特异性T细胞反应。
单核细胞衍生的自体DC是在试验性研究中最普遍使用的DC，因为它有可能从通过白细胞分离法而收集到的外周血白细胞中获得数十亿个单核细胞，这是一个费力而又耗时的过程，其中白细胞从循环血液中分离。随后可使用一些方法来富集单核细胞，且这些方法中的两个，即淘析和抗体/小珠分离，也可在符合药品生产质量管理规范(GoodManufacturingPractice,GMP)指导方针的前提下实施。
单核细胞随后被培养在添加有GM-CSF和IL-4的培养基中达4-7天，使其被分化成未成熟DC，这些未成熟DC的特征在于，它们在随后的某些类型活化因子的刺激下，具有产生大量促炎性趋化因子和细胞因子的突出能力(Sallusto等，EurJImmunol，1999.29:1617；Napolitani等，NatuerImmunology2005.6:769)。在接种疫苗之前，被刺激的DC通常与相关的肿瘤抗原一起被预脉冲，且活化达1-2天。然而，对这类以DC为基础的疫苗所发生的免疫反应往往较弱，且临床反应很少是彻底而持久的。
人们对体外产生的自体DC在其已被注射之后的命运和功能知之甚少。在人类的设置中，最近对注射疫苗DC的迁移模式进行了体内跟踪，且值得注意的是，所注入的DC不到5％到达引流淋巴结，而大多数DC保留在注射部位。这些困于本地的疫苗DC迅速丧失其活力，且随后被所添加的抗原呈递细胞清除。
现已有数据表明，在有限时段内(即6至18h)已被体外活化的注射疫苗DC成为促炎性(pro-inflammatory,PI)DC，其通过作为纯局部免疫佐剂，能够在体内间接地引物天然CD8+T细胞。所注入的PI-DC的佐剂功能严格地依赖于其在施用时(在除去活化因子后)某些DC和NK细胞添加趋化因子的继续分泌。这样的PI-DC也表达/分泌在接种疫苗部位诱导所添加的内源性NK细胞和DC活化的因子。与PI-DC相反，已在临床试验中被普遍应用的长时间(即>24h)活化DC的特征在于其“耗竭”状态(Langenkamp等，2000)，因此其在被施用时无法分泌所期望的趋化因子和DC活化因子。
总之，PI-DC不但可作为MHC相容自体T细胞的直接刺激剂，且可作为在施用时产生大量促炎性趋化因子和细胞因子的佐剂。局部注射PI-DC将导致添加和活化其他免疫细胞，包括循环NK细胞和DC前体。如果所注射的PI-DC已预装有相关的肿瘤抗原或被直接注射到现有的肿瘤病变内，添加内源性DC将分别吞噬那些表达相关肿瘤抗原的垂死疫苗细胞或垂死抗原表达肿瘤细胞。在活化之后，这些添加的和随后负载有抗原的内源性DC将迁移到引流淋巴结中，在此它们以MHC限制方式来引物肿瘤特异性T细胞(Liu等，2008)。该结论得到最近的一些临床前研究数据的支持，其中接种有非耗竭MHC不相容异源PI-DC的治疗性疫苗显著削弱了肿瘤生长(Alder等，2008；Siders等，2009；Edlich等，2010)。
重要的是，PI-DC无需在PI-DC与患者T细胞之间的MHC相容性，因此PI-DC所具有的强大佐剂功能使得有可能将预先产生和冷冻保存的MHC不相容的异源PI-DC用作“现成的”疫苗，其代表一种对于目前订制的患者特异性DC疫苗的可行而又实用的替代品。对这类MHC不相容的异源PI-DC的使用可参见专利EP1509244B1和WO2011/098516。
出于伦理上的考虑，采用白细胞分离法从正常血液供体身上大规模地采集单核细胞，并将其用于商业性大规模疫苗生产这一唯一目的，对于临床使用是不可行的。因此，在实践中，用于PI-DC生产的可用原料，即单核细胞，被限制为如下单核细胞：在将不需要的白细胞从血库的血块黄层中所得到的不同的全血成分或单核细胞中分离出去的过程中，从废物(血块黄层和/或所使用的去白细胞过滤器)中获得的单核细胞。
然而，可从每个血块黄层或每个血袋-去白细胞过滤器中分离出来的单核细胞的总数通常少于2亿个(EbnerS等，从通过去白细胞过滤器而传代的全血中产生的大量人类树突细胞：标准血块黄层的替代品(Generationoflargenumbersofhumandendriticcellsfromwholebloodpassagedthroughleukocyteremovalfilters:analternativetostandardbuffycoats)，JImmunolMethods252(2001))，导致采用符合本领域的药品生产质量管理规范(GoodManufacturingPractice,GMP)的方法对分批的单核细胞(每批源自一个单一供体)进行富集并随后进行DC分化而带来的难以接受的高成本。
因此，有必要在本领域中提供一种方法，用于从源自血库的包含单核细胞的废物中大规模地经济有效地生产出临床级非耗竭未成熟树突细胞。
发明内容
因此，本发明通过提供一种用于从至少两种不同的异源供体中产生非耗竭未成熟树突细胞(dendriticcells,DCs)的方法，力图单独地或任何组合地缓解、减轻、消除或规避一或多个上文所确定的本领域中的潜在缺陷和缺点。在该方法中，提供异源白细胞的混合物，其中所述异源白细胞已从至少两种不同的异源供体中获得。随后，异源单核细胞从异源白细胞的混合物中被分离出来，以提供富含单核细胞的异源白细胞。之后，通过从不含非人血清的含水细胞培养基中共培养富含单核细胞的异源白细胞达2至7天，从富含单核细胞的异源白细胞中生成非耗竭未成熟DC。在培养基中添加有白介素-4(interleukin-4,IL-4)和粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)。
与流行的偏见相反，所产生的单核细胞衍生的未成熟树突细胞是非耗竭的，因而能够在被活化成促炎性DC之后，以一种持续的方式产生大量的促炎性趋化因子和促炎性细胞因子。因此，该方法代表一种用于生产非耗竭未成熟树突细胞的大规模而又经济有效的临床级方法。
本发明的另一方面涉及一种源自至少两种不同的异源供体的异源性非耗竭未成熟树突细胞(DC)的混合物。这样的混合物可通过所描述的方法获得。
本发明的另一方面涉及一种用于产生促炎性DC的方法。通过活化非耗竭未成熟DC，获得促炎性DC。通过这种方法，可获得一种源自至少两种不同的异源供体的异源性促炎性树突细胞的混合物。该混合物可被配制成药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。所述混合物和药物组合物可被分别用于癌症治疗中。
本发明的另一些有利特征在从属权利要求中被限定。此外，本发明的有利特征在本文所公开的实施方式中被详细说明。
具体实施方式
本发明人设想，以下包含单核细胞的白细胞群可潜在地用于对非耗竭未成熟树突细胞的大规模而又经济有效的生产：所述包含单核细胞的白细胞群存在于血块黄层中，或被困在用于去除全血中白细胞(用于富集红细胞)的去白细胞过滤器中，或被困在用于去除所汇集的血块黄层中白细胞(用于富集血小板)的去白细胞过滤器中。
如前所示，通过使用适当的介质进行反冲洗并随后富集单核细胞，可回收由不同类型的去白细胞过滤器保留的白细胞(EbnerS等，从通过去白细胞过滤器而传代的全血中产生的大量人类树突细胞：标准血块黄层的替代品(Generationoflargenumbersofhumandendriticcellsfromwholebloodpassagedthroughleukocyteremovalfilters:analternativetostandardbuffycoats)，JImmunolMethods252(2001)93-104；以及MeyerTPH等，FilterBuffyCoats(FBC)：从去白细胞过滤器中回收的外周血白细胞源(Asourceofperipheralbloodleukocytesrecoveredfromleukocytedepletionfilters)，JImmunolMethods307(2005)150-166)。
血块黄层是包含大部分白细胞的抗凝结血样，包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞、以及在对全血进行密度梯度离心分离之后的血小板。血块黄层通常被用作生产血小板的原料。在该过程时，在汇集4至8个血块黄层之后，采用去白细胞过滤器来减少白细胞。通常，使用TACSI设备或OrbiSac系统从血块黄层中分离出血小板。
用于从所汇集的血块黄层中制备出血小板的TACSI设备包括一系统盒(固定在转子上)以及可被移除的用于安装TACSI试剂盒的一插入件。每个系统盒设有由单个的微处理器控制和监测的压系统。在第一序列中，在汇集容器内所汇集的血块黄层通过离心分离而被沉降在一垂直位置。在接下来的步骤中，所汇集的血块黄层上清液中的富血小板层(还包含大量的白细胞，包括单核细胞和淋巴细胞)通过在每个盒子中的压系统的活化而被转移到储存容器内。此外，去白细胞过滤器被集成在处理袋与最终储存容器之间的TACSI试剂盒中。然后使去白细胞过滤器以及在血块黄层汇集容器内的其余血块黄层排出，二者都包含大量的单核细胞。
在用于自动血小板富集的另一OrbiSac系统中，血块黄层汇集容器呈环形。在离心分离之后，上清液中的富血小板中央部分被转移到在离心机中心的容器内，该转移是通过集成的去白细胞过滤器实现的。然后使去白细胞过滤器以及在血块黄层汇集容器内的其余血块黄层排出，二者都包含大量的单核细胞。
总地来说，在本领域中用于从血块黄层中富集血小板的方法提供两种可能来源的单核细胞，即血小板被耗竭的其余血块黄层--也被称为贫血小板血块黄层，以及去白细胞过滤器。贫血小板血块黄层和去白细胞过滤器每个包含白细胞的混合物，其中包括高达十亿个单核细胞。然而，由于在血小板耗竭之前血块黄层的汇集，这些单核细胞源自不同的异源供体，因而它们相互异源。
未汇集的包含血小板的血块黄层，或在全血耗竭白细胞之后获得的过滤器，将最大限度地只提供每个血块黄层或过滤器约1至2亿个单核细胞。因此，它们必须被汇集，以提供充足的数量，满足非耗竭未成熟DC的经济有效的GMP生产。
与由血小板生产获得的白细胞类似，从血块黄层汇集的包含血小板的白细胞，或从用于从全血中除去白细胞的过滤器中汇集的白细胞，也将由源自不同异源供体的混合细胞群构成。
至少在理论上，从至少5至10个血块黄层中汇集白细胞，或从至少5至10个全血白细胞过滤器中汇集洗脱的白细胞，将会解决以下难题：为大规模而又经济有效地生产临床级非耗竭未成熟DC提供充足数量的白细胞。
类似地，所汇集的贫血小板血块黄层和/或用于从血块黄层中富集血小板的去白细胞过滤器，可潜在地用于为大规模而又经济有效地生产临床级非耗竭未成熟DC提供充足数量的白细胞。
如前所示，通过使用适当的介质进行反冲洗并随后富集单核细胞，可回收由去白细胞过滤器保留的白细胞(EbnerS等，从通过去白细胞过滤器而传代的全血中产生的大量人类树突细胞：标准血块黄层的替代品(Generationoflargenumbersofhumandendriticcellsfromwholebloodpassagedthroughleukocyteremovalfilters:analternativetostandardbuffycoats)，JImmunolMethods252(2001)93-104；以及MeyerTPH等，FilterBuffyCoats(FBC)：从去白细胞过滤器中回收的外周血白细胞源(Asourceofperipheralbloodleukocytesrecoveredfromleukocytedepletionfilters)，JImmunolMethods307(2005)150-166)。
然而，与随后的源自不同异源供体的富含单核细胞的白细胞的共培养相关的一设想问题是，其与主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)I类和II类抗原不相容被认为是以下现象的原因：通过污染来自另一供体的异源T细胞和/或天然杀伤细胞，导致来自一供体的单核细胞/未成熟DC被过早活化。
共培养在标准细胞培养基中，例如具有胎牛血清的RPMI-1640(RPMI＝RoswellParkMemorialInstitute(RoswellPark纪念研究所)，在该研究所中最初的培养基是由Moore等人开发的)，或共培养在来自两种异源供体的包括单核细胞、淋巴细胞和NK-细胞在内的单核细胞的无血清细胞培养基中，例如X-VIVO15，已知可诱导公知的包括TNF-alpha在内的DC活化因子的产生(Laurin等，Transplantation2004；77:267；Wallgren等，ScandJImmunol2005；62:234)。进而，从这样的共培养物中得到培养物上清液，将其加入到异源单核细胞的具有胎牛血清或标准无血清培养基的标准RPMI-1640培养基中，由此已反复地显示出可诱导单核细胞衍生的未成熟DC的活化/成熟(Laurin等，Transplantation2004；77:267；Wallgren等，ScandJImmunol2005；62:234)。
此外，向添加有GM-CSF和IL-4的标准RPMI-1640培养基中加入TNF-alpha，用于将单核细胞分化成未成熟DC，已显示出可诱导所分化的DC的过早活化和随后耗竭(耐受性)(RieserC等，DifferentialDeactivationofHumanDendriticCellsbyEndotoxinDesensitization:RoleofTumorNecrosisFactor-αandProstaglandinE2(通过内毒素脱敏而实现的人类树突细胞的差异性去活化：肿瘤坏死因子-α和前列腺素E2的作用)，Blood91(1998)3112-3117)。
即使在从所汇集的血块黄层或去白细胞过滤器中对单核细胞进行GMP富集(淘析和抗体/小珠分离)之后，污染T细胞和NK细胞的问题仍然是相关的(Schwanke等，JournalofClinicalApheresis21:153–157(2006)；Meyer等，JournalofImmunologicalMethods307(2005)150-166)，因为难以制得基本上不污染T细胞和NK细胞的单核细胞群。
此外并且重要的是，不仅在标准培养基中使用异源淋巴细胞而进行的共培养，而且在添加有胎牛血清的RPMI-1640培养基中使用异源嗜中性粒细胞而进行的单核细胞的共培养，都造成膜CD40、CD86和人类白细胞抗原(HLA)-DR在DC上的上调，即过早活化，如已被Meggiovanni等人所示出的那样(参见LeukocyteBiology,2006；79；977-988)。已显示出，很难通过使用淘析法(Schwanke等，JournalofClinicalApheresis21:153–157(2006))或抗体/小珠分离法(Meyer等，JournalofImmunologicalMethods307(2005)150-166)，在所汇集的血块黄层或所洗脱的过滤器白细胞内，从单核细胞中除去大量的嗜中性粒细胞。通常，这种富含单核细胞的产物包含大量的(即占所存在的细胞总数的25-40％)嗜中性粒细胞。然而，从安全的角度来看，该嗜中性粒细胞污染不成问题。
此外，即使有可能制备100％纯的单核细胞群，这将由于在来自不同的异源供体的单核细胞之间的活跃互动，不会消除过早活化的风险。在最近的一篇由卓越而又著名的免疫学家FadiG.Lakkis和RobertI.Lechler发表的题为“Originandbiologyoftheallogeneicresponse(异源反应的起源和生物学)”的综述文章中(参见ColdSpringHarborperspectivesinmedicine,Vol.3,No.8,2013)，所得的结论是，先天性的异源识别机制的确存在。作者认为：“异源移植排斥不限于被赋予有适应性免疫系统的椎骨动物，而是对早于适应性免疫进化的许多无脊椎生物是共同的(缺乏T和B淋巴细胞、NK细胞、体基因重排酶和MHC的动物)”。
此外，而且也许是更直接地，异源反应也见于缺乏淋巴细胞的老鼠中。单核细胞的活化取决于在受体单核细胞与包括异源单核细胞在内的所注射的异源供体白细胞之间在非MHC抗原上的差异(ZecherD等，AnInnateResponsetoAllogeneicNonselfMediatedbyMonocytes(由单核细胞介导的对异源性后天的先天反应)，JImmunol83(2009)7810-7816)。Zecher等人表明，将异源白细胞注射到缺乏T和B淋巴细胞的RAG2/2老鼠的耳廓内，可引发明显更大的膨胀，且相比于注射同源白细胞，可明显加大宿主骨髓细胞对皮肤的渗入。对异源白细胞的反应独立于NK细胞而发生，且被单核细胞介导。进而，单核细胞反应是对未与MHC关联的异源决定子进行的。
在一篇更近发表的文章中(ZengQ等，“Innaterecognitionofallogeneicnon-selfinducesmonocytedifferentiationtomaturedendriticcellsinvivo(异源后天的先天识别诱导单核细胞分化而使树突细胞在体内成熟)”，AmJTransplant12:148-148,2012)，作者表明，被移植到缺乏T、B和NK细胞的gc2/2RAG2/2老鼠体内的心脏异源移植迅速被那些分化成成熟IL-12表达树突细胞(DC)的宿主单核细胞所渗透。然而，尚不清楚触发宿主单核细胞成熟的异源细胞决定子、以及识别它们的假定单核细胞受体。
因此，存在明确的证据表明，哺乳动物单核细胞独立于T、B和NK细胞，直接对异源细胞的非MHC决定子作出反应。因此，根据一般的普遍看法，异源反应性被认为是单核细胞的一般性质。
综上所述，这意味着，可明确地设想，对由不同异源供体衍生的富含单核细胞的细胞群的共培养，可导致单核细胞在被分化成单核细胞衍生DC的过程中被预活化并随后耗竭。由此，DC当被再次相关的活化因子刺激时，将无法以持续的方式变成产生PI-DC所需的佐剂因子。
这种所设想的活化诱导的耗竭类似于众所周知的由诸如TNF-α的抗炎剂(Park等，NatImmunol.2012；12:607-615)或微生物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通过过早活化而诱导的单核细胞、巨噬细胞和DC的耗竭(RieserC等，DifferentialDeactivationofHumanDendriticCellsbyEndotoxinDesensitization:RoleofTumorNecrosisFactor-αandProstaglandinE2(通过内毒素脱敏而实现的人类树突细胞的差异性去活化：肿瘤坏死因子-α和前列腺素E2的作用)，Blood91(1998)3112-3117；LangenkampA等，Kineticsofdendriticcellactivation:impactonprimingTH1,TH2andnonpolarizedTcells(树突细胞活化动力学：对引物TH1、TH2和非极化T细胞的影响)，NatureImmunol，1(2000)311-316)。
然而，本发明人已惊奇地发现，非耗竭未成熟DC实际上可从由来自不同异源供体的富含异源单核细胞的白细胞的混合物构成的初始细胞群繁殖得到，其方式类似于那种用于从所富集的由单一供体衍生的单核细胞来繁殖非耗竭未成熟DC的方式(参见WO2011/098516)，即使用不含非人类血清但添加有白介素-4(nterleukin-4,IL-4)和粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)的含水细胞培养基。
与流行的偏见相反，人们惊奇地发现，所富集的单核细胞的混合物在特定条件下从不同的异源供体繁殖成未成熟DC，并未造成DC的过早活化和随后耗竭。这些条件包括在不含非人类血清但添加有GM-CSF和IL–4的含水细胞培养基中共培养。
然而，如在本领域中所预期和认为的那样，在不含非人类血清且未添加白介素-4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞菌落刺激的含水细胞培养基中共培养，以及在包含诸如小牛血清的非人类血清且添加有白介素-4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞菌落的含水细胞培养基中共培养，的确造成DC的过早活化和随后耗竭。
因此，单核细胞可与来自不同异源供体的所汇集的白细胞群分离，使其有可能对单核细胞进行大规模而又经济有效的GMP富集，例如通过淘析(Elutra)或抗体/小珠分离(CliniMacs)。随后，可在无过早活化的情况下，从所分离的富含单核细胞的异源白细胞中生产出非耗竭未成熟DC。
这种非耗竭未成熟DC可用于繁殖促炎性DC，这些促炎性DC旨在在瘤内注射时用作一种抗肿瘤疫苗(参见WO2011/098516)。进而，来自不同异源供体的非耗竭未成熟DC可在被活化前负载上肿瘤抗原，以产生“完整的”细胞异源抗癌疫苗(参见EP1509244B1)，该疫苗可被注射到不同部位，包括瘤内、皮下、表皮、肌肉内和/或静脉内部位。
因此，一实施方式涉及一种用于从富含单核细胞的异源白细胞的混合物中生产出非耗竭未成熟DC的方法。在这种方法中，提供了一种从至少两种不同异源供体获得的异源白细胞混合物。根据一实施方式，两种不同的异源供体意指两个捐赠白细胞的个体种类相同，但具有不同的遗传体质，即具有不同的抗原性。如前所述，异源白细胞可由所汇集的血块黄层或通过洗脱白细胞而由所使用的去白细胞过滤器获得。然后，异源单核细胞从所提供的异源白细胞的混合物中分离。随后，由所分离的富含单核细胞的异源白细胞产生非耗竭未成熟DC。
除了能够对单核细胞进行大规模而又经济有效的GMP富集以外，源自由至少两种不同异源供体衍生的异源单核细胞混合物的非耗竭未成熟DC的另一优点是可减少正常的生物变化，所述生物变化涉及在活化时已知存在于来自不同供体的PI-DC之间的不同促炎性因子的产生。
在一优选实施方式中，异源白细胞是由至少两种包含白细胞的血块黄层的汇集提供的。待汇集的血块黄层是从至少两种不同的异源供体获得的。所汇集的血块黄层可包含血小板，或其血小板可被耗竭。
也可通过从至少两个去白细胞过滤器中洗脱白细胞来提供异源白细胞，这些过滤器先前已分别用于从至少两种不同的异源供体中耗竭全血中的白细胞。在洗脱之后，所获得的白细胞被汇集，获得异源白细胞的混合物。明显地，但并不太优选地，也可在耗竭白细胞之前汇集全血。Ebner等人已描述了一种用于从耗竭过滤器中洗脱白细胞的程序，该过滤器先前已用于从全血中除去白细胞(参见JournalofImmunologicalMethods252(2001)93-104)。
类似地，也可通过从一去白细胞过滤器中洗脱白细胞来提供异源白细胞，该过滤器已用于从所汇集的血块黄层中耗竭白细胞，其中所汇集的血块黄层源自至少两种不同的异源供体。Meyer等人已描述了一种用于从耗竭过滤器中洗脱白细胞的程序，该过滤器先前已用于从血块黄层中除去白细胞(参见JournalofImmunologicalMethods307(2005)150-166)。
虽然这样的由去白细胞过滤器获得的异源白细胞也可用于产生非耗竭未成熟DC，似乎优选使用由汇集至少两种血块黄层而得到的异源白细胞，该血块黄层是由至少两种不同的异源供体获得的。与直接从所汇集的外周血样或从所汇集的血块黄层中衍生的异源单核细胞相比，从去白细胞过滤器中洗脱而得到的异源白细胞在成熟之后可产生稍微更少的除了MIG以外的趋化因子以及细胞因子。
从不同白细胞的混合物中分离出单核细胞是公知的现有技术。根据一实施方式，通过确立GMP生产方法，使单核细胞从所提供的异源白细胞的混合物中分离出来。因此，可通过淘析或抗体/小珠分离，使单核细胞从所提供的异源白细胞的混合物中分离出来。
淘析是一种将细胞连续逆流淘析分离成多个级别的技术。简言之，按密度而使细胞分离的恒定离心力通过按大小而使细胞分散的沉降，抵抗不断增加的培养基流。因此，最小/最轻者最先，而最大/最重者最后，培养基流将细胞冲离到一些产物内。
单核细胞的抗体/小珠分离是通过(免疫)-磁性活化细胞分选(magneticactivatedcellsorting,MACS)而进行的。MACS是一种广泛使用的用于将细胞从全血、血块黄层或WBC单采物中选择性地分离出来的技术。简言之，在其Fc末端承载有铁磁性小珠的CD特异性抗体被连接到需要(正选择)或不需要(负选择)的细胞上。这样处理过的细胞当暴露于一强磁场时，可被保留在多孔的涂覆有金属的柱内。
在分离之后，单核细胞被分化成未成熟DC，即生成未成熟DC。未成熟DC是通过以下方式生成的：将异源单核细胞共培养在不含非人类血清且添加有粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)并结合有白介素-4(IL-4)的含水细胞培养基中达2至7天，例如约5天，由此将单核细胞分化成未成熟DC。
人们发现，尽管添加有GM-CSF和IL-4，包含胎牛血清的细胞培养基也会诱导过早活化，所以重要的是所使用的培养基不含非人类血清。
未成熟DC也可通过以下方式生成：将异源单核细胞培养在包含GM-CSF并结合有白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)或干扰素alpha的含水培养基中达2至7天，例如5天，由此将单核细胞分化成未成熟DC。然而，当与不含非人类血清的一种培养基结合使用时，GM-CSF与IL-4的结合优选用于当其已显示出可阻止异源反应和过早活化时。
本领域的技术人员熟悉细胞培养基及其成分。通常，所使用的细胞培养基包含下列成分：
至少一种盐，例如NaCl、KCl、MgSO4和/或Ca(NO3)2；
至少一种糖，例如葡萄糖；
一或多种氨基酸，例如L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-羟基脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸和/或L-赖氨酸；
一或多种维他命以及其他重要的营养物，例如谷胱甘肽、生物素、维生素B12、D-Ca泛酸盐、胆碱氯化物、叶酸、肌醇、nictoninamid、对氨基苯甲酸、吡哆醇、核黄素和/或硫胺素；以及
至少一种缓冲液，例如磷酸盐(如Na2HPO4)和/或碳酸盐(如NaHCO3)。
根据一实施方式，该培养基至少包含以下成分：至少一种盐，例如NaCl；至少一种糖，例如葡萄糖；一或多种氨基酸；一或多种维他命；以及缓冲液，例如磷酸盐(如Na2HPO4)和/或碳酸盐(如NaHCO3)。
进而，虽然细胞培养基不含非人类血清，但它通常至少包含人类多肽。根据一实施方式，细胞培养基包含至少一种选自以下物质的人类多肽；转铁蛋白、白蛋白和胰岛素；优选细胞培养基包含以上所有三种。人类多肽可从人类血浆中获得。进而，它们可被重组制得。例如，可在酵母细胞中重组产生胰岛素。
例如，不含非人类血清的细胞培养基可以是它是由CellGenixGmbH提供的一种GMP无血清树突细胞培养基(DC)。在美国，该培养基以商标CellGenixTM在市场上被出售。
如本领域技术人员所确认和本文所说明的那样，术语“分离”未必是指100％的纯度，而是指通过一种优选单核细胞的分离过程而获得单核细胞。通过这样的过程而获得的单核细胞可被称为富含单核细胞的异源白细胞，因为会存在除了单核细胞之外的其他白细胞。
根据一实施方式，异源单核细胞是从异源白细胞的混合物中被富集的。除了单核细胞之外，富含单核细胞的异源白细胞通常还包含异源嗜中性粒细胞。进而，它们可包含其他粒细胞。
与流行的偏见相反，当在不含非人类血清且添加有GM-CSF/IL-4的含水细胞培养基中共培养异源单核细胞时，未发现过早活化的迹象，尽管事实是从异源白细胞混合物中得到未成熟DC。因此，这种未成熟DC是非耗竭的，由此其在撤回活化因子之后，能够以一种持续的方式，产生例如超过2000、5000或7500pg/ml的大量促炎性趋化因子，包括MIP-1alpha、MIP-1beta、RANTES和MIG，以及例如超过500、1500或3000pg/ml的大量促炎性细胞因子，包括IL-12p70和TNF-alpha。
根据一实施方式，“未成熟”意指那些只表达低水平的DC成熟标志物CD83和CD86的DC、以及那些在活化后能够产生大量促炎性趋化因子和细胞因子的DC。根据实施方式，低水平被解释为，在活化后显示出CD83表达增加至少3倍，例如至少5倍，以及在活化后显示出CD86表达增加至少5倍，例如至少8倍。
如所设想的那样，可看出过早活化，在一些实验中加入环氧合酶-2抑制剂NS-398，它已知是一种阻碍前列腺素E2(PGE2)介导的活化DC耗竭的因子。然而，NS-398在单核细胞繁殖成DC的过程中的存在并未增加而是减少了MIG和IL-12p70的活化诱导产量。因此，没有迹象显示，PGE2介导的分化未成熟DC从混合异源单核细胞的共培养物中耗竭。
如本领域技术人员所确认的那样(例如参见EP1509244B1和WO2011/098516)，非耗竭未成熟树突细胞(DC)对于生产治疗癌症所需的药物组合物是有用的。因此，一实施方式涉及一种源自至少两种不同异源供体的异源性非耗竭未成熟树突细胞(DC)的混合物。这种树突细胞(DC)可通过在本文中公开的一种方法而获得。在被分化成未成熟DC之后，未成熟DC可被活化成促炎性DC。可通过几种方式来诱导活化。已显示，许多信号可诱导DC活化的至少一些方面。其中最有力的是微生物和病毒产物(病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP))，其直接被包括Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)家族成员在内的模式识别受体(pattern-recognitionreceptor,PRR)识别。PRR控制许多先天反应基因的表达，且可直接发信号，以活化DC。此外，PRR在免疫和非免疫细胞中发信号往往导致诸如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素1(IL-1)之类的炎性细胞因子的合成，这也可促进DC活化。因此，加入炎性细胞因子也可有助于活化未成熟DC。
根据一实施方式，在活化之前，或在活化的同时，未成熟DC负载有抗原，以提供一种细胞异源抗癌疫苗。负载抗原是公知的现有技术(例如参见EP1509244B1)，且可使用各种方法进行，例如脉冲、转染、传染或融合。例如，抗原通常可从肿瘤中获得；该肿瘤通常属于那种疫苗被导向的肿瘤类型。在获得抗原的过程中，通常使用感兴趣的癌症类型的代表性样本。
根据一优选实施方式，采用在WO2011/098516中公开的方法进行未成熟DC的活化。由此，可通过加入以下物质来诱导成熟：Toll样受体3(TLR3)-配体聚-I:C；TLR7/8-配体，例如R848(Resiquimod)；以及细胞因子干扰素gamma(IFN-γ)。所述Toll样受体3(TLR3)-配体聚-I:C是一种dsRNA类似物，包含被退火成聚(C)的聚(I)链。链的大小可发生变化。其大小可以是200至8000个碱基对，例如200至1500或1500至8000个碱基对。TLR7/8-配体R848在本领域中也被表示为Resiquimod。作为Resiquimod的替代品，Gardiquimod或Imiquimod可被用作TLR7/8-配体。通常，未成熟DC暴露于活化因子达8至24小时，例如18小时。
活化还可包括加入至少一种选自以下物质的物质：TLR2-配体和TLR4-配体，例如细菌脂多糖和单磷酸脂质A；TLR9-配体，例如用于区分微生物DNA与哺乳动物DNA的CpG寡核苷酸(oligonucleotide,ODN)序列；干扰素alpha(IFN-α)；白介素1β(IL-1β)；以及肿瘤坏死因子alpha(TNF-α)。进而，活化优选不包括加入前列腺素E2(PGE2)，以避免成熟DC变成迁移DC而迅速离开注射部位(肿瘤)，这从本发明来看将是不利的。
在活化之后，所产生的促炎性DC可被清洗，以基本上除去所有的活化因子。因此，通常在将促炎性DC用作疫苗之前洗去活化因子。除去活化因子可避免活化因子的共施用(旨在体外诱导促炎性DC)。活化因子的共施用极有可能引发也是肿瘤内添加的未成熟DC的强烈而又持久的活化，导致其分化成促炎性成熟DC，而非所需的分化成迁移性成熟DC。
如前所述(参见WO2011/098516)，促炎性树突细胞在癌症治疗中是有用的，因为它们可将患者自身的DC活化发育成负载有肿瘤的迁移DC。由此，一实施方式涉及源自至少两种不同异源供体的异源促炎性树突细胞混合物的活化。这种异源促炎性树突细胞可通过在本文中公开的一种方法而获得。通过在活化后将促炎性树突细胞冷冻而将其保存。通常，促炎性树突细胞被冷冻在一种包含二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)和血清或血浆的介质中。在使用之前，冷冻细胞被解冻，且DMSO被洗去。
为用于治疗癌症，这样的异源促炎性树突细胞可被配制成一种药物组合物。该药物组合物可包含以下成分：至少一种药学上可接受的载体，例如被磷酸盐缓冲的盐溶液；水；乳状液，例如油/水或水/油乳状液；以及各种不同的润湿剂。进而，它可包含药学上可接受的佐剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂和/或其他在本领域中已知的成分。例如，载体可以是一种包含人类血清白蛋白的盐溶液。
另一实施方式涉及这样一种异源促炎性树突细胞的混合物，或这样一种包含这类异源促炎性树突细胞的组合物，以用于治疗癌症。类似地，一实施方式涉及在制造癌症治疗药物中使用这样一种异源促炎性树突细胞的混合物。另一实施方式涉及一种用于治疗癌症的方法，其中一种异源促炎性树突细胞的混合物被施用给一位需要这种治疗的患者，其剂量足以活化患者自身的DC，以发育成负载有肿瘤的迁移DC。
虽然未作进一步的阐述，据信本领域的技术人员可通过使用之前的说明和之后的实验部分，将本发明利用到最大程度。因此，在本文中描述的优选具体实施方式应被理解为仅仅是说明性的，而非以任何方式限制本说明的其余部分。进而，虽然已在上文中结合具体的实施方式对本发明进行了说明，但并不意指本发明受限于本文中所给出的特定形式。相反，本发明只受所附权利要求的限制，而其他不同于上述特定形式的实施方式，例如不同于上述实施方式的实施方式，同样有可能在这些所附权利要求的范围内。
在本权利要求书中，术语“包括/包含”不排除其他成分或步骤的存在。此外，虽然各个特征可包括在不同的权利要求中，但这些特征可有利地组合起来，且包括在不同的权利要求中并不意味着特征组合是不可行的和/或不利的。
此外，单数表述并不排除复数。术语“一”、“一个”、“第一”、“第二”等并不排除多个。
附图说明
图1示出在由单一的或混合的外周血液单核细胞培养物衍生的未成熟DC和PI-DC上活化/成熟标志物CD86和CD83的表达。
图2示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)的18小时内，由未成熟DC(衍生自单一的或混合的外周血液单核细胞培养物)导致的促炎性趋化因子的产量。
图3示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)的18小时内，由未成熟DC(衍生自单一的或混合的外周血液单核细胞培养物)导致的促炎性细胞因子的产量。
图4示出在使用活化因子和/或加入环氧合酶-2(Cox-2)抑制剂NS-398而进行持续刺激的18小时内，由未成熟DC(衍生自单一的或混合的外周血液单核细胞培养物)导致的促炎性细胞因子的产量。
图5示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)的18小时内，由未成熟DC(衍生自单一的或混合的血块黄层单核细胞培养物)导致的促炎性趋化因子的产量。
图6示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)的18小时内，由未成熟DC(衍生自单一的或混合的血块黄层单核细胞培养物)导致的促炎性细胞因子的产量。
图7示出由PI-DC(衍生自单一的或混合的外周血液单核细胞培养物)导致的促炎性趋化因子的产量。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
图8示出由PI-DC(衍生自单一的或混合的外周血液单核细胞培养物)导致的促炎性细胞因子的产量。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
图9示出由PI-DC(衍生自单一的或混合的血块黄层单核细胞培养物)导致的促炎性趋化因子的产量。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
图10示出由PI-DC(衍生自单一的或混合的血块黄层单核细胞培养物)导致的促炎性细胞因子的产量。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
图11示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)达18小时的过程中，衍生自过滤器单核细胞的混合的未成熟DC产生大量的促炎性趋化因子。
图12示出在使用活化因子进行持续刺激(“主动产生”)达18小时的过程中，衍生自过滤器单核细胞的混合的未成熟DC产生大量的促炎性细胞因子。
图13示出在撤回活化因子之后，衍生自过滤器单核细胞的混合的PI-DC表现出促炎性趋化因子的大量产生。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
图14示出在撤回活化因子之后，衍生自过滤器单核细胞的混合的PI-DC表现出促炎性细胞因子的大量产生。这些PI-DC在使用活化因子进行刺激达18小时之后被清洗，且随后在未加入活化因子的条件下被再培养(“被动产生”)达24小时。
实验
下列实施例仅仅是示例，不应被理解为限制本发明的范围。相反，本发明只受所附权利要求的限制。
各种来源的白细胞
从去白细胞过滤器(TACSI过滤器)中分离出的白细胞
白细胞过滤器(TACSI去白细胞过滤器，用于在血小板生产过程中常规除去4个所汇集的血块黄层中的白细胞)被收集在哥德堡梭格恩斯卡大学医院输血医学系成分实验室，且被放在冰上运送到实验室(梭格恩斯卡大学医院临床免疫学系)。
在该实验室中，一注射器(Terumo)中装满有50ml的PBS/EDTA缓冲液(CliniMACS)，且通过一路厄锁定接头连接到TACSI过滤器上。该过滤器被反冲洗到无菌的玻璃烧瓶内达三次(总共150mlPBS/EDTA缓冲液)。洗出的细胞悬浮液最终在Falcon试管(Fisherbrand,FisherScientific)中通过使用PBS(PAA,FisherScientific)以1:2的浓度而被稀释。
血块黄层
来自健康血液供体的血块黄层被收集在输血医学系，且在室温下被运送到实验室。
外周血
来自健康供体的外周血被收集在输血医学系，且在室温下被运送到实验室。在该实验室中，该血液在Falcon试管中以1:2的浓度与室温PBS混合。
外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)的分离
来自健康供体的外周血被收集在输血医学系，且在室温下被运送到实验室。在该实验室中，该血液在Falcon试管中以1:2的浓度与室温PBS混合。细胞悬浮液被轻轻转移到装有3ml淋巴制剂(Axis-Shield)的10ml离心管(Nunc)中。每个管子中装有5-6ml被转移液，并随后在室温下以2000rpm的转速在未制动的情况下离心分离达20分钟。所分离的PBMC被转移到预先冷却的10ml管子内。通过使管子中装满冷的PBS，将细胞清洗两次，并随后在4°以1450rpm的转速将其离心分离达10分钟。丢弃上清液，且再次将颗粒悬浮在1ml的冷PBS中。向每个管子中加入另外9ml。
单核细胞分离
洗脱的过滤器白细胞/血块黄层白细胞中的5ml级分，或从10-20ml全外周血中分离出来的PBMC，在管子中在4°以1450rpm的转速被离心分离达10分钟。完全除去上清液，且再次将细胞颗粒悬浮在每107个细胞80μl的PBS/EDTA(Miltenyi)中。每107个细胞被加入在20μlCD14微珠(Miltenyi)中。在4°下混合和孵育细胞达15分钟，随后通过加入1-2mlPBS/EDTA而对其清洗，接着在300xg将其离心分离达10分钟。完全除去上清液，且再次将剩余的细胞悬浮在500μlPBS/EDTA中。
将MidiMACS分离器(Miltenyi)放在一磁性多机座(Miltenyi)中，且使用3mlPBS/EDTA对其进行清洗。将细胞悬浮液放置在MidiMACS分离器上，使细胞通过。使用3mlPBS/EDTA将MidiMACS分离器清洗三次。丢弃具有未标记细胞的流出级分。从磁性多机座上除去MidiMACS分离器，并将其放置在Falcon试管上。使用移液管将5mlPBS/EDTA缓冲液转移到柱上，且随即使用柱塞推动细胞通过。
在Bürker室中确定细胞浓度。在4°以1450rpm的转速将包含单核细胞的细胞悬浮液离心分离达10分钟。丢弃上清液，且将细胞再次悬浮在CellGroDC培养基(CellGenix)中。CD14+单核细胞在所有单核细胞分离的细胞培养物中的纯度大于80％，如FACS分析所确定的那样，详见下文。
未成熟DC的生成
源自TACSI过滤器的白细胞以300,000细胞/mL的浓度被再次悬浮在CellGroDC培养基中，作为一种不含非人类血清的培养基，且被放在24孔板(每孔1ml)中。从血块黄层和外周血得到的富含单核细胞的白细胞首先以5×105个单核细胞/ml的浓度被再次悬浮在CellGro培养基中。400μlCellGro培养基(无细胞)首先被加入到24孔板中的12孔内(A1-6,B1-3,C1-3)。从供体A(分别为血块黄层或外周血)得到的600μl富含单核细胞的细胞悬浮液被转移到孔A1-3中。从供体B(血块黄层或外周血)得到的600μl富含单核细胞的细胞悬浮液被转移到孔B1-3中。从供体C(血块黄层或外周血)得到的600μl富含单核细胞的细胞悬浮液被转移到孔C1-3中。在孔A4-6中，从所有三种供体(血块黄层或外周血)中转移出200μl富含单核细胞的细胞悬浮液。在所有孔中的最终细胞数是300,000个细胞(体积为每孔1mlCellGro培养基)。
为将单核细胞分化成未成熟DC，向培养基中添加1000U/ml重组人类IL-4和1000U/ml重组人类GM-CSF(均由德国弗莱堡的CellGenix提供)，且随后培养细胞达5天。
未成熟DC的活化/成熟
在添加有IL-4和GM-CSF的CellGro培养基中培养达5天之后，通过加入以下物质来诱导未成熟DC的活化/成熟：20μg/ml聚I:C(德国Steinheim的Sigma)，其是一种对TLR-3受体具有特异性的免疫刺激剂，也被称为聚肌胞苷酸或聚肌胞苷酸钠盐；2.5μg/mlR848(德国Steinheim的Sigma)，也被称为resiquimod的Toll样受体7/8-配体；以及1000U/ml干扰素gamma(IFN-γ，美国明尼苏达州R&D系统)。在孵育达18h之后，细胞被清洗三次，且进一步在新鲜的AIM-V培养基中(未加入外源活化因子)被孵育达24h。根据本领域技术人员公知的协议，从培养物中采集培养物上清液。
如下文所述，对上清液进行ELISA分析，以分析促炎性趋化因子和促炎性细胞因子的水平。
促炎性趋化因子和促炎性细胞因子水平的ELISA评估
根据厂家说明书，使用由美国明尼苏达州R&D系统提供的DuoSetELISA开发系统，采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmuneadsorbentassay,ELISA)方法，测量促炎性趋化因子CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES和CXCL9/MIG以及促炎性细胞因子IL-12p70和TNF-α。
采用流式细胞仪的表型检查
如上文所述生成单核细胞和单核细胞衍生的DC。使用FITC-抗人类CD14，通过使细胞染色，估计CD14+单核细胞在单核细胞分离后的频率。在添加有IL-4和GM-CSF的CellGro中孵育达5天之后，清洗未成熟DC，且随后使用PE抗人类CD86并结合FITC抗人类CD83进行染色。也使用PE抗人类CD86并结合FITC抗人类CD83对那些随后已使用活化因子活化达18小时的未成熟DC进行染色。使用FITC和PE染色的小鼠IgG1和IgG2被用作同种型对照物(均由美国加利福尼亚州的BDBiosciences提供)。使用CellQuest软件(由美国加利福尼亚州的BDBiosciences提供)通过流式细胞仪(FACS)对样本进行分析。
结果
下文对从实验部分得到的结果进行了评论。
当在不含非人类血清且添加有GM-CSF和IL-4的含水细胞培养基中进行共培养时，从富含单核细胞的异源白细胞的共培养物中衍生的DC是非表型活化/成熟的。
在不含非人类血清且添加有GM-CSF和IL-4的细胞培养基中繁殖从单一血液供体得到的单核细胞达4-7天，产生具有典型“未成熟”表型的非耗竭DC，包括对成熟标志物CD83的低表达以及对共刺激分子CD86的低表达。如图1a和1b所示，与由所有三种供体的混合物衍生的DC的CD83(图1a)和CD86(图1b)表达相比，对3种不同的“单一”DC进行CD83和CD86的平均表达是相似的。如图1c和1d所示，与对由来自所有三种供体的富含异源单核细胞的白细胞混合物衍生的活化DC进行的CD83(图1c)和CD86(图1d)表达相比，在不含非人类血清且添加有GM-CSF和IL-4的含水细胞培养基中繁殖达4天并随后使用刺激因子进行持续活化达18小时之后，对“单一”DC(来自所分析的3种不同外周血供体的DC)强烈增加活化/成熟标志物CD83和CD86的平均表达是相似的。
综上所述，这些结果表明，从混合的异源单核细胞群得到的单核细胞衍生DC在GM-CSF和IL-4中培养达5天之后是未成熟的，因而在其从单核细胞分化成未成熟DC的过程中未经历任何活化/成熟信号。此外，由混合的异源单核细胞群得到的未成熟DC至少在表型上非耗竭，因为当使用活化因子对其进行刺激时，它们强烈地做出表型成熟的反应。
使用流式细胞仪获得数据。各Y轴显示在使用刺激因子进行持续活化达18小时之前和之后CD83和CD86的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity,MFI)。X轴显示被测量的不同组合。
由混合的异源外周血单核细胞的共培养物衍生的未成熟DC在功能上未被耗竭。
单核细胞(来自一个单一血液供体)在添加有GM-CSF和IL-4的培养基中繁殖达4-7天，由此已知导致非耗竭DC，且在使用某些活化因子进行刺激后，非耗竭DC表现出促炎性趋化因子(MIP-1alpha、MIP-1beta、RANTES和MIG)和促炎性细胞因子(IL-12p70和TNF-alpha)的剧烈产生。
如图2所示，与由来自所有三种供体的单核细胞的混合物衍生的DC相比，由“单一”DC(来自被分析的三种不同外周血供体的DC)在使用刺激因子持续活化达18小时的过程中产生的高平均水平的MIP-1alpha(图2a)、MIP-1beta(图2b)、RANTES(图2c)、MIG(图2d)是相似的。特别地，在不同的单一供体DC之间，在活化诱导的趋化因子产量上有很大变化。如图4所示，与由来自所有三种供体的单核细胞混合物衍生的DC相比，通过活化“单一”DC而产生的高平均水平的IL-12p70(图3a)和TNF-alpha(图3b)是相似的。特别地，在不同的单一供体DC之间，在IL-12p70和TNF-alpha的产量上有很大变化。
由ELISA分析获得数据。所显示的结果是从三个个体得到的平均值±SD以及从所有三种供体的混合物得到的值。各Y轴显示在18小时的持续刺激/活化过程中产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。X轴显示被测量的不同组合。
已提出，前列腺素E2(PGE2)在活化诱导的未成熟DC的耗竭中发挥核心作用(RieserC等，DifferentialDeactivationofHumanDendriticCellsbyEndotoxinDesensitization:RoleofTumorNecrosisFactor-αandProstaglandinE2(通过内毒素脱敏而实现的人类树突细胞的差异性去活化：肿瘤坏死因子-α和前列腺素E2的作用)，Blood91(1998)3112-3117)。因此，我们研究，在异源单核细胞的共培养过程中加入Cox-2抑制剂NS-398(旨在抑制PGE2的潜在产生)是否会在随后的活化中增加促炎性趋化因子(由MIG产量表示)或促炎性细胞因子(由IL-12p70产量表示)的产生。如图4所示，Cox-2抑制剂NS-398在单核细胞繁殖成DC的过程中的存在并未增加而是减少了MIG和IL-12p70的活化诱导产量。因此，没有迹象显示，PGE2介导的分化未成熟DC从混合异源单核细胞的培养物中耗竭。
通过ELISA分析获得数据。所显示的结果来自由所有三种供体的混合物构成的一个实验。各Y轴显示在18小时的持续刺激/活化过程中产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。X轴显示被测量的不同组合。
由混合的富含异源单核细胞的血块黄层白细胞的共培养物衍生的未成熟DC在功能上未被耗竭。
如图5所示，与由来自所有三种供体的单核细胞的混合物衍生的DC相比，由“单一”DC(来自被分析的三种不同血块黄层供体的DC)在使用刺激因子持续活化达18小时的过程中所产生的高平均水平的活化诱导的促炎性趋化因子MIP-1alpha(图5a)、MIP-1beta(图5b)、RANTES(图5c)、MIG(图5d)是相似的。特别地，在不同的单一供体DC之间，在趋化因子产量上有很大变化。
如图6所示，与由来自所有三种供体的富含单核细胞的白细胞混合物衍生的DC相比，通过“单一”DC而产生的高活化诱导平均水平的IL-12p70(图6a)和TNF-alpha(图5b)是相似的。特别地，在不同的单一供体DC之间，在IL-12p70和TNF-alpha的产量上有很大变化。
通过ELISA分析获得数据。所显示的结果是从三个个体得到的平均值±SD以及从所有三种供体的混合物得到的值。各Y轴显示在18小时的持续刺激/活化过程中产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。X轴显示被测量的不同组合。
由混合的异源外周血单核细胞的共培养物衍生的PI-DC呈现出促炎性趋化因子和细胞因子的持续产生
为将活化的促炎性DC(PI-DC)注射到患者体内，通常必须在施用之前对其进行清洗。如果不这样做，有可能发生由同时施用刺激剂(旨在体外诱导PI-DC)而引发的不希望的副作用。因此，在终止活化诱导因子之后，也必须将未成熟DC活化成能够持续产生期望因子的PI-DC。如图7所示，与由来自所有三种外周血供体的单核细胞混合物衍生的PI-DC相比，由“单一”PI-DC在撤回活化因子之后(由来自被分析的三种不同供体的外周血单核细胞得到的PI-DC)产生的平均水平的MIP-1alpha(图7a)、MIP-1beta(图7b)、RANTES(图7c)、MIG(图7d)是相似的。特别地，在撤回活化因子之后，在不同单一供体的PI-DC之间，在趋化因子产量上有很大变化。与由来自所有三种供体的单核细胞混合物衍生的清洗过的PI-DC相比，由“单一”PI-DC在撤回活化因子之后产生的平均产量的IL-12p70(图8a)和TNF-alpha(图8b)是相似的。特别地，在撤回活化因子之后，在不同单一供体的PI-DC之间，在细胞因子产量上有很大变化。
通过ELISA分析获得数据。所显示的结果是从三个个体得到的平均值±SD以及从所有三种供体的混合物得到的值。各Y轴显示在撤回活化因子之后的24小时内所产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。X轴显示被测量的不同组合。
由混合的富含异源单核细胞的外周血块黄层白细胞的共培养物衍生的PI-DC呈现出促炎性趋化因子和细胞因子的持续强烈产生
如图9所示，与由来自所有三种血块黄层供体的单核细胞混合物衍生的PI-DC相比，由“单一”PI-DC在撤回活化因子之后(由来自被分析的三种不同供体的血块黄层单核细胞得到的PI-DC)产生的平均水平的MIP-1alpha(图9a)、MIP-1beta(图9b)、RANTES(图9c)、MIG(图9d)是相似的。特别地，在不同的单一供体PI-DC之间，在趋化因子产量上有很大变化。与由来自所有三种血块黄层供体的单核细胞混合物衍生的清洗过的PI-DC相比，由“单一”PI-DC在撤回活化因子之后产生的平均产量的IL-12p70(图10a)和TNF-alpha(图10b)是相似的。特别地，在不同的单一供体PI-DC之间，在细胞因子产量上有很大变化。
通过ELISA分析获得数据。所显示的结果是从三个个体得到的平均值±SD以及从所有三种供体的混合物得到的数值。各Y轴显示在撤回活化因子之后的24小时内所产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。X轴显示被测量的不同组合。
由富含单核细胞的过滤器白细胞衍生的混合未成熟DC在活化后产生大量的促炎性趋化因子和细胞因子
如图11所示，由富含单核细胞的过滤器白细胞(最初的白细胞群是从一4-血块黄层去白细胞过滤器中清洗出来的)衍生的活化混合DC产生大量的MIP-1alpha(图11a)、MIP-1beta(图11b)、RANTES(图11c)、MIG(图11d)。如图12所示，也产生大量的IL-12p70(图12a)和TNF-alpha(图12b)。
通过ELISA分析获得数据。所显示的结果是从一实验中得到的数值。各Y轴显示在18小时的持续刺激/活化过程中产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。
由富含单核细胞的过滤器白细胞衍生的混合PI-DC在撤回活化因子后呈现出促炎性趋化因子和细胞因子的大量产生
如图13所示，由过滤器白细胞(最初的白细胞群是从一4-血块黄层去白细胞过滤器中清洗出来的)衍生的活化混合DC在撤回活化因子后产生大量的MIP-1alpha(图13a)、MIP-1beta(图13b)、RANTES(图13c)、MIG(图13d)。如图14所示，也产生大量的IL-12p70(图14a)和TNF-alpha(图14b)。通过ELISA分析获得数据。所显示的结果是从一实验中得到的数值。各Y轴显示在撤回活化因子之后的24小时内所产生的各物质的数量，单位为pg/ml/1×106个细胞。

Claims (19)

1.一种用于产生非耗竭未成熟树突细胞(dendriticcell,DC)的方法，包括以下步骤：
-提供异源白细胞混合物，所述异源白细胞已从至少两种不同的异源供体中获得；
-将异源单核细胞从所述异源白细胞的混合物中分离出来，以提供富含单核细胞的异源白细胞；以及
-从所述富含单核细胞的异源白细胞中产生非耗竭未成熟DC，其中通过在不含非人血清的含水细胞培养基中共培养所述富含单核细胞的异源白细胞达2至7天，产生非耗竭未成熟树突细胞(DC)，且在所述培养基中添加有白介素-4(interleukin-4,IL-4)和粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基至少包括人类多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述人类多肽选自以下物质：转铁蛋白、白蛋白和胰岛素。
4.根据权利要求1至3之一所述的方法，其中所述富含单核细胞的异源白细胞包括异源嗜中性粒细胞。
5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其中所述异源白细胞混合物是通过汇集至少两种包含白细胞的血块黄层提供的，所述待汇集的血块黄层是从至少两种不同的异源供体获得的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述汇集的血块黄层包含血小板或其血小板被耗竭。
7.根据权利要求1至4之一所述的方法，其中所述异源白细胞混合物是通过下列方式获得的：
-从至少两个去白细胞过滤器中洗脱白细胞，所述过滤器先前已分别用于从全血中耗竭白细胞，所述全血可从至少两种不同的异源供体中获得；以及
-汇集所获得的白细胞，以获得所述异源白细胞的混合物；
或通过以下方式获得：
-从去白细胞过滤器中洗脱白细胞，所述过滤器已用于从所汇集的血块黄层中耗竭白细胞，其中所汇集的血块黄层源自至少两种不同的异源供体。
8.根据前述权利要求中的任一所述的方法，其中所述异源单核细胞是通过淘析或抗体/小珠分离而分离的。
9.根据前述权利要求中的任一所述的方法，其中所述共培养进行了约5天。
10.根据前述权利要求中的任一所述的方法，还包括将抗原负载到非耗竭未成熟DC上的步骤。
11.一种源自至少两种不同的异源供体的异源性非耗竭未成熟树突细胞(DC)的混合物，所述树突细胞(DC)可通过权利要求1至10中任一所述的方法获得。
12.一种用于产生促炎性DC的方法，包括以下步骤：
-根据权利要求1至11中的任一提供非耗竭未成熟DC；以及
-活化非耗竭未成熟DC，以获得促炎性DC。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述活化是通过加入以下物质而被诱导的：Toll样受体3(TLR3)-配体聚-I:C；TLR7/8-配体，例如Resiquimod；以及干扰素gamma(IFN-γ)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述活化诱导还包括加入至少一种选自以下物质的物质来诱导激活：TLR2-配体，TLR4-配体，TLR9-配体，干扰素alpha(IFN-α)，白介素1β(IL-1β)，以及肿瘤坏死因子alpha(TNF-α)。
15.根据权利要求13至14中的任一所述的方法，其中所述活化不包括加入前列腺素E2(PGE2)。
16.根据权利要求13至15中的任一所述的方法，其中未成熟DC暴露于活化因子中达8至24小时，然后冲去基本上所有的活化因子。
17.一种源自至少两种不同的异源供体的异源性促炎性树突细胞的混合物，所述树突细胞可通过权利要求12至16中任一所述的方法获得。
18.一种药物组合物，包括根据权利要求16所述的异源促炎性树突细胞的混合物、以及至少一种药学上可接受的载体。
19.根据权利要求17所述的异源促炎性树突细胞的混合物，或根据权利要求18所述的组合物，用于治疗癌症。
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