CN102782123A

CN102782123A - 用于抑制肿瘤细胞增殖的改进的组合物

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Publication number: CN102782123A
Application number: CN2011800080123A
Authority: CN
Inventors: 亚历克斯·卡森·帕拉; 本·安德森; 安娜卡琳·沃尔格伦
Original assignee: Immunicum AB
Current assignee: Mendus AB
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2011-02-10
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2031-02-10
Also published as: KR20120114358A; RU2012137173A; ES2581277T3; WO2011098516A1; JP2013519363A; SI2534242T1; KR101770785B1; EP2534242A1; CN102782123B; DK2534242T3; RU2565542C2; PL2534242T3; US20120328662A1; EP2534242B1; BR112012019267A2; US9034317B2; BR112012019267B1; HUE028352T2; JP5855018B2

Abstract

本发明属于癌症免疫疗法，该方法通过提供促炎树突状细胞（DC），它通过特异性处理刺激从而体内成熟；这种治疗的方法，以及包含促炎树突状细胞（DC）的组合物。DC可用作基于细胞免疫疗法，抑制癌症细胞增殖。

Description

用于抑制肿瘤细胞增殖的改进的组合物

发明所属领域

一般而言本发明属于癌症治疗领域。更具体而言本发明涉及癌症免疫疗法，且更具体而言涉及用于抑制肿瘤细胞增殖的基于细胞的免疫疗法。

背景

长久以来，疫苗被用于传染病如病毒或细菌感染的预防。免疫系统的细胞介导手段普遍涉及提供给宿主防卫能力、从感染中恢复并防止由同一抗原引起的再次感染。细胞介导免疫机制被认为对于癌症也是有用的。

树突细胞（DCs），最有效的抗原递呈细胞（APC），在免疫反应的启动和调节中起着核心作用。它们具有独特的能力引导幼稚T细胞，并引起和诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应。DC前体细胞存在于循环的血液中，并能迅速被补充到感染或发炎的位点。当DC前体细胞分化成未成熟DCs细胞时候，它们在开始和处理外源性蛋白质抗体方面变得非常有效。对于各种成熟刺激，例如表达Toll样受体(TLR)配体的细菌和病毒组分、炎症性细胞因子和/或特异性T细胞相互作用（CD40/CD40-配体相互作用），它们开启分化过程导致抗原摄取和处理能力的降低，共-刺激和MHC分子表达的增强。重要地，由直接病原体识别（例如TLRs）或CD40结扎诱导的信号强度和持久性已经显示出是特异性DC功能的关键决定因素。因此DC在外周位点由激活因子最后诱导，从而实现一个或两个互相排斥的功能——即，或为有效的T细胞相互作用而迁移到淋巴结（作为成熟迁移DCs），或通过产生大量包括趋化因子和细胞因子（作为成熟的促炎性DCs）在内的炎症性介质而决定微环境。

已有的集中于DCs的癌症免疫疗法策略均基于一个前提——T细胞反应的质量主要取决于迁移DCs对次级淋巴器官中的T细胞处理和递呈肿瘤抗原的能力，从而开创肿瘤特异性CTL反应，其导致在肿瘤细胞上免疫学攻击。来自不同小鼠肿瘤模型数据显示出这些反应可基于本领域技术人员公知的三种主要策略之一而被触发。这些免疫治疗抗癌策略现在被积极在人类中试验但均仅有很有限的成功。

第一种策略是使来自患有肿瘤的病人加载有抗原的迁移性DCs体内激活和成熟，随后将它们引入相同患者。典型地，抗原加载是通过将肿瘤相关抗原（溶解的肿瘤细胞、蛋白、多肽或编码这些抗原的核酸）加入到单核细胞衍生的未成熟DCs，随后用不同炎症因子的组合使抗原加载DCs激活/成熟而完成的。重引入的DCs应当迁移至引流淋巴结，在其中它们起动填充（prime）肿瘤-特异性T淋巴细胞。DC-起动的（primed）T淋巴细胞，尤其是CTLs，接着移至肿瘤位点，在其中它们随后诱导肿瘤细胞凋亡。

然而，临床中，在患者自己的体内处理即自体情况下，DCs很耗时且使患者暴露于增大的感染风险中。另外，其中用肿瘤抗原脉冲触发DCs并激活到有效递呈肿瘤抗原的迁移性DCs的处理程序是冗长的。

第二种主要的策略，它绕开了迁移性DCs来源的患者体内增殖的需要，该策略包括给予肿瘤抗原，包括已辐照的同种异体肿瘤细胞，或编码肿瘤抗原的质粒，使其进入完整正常组织中，包括皮下或肌内注射。肿瘤抗原辅以所谓的佐剂，目的在于引发DC-介导的体内免疫反应。最常见地，趋化因子、细胞因子或编码这些因子的质粒，和/或DC-成熟因子例如如肿瘤坏死因子a（TNF-α），和/或TLR激动剂可用作佐剂。

然而，给予外源肿瘤抗原是个繁冗的程序。

第三种主要策略，也绕开了在第一种主要策略中所包括的迁移性DCs来源的患者体内增殖的需要，并进一步绕开了第二种主要策略中所包括的外源肿瘤抗原的需要，涉及直接注射进入肿瘤中的一种佐剂。因此，佐剂旨在体内靶向确定DCs而患者的肿瘤作为肿瘤相关抗原的来源。已经测试的佐剂与第二种主要策略中描述的那些类似：趋化因子、细胞因子或编码这些因子的质粒，和/或DC-成熟因子例如TNF-α,和TLR激动剂。然而，因为死亡数量不足，可行的肿瘤可能是用于补充未成熟DCs的肿瘤相关抗原的贫瘠来源，优选地由激动剂诱导，肿瘤细胞可以被这些DCs吞噬。

所有上述三种策略均已在人类肿瘤患者中进行了测试，但仅取得有限成功。因此，明显的需要一种更有效的免疫疗法和改善的治疗癌症的方法。

发明简述

相应地，本发明通过提供一种能够产生高水平所期望的趋化因子和白介素（IL-12）的促炎成熟树突细胞，一种包含这种促炎树突细胞的组合物，一种生产这种促炎树突细胞的方法，所述促炎树突细胞或所述组合物作为药物的用途，以及所述树突细胞或所述组合物用于治疗癌症的用途，来更好地试图单独地或以任何形式组合，来克服现有技术中上文所识别的缺陷，并解决至少上述一种问题。

因此，在第一个方面，提供了一种通过用聚胞苷酸钠盐（poly-I：C）、雷西莫特（R848）和干扰素-γ(IFN-γ)的物质处理从而被刺激至体内成熟的促炎树突细胞（DC）。

在第二个方面，提供了一种包含基于第一个方面的促炎性DC和外周血液单核细胞（PBMCs）的组合物。

在第三个方面，提供了一种生产基于第一个方面的促炎性DC的方法。所述方法包括提供外周血液单核细胞（PBMCs）、从所述PBMCs中分离单核细胞、从所述单核细胞中产生未成熟DCs（iDCs）、以及通过将poly-I:C、R848和IFN-γ添加到iDCs中诱导iDCs的成熟，从而获得促炎性DC的步骤。

在第四个方面，提供了生产基于第二个方面的组合物的方法。所述方法包括提供外周血液单核细胞（PBMCs）、获得基于第一个方面的促炎性DC，以及混合所述PBMCs和所述促炎性成熟DC的步骤。

在第五个方面，提供了基于第一个方面的促炎性DC或第二个方面的组合物用作药物的用途。

在第六个方面，提供了一种基于第一个方面的促炎性DC或第二个方面的组合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的来源的个体中用作药物的用途。

在第七个方面，提供了一种基于第一个方面的促炎性DC或基于第二个方面的组合物，用于治疗癌症的用途。

在第八个方面，提供了一种基于第一个方面的促炎性DC，或基于第二个方面的组合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的源头的个体中用作治疗癌症的用途。

本发明的进一步的实施方式限定于从属权利要求中。

本发明不同于现有技术的地方在于它产生高水平的期望的细胞因子，例如趋化因子（C-X-C motif）配体9（CXCL9），又知为MIG、C-C motif趋化因子3(CCL3),又知为巨噬细胞促炎蛋白α(MIP-Iα)，去除活性刺激后的肿瘤坏死因子α(TNF-α),IL-Ιβ,和IL-12，因此是适宜使用的，例如可通过注射，在无外源性成熟刺激因子存在的情况下。

当对患者以同种异体方式，即患者不同于贡献用于创造促炎性DC产生的促炎性DC、或PBMCs的供者，进行瘤内注射时，这种促炎性DC将激活患者自身的DCs从而它们发展成肿瘤负载的迁移性DCs。这种效果是由于注射促炎性DC产生大量期望的细胞因子和IL-12，包括DC、NK细胞和记忆T细胞补充趋化因子MIP-1α/CCL3，NK细胞和记忆T细胞补充趋化因子MIP-1α/CCL9，以及NK激活趋化因子IL-12的组合的能力。此外，成熟DCs例如促炎性成熟DC，与未成熟DCs相比的一个好处就是能够通过细胞-细胞接触而加强NK细胞激活。这一促炎性DC的事实不受外源的强烈激活，例如成熟的影响，因子是有利的，因为在肿瘤中强烈的外源激活因子的存在可能另外地触发患者自身瘤内补充DCs成为患者特异性的即自身促炎性DCs而非成为期待的患者特异性迁移性DCs的分化。因此，为实现诸如CD86分子在成熟DC上的高表达，将可能需要至少18个小时的刺激，以便给予其最佳的能力来激活NK细胞。基于现有技术，在18小时后，激活/成熟不能产生显著量的IL-12。假若在仅8小时后中止激活，尚可保留产量。但是，这些DC没有足够时间来上调有关NK激活分子。

进一步，为了诱导强的免疫导致同种异体反应性、对存在于自身MHCII类分子（称为间接同种识别途径）上的同种异体MHC-衍生的多肽特异性的CD4+T细胞的扩张，同种异体器官、组织或成熟DCs的移植是已知的。通过将同种异体促炎性DC用作瘤内注射，DC将随即被宿主免疫系统杀死（拒绝），并从而变成高度免疫原性CD4+辅助T细胞抗原表位（同种异体MHC-衍生多肽）的来源，将被自身补充DCs捕获，最可能的是将有助于打破肿瘤患者中对肿瘤抗原的CD8耐受性。因此，促炎性C将作为佐剂，而非作为迁移性DCs，和现有技术相比，这将是有利的和不同的。例如，假若前列腺素E2（PGE2）被包括在不同的DC成熟混合物中，成熟的DC将变成迁移性DC，其迅速离开（肿瘤）注射位点，这在本发明的篇幅内是不利的。

通过使用同种异体DC即与来源或供者不相同的个体中，促炎性成熟DC或PBMCs，这些潜在的佐剂不再必须对每个特定病人单独制备，允许以随后的较低生产成本大量生产。另外，疫苗可以冷冻和通过长距离运输，进一步增强了其商业可行性。

附图简述

通过下述本发明的实施方式的描述，将使得本发明这些或其它方面、特征和优点更加明显和得到阐释，附图用作参考，其中

图1是基于第三个方面的方法的示意图；

图2是基于第四个方面的方法的示意图；

图3显示的是基于第一个方面，藉由促炎性成熟DC的CCL3/MIP-lα产量(图3C)、CCL5/RANTES(图3A)和CXCL9/MIG(图3B)的图表；

图4是基于第一个方面的显示促炎性成熟DC的IL-12产量的图表；

图5是基于第二个方面显示由IL-Ιβ和TNF-α组成的产量的图表；

图6是基于第二个方面显示由IL-Ιβ和TNF-α组成的产量的图表；

图7是基于第二个方面显示由TNF-γ组成的产量的图表；

图8是显示不同物质对iDCs的成熟的影响的FACS图表；

图9是显示基于第一个方面的促炎性成熟DC的影响，或基于第二个方面的组合物对iDCs的成熟的影响的FACS图表；

图10是显示对于一个实施方式研究中肿瘤体积的图表；

图11显示了在对于一个实施方式研究中组织病理学结果（原发肿瘤）的图片；

图12显示了在对于一个实施方式研究中组织病理学对照结果（原发肿瘤）的图片；

图13显示了在对于一个实施方式研究中组织病理学结果（继发肿瘤）的图片；以及

图14显示了在对于一个实施方式研究中组织病理学对照结果（继发肿瘤）的图片。

实施方式的描述

为了使本领域技术人员能够实施本发明，下面将结合附图进一步具体描述本发明的几个实施方式。然而，本发明可以以各种形式实施，不应当被解释为仅限于本文所提出的实施方式。恰恰相反，提供这些实施方式是为了公开彻底和完整。这些实施方式不对本发明构成限制，但本发明仅受附带的专利权利要求的限制。进一步，在附图所阐释的特定实施方式的具体描述中所使用的术语并不意味着对本发明的限制。

瘤内注射佐剂旨在诱导有效地抗肿瘤免疫反应，最可能必须在注射肿瘤中诱导3个事件，它们对于实现CTL介导的肿瘤根治都是重要的。

首先，为了被暴露在肿瘤抗原中，未成熟DC（iDC）需要被补充给肿瘤。趋化因子MIP-1/CCL3具有很强的刺激补充iDC的能力，包括体内瘤内注射补充iDC，在本领域已经被很好地建立。

其次，为了使肿瘤抗原对补充的iDC来说是可用的，诱导肿瘤细胞的凋亡是很重要的。在本领域为了实现这个存在多种不同的方法，包括触发瘤内补充并激活自然杀伤（NK）细胞的方法。NK-细胞介导敏感肿瘤细胞的初步杀伤，主要归因于细胞凋亡的诱导，在不同小鼠模型中已经重复地显示出有效地唤起随后的对亲本NK细胞耐受的肿瘤细胞的肿瘤-特异性细胞毒性T细胞应答的DC-介导的发展。已知NK细胞可表达趋化因子受体CXCR3，以及NK细胞的CXCR3-依赖性补充，这已经在不同动物模型中得到证实。其中一个公知的CXCR3-配体是MIG/CXCL9，有证据显示NK细胞在瘤内注射MIG/CXCL9后得到累积。

为了补充NK细胞从而有效杀死肿瘤细胞，NK细胞激活因子例如IL-12，一种潜在的NK细胞体外和体内杀伤活力激活剂的存在，也最可能地是必要的。

第三，必须诱导补充iDC成为成熟迁移性DC的成熟过程。

病毒感染（一般导致Thl-衍生的免疫反应）的早期步骤通常和DCs和NK细胞两者的局部补充和激活相关。在最近的研究中，使人类外周血液NK细胞暴露于IL-12或IL-4短时间短期（过夜）培养，调查了诱导DC成熟的能力。值得一提的是，仅有已用IL-12刺激的NK细胞能够诱导实质DC成熟过程。从而推论出与体内响应相一致，暴露于IL-12一段时间间隔的NK细胞可能倾向于为随后在次级淋巴器官（5）中起动的Thl细胞选择适宜的成熟DCs。这些人类体外数据与小鼠模型的体内数据显示出的当随着累积补充NK细胞后，在小鼠中注射抗原负载DC时，与没有NK细胞补充的情况相比，Thl响应变得显著提高是线性一致的。

Thl极化DC的成熟过程也已显示出是藉由多克隆激活的T细胞产生的可溶性因子诱导的。用由抗-CD3-激活的T细胞，或藉由用抗CD3和抗CD28两种刺激激活的T细胞的无细胞上清培养液制备的T细胞条件培养基（TCCM）对未成熟DC的处理已经显示出包含数种可溶性因子，包括CD40-配体、TNF-α和andIFN-γ。与通过添加个体细胞因子或单核细胞-条件培养基的协同刺激分子的温和的上调相反，用TCCM对未成熟DC的处理已显示出以剂量依赖方式诱导协同刺激分子表达的显著增加。TCCM诱导这种表型改变的能力进一步通过对CD40L、TNF-α和IFN-γ特异性的中和抗体而消除，表明TCCM中存在的这些因子主要被涉及在DC的成熟过程。重要地，TCCM处理的DC能够产生高水平的Thl-衍生的IL-12。

最后，已知在和抗原特异性CD8+T细胞在引流淋巴结中的同源相互作用期间，CD4+T细胞通过“帮助”迁移性DCs，在CD8+CTL的起动、发展和记忆，以及存活中起着决定性作用。在癌症免疫疗法领域的很多研究依赖于对将提供对于CTL诱导所需的帮助的来自野生型肿瘤抗原的MHCII类多肽的CD4+T细胞识别途径。然而，由于DC4+T细胞对这些在肿瘤发展期间进化的自身蛋白的耐受诱导，来自肿瘤抗原的多肽提供的帮助将常常是微弱的或缺乏的，这可能妨碍疫苗的治疗效果。最近的发现证明向肿瘤免疫位点相关的自身蛋白中加入非自身CD4+T细胞辅助表位足以在小鼠模型中打断对肿瘤相关抗原已建立的CD8耐受。

总起来说，所有这些数据显示旨在诱导有效的抗癌适应性（T细胞介导的）免疫相应的瘤内注射佐剂应具备高和持久的MIP-1α/MIP-lα/CCL3(DC、NK以及T细胞补充)、MIG/CXCL9(NK细胞以及T细胞补充),IL-12p70(NK细胞介导的肿瘤抗原的释放和NK细胞介导的迁移性DCs的成熟)的产量，并且最终，在引流淋巴结中肿瘤特异性CD8+T细胞的DC介导起动期间，免疫原性非自身蛋白质的存在可作为CD4+T细胞辅助表位。

人类单核细胞-衍生的DCs具有在用某些TLR-配体持续刺激期间产生高水平MIP-1α/CCL3、IL-12p70和MIG/CXCL9的潜力，这也导致它们的成熟。为了瘤内注射这种持久激活促炎性成熟Cs，它们必须在瘤内安置之前被洗涤。否则，同时给予的刺激剂（旨在诱导体内促炎性DCs）将非常可能也导致瘤内补充未成熟DCs的强烈和持久的激活，导致它们分化成促炎性成熟DCs而非所期待的分化成迁移性成熟DCs。不幸地，已知成熟化刺激例如TLR4配体或CD40L在当DCs已经分化成成熟DCs（通常是在超过12小时刺激之后）的某些时间点上的中止会诱导促炎性细胞因子生产，包括IL-12的生产的快速下调。从而在诱导因子激活的中止之后，必须使用激活方法将DCs激活成促炎性成熟DC来维持期待的因子的持续生产。

本发明人发现了一种生产促炎性成熟DC的方法，在撤去用强烈激活因子的持续刺激之后，从而使DCs摆脱刺激因子，令人惊讶地，这产生高水平的期待的趋化因子和IL-12。促炎性成熟DCs可以以一种同种异体方式给予患者，所述方式即给予与DC来源不相同的患者。

促炎性成熟DCs可以和外周血液单核细胞（PBMCs）混合，从而形成一种组合物。促炎性成熟DCs可以涂覆超级抗原，例如金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB），会引起PBMC群体范围内T细胞的多克隆激活。

当给予患者时，促炎性成熟DCs或其组合物将诱导免疫反应，该反应将导致将杀死肿瘤的针对肿瘤的细胞免疫反应。

假若患者不是PBMCs的供者，或者不是作为这个，或者不是促炎性成熟DCs的来源，即它们是和患者同源异体的，则效果出奇的强烈。于是，促炎性成熟DCs或其组合物可用作非自身的CD4+T辅助型T细胞表位。

促炎性成熟DCs或其组合物将通过促炎性成熟DCs产生高水平的相关趋化因子例如MIP-1α/CCL3，和通过细胞-细胞依赖性相互作用激活补充NK细胞的能力，以及促炎性成熟DCs产生高水平的细胞因子IL-12，导致患者自身用来自NK细胞-杀死肿瘤细胞的免疫原性肿瘤材料补充DCs的抗原负载的能力，从而有助于将患者自身的DC、NK细胞和T细胞吸引到注射位点。

优选地，将组合物100直接注射进入肿瘤。吸引DCs进入并遍布整个肿瘤的能力是重要的，因为在已研究的绝大多数癌症患者中，发现DCs主要在肿瘤的外周，这可能限制了它们和肿瘤细胞的相互作用。重要地，趋化因子将患者自身循环DCs补充到肿瘤位点的能力使肿瘤细胞暴露于新近产生的/补充的DCs（与本处的DCs相反），可能更少受到免疫抑制性肿瘤环境的影响。

在基于附图1的一个实施方式中，提供了一种方法10，其中外周血液单核细胞（PBMCs）101被提供11,。从所述PBMCs 101中分离12出单核细胞102。从所述单核细胞102中产生13未成熟DCs103，而iDCs103的成熟过程是通过向iDCs 103中添加激活-诱导剂poly-I:C,R848和IFN-γ而诱导14的，随后通过洗涤去除所有激活因子，从而得到不含刺激因子的促炎性成熟DC104。

在一个实施方式中，iDCs103成熟过程的诱导进一步包含添加至少选自由IFN-α、IL-ip和TNF-α组成的组中的至少一种物质。

在一个实施方式中，iDCs的产生13是通过在包含IL-4和GM-CSF的水相培养基中培养单核细胞2到7天，例如3到5天，或3到5天而诱导的。

在基于附图2A的一个实施方式中，提供了一种生产组合物100，例如促炎性成熟DCs104和PBMCs101的共培养的方法20。该方法包括提供21外周血液单核细胞（PBMCs）101，获得22促炎性成熟DCs104，并混合23所述PBMCs101和所述促炎性成熟DCs104。

在基于附图2B的一个实施方式中，生产组合物100的方法20进一步包括在混合之前用超级抗原200对促炎性成熟DC103进行处理22b的步骤。

上述实施方式将在下文中进一步进行描述。

实验

下述实验例的具体实施方式意图并非对本文中列出的特定形式的限制。相反，本发明仅由附带的权利要求限制，与上述具体实施方式相比，其他可能等同的实施方式也落入附带的权利要求的范围之内。

PBMC和单核细胞的分离

外周血液单核细胞(PBMCs)101是从从获自健康供者（萨尔格林斯卡医院，哥德堡，瑞典）外周血液中使用人淋巴细胞分离液通过本领域技术人员公知的密度梯度离心法而分离的。PBMCs101被重悬浮于Cellgro培养基（德国，弗莱堡，Cell Genix公司）中，至终浓度为25x10⁶/mL，随后于平底24-阱（1ml/阱）37℃、6% CO₂培养。2小时后，除去未粘结细胞，用PBS洗涤保留的粘结性细胞两次，得到分离的单核细胞102（主要由CD14+细胞组成）

DCs的产生

为了使单核细胞102分化成未成熟DCs103，将从分离步骤得到的单核细胞102在新鲜水相培养基例如Cellgro培养基中培养，在3或5天内补充诱导剂即1000U/mL的重组人类IL-4和1000U/mL的重组人类GM-CSF(均来自德国弗莱堡，Cell Genix公司)。

在IL-4和GM-CSF中的单核细胞-衍生的未成熟DCs（iDCs）103是一个公认的体内模型，细胞可以看做类同与外围组织DCs。

DCs的成熟

用IL-4和GM-CSF补充，在Cellgro培养基中培养3或5天后，或向培养基中添加20μg/mL polyLC(德国施泰因海姆，Sigma公司)，一种对TLR-3受体有特异性的免疫刺激剂也就是聚肌胞：聚胞苷酸或聚肌胞-聚胞苷酸钠盐，以及25μg/mL R848(德国施泰因海姆，Sigma公司),toll样受体7/8-配体又称为雷西莫特，或添加polyLC和R848，并补充l000U/ml干扰素γ(IFN-γ,R&D systems,明尼阿波利斯市，美国)的组合，来诱导未成熟DCs103的成熟。培养18小时后，洗涤细胞三次，进而在新的培养基（未添加外源激活因子）中培养24小时，从而获得基于一个方面的促炎性成熟DC104。

可用基于本领域技术人员公知的规程来从培养基中获取培养基上清液。

可对上清液进行下文所述的ELISA分析，从而分析趋化因子CCL3/MIP-lα、CCL5/RANTES、CXCL9/MIG、CCL2/单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，以及细胞因子白介素12(IL-12)的水平。

DC和PBMCs的共培养

基于上述方式获得PBMCs 101，同样基于上述方式获得促炎性成熟DC 104。

为了实现来自PBMCs 101的T细胞的快速成熟和多克隆激活，在培养步骤于洗涤之前30分钟将0.01μg/mLSEB(R&D systems,明尼阿波利斯市，美国)加入到DC培养基中。用PBS洗涤三次后，用1×10⁶细胞/mL的同种异体PBMCs(分离自如前所述的健康供者的外周血液)和促炎性成熟DC104（2.5×10⁵细胞/mL）在总体积为1mL中共培养24小时。

收获来自促炎性成熟DC 104和同种异体PBMCs的共培养基的培养基上清液，所谓的MLR上清液，随后于-80℃贮存。其后对上清液中存在的公知的DC-激活/成熟因子IFN-γ,TNF-α和IL-1β按照下文所述ELISA方法进行分析。如下文所述，对上清液也进行了iDCs表型成熟诱导的研究。

ELISA

通过使用来自明尼阿波利斯的R&D systems公司的Duo Set ELISA Development System，基于生产商说明的酶联免疫吸收测定法（ELISA），来测定CCL3/MIP-lα、CCL5/RANTES、CXCL9/MIG、CCL2/MCP-1、IL-12、TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平。

表型成熟检验

单核细胞衍生的树突细胞103（iDCs）如上面描述那样产生。在补充了IL-4和GM-CDF的Cellgro培养基中培养5天后，未成熟的DCs 103细胞在300μ1上述的MLR上清液和100μ1新鲜Cellgro培养基中37℃培养24小时。以没有额外补给的DCs培养作为对照。为确定MLR上清液是否能诱导成熟，将PE抗人CD86结合FITC抗人CD83染色样品。染上FITC和PE的小鼠IgG1和IgG2作为同种型对照（均来自美国加利福尼亚BD Biosciences公司）。用流式细胞术（FACS）使用细胞寻找软件（美国加利福尼亚BDBiosciences公司）分析样品。

结果

下面对来自实验部分的结果进行评论。

令人满意的炎性趋化因子的持续产生

如图3所示，假如在和TLR刺激即成熟的诱导14混合之前，iDCs已经在GM-CSF和IL-4中培养5天，则与在GM-CSF和IL-4中培养3天相比，来自3个所调查的血液供者的，促炎性成熟DC 104所产生的CCL3/MIP-lα（图3C）、CCL5/RANTES(图3A)和CXCL9/MIG(图3B)将会升高。另外，添加IFN-γ的复合TLR刺激产生最高水平的CCL3/MIP-l和CXCL9/MIG，而CCL5/RANTES的产量不受添加IFN-γ的影响。

因此，促炎树突细胞（DC），已经通过用聚肌胞-聚胞苷酸钠盐（poly-I:C）、雷西莫特(R848)和干扰素γ(IFN-γ)的物质处理从而刺激至体内成熟。

在一个实施方式中，用至少一种选自由干扰素a(IFN-α)、白介素1、beta(IL-1β)和肿瘤坏死因子（TNF-α）组成的组中组成的组的物质对促炎树突细胞（DC）进行额外的刺激。

值得注意的是，相关趋化因子的记录的最高水平是在撤去成熟化刺激后产生的。这种促炎成熟DC104不受强烈的外源激活，例如成熟化、各因子影响的事实是有利的，因为在肿瘤中强烈外源激活因子的存在可能在其他方面触发患者自身瘤内补充DCs向患者特异性即自身促炎性DCs的分化，而非所期望的患者的特异性迁移性DCs。

在撤去刺激24小时后的期间，促炎性成熟DC产生至少25000pg IL-12/mL/10⁶细胞，例如120000pg/mL/10⁶细胞，至少100000pg CXCL9/mL/10⁶细胞，例如400000pg/mL/10⁶细胞，以及至少40000pgCCL3/mL/10⁶细胞，例如180000pg/mL/10⁶细胞。

促炎性成熟DC也可产生CCL5/RANTES，在撤去刺激24小时后的期间，产生例如17500pg/mL/10⁶细胞。

如ELISA分析所得，没有发现可检测水平的（检测水平：312pg/mL）CCL2/MCP-1（数据未显示）。附图3显示的是CCL3/MIP-1α(附图3C)、CCL5/RANTES(附图3A)和CXCL9/MIG(附图3B)的水平。结果显示的是三个个体的平均值±SD。Y-轴显示的是在撤去刺激24小时后的期间，以pg/mL/2.5×10+细胞计的所产生的各种物质的量。X轴显示的是测量的不同组合。

IL-12p70的持续产生

由于组合了TLR刺激即成熟的诱导14，无论发现在促炎性成熟DC104中有或没有IFN-γ的并发刺激从而诱导持久和强烈的NK细胞补充趋化因子(CCL3/MIP-l、CCL5/RANTES和CXCL9/MIG)的产生，调查此类DCs是否同时能够释放IL-12，例如IL-12p70，一种公知的NK-细胞激活因子是有益的。如附图4中所示，在撤去成熟刺激例如激活诱导剂之后，显示了TLRs（例如R848和PolyLC）的双重刺激，以诱导强烈和持久的IL-12p70的产生。另外，在激活期间IFN-γ的添加进一步增强IL-12p70的产生。与趋化因子的产生类似，在激活之前，当单核细胞在GM-CSF和IL-4中培养5天时，和3天相比，IL-12p70的产生是最佳的(in 3 out of 4 experiments)。附图4显示出紧随DC成熟的诱导，IL-12p70的产生。给出的数据时不同来源的三个实验的平均值±SD。Y-轴显示的是在撤去刺激24小时后的期间，以pg/mL/2.5×10⁵细胞计的所产生的物质的量。X轴显示的是测量的不同组合。

用同种异体的PBMCs诱导产生DC-成熟因子的成熟DCs或SEB-涂覆成熟DCs的共培养

已知由激活的NK细胞和T细胞产生的炎性可溶性因子能促进其他的未成熟DCs的成熟。从而，当促炎性成熟DC104和免疫原性PBMCs(模仿补充免疫细胞)在组合物100中共培养时，能够诱导已知对于DCs的成熟时很重要的细胞因子的产生，这是有益的。为了优化DC-诱导的T细胞激活，在刺激阶段的最后（洗涤前30分钟），用双重的TLR激动剂和IFN-γ，添加SEB到DC-培养基中用超级抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）涂覆DCs。超级抗原，包括SEB，已知可和II类MHC在APCs上形成复合体，从而通过T细胞受体而刺激T细胞。出于对SEB的响应，同时产生迅速的多克隆激活和CD4+与CD8+T细胞，导致促炎介质包括TNF-α、IL-1和IFN-γ的产生增加。有差不多20%的T细胞谱能被SEB刺激，T细胞的“超激活”通常在SEB暴露之后48小时内发生。

经重复洗涤后，无论有或没有用并发的SEB“涂覆”，用免疫原性PBMCs对促炎性成熟DC104共培养24小时，通过ELISA方法测量上清液中释放出TNF-α、IL-1β和IFN-γ的水平。也可以使用其他类型的超级抗原，例如葡萄球菌肠毒素A、C、D、E、F、G、H和J，以及金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素-1(TSST-1)。如在附图5A中所显示，SEB-包衣的促炎性成熟DC104而非未成熟DCs的共培养（用TLR配体刺激），在用同种异体PBMCs共培养之后诱导了IL-1β的大规模产生。SEB包衣的未成熟DCs和同种异体的PBMCs的共培养诱导大规模的TNF-α的产生，通过使用成熟DCs使其略有增强。在DC成熟期间，向二倍的TLR刺激中中添加IFN-γ，基本不会影响IL-1β或TNF-α。尤其是，SEB包衣明显有助于所给予的共培养模型中IL-1β和TNF-α的释放（附图6），显示了作为这些细胞因子的主要来源的多克隆激活T细胞。

从而，在撤去刺激后的24小时期间，促炎成熟DC可产生至少2000pg TNF-α/mL/10⁶细胞，例如32000pg/mL/10⁶ cells，以及至少500pg IL-1β/mL/10⁶细胞，例如2500pg/mL/10⁶细胞。

和IL-1β和TNF-α的生产相似，当使用在共培养中已经用SEB包衣的成熟DC来生产时，IFN-γ的产生量是最大的（附图7），最可能原因是因为T细胞的多克隆激活。向TLR中添加PBMCs，以及IFN-γ刺激DC，对可能是由通过促炎成熟DC104产生的IL-12激活的NK细胞分泌的IFN-γ的产生稍有诱导。

附图5显示了通过ELISA法测量的IL-1β(附图5A)和TNF-α(附图5B)的细胞因子水平。附图6显示了未添加培养基，PBMC或PBMC/SEB，通过ELISA法测量的IL-1β(附图6A)和TNF-α(附图5B)的细胞因子水平。附图5中显示的数据是来自四个个体的平均值±SD，附图6中显示源自一个实验。

附图7显示通过ELISA法测量的上清液中IFN-γ的细胞因子水平。附图7中显示的数据来自一个实验。

附图5、6、7中各自的X轴显示了在撤去刺激后24小时期间在pg/mL/2.5x10⁵细胞中各自产生的物质的数量。Y轴显示的是测量到的不同组合。

旁观的未成熟DCs的显型成熟

随后，研究了来自未包衣的，或SEB包衣的促炎成熟DC104的共培养的旁观的未成熟DC上清液的显型成熟和同种异体的PBMCs101关于诱导旁观未成熟DCs的显型成熟的能力。从而，提供了基于前述任意一项权利要求的、包含促炎成熟DC104和外周血液单核细胞（PBMCs）101的组合物100。使用从这些细胞共培养物中得到的上清液对在GM-CSF和IL-4中培养5天的粘附的单核细胞而获得的未成熟的旁观DCs进行刺激。刺激24小时后，收获细胞用于FACS分析。分别使用抗-人类CD86和CD83来检验共刺激分子（CD86）和成熟标记（CD83）的表达。如附图8中所示，已经用组合TLR刺激例如通过向iDCs103中添加聚-I：C、R848，而后用SEB-包衣从而成熟的促炎成熟DC104共培养而得的上清液诱导出旁观的DCs的CD86和CD83显著的表达。从而，组合物100可包含一种超级抗原。如附图8C中所示，在TLR介导的疫苗DCs的成熟期间IFN-γ的添加不会导致旁观的未成熟DCs产生任何附加的、上清液-诱导的显型成熟。

附图8显示SEB和TLR配体，即成熟诱导剂对未成熟DCs103的影响。粘附的单核细胞于GM-CSF和IL-4中培养5天从而获得iDCs103。在第5天，添加用SEB/TLR刺激促炎成熟DC104和PBMCs101从而从MLR获得的上清液，随后另外培养24小时。为了研究共刺激分子和成熟标记，收获细胞并用抗-人类CD86和CD83染色。成熟和共刺激的表面标记高度受TLR配体和SEB的诱导。显示的结果来自从两个实验中选取的一个代表性实验。

如附图9B中所示，来自细胞培养物的、仅包含已经用组合TLR结合IFN-γ刺激而成熟的促炎成熟DC104的上清液诱导了基于旁观的DCs的CD83的大量表达。如附图9C中所见，通过来自和同种异体的PBMCs和促炎成熟DC104共培养的上清液，CD83表达进一步加强。最后，如附图9D所见，来自和SEB包衣的促炎成熟DC104和同种异体PBMCs101共培养的上清液诱导了最强的CD83的表达，显示出在促炎成熟DC104-同种异体PBMC101-共培养100中包含SEB对于诱导未成熟旁观DCs的最强的上清液-诱导成熟是很重要的。

考虑到上述结果，基于一个方面，提供了促炎成熟DC104，或组合物10，作为药剂的用途。

基于一个方面，提供了促炎成熟DC104、或组合物100，以及在治疗癌症中的用途。

基于一个方面，提供了促炎成熟DC104的用途、或用于制备治疗癌症的药剂的组合物100。

促炎成熟DC104、或组合物100，可以通过瘤内注射。

在一个实施方式中，癌症选自由乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肠癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、胰腺癌、恶性淋巴瘤和食道癌组成的组。

基于一个方面，提供了促炎成熟DC104、或组合物100，在不同于来源例如提供促炎成熟DC104，或PBMCs101的供者的个体中用作药剂的用途。

基于一个方面，提供了促炎成熟DC104、或组合物100，在不同于来源例如提供促炎成熟DC104，或PBMCs101的供者的个体中用于制备治疗癌症的药剂的组合物100。

瘤内注射

如上所述，可将促炎成熟DC104、或组合物100瘤内注射从而在肿瘤生长方面产生抑制效果。

为了显示此，在瑞典的乌普萨拉，基于下述描述使用Visionar Preclinical AB对大鼠进行了研究。

在本研究中使用了15只费舍尔鼠。适应过程（最少一周）后，将RPMI介质中的100μl包含10⁶MATB III细胞（最初从大鼠乳腺肿瘤中分离出来）的细胞悬浮液在动物的左后侧腹皮下注射（第-4天）。四天后在右后侧诱导出第二肿瘤（第0天）。促炎成熟DC104（如上所述而产生）或载体（10%（体积）牛血清（FCS）的PBS缓冲液）单独注射进入第一（左后侧腹）肿瘤，4天后载入第二（右后侧腹）肿瘤（第4天）。促炎成熟DC104的剂量为每个动物20μl，包含10⁶促炎成熟DC104细胞。整个研究中记录第一和第二肿瘤的生长。本研究中动物的实验部分得到了位于瑞典乌普萨拉(C320/9)的地区动物实验伦理委员会的批准。

下文表1中可看出实验设计的概述。

表1.实验设计。第一列为组，随后是参与大鼠的数目（N）、参与大鼠的独有ID、肿瘤1和肿瘤2的诱导的规格，以及最终各自的处理规格。

在左后侧腹的第一肿瘤接种瘤内疫苗的当日（第4天），将动物基于左侧腹肿瘤的体积随机分成两个不同组。无论是对照组还是促炎成熟DC104组，用10%（体积）牛血清的PBS载体进行瘤内注射。

每两天检查动物的肿瘤生长。当明显可见时，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸。记录肿瘤的长度和宽度。通过公式：长度（cm）×宽度（cm）×宽度×0.44，来计算肿瘤的体积。

最初的计划是在第7天将从促炎成熟DC104组的三只动物进行安乐死，所有其他动物则在第15天（第二肿瘤注射后的11天）进行安乐死。然而，第7天在一个对照动物和7个促炎成熟DC104组的实验动物中（分别给予载体或载体+疫苗细胞）肿瘤大于2cm³，因此这8个动物被施于安乐死。2天后（第9天），剩余的7只动物中的左侧（第一）肿瘤也已经长的超过伦理限度从而这些动物被实施安乐死。

将肿瘤切除、称重并干冰冷冻，保存在-70℃以备随后的组织病理学使用。

下表2中可见发送给MicroMorph用于组织病理学分析的冷冻肿瘤（包括左侧和右侧）。基于本领域熟练技术人员公知的方法，制备8μm的冷冻切片，用苏木素/伊红染色，用于DCs/巨噬细胞（小鼠抗大鼠CD68）、NK细胞（小鼠抗大鼠CD161a）、CD8阳性细胞（CD8+T细胞还有CD8+DCs/巨噬细胞）。

不同肿瘤中免疫原性细胞的数目按照如下方式盲打分：很少的阳性细胞（1+）、中等数量的阳性细胞（2+）或高数量的阳性细胞（3+）。

ID	组	试验天数
			659	对照	7
661	促炎成熟DC104	7
			662	对照	9
664	促炎成熟DC104	9
			665	促炎成熟DC104	7
667	对照	9
			670	促炎成熟DC104	9

表2：用于组织病理学分析的冷冻肿瘤。各列显示了大鼠各自的ID、组和安乐死的实验天数。

使用t-检验和重复测量方差分析（PASW v 18 on a HP Compac dc 7700p computer）来进行来自不同组的关于肿瘤体积的结果分析。肿瘤体积的描述性统计在下文表3和表4中给出。

表3：不同日期（d*）肿瘤体积（TV）。本表显示整个研究中平均肿瘤体积（mL）、平均数标准误（SEM），和动物的编号（N）。

使用重复测量方差分析来分析第6天到第9天的肿瘤体积。第一肿瘤和第二肿瘤分别进行分析。由于对重复测量中缺失值的处理，最后一个测量值结转。

表4：平均肿瘤体积（mL）、平均数标准误（SEM），和动物的编号（N），最后测量值结转。和组中第6天的相比，*P<0.05。在所有对照组中相应肿瘤相比#P<0.05。和对照组中相应肿瘤相比++P<0.05。

下表5中给出肿瘤重量的描述性统计。

表5：在不同日期安乐死的平均肿瘤重量（TW，g）、平均数标准误（SEM），和动物的编号（N）。和对照组中相应肿瘤相比*P<0.05（t-检验）。

附图10是显示在不同组（COMBIG-DC表示促炎成熟DC104）中不同肿瘤的肿瘤体积（mL）的图表。当从研究中去除动物时末次观测值结转。数值为平均±SEM。无论对于第一和第二肿瘤而言，均可以清楚地看出用促炎成熟DC104处理的大鼠具有较小的肿瘤体积。

第一肿瘤生长非常快速，由于很大的肿瘤体积，所有动物不得比计划的更早被实施安乐死。在第7天，在9只促炎成熟DC104组中有7只，在6只对照组中的一只，其余的动物在第9天必须被实施安乐死。为了完成基于材料的数据分析，第7天所测的肿瘤体积被结转到第9天。这可能使得第9天的第一肿瘤（注射疫苗的）的虚假的较低值，当分析基于第一（左侧）肿瘤的体积和重量的结果时，应当考虑从促炎成熟DC104组中去除更多动物的这一事实。随后，从第6天至第9天，使用重复测量的ANOVA来分析肿瘤体积。第一和第二肿瘤分开来分析。

第7天，在促炎成熟DC104组中第一肿瘤的肿瘤体积更大，可能可由对于注射的树突细胞的持续炎症反应来解释，因为免疫组织化学揭示出与对照组相比，在促炎成熟DC104组的这些第一肿瘤中，浸润的炎症细胞数量增加（参见下文）。

与对照组相比，促炎成熟DC104组中的第二肿瘤的肿瘤体积具有统计学显著的降低。

此外，与对照组相比，发现在促炎成熟DC104组中，第9天去除的两个第二肿瘤的统计学显著的较低重量。

将肿瘤冷冻，制备成冷冻切片，并用苏木素/伊红染色，并用于DCs/巨噬细胞（小鼠抗大鼠CD68）、NK细胞（小鼠抗大鼠CD161a）和CD8阳性细胞（CD8+T细胞还有CD8+DCs/巨噬细胞）。肿瘤由被各种厚度的松散连接的荚膜环绕的恶性肿瘤细胞组成。发现连接纤维束和肿瘤细胞混合在一起。在所有样品中观察到坏死肿瘤细胞的区域。在一些第一肿瘤（注射的）中发现了结晶材料池。由于这些仅发现于第一肿瘤中，最可能的是会联想到注射材料。

这在下表6给出概述。

表6：不同日（实验天数）安乐死的组织病理学分析结果。这些数值是DCs/巨噬细胞（CD68）、NK细胞（CD161a）、DCs/巨噬细胞（CD68a）和细胞毒性T细胞（CD8a）的评分。肿瘤的形态学评价通过在切片上H/E染色而完成。

在所有分析样本中均发现了肿瘤浸润CD8a、CD68和CD161a阳性细胞。阳性细胞同时在环绕肿瘤的荚膜和肿瘤细胞区域中被发现。尽管该结果并非定论，但看起来似乎用促炎成熟DC104处理的动物具有所研究细胞的更高的存在趋势。

因此，用促炎成熟DC104的瘤内注射处理诱导了DCs/巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞对肿瘤的补充的提高，从而第二肿瘤的体积和重量相应减小的趋势。

附图11显示了在初级肿瘤中瘤内注射促炎成熟DC104后3天巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞（DCs/CD8+）的组织病理学图片。

附图12显示了仅仅瘤内注射载体的相应对照的组织病理学结果的图片。

因此，可以看出在注射促炎成熟DC104后，肿瘤得以补充巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞，但仅注射载体则无此表现。附图13显示了在初级肿瘤中瘤内注射促炎成熟DC104后5天第二肿瘤的DCs/巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞的组织病理学结果的图片。

附图14显示了仅仅瘤内注射载体的相应对照的组织病理学结果的图片。

因此，可以看出在初级肿瘤中注射促炎成熟DC104后，甚至第二肿瘤（转移瘤）也得以补充巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞，但仅注射载体则表现出较低水平。

总体来说，这项肿瘤模型的疫苗研究显示出瘤内注射促炎成熟DC104诱导突出的炎性细胞，包括DCs、NK细胞和T细胞向注射部位（第一肿瘤）的补充。促炎细胞的这种强度的补充大概解释了注射后最初的2-3天观察到的肿瘤体积的增大。促炎成熟DC104的瘤内注射进一步诱导远处肿瘤（右侧肿瘤）的减小，显示出系统的抗肿瘤效果。

在一个实施方式中，癌症选自由：乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肠癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、胰腺癌、恶性淋巴瘤和食道癌组成的组。

在一个实施方式中，基于上文的促炎成熟DC104或组合物100进一步包含一种要学上可接受的赋形剂，例如载体、防腐剂和佐剂等。

在一个实施方式中，赋形剂是2%的人血清蛋白，以生理盐水溶液给予。

在一个实施方式中，成熟DCs104和外周血液单核细胞（PBMCs）101是涉及该主题的同种异体物，即来源于和该主题是MHC（主要组织相容性复合体）不相容的，例如完全MHC不相容的供者。

这具有治疗剂组合物可以在使用之前被预先生产并贮存，例如以冷冻状态的优点。如前所讨论，涉及病人的组合物的同种异体属性也将会使组合物更有效。

在一个方面，提供了一种治疗患有肿瘤哺乳动物患者的方法。该方法包含给予患者一次或多次治疗学上有效剂量的促炎成熟DC104或组合物100，其中所采用的促炎成熟DCs104和/或PBMC101的供者不是患者。

给药可以是瘤内注射。

在权利要求中，术语“包含/包含有”不排除其他元素或步骤的存在。进一步，尽管单独列出，多个元素或方法步骤也可以用例如一个步骤来实施。此外，尽管单个技术特征可以包含在不同权利要求中，将其组合是有利的，在不同权利要求中包含的内容并不意味着技术特征的组合是不可行的和/或不利的。此外，单数的参考并不排除复数。术语“a”、“an”、“第一”和“第二”等不排除复数。权利要求中签署的参考仅用作澄清性示例，不应被视作任何形式的对权利要求范围的限定。

Claims

1.一种促炎树突细胞（DC），其已由聚肌胞-聚胞苷酸钠盐（poly-I:C）雷西莫特(R848)和干扰素γ(IFN-γ)的物质处理从而刺激至体内成熟。

2.根据权利要求1的促炎成熟DC，其已进一步用选自由干扰素a(IFN-α)、白介素1、beta(IL-1β)和肿瘤坏死因子（TNF-α）组成的组的至少一种物质刺激。

3.根据权利要求1或2的促炎成熟DC，在撤去刺激后的24小时期间产生至少25000pgIL-12/mL/10⁶细胞，至少100000pg CXCL9/mL/10⁶细胞，以及至少40000pg CCL3/mL/10⁶细胞。

4.根据前述任意一项权利要求的促炎成熟DC，在撤去刺激后的24小时期间进一步产生至少2000pg TNF-α/mL/10⁶细胞，以及至少500pg IL-1β/mL/10⁶细胞。

5.包含根据前述任意一项权利要求的促炎成熟DC和外周血液单核细胞（PBMCs）的组合物，

6.根据权利要求5的组合物，进一步包含一种超级抗原。

7.一种生产根据权利要求1至4的任意一项促炎成熟DC的方法（10），所述方法包括步骤：

提供（11）外周血液单核细胞（PBMCs）101；

从所述PBMCs 101中分离（12）出单核细胞102；

从所述单核细胞102中产生（13）未成熟DCs103；

通过向iDCs 103中添加激活-诱导剂poly-I:C,R848和IFN-γ而诱导（14）iDCs103的成熟过程，从而获得促炎成熟DC（104）。

8.根据权利要求7的方法，其中iDCs(103)的成熟的诱导（14）进一步包含添加至少一种选自由IFN-α、IL-Iβ和TNF-α组成的组的物质。

9.根据权利要求7或8的方法，其中iDCs的产生（13）是通过在包含IL-4和GM-CSF的水相培养基中培养单核细胞2到7天而诱导的。

10.根据权利要求7至9任意一项的方法，其中iDCs的产生（13）是通过在IL-4和GM-CSF中培养单核细胞5天而诱导的。

11.一种生产根据权利要求5或6中任意一项组合物（100）的方法（20），所述方法包括步骤：提供（21）外周血液单核细胞（PBMCs101）；获得（22）根据权利要求1至4的促炎性成熟DCs（104），并混合（23）所述PBMCs101和所述促炎性成熟DCs（104）。

12.根据权利要求1的方法，进一步包括在混合前用超级抗原（200）处理促炎成熟DC（104）的步骤。

13.根据权利要求1-4任意一项的促炎成熟DC，或根据权利要求5或6的组合物，用作药物的用途。

14.根据权利要求1-4任意一项的促炎成熟DC，或根据权利要求5或6的组合物，在不同于促炎性成熟DC或PBMCs的源头的个体中用作药物的用途。

15.根据权利要求1至4任意一项的促炎成熟DC，或根据权利要求5或6的组合物，用于癌症的治疗。

16.根据权利要求1至4任意一项的促炎成熟DC，或根据权利要求5或6的组合物，用于在促炎成熟DC104，或PBMCs101来源不同的个体中用于治疗癌症的用途。

17.根据权利要求13至16的促炎成熟DC或组合物，其中癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肠癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、胰腺癌、恶性淋巴瘤和食道癌组成的组。

18.根据权利要求13到17的促炎成熟DC或组合物，其应用是瘤内注射。

19.一种治疗患有肿瘤哺乳动物患者的方法，包含给予患者一次或多次治疗学上有效剂量的根据权利要求1至4任意一项所述的促炎成熟DC，或根据权利要求5至6的任意一项的组合物，其中所采用的促炎成熟DCs和/或PBMC的供者不是患者。

20.根据权利要求19的方法，其中给药是瘤内注射。