KR20180002679A - 수지상 세포 면역요법 - Google Patents

수지상 세포 면역요법 Download PDF

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KR20180002679A
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sensitized
antigen
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KR1020177032647A
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윌리엄 케이. 데커
매튜 핼퍼트
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

요약
수지상 세포 집단의 투여를 포함하는, 피험체에서 표적화된 면역 반응을 제공하는 방법이 제공된다. 일부 양상들에서, 수지상 세포 집단은 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1, TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여되고 및/또는 질환있는 조직에 가까운 조직 부위에 투여된다. 치료적 수지상 세포 조성물 또한 제공된다.

Description

수지상 세포 면역요법
본 출원은 2015년 5월 7일 출원된 미국 가특허출원 제 62/158,237호의 이익을 주장하며, 이 출원 모두는 본 출원에 참고문헌으로 첨부된다.
본 발명은 미국 국립 보건원이 지급하는 정부 보조금 지원 제 AI036211, CA125123, 및 RR024574호로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가진다.
서열 목록의 포함
파일명 "BACMP0004WO_ST25.txt"로 포함되어 있는 서열 목록은 4 KB (Microsoft Windows®로 측정)이며 2016년 4월 19일에 생성되어, 전자 제출 형식으로 본 출원과 함께 출원되었으며 본 출원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자생물학, 면역학 및 의학 분야에 관련된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 피험체에 면역 반응을 제공하는 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 설명
중요한 TH1-연관 효과기로서, CD8+ 세포독성 T-세포 (CTLs)는 이들의 효과기가 항바이러스 및 항-종양 면역, 및 그 자체로, 숙주의 생존에 결정적이기 때문에 치료적 개입에 매력적인 표적이다 (Dudda 외, 2013). T-세포 활성화는 전문적 항원 제시 세포들 (APC)과의 상호작용을 필요로하며, 그 중 수지상 세포들 (DC)은 항원 처리 및 제시, 림프구 공동-자극, 및 사이토킨 및 말단 T-세포 분화를 조절하는 다른 염증 매개인자의 생성에 가장 특이적이다 (Lotze 외, 2001). DC는 T-세포 분극을 촉진하고 뿐만 아니라 그 자신을 TH1 분극화시키기 위해 사용된다 (예컨대, DC1) (Hokey 외, 2005). DC1-분극은 염증성 사이토킨 (Hilkens 외, 1997), 인터페론 (Longhi 외, 2009), 및 톨-유사 수용체 (TLR) 리간드 (Spranger 외, 2010)를 포함하는 패턴-인식 수용체 (PRR) 효능제에 의해 촉진될 수 있으나, TLR-/-, MyD88-/-, 제1형 인터페론 (IFN)-/-, 및 제1형 IFNR-/- 시스템들에서 얻은 혼동스러운 데이터는 DC 분극을 조절하는 확인되지 않은 또다른 메커니즘을 암시한다 (Ahmed 외, 2009; Carvalho 외, 2011; Lopez 외, 2003; Lopez 외, 2006A; Lopez 외, 2006B; Tam 및 Wick, 2009). 더욱이, 면역원성의, 이종 클래스 II 펩티드를 사용하여 T-세포 보조하고 DC 라이센싱을 향상시키기 위한 시도는 (Jones 외, 1999; Rosa 외, 2004) CD40 신호전달을 성공적으로 향상시켰으나, 역설적으로 또한 일부 모델에서 항원-특이적 CD8+ CTL을 하향조절하였다 (Hung 외, 2007; Kim 외, 2008; Ressing 외, 2000). 다른 연구들은 인플루엔자-특이적 TH1 면역성이 CD4+ T-세포가 없는 마우스에서는 일반적으로 생성될 수 있으나 (Allan 외, 1990) MHC 클래스 II가 없는 마우스에서는 결손됨을 나타내는데 (Tripp 외, 1995), 이는 TH 분극에 있어 MHC의 잠재적인 역할을 나타내는 것이다. 수지상 세포 항원 제시 및 기능을 조절하는 인자들에 관한 상당한 기술자들의 연구에도 불구하고, 현재까지 면역 자극을 향상시키기 위해 수지상 세포 항원 제시를 조절할 수 있는 방법은 여전히 불명확한 상태이다.
발명의 요약
첫번째 구체예에서 본 발명은 질환있는 세포 집단을 보유한 피험체에서 면역 반응을 제공하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 질환있는 세포 집단에 특이적인 하나 이상의 항원으로 감작되어 있는 감작된(primed) 수지상 세포 집단을 얻는 단계, 및 감작된 수지상 세포 집단의 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1, TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여된다. 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여된다. 또한 한 다른 양상에서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1 TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여되며 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여된다.
구체예들 중 일부 양상들은 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1 또는 이의 혼합물과 함께 감작된 수지상 세포 집단의 투여를 고려한다. 예를 들면, 일부 경우들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 INF와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, 제1형 INF는 INF-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 또는 IFN-ω 일 수 있다. 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-7 효능제와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, TLR-7 효능제는 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, 폴리(dT), 이미퀴모드, 가디퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 록소리빈, 및 ssRNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-9 효능제와 함께 투여된다. 예를 들면, 일부 경우들에서, TLR-9 효능제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN) 일 수 있다. 또한 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 AIMp1 폴리펩티드 (예컨대, NCBI 등록 번호 NP_001135887.1 및 NP_001135888.1 참고, 각각은 본 출원에 참고로 포함된다)와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-3 효능제와 함께 투여된다. 특정 양상들에서, TLR-3 효능제는 폴리이노신-폴리시티딜릭 애시드(폴리(I:C)) 또는 RGC100이다. 특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 RIG-1-유사 수용체 리간드와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, RIG-1-유사 수용체 리간드는 또한 RIG-1, MDA5, LGP2, 또는 IPS-1 리간드로서 정의된다. 예를 들면, RIG-1-유사 수용체 리간드는 MDA5 리간드, LGP2 리간드, ssRNA, dsRNA, 5'ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 및 폴리(I:C)로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 CDS 수용체 리간드와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, CDS 수용체 리간드는 또한 cGAS-STING 리간드로서 정의된다. 예를 들면, cGAS-STING 리간드는 세균성 사이클릭-디뉴클레오티드 (CDN)이다.
특정 양상들에서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1, TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드는 감작된 수지상 세포 집단 이전, 이후 또는 본질적으로 이와 동시에 투여된다. 일부 양상들에서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1은 전신 투여되며 수지상 세포 집단은 국소 투여된다. 또다른 양상들에서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1 및 수지상 세포 집단은 모두 국소로, 가령, 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 부위에 투여된다. 특정 양상들에서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1은 감작된 수지상 세포 집단의 약 1주, 1일, 8시간, 4시간, 2시간 또는 1시간 이내 투여된다. 특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단이 투여되는 피험체는 사전에 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1로 투여되었거나 현재 투여중이다. 일부 양상들에서, 상기 방법은 유효량의 감작된 수지상 세포 집단 및 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1을 포함하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 또다른 양상들에서, 구체예들의 방법은 피험체에 (감작된 수지상 세포 조성물과 함께) 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 일부 양상들에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제이다. 일부 양상들에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4에 특이적인 소형 분자 억제제 또는 억제제 핵산이다. 특정 양상들에서, 억제성 핵산은 RNA이다. 또다른 양상들에서, RNA는 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 또다른 양상들에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4-결합 항체이다. 일부 양상들에서, 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이고, 일부 양상들에서, CTLA-4-결합 항체는 IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgM, IgA, 유전적으로 변형된 IgG 동형, 또는 이의 항원 결합 단편(antigen binding fragment) 일 수 있다. 항체는 Fab-, F(ab-)2 , F(ab-)3, 1가 scFv, 2가 scFv, 2특이적 또는 단일 도메인 항체일 수 있다. 항체는 인간, 인간화된 또는 탈-면역화된 항체일 수 있다. 또한 또다른 양상들에서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙이다.
구체예들의 특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여된다. 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 INF, TLR-7의 효능제, TLR-9의 효능제, AIMp1, TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여되며 감작된 수지상 세포 집단은 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여된다. 특정 양상들에서, 상기 림프 조직 부위는 질환있는 세포 집단을 둘러싸고 있는 조직을 배출시키는 림프 조직이다. 예를 들면, 감작된 수지상 세포 집단은, 일부 양상들에서, 질환있는 세포 집단을 둘러싸고 있는 조직을 배출시키는 림프절에 투여된다. 일부 특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 하위분절, 분절, 폐엽, 엽간, 폐문, 종격, 활차상, 삼각흉간, 외측, 가슴, 견갑골하, 중간, 쇄골하, 표재 서혜, 심부 서혜, 오금, 얼굴 볼근, 얼굴 코입술, 전립선, 하악골, 턱끝밑, 후두, 유양돌기/이개후, 귀밑샘, 심부 귓바퀴앞, 심부 귓바퀴밑, 심부 선내, 심부 경부, 심부 전경부, 기관전, 기관옆, 후두전방, 갑상선, 심부 외측 경부, 상 심부 경부, 하 심부 경부, 인두뒤, 목정맥두힘살근, 전 경부, 외측 경부, 쇄골상, 후대동맥(retroaortic), 외측 대동맥, 복강, 위, 간, 비장, 상부 장간막, 장간막, 회결장, 결장간막, 하부 장간막, 또는 직장주위 림프절에 투여된다. 일부 양상들에서, 수지상 세포 집단은 림프절 내부에 직접 주사에 의해 투여된다.
특정 양상들에서, 상기 구체예들에 따른 치료를 위한 피험체는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 가진다. 자가면역 질환의 예들에는, 셀리악 질환, 제1형 진성 당뇨병 (IDDM), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 쇠그렌 증후군, 다발성 경화증 (MS), 하시모토 갑상선염, 그레이브스 질환, 특발 저혈소판 자색반병, 류마티스 관절염 (RA), 급성 특발 저혈소판 자색반병, 만성 특발 저혈소판 자색반병, 피부근육염, 시데남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반 루푸스, 루푸스 신장염, 류마티스 열, 다선 증후군, 물집유사 천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자색반, 연쇄상구균 신염, 결절 홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨 질환, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절 다발동맥염, 강직 척추염, 굿파스쳐 증후군, 폐색성 혈전 혈관염, 쇠그렌 증후군, 원발성 쓸개관 간경화증, 하시모토 갑상선염, 갑상선항진증, 피부경화증, 만성 활동 간염, 다발근육염/피부근육염, 다발연골염, 보통 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축 측삭경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발근육통증, 악성빈혈, 급속 진행 사구체신염, 건선, 및 섬유화 폐포염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 감염성 질환들의 예에는, 탄저병, 수두, 디프테리아, A, B 또는 C형 간염, HIB, HPV, HIV, 라임 병, 계절성 인플루엔자, 뇌염, 말라리아, 홍역, 수막염, 볼거리, 백일해, 폴리오, 광견병, 풍진, 대상포진, 천연두, 파상풍, TB 및 황열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체예들의 일부 양상들에서, 구체예들의 방법 및 조성물들로 치료되는 질환있는 세포 집단은 암 세포이다. 상기 구체예들에 따라 치료될 수 있는 암 세포들은 광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 가슴, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 코인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀, 또는 자궁의 세포들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양상들에서, 암은 신생물, 악성; 암종; 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두모양 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모발기질 암종; 이행 세포 암종; 유두모양 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 조합 간세포 암종 및 담관암종; 지주선암종; 선낭 암종; 샘종 폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 폴립증; 고체 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 아가미-치경음 선암종; 유두모양 선암종; 비염색 암종; 호산균 암종; 호산성 선암종; 호염기 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두모양 및 여포성 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이구선암종; 점막표피모양 암종; 낭선암종; 유두모양 낭선암종; 유두모양 장액 낭선암종; 점액 낭선암종; 점액선암종; 반지세포 암종; 침윤성 유관 암종; 속질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트 병, 유방; 세엽 세포 암종; 선편평세포 암종; 편평상피화생 존재 선암종; 흉선종, 악성; 난소 간질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 서톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방-외 부신경절종, 악성; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 간질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬러리안 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 중간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 윤활막 육종; 중피종, 악성; 난소고환종; 배아형 암종; 기형종, 악성; 난소 갑상선종, 악성; 융모막암종; 중간콩팥종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 방피성 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 중간엽 연골육종; 골의 거대세포 종양; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 사기질모세포성 치아육종; 사기질모세포종, 악성; 사기질모세포 섬유육종; 송과체종, 악성; 척삭종; 신경아교종, 악성; 뇌실막종; 별아교세포종; 원형질 별아교세포종; 원섬유 별아교세포종; 별아교모세포종; 아교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경인성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소형 림프구성; 악성 림프종, 대형세포, 미만성; 악성 림프종, 여포; 균상 식육종; 다른 특이적 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거대핵모세포 백혈병; 골수성 육종; 및 털세포 백혈병일 수 있다. 또다른 양상들에서 암은 뇌 암 (예컨대, 신경아교종), 전립선 암, 유방암 (예컨대, 3중 음성 유방암), 이자암 (예컨대, 이자 관 선암종), 급성 골수성 백혈병 (AML), 흑색종, 신장 세포 암 또는 만성 림프구 백혈병이다.
특정 양상들에서, 질환있는 세포 집단은 종양, 가령, 고체 종양이다. 또다른 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 양을 배출시키는 림프절에 투여된다. 특정 양상들에서, 종양은 전이 종양이고 감작된 수지상 세포 집단은 일차 종양 부위를 배출시키는 림프절에 투여된다. 또다른 양상들에서 암은 뇌 종양 (예컨대, 신경아교종), 전립선 종양, 가슴 종양 (예컨대, 3중 음성 유방암), 이자 종양 (예컨대, 이자 관 선암종) 또는 신장 세포 종양이다.
또다른 양상들에서, 구체예들 중의 한 방법은 피험체에 본 발명의 조성물을 1회 이상, 가령, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20회 또는 그 이상 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 구체예들에 따른 치료를 위한 피험체는, 일부 양상들에서, 포유동물 피험체이다. 예를 들면, 피험체는 사람과 같은 영장류동물일 수 있다. 또다른 양상들에서, 피험체는 비-사람 포유동물, 가령, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 돼지 또는 동물원 동물이다.
또다른 구체예에서, 다음을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다: (i) 항원-감작된 수지상 세포 및 (ii) 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, AIMp1, TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드. 일부 양상들에서, 항원-감작된 수지상 세포는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환 관련 항원으로 감작되어 있다. 특정 양상들에서, 항원-감작된 수지상 세포는 하나 이상의 종양 항원으로 감작되어 있다.
그러므로 특정 양상들에서, 구체예들의 조성물은 감작된 수지상 세포 집단 및 제1형 INF를 포함한다. 일부 양상들에서, 제1형 INF는 INF-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 또는 IFN-ω 일 수 있다. 다른 양상들에서, 조성물은 감작된 수지상 세포 집단 및 TLR-7 효능제를 포함한다. 일부 양상들에서, TLR-7 효능제는 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, 폴리(dT), 이미퀴모드, 가디퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 록소리빈, 및 ssRNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 또다른 양상들에서, 조성물은 감작된 수지상 세포 집단 미 TLR-9 효능제를 포함한다. 일부 경우들에서, TLR-9 효능제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)일 수 있다. 또한 또다른 양상에서, 구체예들의 조성물은 감작된 수지상 세포 집단 및 AIMp1을 포함한다.
또다른 구체예는 다음을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다: (i) 항원-감작된 수지상 세포 및 (ii) TLR-3 효능제, RIG-1-유사 수용체 리간드, 또는 CDS 수용체 리간드. 일부 양상들에서, 항원-감작된 수지상 세포는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환 관련 항원으로 감작되어 있다. 특정 양상들에서, 항원-감작된 수지상 세포는 하나 이상의 종양 항원으로 감작되어 있다. 일부 양상들에서, 종양은 뇌 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 전립선 암, 유방암, 또는 만성 림프구 백혈병이다. 일부 양상들에서, 상기 조성물은 TLR-3 효능제를 포함한다. 특정 양상들에서, TLR-3 효능제는 폴리(I:C) 또는 RGC100이다. 일부 양상들에서 상기 조성물은 RIG-1-유사 수용체 리간드를 포함한다. 일부 양상들에서, RIG-1-유사 수용체 리간드는 MDA5 리간드, LGP2 리간드, ssRNA, dsRNA, 5'ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 및 폴리(I:C)로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 양상들에서, 상기 조성물은 CDS 수용체 리간드를 포함한다. 예를 들면, CDS 수용체 리간드는 세균성 CDN이다.
또한 본 발명의 또다른 구체예에서, 항원 제시 세포 집단의 존재하에서 T-세포 또는 T-세포 전구물질의 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 배양단계는 AIMp1의 존재하에서 이루어지는 항원 특이적 T-세포 배양 방법이 제공된다. 일부 양상들에서, 항원 제시 세포 집단은 감작된 수지상 세포 집단이다. 다른 양상들에서, 항원 제시 세포 집단은 인공 항원 제시 세포들일 수 있으며, 이러한 세포들은 불활성화되어 있다 (예컨대, 방사선 조사에 의해). 일부 양상들에서, 상기 방법은 항원 특이적 T-세포의 시험관내 확대 방법으로서 추가로 정의된다. 특정 양상들에서, 수지상 세포 집단은 일차 수지상 세포를 포함한다. 또다른 양상들에서, 상기 배양단계는 면역 관문 억제제, 가령, CTLA-4 길항제의 존재하에서 이루어진다. 특정 양상들에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4에 특이적인 억제제 핵산이다. 특정 양상들에서, 억제성 핵산은 RNA이다. 또다른 양상들에서, RNA는 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 다른 양상들에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4-결합 항체이다.
또한 또다른 구체예에서, 적어도 제 1 항원으로 감작된 항원 제시 세포들의 집단의 존재하에서 T-세포 또는 T-세포 전구물질의 집단을 배양하는 단계를 포함하며 이 배양 단계는 폴리(I:C)의 존재하에서 이루어지는 항원 특이적 T-세포 배양 방법이 제공된다. 일부 양상들에서, 이 방법은 항원 특이적 T-세포의 시험관내 확대 방법으로서 추가로 정의된다. 일부 양상들에서, 항원 제시 세포들은 수지상 세포를 포함한다. 특정 양상들에서, 수지상 세포들은 항원으로 동종 부하된다. 일부 양상들에서, 수지상 세포 집단은 일차 수지상 세포를 포함한다. 일부 양상들에서, 배양 단계는 피험체에 대한 면역 관문 억제제의 존재하에서 이루어진다. 일부 양상들에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제이다. 특정 양상들에서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙이다.
본 출원에서 명시된 성분에 관하여 사용되는 "실질적으로 없는"은, 본 출원에서 명시된 성분은 전혀 의도적으로 조성물로 제제화되지 않았으며 및/또는 오염물로서 또는 미량으로서만 존재함을 의미하기 위하여 사용된다. 그러므로 의도하지 않은 조성물의 오염으로부터 생성된 명시된 성분의 총량은 0.05% 훨씬 미만이다. 명시된 성분의 양이 표준 분석법으로 전혀 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는, "하나(a 또는 an)"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 명세서 및 청구범위에서 사용되는 단어 "하나 (a 또는 an)"는, 단어 "포함하는"과 함께 사용시, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 명세서 및 청구범위에서 사용되는 "또다른" 또는 "추가"는 적어도 제 2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 용어 "약"은 한 수치가 장치의 고유한 오차 변화, 그 수치를 결정하기 위해 사용된 방법, 또는 연구 피험체들 중에 존재하는 변화를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나 상세한 설명 및 구체적인 실시예들은, 본 발명의 특정 구체예들을 나타내기는 하지만, 단지 설명을 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 다양한 변화 및 변형들은 하기 상세한 설명으로부터 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 명확할 것임을 이해하여야 할 것이다.
도 1A-F: 항원적으로 관련된 MHC 클래스 I 및 II 결정인자들의 동시 부하는 마우스 DC의 TH1-분극을 촉진시킨다. (A) 동종 mRNA (전기천공) 및 용해물 (배양)로 동시에 부하된 마우스 DC는 ELISA로 분석시 비장세포와 함께 공-배양될 때 택일적으로 부하된 DC보다 현저히 더 많은 IL-12p70을 분비하였다. 이러한 효과는 AIMp1의 siRNA 녹다운에 의해 제거되었다. 항원들은 RAW264.7 세포주로부터 유도되었다. 이종 클래스 II 항원들은 4T1 유방암 세포주로부터 유도되었다. Y-축: 부하되지 않은 (UL) DC로부터 IL-12p70 분비의 배수 변화. (B) 공-배양 이전, 48 시간 세포 배양 상청액의 웨스턴 블롯에 의한 분석시 동종 부하된 DC는 이종 결정인자들로 부하된 또는 그 외 하나로 부하된 DC보다 현저히 더 많은 AIMp1을 분비하였다. 상부 패널: RAW264.7 항원 결정인자들로 동종 부하 후 AIMp1 방출. 4T1으로부터 유도된 이종 용해물. 하부 패널: 일차 SV 항원 결정인자들로 동종 부하 후 AIMp1방출. 일차 전립선으로부터 유도된 이종 용해물. (C) 동종 부하된 DC는 또한 sCTLA-4 분비의 현저한 감소를 보여주었다. 도시: RAW264.7 항원 결정인자들로 동종 부하 후 sCTLA-4 방출. 4T1으로부터 유도된 이종 용해물. (D) 동종-부하된 DC에서 AIMp1 siRNA 녹다운은 B16 흑색종 결정인자들 (좌측 패널) 및 일차 SV 결정인자들 (우측 패널)로 동종 부하된 DC로부터 기저선으로 sCTLA-4 분비를 회복시켰다. 도시된 데이터는 > 70%의 전형적인 AIMp1 녹다운을 나타낸다. (E) SV 결정인자들로 동종-부하된 DC는 임의의 다른 방식으로 부하된 DC에 비해 자가 비장세포와 함께 시험관내 공-배양하는 동안 현저히 증가된 CD3+, CD3+CD8+, 및 CD3+CD8+CD25+ T-세포 증식을 생성하였다. 이러한 효과는 AIMp1 siRNA로 동종-부하된 DC의 처리에 의해 제거되었다. 이종 용해물은 일차 전립선이었다. Y-축: 부하되지 않은 (UL) DC와 비교한 총 세포수의 배수 변화. (F) SIINFEKL (서열 번호: 1) MHC 클래스 I H-2Kd 결합 에피토프 및 전체 OVA 단백질로 동종-부하된 DC는 임의의 다른 방식으로 부하된 DC에 비해 생체내 현저히 증가된 CD3+, CD3+CD8+, 및 CD3+CD8+CD25+ T-세포 증식을 생성하였다. 이러한 효과는 AIMp1 siRNA로 동종-부하된 DC의 처리에 의해 제거되었으며 H2-DM-/- DC에서는 관찰되지 않았다. 이종 클래스 II 항원은 일차 SV 용해물이었다. Y-축들: 부하되지 않은 (UL) DC와 비교한 배수 변화 백분율. 모든 실험들에 있어서 siNT 또는 NT = 비-표적 siRNA. siAIMp1 = AIMp1 siRNA.
도 2A-F: 동종 클래스 I 및 II 항원 결정인자들은 PRR 효능성과 독립적인 방식으로 TH1-분극된 DC를 생성한다. (A) GFP-발현 아데노바이러스로 형질도입, rGFP 단백질로 배양, 두 가지 모두 처리 또는 비처리 후 사람 DC 배양 상청액의 sCTLA-4 ELISA. 이종 부하 또한 관련없는 항원인, 쥐과 IL-4를 사용하여 나타내었다. ( C) 두 가지 상이한 농도의 단백질에서 GFP-mRNA로 전기천공, rGFP 단백질로 배양, 이들 두 가지 모두 처리 또는 비처리 후 사람 DC 배양 상청액의 AIMp1 웨스턴 블롯. 5가지 중 하나의대표적인 실험을 나타낸다. (C) 클래스 I 인플루엔자 HA 펩티드로 전기천공 및 중첩 (동종) 또는 비-중첩 (이종) 클래스 II 인플루엔자 HA 펩티드로 배양 후 사람 DC 배양 상청액의 sCTLA-4 웨스턴 블롯. (D) 다양한 TLR 효능제 자극의 존재시 동종 또는 이종 클래스 I 및 II 펩티드 쌍으로 부하 후 사람 DC 배양 상청액의 sCTLA-4 및 AIMp1 웨스턴 블롯. 대표적인 세 가지 실험이 도시되어 있다. (E) (d)에 도시된 세 가지 독립 실험들에 관한 데이터의 AIMp1/sCTLA-4 비율의 밀도측정 정량 (F) RT-PCR 분석은 동종 인플루엔자 HA 펩티드 쌍 (B8-166 (서열 번호: 3)/DR3-162 (서열 번호: 2) 및 A2-443 (서열 번호: 5)/DR3-440 (서열 번호: 4))로의 DC 부하가 (Decker 외, 2009) CTLA-4 및 sCTLA-4 mRNA 전사체들을 현저히 하향조절하였음을 나타낸다. 부하되지 않은, 단일-부하된, 및 이종-부하된 DC는 지속하여 CTLA-4를 발현시켰다. GAPDH 증폭은 부하 대조군으로 도시되었다. (*) = 이종 펩티드 쌍의 부하 +/- 클래스 I 펩티드의 전기천공은 CLTA-4 발현시 전혀 영향을 미치지 않았다.
도 3A-G: AIMp1/sCTLA-4 조절은 MHC에 대한 동종 클래스 I 및 II 펩티드의 결합에 따라 달라진다. (A) SV mRNA 및 용해물로 단일, 동종, 또는 이종 부하 후 야생형 (상부) 및 H2-DM-/- (하부) 쥐과 DC 배양 상청액의 sCTLA-4 (우) 및 AIMp1 (좌) 웨스턴 블롯. 대표적인 실험이 도시되어 있다. (B) (a)에 도시된 세 가지 독립 실험들에 대한 데이터의 AIMp1/sCTLA-4 비율의 밀도측정 정량. 상부 패널: 야생형 DC. 하부 패널: H2-DM-/- DC. (C) CLIP에 대한 아미노산 서열 상동성을 보유하는 클래스 I H-2Db 펩티드로 H2-DM-/- DC 부하는 AIMp1 및 sCTLA-4의 적절한 조절을 반복한다 (Ii CLIP = 서열 번호: 6; H2-Db CLIP = 서열 번호: 7). (D) 클래스 I H-2Db CLIP을 이용한 H2-DM-/- DC의 동종 부하에 반응한 높은 AIMp1/sCTLA-4 분비 비율은 시험관내 TH1 반응의 하위 증대를 매개하였는데, 이는 H-2Db CLIP-부하된 H2-DM-/- DC를 자가 비장세포와 공배양 후 활성화된 CD8+ T-세포들의 발달이 향상된 것에 의해 증명되었다. (E) 아미노산 치환체들 (Gly 대 Met)을 클래스 I 또는 클래스 II 결합 펩티드 내부에 도입시킴으로써, 세 가지 아미노산들에 대한 인접 상동성 구역들을 제한하는 것은 펩티드 부하에 반응한 높은 AIMp1/sCTLA-4 분비 비율을 제거하기에 충분하였다. 동족 펩티드에 상보적 치환체들을 도입함으로써, 연장된 상동성을 반복시키는 것은 높은 AIMp1/sCTLA-4 분비 비율을 해결하기에 충분하였다. 도시: 16가지 대표적인 실험. (글리신 쌍: 클래스 I = 서열 번호: 3, 클래스 II = 서열 번호: 2; 메티오닌 쌍: 클래스 I = 서열 번호: 8, 클래스 II = 서열 번호: 9) (F) (e)에 제시된 데이터의 밀도측정 정량. 16가지 독립 실험들의 평균 값들. *p < 0.05. (G) AIMp1 coIP는 AIMp1와 MHC의 상호작용이 동종 펩티드들로 부하되었을 때 실질적으로 제거되었음을 나타내는데, 이는 분비된 AIMp1이 MHC-결합된 AIMp1으로부터 유도될 수 있음을 제시하는 것이다. (이종 펩티드 = 서열 번호: 3 및 서열 번호: 10; 동종 펩티드 = 서열 번호: 3 및 서열 번호: 11; 클래스 II 펩티드 = 서열 번호: 11 및 서열 번호: 10; 클래스 I 펩티드 = 서열 번호: 3 및 서열 번호: 8)
도 4A-E: 동종 항원 결정인자들에 의하여 분극된 DC는 말초 내성을 극복하고 정낭을 제거한다. (A) 보강제(adjuvant)만을 또는 SV-부하된 동종 DC 백신과 보강제를 주사한 수컷 C57BL/6 마우스로부터 얻은 정낭의 육안 (우) 및 부분-육안 (sub-gross) (좌) 이미지. (B) 6개월의 기간에 걸친 SV의 제거를 증명하는 3D 종단 MRI. (C) 백신접종 후 6개월에 SV를 H&E 염색하였는데, 백신접종한 마우스에서 남아있는 SV는 보강제만을 투여받았던 마우스에 비해 주로 섬유증으로 이루어졌음을 보여준다. (D) 처리 후 1개월에, 항-CD8을 이용한 IHC 염색은 보강제만을 투여받앗던 마우스에 비해 백신접종된 마우스에서 현저한 CD8+ T-세포 침윤을 나타낸다. (E) 반응성 SV-백신접종 동물들로부터 면역이 없는 수용자들로 말초 혈액 림프구 (PBL)의 입양 전이는 6주의 전이 이내에 SV 파괴를 반복하였다. 위장-백신접종 또는 보강제만을 투여한 동물들로부터의 PBL 입양 전이는 정상 SV 조직병리학 (상부 패널)에 전혀 영향을 나타내지 않았다. 2차 입양 전이는 동일한 효과를 생성하였다 (하부 패널). 총 SV 반응성 = 25/42 (60%).
도 5A-J: 동종 항원 결정인자들에 의해 분극된 DC는 특이적이고 분화적인 방식으로 전립선 및 정낭을 제거한다. 정상 전립선 (상부) 및 동종-부하된 DC 전립선 백신으로 백신접종된 동물로부터 유래한 전립선 (하부)의 MRI (A 및 D) 및 육안 (B 및 E) 이미지. 백신접종된 그리고 보강제만 투여한 동물들의 H&E 염색은 (C) 보강제만 투여한 동물에서 정상 전엽 및 (F) 백신접종된 동물의 전엽에서 뚜렷한 비대 및 염증을 나타낸다. 시간 경과에 따라, 백신접종된 동물들에서의 전립선 엽은 보강제만 투여한 동물 (G)과 비교하여 백신접종된 동물 (H)의 부재 및 저형성 전엽 이미지에 의해 나타나는 바와 같이 수축하여 사라지는 경향이 있었다. SV 및 전립선이 아주 근접하여 존재한다 하더라도, 백신접종은 매우 특이적이었는데, 이는 (I) 전립선-백신접종된 동물에서 정상 SV와 함께 전립선의 염증성 병리 뿐만 아니라 (J) SV-백신접종된 동물에서 정상 전립선과 함께 SV의 특징적인 염증성 병리에 의해 입증된다. 총 전립선 반응성 = 8/17 (47%).
도 6A-J: 동종 백신접종은 생리학적 모델 시스템에서 신생물 자체와 정상을 식별하게 하고 전립선 선암종을 제어한다. 선암종 단계의 Pro-Cat/JOCK1 동물들의 추가 코호트를 백신접종시키기 위해 Pro-Cat/JOCK1 마우스로부터 유도된 전립선 선암종 결정인자들 (Carstens 외, 2014)이 사용되었다. 데이터는 (A) 선암종-부하된 백신 및 보강제는 정상 전립선과의 교차-반응성을 거의 나타내지 않았던 반면, (B) 질환의 선암종 단계로 유도되었던 마우스는 백신접종시 가장 mPIN을 연상시키는 병리학적 소견을 보였으며 또한 백신접종되지 않은 또는 암이 아닌 마우스에서 볼 수 없는 림프구-침윤된 세엽 (B.1 삽도)을 보였음을 나타낸다. 보강제만을 투여받아 유도된 마우스 (C)는 Pro-Cat/JOCK1선암종의 전형적인 병리학적 특징들을 보여주었다. (D) 병리학적 점수 (실험 절차에 정의됨)는 백신화된 유도 마우스와 보강제만으로 처리하여 유도된 마우스 간의 병리학적 표현형에 있어서 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다. Y-축: 병리조직학적 점수. 백신접종은 또한 DC 투여받지 않은 (E 및 F), 1 x 105 DC (G 및 H), 및 4 x 105 DC 투여받은 (I 및 J), 유도된 (E, G, I) 그리고 유도되지 않은 대조군 동물들 (F, H, J)에서 관찰된 바와 같이 용량 반응적 효과를 주는 것으로 나타났다. 기준 바 = 100 mM.
도 7A-H: 동종 백신접종은 자발성 CNS 악성의 대형 동물 모델에서 실시가능하며 잠재적인 효능이 있다. CNS 악성 진단시, 두 마리의 대형 (> 25 kg) 개 환자들을 비-무작위 I상 수의학 시험을 위해 채용하였다. 뇌의 임상 MR 이미지는 진단시 (A 및 E), 보존적 종양 절제 직전 (B 및 F), 절제 직후 (C 및 G), 및 백신접종 프로토콜 개시 5주 후 (D 및 H), 2마리 동물들의 종양들을 보여준다. 화살표는 종양 구역을 나타낸다. 첫번째 동물 (상부 4개 패널)은 단일 백신 주사 후 50%의 종양 부피 감소를 보였던 반면 (C 및 D 참고) 두번째 동물 (하부 4개 패널)은 3회 백신 주사 후 79%의 종양 부피 감소를 보였다 (G 및 H 참고).
도 8A-B: AIMp1은 DC의 동종 부하 후 조기에 성숙 이전에 방출되는 반면 sCTLA-4 분비의 제거는 하위에서 발생한다. (A) AIMp1 분비의 개시는 동종 클래스 I 및 II 펩티드로 DC 부하 후 3시간인 조기에 관찰되었으나, sCTLA-4 분비는 이러한 조기 시점에서 영향받지 않은채 남아있었다. sCTLA-4 분비의 제거는 성숙 후 이후 시점들까지도 보이지 않았다 (예컨대 부하 48시간 후에서 볼 수 있음). (B) 비일치된 이종 펩티드 (밝은 회색) 또는 중첩 동종 펩티드 (어두운 회색)로 부하된 DC로부터 부하 3시간 후 및 48시간 후에서의 AIMp1 및 sCTLA-4 분비 정량. Y-축: AIMp1/sCTLA-4 비율.
도 9: AIMp1 coIP 및 상호 MHC 클래스 I coIP는 특히 성숙 DC에서, AIMp1과 MHC 사이에 강한 상호작용을 나타낸다. 결과들을 탠덤 질량 분광법로 확인하였다 (도시되지 않음). IP = 면역침전에 사용되는 항체의 특이성. IB = 검출에 사용되는 항체의 특이성. 대표적인 세 가지 실험이 도시되어 있다.
도 10: MHC에 대한 AIMp1 결합은 동종 항원 결정인자들 (mRNA 및 용해물)로의 DC 부하에 따라 달라진다. 동종 클래스 I 및 II 펩티드 쌍으로 부하된 DC와 유사한 방식으로, AIMp1 coIP는 DC가 동종 mRNA 및 용해물 제조물로 부하되었을 때 MHC 클래스 II 및 클래스 I와 AIMp1의 상호작용 (도시되지 않음)이 실질적으로 제거되었음을 나타내었으며, 이는 분비된 AIMp1이 MHC-결합된 AIMp1으로부터 유도될 수 있음을 제시하는 것이다. 흥미롭게도, 이종 제조물을 사용함에 의한, 클래스 I (mRNA)과 클래스 II (용해물) 결정인자들간의 증가된 항원 이질성 도입은 MHC에 대한 AIMp1 결합을 향상시키는 것으로 나타났다. 대표적인 세 가지 실험이 도시되어 있다.
도 11A-B: b2-마이크로글로불린 또는 HLA-DM의 siRNA 녹다운에 의한 MHC 부하의 제거는 동종 펩티드 부하에 대해 반응하여 AIMp1/sCTLA-4 분비를 조절하는 사람 DC의 능력을 제거한다. (A) 두 개의 상이한 쌍의 동종 펩티드들로 부하된 DC (야생형 인플루엔자 HA 및 gly-대-met 치환된 HA)는 비-표적화 (NT) siRNA로 처리 시 AIMp1 분비를 증대시키고 sCTLA-4 분비를 감소시켰으나; b2-마이크로글로불린 또는 HLA-DM siRNA로의 처리는 AIMp1 및 sCTLA-4를 조절하는 능력을 완전히 제거하여, 분비된 AIMp1/sCTLA-4 비율을 부하되지 않은, 단일-부하된, 또는 이종-부하된 DC의 비율들과 구별될 수 없게 하였다. 네 가지 대표적인 실험들이 도시되어 있다. (B) (a)에 제공된 데이터의 밀도측정 정량. 네 가지 독립 실험들의 평균 값들. *p < 0.05.
도 12: 면역학적 자기를 생체내 표적화하기 위한 DC 동종 부하 방법의 도식적 개요.
도 13: 입양 전이 일정 및 분석 시각표의 도식적 개요.
도 14: 부분적-HLA 일치된 사람 DC의 동종 부하는 WPMY-1 정상 전립선을 특이적으로 용해시키는 능력을 향상시키면서 CTL을 생성한다. WPMY-1 정상 사람 전립선 세포주로부터 유도된 결정인자들로 부하된 사람 DC가 자가 림프구들을 감작하여 확대시키기 위해 사용되었다. 3회의 자극 후, T-세포들을 수집하였으며 용해적 특이성을 전술한 바와 같이 51Cr 용해 분석으로 테스트하였다. 50 WPMY-1 mRNA 및 WPMY-1 용해물 모두로 부하된 DC는 WPMY-1 용해물 또는 WPMY-1 mRNA 단독으로 부하된 DC 보다 실질적으로 보다 우수한 특이적 CTL 활성을 생성하였음을 나타내었다. Y-축: 특이적 용해 백분율. X-축: E:T 비율.
도 15A-D: 동종 항원 부하에 의해 생성된 백신들은 CD8+ 세포에 의존적인 방식의, 확정된 4T1 유방암 종양들의 성장 및 전이 확산을 나타낸다. (A) 루시페라제-발현 4T-1 종양들의 전위 확정 8일 후, 마우스를 동종-부하된 수지상 세포로 백신접종하거나 위장 백신접종 및 전신 보강제로 처리하였다. 종양들의 전이 확산을 IVIS로 모니터하였다. 보는 바와 같이, 위장-백신접종된 마우스는 간, 폐, 및 뇌로의 원거리 전이를 발달시켰으며 이식 후 1개월에 사망하기 시작하였다. 백신접종된 마우스는 전이 질환 및 일차 종양을 발달시키지 않았으며 잘 제어되는 상태로 유지되었다. 동종 부하를 위한 항원 물질은 루시페라제를 발현시키지 않았던 4T1 세포주로부터 유도되었다. 대표적인 마우스가 도시되어 있다. 코호트 크기 = 그룹 당 6마리. (B) (A)로 도시된 데이터의 카플란-마이어 생존 분석. 56 연구일에 p < 0.001. (C) CD8+ 세포들에 대한 의존성을 증명하기 위하여, 비-종양-보유 마우스의 코호트들을 동종 백신으로 2회 백신접종하였다. 단일 코호트의 CD8-고갈 후, 비장세포를 수집하고 종양-보유 마우스의 코호트들로 입양 전이 시켰다. 데이터는 동종-백신접종되고, 동형-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스는 종양 제어를 유지하였으나 전이 확산을 보이지 않았던 반면, 동종-백신접종되고, CD8-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스는 궁극적으로 질환으로 쓰러졌음을 증명하였다. 이종-백신접종되고, 동형-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스는 모두 중에서 가장 결과가 좋지 않았으며, 이는 아마도 추가적인, CD8- 효과기의 존재가 동종 백신접종에 의해 생성되었음을 나타내는 것이다. 대표적인 마우스가 도시되어 있다. 코호트 크기 = 그룹 당 5마리. (D) (C)로 도시된 데이터의 카플란-마이어 생존 분석. 43 연구일에, 동종-백신접종된 숙주들로부터 유도된 동형-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스의 80%는 살아남아 있었으나 동종-백신접종된 숙주들로부터 유도된 동형-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스의 20%만이 살아남았다. 동형-고갈된, 이종-백신접종된 숙주들로부터 유도된 비장세포로 입양 전이된 모든 마우스는 32 연구일까지 종양으로 쓰러졌다. 43 연구일에서 p<0.001.
도 16: 재조합 AIMp1 (p43)은 TH1 반응 생성을 향상시킨다. 사람 DC에 지시된 펩티드 조합물들을 부하하고 100 ng/ml 재조합 AIMp1 (p43)의 존재 또는 부재시 자가 T-세포들을 감작시키기 위해 사용하였다. 테스트된 모든 조건들하에서, 활성화된 CD8+ T-세포의 백분율은 AIMp1의 존재시 50%에서 150%로 향상되었다. 테스트된 각 쌍의 조건에 대한 p<0.05. rAIMp1 사이의 가장 강력한 증가는 항원으로 동종-부하되었던 DC에서 관찰되었다.
예시적 구체예들의 설명
I. 본 발명의 구체예들
수지상 세포는 매우 특성화된 클래스의 항원 제시 세포들을 포함한다. 종래의 연구들은 수지상 세포가 피험체 내 세포 집단, 가령, 암 세포에 특이적으로 표적된 T-세포 반응을 자극하기 위하여 효과적으로 감작될 수 있음을 증명하였다 (예컨대, 미국 특허 제 8,728,806호 참고, 이는 본 출원에 참고문헌으로 포함됨). 그러나 수지상 세포 조성물들의 효능을 향상시켜 더욱 강력한 면역 반응을 제공하기 위한 방법들에 대한 수요가 여전히 존재하였다.
본 출원에서 제시된 연구들은 공동-자극기 분자들 및 수지상 세포 처리 부위 모두가 세포 조성물의 효능에 현저히 영향을 줄 수 있음을 처음으로 증명한다. 특히, 공동-자극기, 가령, 제1형 인터페론 (예컨대, INFα), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제, 또는 AIMp1과 함께 수지상 세포들의 투여는 감작된 수지상 세포 조성물들에 의해 제공되는 T-세포 반응을 현저히 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 향상된 T-세포 반응들은 TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여되는 감작된 수지상 세포들을 이용하여 구현될 수 있다. 더욱이, 수지상 세포의 처리 부위는 T-세포 자극의 유효성을 상당히 달라지게 함이 밝혀졌다. 특히, 임의의 특정한 작용 메커니즘 이론에 제한하고자 하는 것은 아니지만, 수지상 세포는 바람직하게는 표적된 질환 조직 (예컨대, 종양)에 근접한 부위에 있는 T-세포에 노출되어야 하는 것으로 생각된다. 따라서, 일부 바람직한 양상들에서, 수지상 세포 조성물은 질환있는 세포 집단, 가령, 종양 부위를 배출시키는 림프 조직으로 직접 도입시켜 피험체에 투여된다. 그러므로 공동-자극기 분자들의 사용 및 질환 조직에 근접한 부위에 감작된 수지상 세포의 투여를 조합함으로써 극히 강력한 면역 반응이 유도될 수 있다.
II. 구체예들의 수지상 세포 집단
수지상 세포들을 단리, 배양 및 감작시키는 방법들은 해당 분야에 널리 공지이다. 예를 들면, 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 8,728,806은, 항원 감작된 수지상 세포를 제공하는 상세한 방법들을 제공하는데, 이러한 세포는 상기 구체예들의 조성물 및 방법들에서 사용될 수 있다. 특정 양상들에서, 상기 구체예들에 따라 사용하기 위한 수지상 세포는 상기 구체예의 방법으로 처리될 피험체로부터 단리된다. 다른 양상들에서, 수지상 세포는 상이한 피험체, 가령, HLA-일치된 공여자의 것일 수 있다. 특정 양상들에서, 수지상 세포는 정의된 HLA 형결정을 보유한 수지상 세포들의 은행으로부터 온 것이다. 바람직한 양상들에서, 상기 구체예들에 따라 사용하기 위한 감작된 수지상 세포는 본 출원에 그리고 미국 특허 제 8,728,806호에 상세히 기질된 항원으로 동종-부하된다.
혈액 및 골수를 비롯한 다양한 공급원들로부터 온 미성숙 수지상 세포 및 수지상 세포 전구물질이 풍부한 세포 집단을 단리시키는 방법들은 해당 분야에 공지이다. 예를 들면, 수지상 세포 전구물질 및 미성숙 수지상 세포들은 헤파린첨가 혈액을 수집함으로써, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해, 백혈구 연층 제조, 로제팅 (rosetting), 원심분리, 밀도 구배 원심분리 (예컨대, Ficoll (가령, FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (비-투석성 폴리피롤리돈(PVP)으로 코팅된 콜로이드 실리카 입자들 (15-30 mm 직경)), 수크로스 등을 사용), 세포들의 시차 용해, 여과 등에 의해 단리될 수 있다. 특정 구체예들에서, 백혈구 집단은 가령, 예를 들면, 피험체로부터 혈액을 수집하고, 탈피브린화시켜 혈소판을 제거하고 적혈구 세포들을 용해시켜 제조될 수 있다. 수지상 세포 전구물질 및 미성숙 수지상 세포들은 선택적으로, 예를 들면, PERCOLL® 구배를 통한 원심분리를 통해 단핵구 수지상 세포 전구물질을 풍부하게 할 수 있다. 다른 양상들에서, 수지상 세포 전구물질은 G-CSF 동원 말초 혈액의 CD14 선택을 사용하여 선택될 수 있다.
수지상 세포 전구물질 및 미성숙 수지상 세포들은 선택적으로, 차단된 무균 시스템에서 제조될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 “차단된 무균 시스템” 또는 “차단된 시스템"은 비-멸균의, 주변의, 또는 순환하는 대기 또는 다른 비-멸균 조건들에 대한 노출이 최소화 또는 제거되어 있는 시스템을 의미한다. 수지상 세포 전구물질 및 미성숙 수지상 세포들을 단리시키기 위한 차단 시스템은 일반적으로 상부 개방 시험관에서의 밀도 구배 원심분리, 개방된 대기 중에서 세포들의 전달, 조직 배양 플레이트 또는 밀폐되지 않은 플라스크 등에서 세포들의 배양을 배제시킨다. 한 전형적인 구체예에서, 차단된 시스템은 수지상 세포 전구물질 및 미성숙 수지상 세포들을 초기 수집 용기로부터 밀봉가능한 조직 배양 용기로 비-멸균 대기에 노출시키지 않고 무균 전달 가능하게 한다.
특정 구체예들에서, 단핵구 수지상 세포 전구물질은 단핵구-결합 기질에 부착함으로써 단리된다. 예를 들면, (예컨대, 백혈구성분채집술로 단리된) 백혈구들의 집단은 단핵구 수지상 세포 전구물질 부착 기질과 접촉될 수 있다. 이러한 백혈구들의 집단이 기질과 접촉될 때, 백혈구 집단 내 단핵구 수지상 세포 전구물질은 우선적으로 기질에 부착한다. 다른 백혈구들 (다른 가능한 수지상 세포 전구물질 포함)은 기질에 대한 감소된 결합 친화도를 보이므로, 단핵구 수지상 세포 전구물질은 기질 표면에 우선적으로 풍부해지도록 한다.
적합한 기질에는, 예를 들면, 큰 표면적 대 부피 비율을 보유하는 기질들이 포함된다. 이러한 기질들은 예를 들면, 미립자 또는 섬유 기질일 수 있다. 적합한 미립자 기질들에는, 예를 들면, 유리 입자, 플라스틱 입자, 유리-코팅된 플라스틱 입자, 유리-코팅된 폴리스티렌 입자, 및 단백질 흡수에 적합한 다른 비드가 포함된다. 적합한 섬유 기질들은, 마이크로모세 시험관(microcapillary tubes) 및 미세융모막을 포함한다. 미립자 또는 섬유 기질은 통상적으로 부착된 세포들의 생존력을 실질적으로 감소시키지 않고 부착된 단핵구 수지상 세포 전구물질이 용리되게 한다. 미립자 또는 섬유 기질은 기질로부터 단핵구 수지상 세포 전구물질 또는 수지상 세포의 용리를 용이하게 하기 위하여 실질적으로 비-다공성일 수 있다. “실질적으로 비-다공성” 기질은 기질에 존재하는 적어도 다수의 공극들이 세포들 보다 작아서 기질내 포획되는 세포들이 최소화되는 기질이다.
단핵구 수지상 세포 전구물질의 기질에 대한 부착은 결합 배지의 부가에 의해 선택적으로 향상될 수 있다. 적합한 결합 배지에는, 예를 들면, 사이토킨 (예컨대, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨 4 (IL-4), 또는 인터루킨 13 (IL-13)), 혈장, 혈청 (예컨대, 사람 혈청, 가령, 자가 또는 동종 혈청), 정제된 단백질, 가령, 혈청 알부민, 2가 양이온 (예컨대, 칼슘 및/또는 마그네슘 이온) 및 단핵구 수지상 세포 전구물질의 기질에 대한 특이적 부착에 도움을 주는, 또는 비-단핵구 수지상 세포 전구물질의 기질에 대한 부착을 방해하는 다른 분자들로 개별적으로 또는 임의로 조합하여 보충된 단핵구 수지상 세포 전구물질 배양 배지 (예컨대, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® 등)가 포함된다. 특정 구체예들에서, 혈장 또는 혈청은 열-불활성화 될 수 있다. 열-불활성화 혈장은 백혈구에 대해 자가유래 또는 이종일 수 있다.
단핵구 수지상 세포 전구물질이 기질에 부착 후, 비-부착 백혈구들은 단핵구 수지상 세포 전구물질/기질 복합체들로부터 분리된다. 비-부착 세포들을 복합체들로부터 분리하기에 적합한 임의의 수단들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비-부착 백혈구들과 복합체들의 혼합물이 가라앉도록 두고, 비-부착 백혈구와 배지를 따라내거나 배출시킬 수 있다. 대안적으로, 이러한 혼합물을 원심분리하고 비-부착 백혈구를 내포하는 상청액을 펠릿화된 복합체들로부터 따라내거나 배출시킬 수 있다.
단리된 수지상 세포 전구물질은 분화, 성숙 및/또는 확대를 위해 생체외 배양될 수 있다. (본 출원에서 사용되는, 단리된 미성숙 수지상 세포, 수지상 세포 전구물질, T 세포들, 및 다른 세포들은 인공적으로 그 고유 환경으로부터 격리되어 존재하게 되어 자연의 생성물이 아닌 세포들을 의미한다. 단리된 세포들은 정제 형태로, 반-정제 형태로, 또는 비-고유 환경에 존재할 수 있다.) 요약하자면, 생체외 분화는 전형적으로 수지상 세포 전구물질, 또는 수지상 세포 전구물질을 보유하는 세포들의 집단을, 하나 또는 그 이상의 분화제의 존재하에 배양하는 것을 포함한다. 적합한 분화제는, 예를 들면, 세포 성장 인자들 (예컨대, 사이토킨 가령, (GM-CSF), 인터루킨 4 (IL-4), 인터루킨 13 (IL-13), 및/또는 이의 조합) 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 단핵구 수지상 세포 전구물질들은 분화되어 단핵구-유래 미성숙 수지상 세포들을 형성한다.
수지상 세포 전구물질은 적합한 배양 조건에서 배양되어 분화될 수 있다. 적합한 조직 배양 배지는 AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, 등을 포함한다. 조직 배양 배지는 세포들의 분화를 촉진시키기 위하여 혈청, 아미노산, 비타민, 사이토킨, 가령, GM-CSF 및/또는 IL-4, 2가 양이온 등으로 보충될 수 있다. 특정 구체예들에서, 수지상 세포 전구물질은 무-혈청 배지에서 배양될 수 있다. 이러한 배양 조건들은 선택적으로 임의의 동물-유래 생성물들을 제외시킬 수 있다. 전형적인 수지상 세포 배양 배지에서 전형적인 사이토킨 조합은 각각 GM-CSF (50 ng/ml) 및 IL-4 (10 ng/ml)인 약 500 유닛/ml이다. 미성숙 수지상 세포를 형성하기 위해 분화될 때 수지상 세포 전구물질은 피부 랑게르한스 세포들과 표현형적으로 유사하다. 미성숙 수지상 세포는 전형적으로 CD14 및 CD11c+이고, 낮은 수준의 CD86 및 CD83을 발현시키며, 특화된 내포작용을 통해 용해성 항원을 포획할 수 있다. 미성숙 DC는 매우 높은 수준의 CD86을 발현시켰다. 또한, 상기 집단은 CD14 및 CD11C과 관련하여 혼합되었다. 대다수가 CD11c+였으나, CD11c 및 CD 14+였던 구별되는 하위 집단이 존재하였다.
미성숙 수지상 세포는 성숙되어 성숙 수지상 세포를 형성한다. 성숙 DC는 항원을 수용하는 능력을 상실하고 공동자극성 세포 표면 분자들 및 다양한 사이토킨의 상향-조절된 발현을 나타낸다. 구체적으로, 성숙 DC는 미성숙 수지상 세포보다 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 II 항원들을 발현시키고, 성숙 수지상 세포는 일반적으로 CD80+, CD83+, CD86+, 및 CD14인 것으로 식별된다. 보다 많은 MHC 발현은 DC 표면 상에서의 항원 밀도 증가를 초래하는 반면, 공동자극성 분자들 CD80 및 CD86의 상향 조절은 공동자극성 분자들의 대응부들, 가령, T 세포 상의 CD28을 통한 T 세포 활성화 신호를 강화시킨다.
본 발명의 성숙 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포를 유효량 또는 유효 농도의 핵산 조성물 및 종양 항원 조성물과 접촉시킴으로써 제조(즉, 성숙) 될 수 있다. 유효량의 핵산 조성물은 전형적으로 배양접시 당 또는 세포 당 최대, 적어도, 또는 약 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 내지 10, 15, 20, 50, 100 ng 또는 mg의 핵산 범위이며, 상기 범위 사이의 모든 값들 및 범위들을 포함한다. 유효량의 종양 항원 조성물은 전형적으로 배양접시 당 또는 세포 당 최대, 적어도, 또는 약 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 내지 10, 15, 20, 50, 100 ng 또는 mg의 단백질 범위이다. 특정 양상들에서 0.001 ng의 종양 항원/세포 내지 1 μg의 종양 항원/백만개 세포)가 사용될 수 있다. 상기 종양 항원 조성물은 수지상 세포들과 접촉하기 이전에 선택적으로 열 불활성화되거나 처리 (예컨대, 프로테아제에 노출)될 수 있다. 미성숙 수지상 세포를 핵산 조성물 및 종양 항원 조성물로 성숙시키는 것은 성숙 수지상 세포를 1형 (Th-1) 반응에 대해 감작시킨다.
미성숙 Dc는 전형적으로 유효량의 핵산 조성물 및 종양 항원 조성물과 최대, 적어도, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24분, 시간 또는 일 동안 접촉된다. 미성숙 수지상 세포는 적합한 성숙 배양 조건들에서 배양되고 성숙될 수 있다. 적합한 조직 배양 배지는 AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, 등을 포함한다. 조직 배양 배지는 세포들의 성숙을 촉진시키기 위하여 아미노산, 비타민, 사이토킨, 가령, GM-CSF 및/또는 IL-4, 2가 양이온, 등으로 보충될 수 있다.
수지상 세포들의 성숙은 해당 분야에 공지된 방법으로 모니터 될 수 있다. 세포 표면 표지자는 해당 분야에 잘 알려진 분석법, 가령, 유세포분석, 면역조직화학 등으로 검출될 수 있다. 세포들은 또한 사이토킨 생성에 관해 모니터될 수 있다 (예컨대, ELISA, FACS, 또는 다른 면역 분석법에 의함). 항원으로 감작된 또는 감작되지 않은, 수지상 세포 전구물질, 미성숙 수지상 세포, 및 성숙 수지상 세포는, 추후 사용을 위해 동결보존 될 수 있다. 동결보존 방법들은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,788,963호는 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
A. 유전적으로 변형된 수지상 세포
구체예들 중 특정 양상들은 유전적으로 변형되어 있는 수지상 세포들을 고려한다. 일부 양상들에서, 유전적 변형은 세포 내 외인성 전이유전자, 가령, 억제성 핵산의 도입을 포함한다. 또다른 양상들에서, 전이유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있는 자살 유전자, 가령, 티미딘 키나아제를 인코딩하는 유전자일 수 있다. 그러므로 일부 양상들에서, 면역 반응을 자극 후, 투여되는 수지상 세포는 자살 유전자의 발현을 제어하는 프로모터의 유도에 의해 전멸될 수 있다.
또다른 양상들에서, 유전적 변형은 세포 집단 내 유전체 결실 또는 삽입을 포함한다. 예를 들면, 수지상 세포가 치료될 피험체에 효과적으로 HLA 일치되도록, 하나 이상의 HLA 유전자는 파괴될 수 있다.
구체예들 중 또다른 양상들은 가령, CTLA-4의 발현을 감소시키기 위해 유전적으로 변형되어 있는 수지상 세포를 고려한다. 일부 양상들에서, 유전적 변형은 CTLA-4에 특이적인 외인성 억제성 핵산의 도입을 포함한다. 특정 양상들에서, 억제성 핵산은 RNA, 가령, 수지상 세포 내 DNA 벡터로부터 발현된 RNA이다. 또다른 양상들에서, 억제성 핵산은 수지상 세포 내 도입되는 siRNAs, dsRNA, miRNA 또는 shRNA 일 수 있다. 이러한 RNA에 관한 상세한 내용은 하기 제공된다.
또다른 양상들에서, 유전적 변형은 CTLA-4를 감소시키는 세포 집단 내 유전체 결실 또는 삽입을 포함한다. 다른 양상들에서, 수지상 세포는 CTLA-4 유전자 내부에 반접합성 또는 동형접합성 결실을 포함한다. 예를 들면, 일부 양상들에서, 수지상 세포의 CTLA-4 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 완전히 또는 부분적으로 결실되어, CTLA-4 폴리펩티드의 발현이 억제될 수 있다. 일부 양상들에서, 하나 이상의 CTLA-4 유전자를 발현시키지 않도록 하는 세포들의 변형은 CTLA-4 좌위를 특이적으로 표적하는 인공 뉴클레아제를 세포 내부로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 양상들에서, 인공 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9일 수 있다. 다양한 양상들에서, 인공 뉴클레아제를 세포 내부로 도입하는 것은 세포 내부로 인공 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
III. 조합 치료법
상기 구체예들의 수지상 세포 치료법들의 유효성을 증가시키기 위하여, 이들 조성물들과 관심 질환의 치료에 효과적인 다른 제제들을 조합하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양상들에서, 수지상 세포 치료법은 분자들, 가령, TLR 효능제, 제1형 인터페론 (INF), AIMp1, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께 투여된다. TLR 효능제는 TLR3, TLR7, TLR8 또는 TLR9 효능제 일 수 있다. 제1형 INF는 INF-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 또는 IFN-ω 일 수 있다. 예를 들면, TLR-7 효능제는 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, 폴리(dT), 이미퀴모드, 가디퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 록소리빈, 및 ssRNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 예시적인 TLR-9 효능제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)를 포함한다. 다른 TLR 효능제는, 예를 들면, 미국 공개 특허 출원 제 2014/0005255호에 기재되어 있으며; 이는 참고문헌으로 본 출원에 포함된다.
해당 분야에 공지된 RIG-I-유사 수용체 (RLR) 리간드는 RIG-I, Mda5, 및 LGP2 신호전달의 활성화제를 의미한다. 이들 리간드는 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA, 및 5′-트리포스페이트 RNA를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. RIG-I-유사 수용체 리간드는 또한 RNA 분자에 도입되는 임의의 변형을 의미하는데, 이는 RIG-I, Mda5, 및 LGP2를 결합 및 활성화시켜 RLR-유사 생물학적 활성을 초래할 수 있다. 일부 양상들에서, RLR 리간드는 통상의 어댑터 단백질, 가령, MAVS, VISA 또는 CARDIF로도 공지된 IPS-1의 조절인자일 수 있다. 예를 들면, RIG-1-유사 수용체 리간드는 MDA5 리간드, LGP2 리간드, ssRNA, dsRNA, 5'ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 및 폴리(I:C)로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 양상들에서, 감작된 수지상 세포 집단은 CDS 수용체 리간드와 함께 투여된다. 일부 양상들에서, CDS 수용체 리간드는 또한 cGAS-STING 리간드로서 정의된다. 예를 들면, cGAS-STING 리간드는 세균성 사이클릭-디뉴클레오티드 (CDN)이다. 다른 cGAS-STING 효능제, 가령, 핵산, 단백질, 펩티드, 또는 소형 분자는 예를 들면 국제 공개 특허 출원 제 WO2015/077354호에 기재되어 있다.
비-제한적 예로서, 암의 치료는 다른 항암제와 함께 본 발명의 구체예들의 감작된 수지상 세포 조성물을 이용하여 실시될 수 있다. “항암”제는 예를 들면, 암세포를 사멸, 암세포에서의 세포사멸 유도, 암세포의 성장 속도 감소, 전이 발생율 또는 전이수 감소, 종양 크기 감소, 종양 성장 감소, 종양 또는 암세포에 대한 혈액 공급 감소, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응 촉진, 암 진행 방지 또는 억제, 또는 암을 보유한 피험체의 수명 증가에 의하여, 피험체의 암에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 더욱 일반적으로, 이러한 다른 조성물들은 세포의 증식을 사멸 또는 억제하는데 유효한 조합량으로 제공될 것이다. 이 과정은 항암 펩티드 또는 나노입자 복합체 및 상기 제제(들) 또는 다수의 인자(들)과 세포들을 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는, 동시에, 단일 조성물 또는 두 가지 제제들 모두를 포함하는 약리학적 제재와 세포를 접촉시킴으로써, 또는 하나의 조성물이 수지상 세포 조성물을 포함하고 다른 조성물은 제 2의 제제(들)을 포함하는 두 가지 별개의 조성물 또는 제재와 세포를 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다.
수지상 세포 조성물을 이용한 치료는 수 분 내지 수 주 범위의 간격으로 다른 제제 치료에 선행하거나 후속할 수 있다. 다른 제제 및 수지상 세포 조성물이 피험체에 별도로 처리되는 구체예들에서, 상기 제제 및 수지상 세포 조성물이 여전히 세포에 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각각의 전달 시간 간에 상당한 기간의 시간이 경과되지 않도록 하는 것이 일반적이다. 이러한 경우에, 세포를 상기 두 가지와 서로 약 12-24 시간 이내 그리고, 더욱 바람직하게는, 서로 약 6-12 시간 이내에 접촉시킬 수 있는 것으로 생각된다. 일부 상황들에서, 각각의 투여간에 수 일 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수 주 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하도록 치료 시기를 상당히 연장시키는 것이 바람직 할 수 있다.
다음과 같은 다양한 조합들이 사용될 수 있는데, 여기서 수지상 세포 치료제는 “A”이고 제 2 제제, 가령, 방사선치료, 화학치료 또는 항염제는 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
특정 구체예들에서, 본 발명의 구체예의 수지상 세포 치료제의 환자에 대한 투여는, 존재한다면, 벡터의 독성을 고려한, 화학치료제의 투여에 관한 일반적 프로토콜을 수반할 것이다. 치료 주기는 필요한 만큼 반복될 것으로 예상된다. 또한 상기 기재된 과대증식성 세포 치료와 조합하여 다양한 표준 치료들, 뿐만 아니라 외과적 시술이 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
A. 화학치료
암 치료는 또한 다양한 조합 치료를 포함한다. 일부 양상들에서 상기 구체예들의 수지상 세포 조성물은 화학치료제와 함께 투여된다 (또는 제재화된다). 예를 들면, 일부 양상들에서 화학치료제는 단백질 키나아제 억제제, 가령, EGFR, VEGFR, AKT, Erb1, Erb2, ErbB, Syk, Bcr-Abl, JAK, Src, GSK-3, PI3K, Ras, Raf, MAPK, MAPKK, mTOR, c-Kit, eph 수용체 또는 BRAF 억제제이다. 단백질 키나아제 억제제의 비제한적 예들에는, 아파티닙, 악시티닙, 베바시주맙, 보수티닙, 세툭시맙, 크리조티닙, 다사티닙, 에를로티닙, 포스타마티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 무브리티닙, 닐로티닙, 파니투무맙, 파조파닙, 페갑타닙, 라니비주맙, 룩솔리티닙, 사라카티닙, 소라페닙, 수니티닙, 트라스투주맙, 반데타닙, AP23451, 베무라페닙, MK-2206, GSK690693, A-443654, VQD-002, 밀테포신, 페리포신, CAL101, PX-866, LY294002, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, 알보시딥, 게니스테인, 셀루메티닙, AZD-6244, 바탈라닙, P1446A-05, AG-024322, ZD1839, P276-00, GW572016 또는 이의 혼합물이 포함된다.
또한 추가적인 조합 치료제들에는, 예를 들면, 알킬화제, 가령, 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 가령, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 가령, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타신온); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 가령, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로소우레아, 가령, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 가령, 에네다인 항생제 (예컨대, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마 II 및 칼리키아미신 오메가 II; 다이네미신 A를 포함한 다이네미신; 비스포스포네이트, 가령, 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네다인 항생 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-파이롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 가령, 미토마이신 C, 마이코페놀릭 애시드, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사제, 가령, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 가령, 데노프테린, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 가령, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 가령, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 가령, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 가령, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 가령, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 가령, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아조닉 애시드; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신, 다카르바진, 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 배위 착물, 가령, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예컨대, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴 (DMFO); 레티노이드, 가령, 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라틴, 및 상기 임의의 제약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 제공된 조성물들은 게피티닙과 조합하여 사용될 수 있다. 다른 구체예들에서, 본 발명의 구체예들은 글리벡과 조합하여 실시될 수 있다 (예컨대, 약 400 내지 약 800 mg/일의 글리벡이 환자에게 투여될 수 있다). 특정 구체예들에서, 하나 이상의 화학치료제가 본 출원에 제공된 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.
B. 방사선치료
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어왔던 다른 인자들은 γ-선, X-선으로 통상적으로 공지된 것들, 및/또는 종양 세포에 대한 방사성동위원소의 직접 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자들, 가령, 마이크로파 및 UV-조사 또한 고려된다. 이러한 인자들 모두 DNA에, DNA의 전구물질에, DNA의 복제 및 복원에, 그리고 염색체의 어셈블리 및 유지에 광범위한 손상을 줄 가능성이 크다. X-선 조사량은 장기간의 시기 (3 내지 4주) 동안 일일 50 내지 200 뢴트겐 조사량 내지 1회 2000 내지 6000 뢴트겐 조사량 범위이다. 방사성동위원소에 관한 투여량 범위는 광범위하게 달라질 수 있으며 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포들에 의한 흡수에 따라 달라진다.
세포에 대해 사용될 때 용어 “접촉된” 및 “노출된"은 치료 조성물 및 화학치료제 또는 방사선치료제를 표적 세포에 전달하는 또는 표적 세포와의 근접위치에 직접 넣는 과정을 설명하기 위하여 본 출원에서 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 구현하기 위하여, 두 가지 제제들 모두가 세포를 사멸 또는 세포 분열을 방지하기에 효과적인 조합량으로 세포에 전달된다.
C. 유전자 치료
또한 또다른 구체예에서, 2차 치료는 치료적 폴리뉴클레오티드가 치료 조성물 이전, 이후 또는 치료 조성물과 동시에 투여되는 유전자 치료이다. 유전자 생성물의 발현을 위한 바이러스 벡터들은 해당 분야에 널리 공지이며, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 우두증 바이러스를 포함하는 폭스바이러스, 및 SV40을 포함하는 파필로마 바이러스와 같은 진핵 발현 시스템을 포함한다. 대안적으로, 발현 작제물들의 투여는 지질계 벡터들, 가령, 리포좀 또는 DOTAP: 콜레스테롤 수포를 이용하여 구현될 수 있다. 이들 방법들 모두는 해당 분야에 널리 공지이다 (예컨대 Sambrook 외, 1989; Ausubel 외, 1998; Ausubel, 1996 참고).
D. 수술
암을 보유한 사람들 중 대략 60%는 일부 유형의 수술을 받게 될 것이며, 이러한 수술은 예방, 진단 또는 병기결정, 치유 및 완화 수술을 포함한다. 치유 수술은 다른 치료, 가령, 본 출원에 제공된 치료들, 화학치료, 방사선치료, 호르몬 치료, 유전자 치료, 면역요법 및/또는 대체 치료와 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 의미한다. 종양 절제 이외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 미스코피컬 제어된 (miscopically controlled) 수술 (Mohs' surgery, 모스 수술)을 포함한다. 본 발명의 구체예들은 표재 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있는 것으로 또한 생각된다. 일부 양상들에서, 종양 절제 후 상기 구체예들의 수지상 세포 조성물은 이전 종양 부위를 배출시켰던 림프 조직에 투여된다.
IV. 실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 증명하기 위하여 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술들은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술들을 나타내므로, 그 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 자명하다. 그러나 해당 분야의 숙련된 기술자는, 본 출원의 개시내용에 비추어, 개시된 특정 구체예들에 많은 변화들을 줄 수 있으며 여전히 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 가능성 있는 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1 - 재료 및 방법
하기 실시예에서 사용되는, 8-내지-12주령의 C57BL/6, Balb/c, 및 FVB 마우스는 할란 연구소 (Harlan Laboratories, 인디애나 주, 인디애나폴리스) 또는 잭슨 연구소 (Jackson Laboratory, 메인 주, 하르 하버)로부터 얻었다. C57BL/6 바탕의 H2-DM 녹아웃 마우스는 채플 힐에 있는 노쓰 캐롤라이나 대학의 Jenny Ting 박사의 선물이었다. 기재되어 있는 바와 같이 (Carstens 외, 2014), 텍사스 주 휴스톤의 베일러 의과 대학의 David Spencer 박사의 연구실에서 FVB 바탕의 Pro-Cat/JOCK1 유전자삽입 마우스를 생성하였다. 모든 마우스들을 베일러 의과대학의 특정 IACUC 요건에 따라 유지시켰다.
백신 재료의 준비, DC의 부하, 및 시험관내 공배양 -정낭 (SV) 및 전립선을 10주령의 수컷 마우스로부터 수집하고 즉시 -80℃에서 동결시켰다. RAW264.7, B16-F10, 4T1, 및 WPMY-1 세포주들을 미국 미생물 자원 센터 (ATCC, 버지니아 주, 마나사스)로부터 얻어, 37℃, 5% CO2의 T225 플라스크 (Corning Lifesciences, 메사츄세츠 주, 턱스베리)에서 성장시켜 융합시키고, 수집하였으며 또한 -80℃에서 즉시 동결시켰다. 펩티드들을 10mg/ml의 80:20 dH2O:DMSO 용액에서 재구성하여 -80 ℃에서 보관하였다. MHC 클래스 I (mRNA) 또는 II (용해물) 결정인자들을 생성하기 위하여, 조직 분획들을 먼저 Polytron PT1200E 조직 균질기 (Kinematica, Inc, 뉴욕주, 보헤미아)를 사용하여 파괴하였다. 세포 용해물을 생성하기 위하여, 균질화된 조직 현탁액들은 PBS (Life Technologies, 캘리포니아 주, 칼스바드)에서 50 mg/ml로 희석되고 동결-해동 주기를 반복하여, -20℃에서 보관되었다. mRNA를 생성하기 위하여, 제조업자의 지시사항에 따라 Trizol 시약 (Life Technologies, 캘리포니아주, 칼스바드)을 사용하여 전체 RNA를 균질화된 조직으로부터 단리하였으며, 또한 제조업자의 지시사항에 따라 mRNA를 Oligotex mRNA 맥시 키트 (Qiagen, 캘리포니아주, 발렌시아)를 사용하여 전체 RNA로부터 단리시켰다. mRNA를 Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific)를 사용하여 정량하였으며, 통합성을 겔 전기영동으로 확인하였다. 기재된 바와 같이 사람 (Decker 외, 2006; Decker 외, 2009) 및 야생형 마우스 (Konduri 외, 2013) 수지상 세포들을 제조하고 부하시키고 성숙시켰다. siRNA의 사용은 제조업자의 지시에 따라 수행되었다 (Thermo Scientific - Dharmacon). H2-DM-/- DC의 성숙 칵테일을 1 μg/ml CpG-ODN (InvivoGen)으로 추가 보충하였다. 앞서 기재한 바와 같이 시험관내 공-배양을 수행하였다 (Decker 외, 2006; Decker 외, 2009; Konduri 외, 2013).
백신접종 - 치료적으로 백신접종된 모든 마우스들에게 5 x 104 - 5 x 105 DC i.p. 및 20% DMSO/80% AIM-V에 현탁되었으나 용해되지 않은 0.5 mg 이미퀴모드 (LC Labs, 메사츄세츠주, 워번), 이 또한 i.p로 투여하였다. 마우스들을 도 12에 도시된 바와 같이 1 내지 4회 백신접종하였다. 상이한 백신 치료들은 mRNA로 부하된 DC, 용해물로 부하된 DC, 동종 또는 이종 mRNA 및 용해물로 동시에 부하된 DC, 동종 mRNA 및 용해물 및 AIMp1 siRNA로 부하된 DC, 그리고 부하되지 않은 DC를 포함하였다. 다회의 백신접종을 10일 간격으로 하였다. SIINFEKL (서열 번호: 1)/Ova 부하된 DC로 백신접종된 마우스들의 발바닥에 백신접종하였으며 이미퀴모드는 투여받지 않았다.
조직학적 및 육안 분석 - Olympus CX41 현미경 (Olympus corporation, 펜실베니아 주, 센터 밸리)을 사용하는 광학 현미경과 Olympus DP70 디지털 카메라 (Olympus Corporation)에 의한 육안 조직학적 분석을 위해 파라핀 절편들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 전립선 암의 맹검 병리조직학적 점수는 상이한 깊이의 두 개 절편들에서 관찰된 모든 전방, 배쪽, 및 후외방 부위 중에 존재하는 질환의 두드러진 병기에 기초하여 4-점 등급으로 구성되었다: 0 = 정상, 1 = 과다형성, 2 = PIN, 3 =선암종, 4 = 이행. 두드러진 병기가 구별될 수 없는 경우 절반 점수가 허용되었다.
MRI 분석 - 35 mm 부피의 공명기를 구비한 9.4T, 21 cm 보어 수평 스캐너 (Bruker BioSpin, 메사추세츠 주, 빌러리카)를 사용하여 전립선 및 정낭의 MRI를 수행하였다. 3차원 (3D) 터보 이완 증강 급속 획득 (rapid acquisition with relaxation enhancement, RARE) 이미지를 얻기 위해 사용된 이미지 변수들은 다음과 같았다: TR = 3000 ms;　유효 TE = 30 ms; FOV = 30 mm3; 매트릭스 = 128 x 128 x 128; RARE 계수 = 8; 평균의 수 = 1. Paravision 소프트웨어 버전 5 (Bruker BioSpin)를 사용하여 이미지들을 얻었다. 이미지처리하는 동안, 마우스들을 산소와 함께 혼합된 0.25% 이소플루란 (Abbott, 일리노이 주, 애봇 파크)으로 안락사시키고 코어 온도를 37 ℃로 유지하였다. Amira 3.1 소프트웨어 (Visage Imaging, 캘리포니아 주, 샌 디에고)를 사용하여 MRI 이미지들을 분석하였다.
CTLA -4/ sCTLA -4 RT- PCR 분석 - 부하되고, 성숙된 DC를 1mL 트리졸 (Life Technologies)에서 샘플 당 < 1 x 107개 세포로 재현탁시키고, 제조업자의 지시에 따라 전체 RNA를 추출하였다. RNA를 1 μg/μl DNase I (Invitrogen)으로 처리하였다. DNase-처리된 RNA 샘플로부터 SuperScriptTM　III First-Strand 합성 키트 (Life Technologies)를 사용하여 cDNA를 합성하고 CTLA-4 정방향 프라이머와 함께 55℃의 어닐링 온도에서 35 주기동안 PCR로 증폭시켰다: ATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGC (서열 번호: 12) 및 CTLA-4 역방향 프라이머: TCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (서열 번호: 13). 프라이머들은 용해성인 그리고 막-결합된 CTLA-4 아형들 모두에 대응하는 전사체를 증폭시키기 위하여 설계되었다.
웨스턴 블롯 이미지의 정량 - Image Lab 소프트웨어 버전 2.0.1 (Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아 주, 허큘리스)로 가동되는 ChemiDoc XRS 디지털 이미징 시스템을 사용하여 웨스턴 블롯 화학발광 신호를 검출하였다. 모든 웨스턴 블롯들을 Ponceau S (Sigma-Aldrich) 염색 막들의 밀도측정으로 정량하였다. 세포 사멸로부터 생긴 잔부 세포 용해물 또는 조직파편으로 인한 상청액들의 오염은 항-b-작용 (Santa Cruz)을 이용한 면역염색 및 추가 밀도측정에 의해 제어되었다. 밀도측정은 ImageJ 소프트웨어 (NIH; 메릴랜드 주, 베데스다)를 사용하여 수행되었다. 단일 막에서 sCTLA-4 및 AIMp1 모두 검출하기 위해, 막은 전형적으로 항-CTLA-4로 먼저 프로브시키고, 그 후 제조업자의 지시에 따라 웨스턴 블롯 복원 완충액 (Western Blot Restore buffer) (Pierce, 일리노이주, 록포드)에서 스트리핑하였으며, 항-AIMp1으로 재-프로브하였다.
Pro - Cat / JOCK1 전립선 암 치료 모델 - Pro-Cat/JOCK1 마우스를 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 무-병원체 시설에 수용시켰다. 기재된 바와 같이 (Carstens 외, 2014) 이중 유전자삽입 마우스를 생성하고 유전형을 분석하였다. 마우스들을 6주령에서 시작하여 격주로 100 ml AP20187 (Ariad Pharmaceuticals)을 2 mg/약물 희석액 kg (16.7% 프로판디올, 22.5% PEG400, 1.25% TWEEN 80)으로 i.p. 주사하여 치료하였다. 마우스들은 5 x 104 - 4 x 105 부하된 DC + 100 ml 20% DMSO에서의 0.5 mg 미립자 이미퀴모드 (LC LABS) 또는 0.5 mg 이미퀴모드만으로 주사하면서 AP20187 치료 24주 후 하부 비뇨생식기 영역에 i.p. 백신접종되었다. 마우스들은 백신 + 이미퀴모드 주사를 10일 간격으로 4회 투여받았다.. AP20187 주사는 사망시까지 격주로 유지시켰다.
자발성 개 희소돌기아교세포종 치료 모델 - 임상 MR 이미지로 CNS 악성 진단시, 대형 (> 25 kg) 개 환자들을 미국 응용유전체학 연구소에 의해 확립된 IACUC 프로토콜하에 소유주의 고지 동의 후 비-무작위 I 상 시험에 참여시켰다. 개 환자들은 머리뼈절개 및 보존적 종양 절제를 받았으며 그 후 절제된 종양을 액체 질소에 급속 냉동시켰다. 백신 항원을 준비하기 위하여, 해동된 종양 표본을 용해성 용해물 및 mRNA 성분들로 세분하고, 항원 분획들을 상기와 같이 준비하였다. 후속적으로, 환자들을 G-CSF (Neupogen, Amgen, 캘리포니아 주, 사우전드 오크)로 동원시켰으며 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC)을 수집하였다. 개 DC는 10% 개 혈청 (Equitech Bio), 1% 항-항 (Life Technologies), 30 ng/ml rcGM-CSF 및 10 ng/ml rcIL-4 (두 가지 모두 R&D Systems)로 보충된 AIM-V 배지에서 6일간 배양하여 인접 단핵구 분획으로부터 생성되었다. 상기 기재한 바와 같이 종양 항원들로 부하 후, 부하된 DC를 10 ng/ml rcIL-1b, 15 ng/ml rcIL-6, 10 ng/ml rcTNF-a (모두 R&D Systems) 및 1 mg/ml PGE2 (Sigma-Aldrich)로 추가 보충된 상기와 동일한 배양 배지를 사용하여 성숙시켰다. 그 후 DC를 수집하고 초음파 촬영에 의해 심부 경부 림프절 부근에 양측 주사하기 위하여 2 x 500 ml 분취량 PBS에 재현탁시켰다. 다회 투여로 투여될 경우, 주사는 2주 간격을 두었다. 치료 과정 중, 동물들은 주 3회 사람 IFN-a를 용량 당 2백만 내지 8백만 유닛으로 피하 투여하여 보충되었다. 디지털 MRI 측정치들로부터 다음 식에 따라 종양 부피를 결정하였다: 부피 = 4/3p(최소 반경)2 x (최대 반경/최소 반경).
통계적 분석 - 통계적 유의도는 p < 0.05 (* = p < 0.05, ** = p < 0.01)로 정의되었으며 통계적으로 적절하게 한쪽 또는 양쪽 꼬리의 스튜던트 독립표본 또는 대응표본 t-검정으로 결정되었다. 복수 그룹들 간의 통계적 편차는 일원 또는 이원 ANOVA에 의해 입증되었다. Macintosh 버전 12.0의 Microsoft 엑셀 2008을 사용하여 통계적 테스트를 수행하였다. 정규화된 정량 그래프 모두는 달리 언급이 없는 한 세 개의 독립 실험들로부터 유도되었으며 오차 막대 = +/- SD 이다.
시약 - 항체: a사람 CTLA-4 (ELISA) (eBioscience, 캘리포니아주, 샌 디에고); a사람/마우스 CTLA-4 (WB) (Abcam; 메사추세츠주, 캠브리지); a사람/마우스 AIMP1 (Lifespan BiosciencesInc, 워싱턴 주, 시애틀); a마우스 IL-12p70 (ELISA) (BD Biosciences, 캘리포니아주, 산 호세); a사람 CD8 (ICH) (Biorbyt; 캘리포니아주, 샌 프란시스코), α마우스 CD8 (유세포분석), α마우스 CD25, α마우스 CD3, 및 α마우스 CD4 (BD Biosciences); α마우스 CD8 (생체내 고갈) 및 동형 대조군 (BioXCell, 뉴햄프셔 주, 웨스트 레바논). a사람/마우스 b-액틴을 Santa Cruz Biotechnologies사 (캘리포니아주, 산타 크루즈)로부터 구입하였다. αHLA-A,B,C를 캘리포니아주, 샌 디에고의 BioLegend사로부터 구입하였다. HLA 형결정 항체: αHLA-A2-FITC (BD Biosciences), αHLA-B8-비오틴 (Abcam), 및 접합되지 않은 αHLA-DR3/DR6 (Lifespan Biosciences). TLR 효능제 : TLR-3 효능제 폴리(I:C)-로다민, TLR-9 효능제 CpG ODN-FITC, 및 TLR-5 효능제 플라젤린을 InvivoGen사 (캘리포니아주, 샌 디에고)로부터 얻었다. TLR-4 효능제 LPS를 Sigma-Aldrich사 (미주리주, 세인트 루이스)로부터 얻었다. 폴리(I:C)-로다민 및 CpG-FITC의 DC 흡수를 형광 현미경법 및 LSR II 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용한 유세포분석법으로 확인하고 정량하였으며 MacIntosh용 FlowJo 버전 10.0.00003 (Tree Star Inc, 오레곤주, 애쉬랜드)으로 분석하였다. 모든 TLR 효능제는 1 mg/ml 농도로 사용되었다. 펩티드: 인플루엔자 A 뉴칼레도니아 헤마글루티닌 펩티드 WLTGKNGL (서열 번호: 3), RNLLWLTGKNGLYPN (서열 번호: 2), VLLENERTL (서열 번호: 5), 및 ELLVLLENERTLDFH (서열 번호: 4) (종래에 Decker 외, 2009에 기재됨) 뿐만 아니라 메티오닌-대-글리신 치환 유도체 WLTMKNML (서열 번호: 8) 및 RNLLWLTMKNMLYPN (서열 번호: 9)이 United BioSystems사 (버지니아주, 헤른던)에 의해 합성되었다. 난백 알부민 H-2Kb 면역우세 펩티드 SIINFEKL (서열 번호: 1)이 Anaspec사 (캘리포니아주, 프리몬트)에 의해 합성되었다. H-2Db CLIP-중첩 MRMATPLLM (서열 번호: 6)이 United Biosystems에 의해 합성되었다. 재조합 난백 알부민 단백질을 InvivoGen사로부터 구입하였다. 재조합 eGFP 단백질을 Biovision사로부터 구입하였다 (캘리포니아주, 마운틴뷰). 기타: AIMp1 (SCYE1, 마우스 및 사람), β2-마이크로글로불린 (마우스 및 사람), 및 HLA-DM (사람) siGenome SMART 풀 및 비-표적화 siRNA 풀을 Thermo Scientific사 (델라웨어주, 윌밍턴)으로부터 구입하였다. 정제된 GFP mRNA를 Stemgent사 (메사추세츠주, 캠브리지)로부터 구입하였다.
공동-면역침전법 분석- DC를 지시한 바와 같이 부하하고 1% NP-40 완충액 + 프로테아제 칵테일 억제제 (두 가지 모두 Sigma-Aldrich사)로 용해시키기 전 2일간 성숙시켰다. 조직파편을 탁상형 마이크로원심분리기에서 4℃에서 20분간 14,000 rpm으로 펠릿화하였으며, 후속 세포 용해물들을 단백질 G 플러스-아가로즈 비드 (Protein G plus-Agarose Bead) 현탁액 IP04 (EMD Millipore; 독일, 담스타트)으로 4℃에서 1시간 동안 사전 세척하였다. 그 후 용해물들을 항-AIMp1 (Lifespan Biosciences) 또는 항-HLA-A,B,C (BioLegend)으로 코팅된 단백질 G 플러스 비드와 함께 4℃에서 하룻밤동안 교반시켰다. 그 후 비드들을 1% NP-40 완충액에서 3회, PBS에서 2회 세척하고, 2% SDS (Sigma-Aldrich) 변성 완충액에서 끓여 면역침전물을 수집한 후 PAGE로 분석하였다.
51 Cr 용해 분석 - 종래에 기재된 바와 같이 (Decker 외, 2006) 51Cr 용해 분석을 수행하였다.
4T1- luc2 종양 모델- pGL4.10로부터의 PCR-증폭된 luc2 카세트를 pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro 발현 벡터 내부로 클로닝하여 4T1-luc2 종양 세포들을 준비하였다. 선형 벡터를 4T1 모세포들로 전기천공하였으며, 100 μg/ml 하이그로마이신 선별이 2주간 이루어졌다. 종양을 생성하기 위하여, Balb/c 마우스들을 2.5 x 105 4T1-luc2 세포들로 진피내 접종하였다. 캘리퍼 측정 및 IVIS로 격일마다 종양 성장을 모니터하였다. 100 μl 희석액에서의 0.5 mg d-루시페린 (Regis Technologies, 일리노이주, 모튼 그로브) i.p. 주사 후 IVIs 이미지를 얻었다.
실시예 2 - 마우스 DC의 AIMp1 방출 및 T H 1-분극에 관한 특성화
종래의 연구들은 DC TH1 분극의 TLR- 및 IFN-독립 메커니즘의 존재가 항원관련 동종 MHC 클래스 I 및 II 결정인자들의 부하에 의해 개시되었음을 암시하였다 (Decker 외, 2009). AIMp1이 이 과정에서 역할을 하는지 여부를 결정하기 위하여, 발명자들은 동종 클래스 I 및 II 항원 결정인자들로 DC를 부하하고 TH1 분극 및 AIMp1 방출에 관해 분석하였다. 마우스 DC는 단일- 또는 이종-부하된 DC와 비교하여 (도 1B) 세포주 또는 일차 조직 결정인자들 (mRNA 및 용해물)로 동종 부하시 10-배 더 많은 IL-12p70 (도 1A) 및 현저히 더 많은 AIMp1를 분비하였다. AIMp1 방출의 증대 이외에도, TH1 DC는 클래스 I 및 II 결정인자들이 동종이었을 경우보다 현저히 더 적은 sCTLA-4를 분비하였다 (도 1C). TH1 분극에서 AIMp1의 역할을 나타내는 연구와 일관되게, AIMp1 siRNA 녹다운은 동종 부하에 대해 반응하여 IL-12 분비를 현격히 감소시켰으며 (도 1A) sCTLA-4 분비를 회복시켰다 (도 1D). 따라서, 동종-부하된 DC는 AIMp1 siRNA로 전기천공된 동종-부하된 DC 또는 이종-부하된 DC보다 현저히 더 많은 활성화 CD8+ T-세포를 시험관내 생성하였다 (도 1E). 다음으로 발명자들은 이러한 동일한 생체내 현상을 연구하기 위해 H-2Kb 클래스 I 난백 알부민 (Ova) 에피토프 SIINFEKL 및 전체 Ova 단백질을 동종 클래스 II 항원의 공급원으로 사용하였다. 시험관내 실험들과 마찬가지로, SIINFEKL 펩티드로 전기천공된 DC 그리고 동시에 Ova로 부하된 DC에서만 CD3+, CD3+CD8+, 특히 CD3+CD8+CD25+ 집단의 확대가 관찰되었다. 대조적으로, 단일-부하된 DC, 이종-부하된 DC, 또는 AIMp1 siRNA로 처리된 동종-부하된 DC는 관련 T-세포 집단에 있어서 차이를 전혀 보이지 않았다 (도 1F). 종합하면, 상기 데이터는 DC MHC 클래스 I 및 II를 항원-관련 결정인자들로 부하하는 것은 TH1-비대칭(skewing)을 촉진시킴을 나타내며, 이는 분비되는 AIMp1/sCTLA-4 비율의 증가, IL-12의 하위 방출, 및 활성화 CD8+ T-세포들의 생성 향상을 포함한다.
실시예 3 - 사람계 DC AIMp1/sCTLA-4 방출
사람 DC를 모델 GFP 항원 (GFP mRNA 및 재조합 GFP 단백질)으로 동종-부하시켰을 경우, AIMp1/sCTLA-4 비율의 현저한 증가가 관찰되었다 (도 2A-B). 그 후 발명자들은 다중-에피토프 시스템으로부터 종래에 특성화된 MHC 결합 펩티드 (Decker 외, 2009)로 이행하였다. 클래스 I 및 II 펩티드들이 아미노산 서열에서 중첩될 경우, 부하된 DC로부터 통상적으로 sCTLA-4 분비의 감소 및 AIMp1 분비의 증가가 관찰되었다 (도 2C-E). 성숙 이전에는 sCTLA-4 분비에 있어서의 차이가 관찰되지 않았으나, 중첩 펩티드로 부하된 DC로부터의 AIMp1 방출은 거의 즉시 그리고 성숙 전에 시작되었는데 (도 8), 이는 AIMp1 방출에 관한 초기 상위 역할을 제시하는 것이다. 모든 펩티드들이 동일하게 준비되었고, 단일 또는 이종 방식으로 추가될 때 AIMp1 및 sCTLA-4 분비에 전혀 영향을 주지 않았으며, 공지의 PRR 리간드를 전혀 보유하지 않기 때문에, AIMp1 분비/sCTLA-4 제거의 메커니즘은 실제로 PRR 효능성에 의한 것이 아니라 동시 동종 MHC 부하에 의해 촉발되었던 것으로 생각되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 실험들은 다양한 TLR 효능제의 존재하에 반복되었다. 항원 부하가 없을 때 폴리(I:C), LPS, 플라젤린도, 또한 CpG-ODN도 마우스 (도시되지 않음) 또는 사람 DC (도 2D-E)로부터 sCTLA-4 또는 AIMp1 분비를 전혀 변화시키지 않았다. 추가적으로, 다양한 동종 클래스 I 및 II 결합 펩티드들의 사용은 DC에 동시에 추가시 CTLA-4 및 이의 대응 mRNA 모두를 제거하였으나, 단일 또는 이종 클래스 I 및 II 결합 펩티드의 추가는 이러한 효과가 전혀 없었다 (도 2F). AIMp1은 항원 부하와 관계없이 mRNA 수준의 차이를 전혀 보여주지 않았다.
이러한 특유한 TH 분극 계기(cue)의 기능에 대한 MHC 결합의 중요성을 확인하기 위하여, 발명자들은 H2-DM-/- DC를 이용하였다. H2-DM 분자 샤페론은 MHC 클래스 II 결합 포켓로부터 불변 사슬의 CLIP 펩티드 제거에 기인한다. H2-DM의 부재시, CLIP은 I-Ab 일배체형의 클래스 II 결합 포켓에 거의 비가역적으로 결합됨으로써, 외인성 항원 부하 능력을 없앤다 (Martin 외, 1996; Miyazaki 외, 1996). 외인성 항원 부하 불능은 H2-DM-/- DC의 주된 분자 결함이다. H2-DM -/- DC는 TLRs, NLRs, 또는 다른 PRR에서 공지된 결함들이 전혀 없으며 TLR 효능성에 적절하게 반응함이 종래에 밝혀진 바 있다 (Strong 외, 1997). 매우 흥미롭게도, H2-DM-/- DC는 또한 물리적으로, 결합된 CLIP 펩티드의 존재에 의존적으로 TH2 분극된 표현형을 보이는 것으로 보고된 바 있다 (Rohn 외, 2004). 동종 mRNA 및 용해물로 부하시, H2-DM-/- DC는 AIMp1 또는 sCTLA-4의 분비 차이를 전혀 나타내지 않았으며 또한 SIINFEKL (서열 번호: 1) 및 Ova로 부하시 (도 3A-B 및 도 1F) 활성화 CD8+ T-세포의 생체내 생성 향상을 자극하지도 않았다. 그보다는, H2-DM-/- DC는 구성적으로 그리고 불변적으로 낮은 수준의 AIMp1 및 높은 수준의 sCTLA-4를 분비하였다 (도 3A- B). DC AIMp1/sCTLA-4 방출 및 하위 TH1 반응들은 MHC-결합 펩티드들의 서열 상동성에 의해 조절되었다.
H2-DM-/- DC가 영구적으로 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 CLIP을 유지시키기 때문에, 본 출원에 기재된 계기에 의해 H2-DM-/- DC에서의 TH1 분극을 자극하기 위한 오직 이론적인 방식은 CLIP에 대한 상당한 상동성을 가지는, 즉, MHC 클래스 II 결합된-CLIP 서열 lpksakpvsqmrmatpllmrpmsm (서열 번호: 14)에 중첩하는 아미노산 서열을 가지는 클래스 I 결합 펩티드의 부하에 의한 것이 될 것이다(Ghosh 외, 1995). 이러한 가설을 테스트하기 위하여, 발명자들은 H-2Db 를 결합시킬 것으로 예상되는 그리고 CLIP와 완전한 서열 중첩을 보유하는 (MRMATPLLM, 서열 번호: 6) 클래스 I 펩티드를 설계하였다. 그 후 발명자들은 이러한 CLIP-특이적 H-2Db 클래스 I 펩티드로 또는 대조군으로서 확립된 H-2b 클래스 I SIINFEKL (서열 번호: 1) 펩티드로 H2-DM-/- DC를 부하하였다. H-2Db CLIP으로 부하된 세포들로부터만 용량-의존 방식으로 실질적인 AIMp1 방출이 관찰되었다 (도 3C). 유사하게, sCTLA-4 분비의 약화는 오직 H-2Db CLIP으로 부하된 H2-DM-/- DC로부터만, 역시 용량-의존 방식으로 관찰되었다. 후속하여 야생형, 공통유전자 비장세포와 함께 부하된 H2-DM-/- DC의공배양은 H2-DM-/- DC가 H-2Db CLIP로 부하되었을 경우에만 CD8+CD25+ T 세포들의 증가를 가져왔다 (도 3D). 이러한 데이터는 전술한 결과들을 입증하며 MHC 클래스 I 및 II에 동시에 결합된 펩티드들의 아미노산 서열들을 비교하는 내재적인 DC 기계적 과정의 높은 수준의 특이성을 제시한다.
AIMp1 및 sCTLA-4 분비의 교란에 필요한, 클래스 I 및 II 서열 상동성 정도를 결정하기 위하여, 발명자들은 두 개의 비-앵커 글리신 잔기가 메티오닌으로 치환된 것을 제외하고는 동일하였던 두 가지 상이한 동종 결합 펩티드 쌍들을 이용하였다 (도 3E). 이러한 펩티드 쌍들의 사람 DC 부하는, 하나 또는 또 다른 하나의 HLA 클래스 I 또는 II 결합 펩티드의 치환이 CTLA-4 분비의 제거 및 AIMp1 분비의 증대를 방지하기에 충분하였던 반면, 상호 펩티드에서의 보상적 치환은 이미 나타났던 동종 표현형을 회복시키기에 충분하였음을 나타내었다 (도 3E-F). coIP 및 웨스턴 블롯에 의해 확인된 탠덤 질량 분광법 (도시되지 않음)은 AIMp1이 MHC 클래스 I 및 II 분자들 모두와, 특히 성숙된 DC 내부에서 두드러지게 상호작용함을 나타내었다 (도 9). 그 다음 동종 및 이종 펩티드 쌍들을 이용하여, 발명자들은 동종 클래스 I 및 II 펩티드가 부하되었을 경우에만 AIMp1/MHC 상호작용이 현저시 감소되었으며 (도 3G), 이러한 관찰내용은 세포로부터의 AIMp1 분비 증가와 잘 상호연관되어 있음을 AIMp1 coIP에 의해 입증하였다. 다수의 클래스 I, 클래스 II, 또는 이종 클래스 I 및 II 펩티드들이 부하되었을 경우 유사한 결과들이 관찰되지 않았다. mRNA 및 용해물을 이용한 실험들은 동일한 결과를 생성하였다: AIMp1은 단일 또는 이종 mRNA 및 용해물로 부하된 DC에서 MHC에 결합된 채로 남아있었던 반면, 약간의 AIMp1은 동종 mRNA 및 용해물로 부하된 DC에서 MHC에 결합된 채로 남아있었다 (도 10).
클래스 I 및 II 에피토프들 간의 서열 중첩으로 인한 TH1 분극이 전통적인 MHC 결합과 독립적으로 발생할 수 있는지를 사람계에서 추가로 결정하기 위하여, 발명자들은, 각각, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 펩티드 항원 부하 능력에 현저히 영향을 주는, b2-마이크로글로불린 또는 HLA-DM에 대한 siRNA를 이용하였다. 클래스 I 또는 클래스 II를 부하하는 능력이 저해되었을 경우, DC는 동종 클래스 I 및 II 펩티드 부하에 대해 반응하여 AIMp1 및 CTLA-4 분비를 조절하는 능력을 상실하였으며 (도 11A-B), 이러한 결과는 마우스로부터 얻은 전술한 데이터와 일치하였다 (도 1F 및 3). 종합하면, 상기 데이터는, DC가 중요한 신호전달 분자들의 방출, 하위 TH 분극에 매우 현저한 영향을 주는 교란 그리고 CD8+ T-세포들의 발달을 조절하는, TLR-독립적인, 항원 서열-의존 메커니즘을 보유한다는 가설을 확고히 뒷받침한다 (Decker 외, 2006; Decker 외, 2009).
실시예 4 - 서열-의존 메커니즘의 생리학적 적절성
이러한 새로이-특성화된 메커니즘의 생리학적 적절성을 밝히기 위하여, 발명자들은 정상적인 자기 면역 관용을 파괴하는 동종 항원 부하 능력을 특성화하였다. 발명자들은 MRI로 용이하게 가시화되는, 밀접하게 관련되어 있으나 항원적으로 구별되는 비뇨생식 기관들인 정낭 (SV) 및 전립선을 비롯한 야생형 조직들에 대해 복수의 동종-부하된 DC 백신들을 생성하였다. 야생형 마우스에게 SV mRNA 및 용해물로 부하된 0.5 - 2.0 x 105 DC를, 형질세포양 DC (pDC)의 자극에 의해 바이러스 감염 환경을 모방하는 보강제인 인- 시투 ( in situ ) 방식의 이미퀴모드 (imq)와 함께 1 - 4회 복강내 (i.p) 주사하였다 (도 12). 치료 1개월 후, SV-부하된 DC를 주사한 마우스들은 섬유증 및 괴사, 평활근 및 상피 과다형성, 내강 확장 및 응괴, 및 혼합 계통의 염증성 침윤물을 포함한 특징적인 생리학적 변화들을 보여주었다 (도 4A). SV 박멸은 MRI에 의해 종단으로 모니터링될 수 있었으며, 치료 1개월 후 MR 이미지형성 조직 중 구분된 부분의 소실이 관찰되었다 (도 4B). 백신접종 후 6개월까지, SV-부하된 DC를 투여받은 마우스는 주로 섬유증 조직으로 구성된 흔적 구조만을 계속 함유하였다 (도 4C). CD8+ 침윤을 면역조직화학으로 확인하였다 (도 4D). 백신 특이성 및 기억을 입증하기 위하여, 백신접종 2개월 후에 비장세포를 대조군 또는 SV-백신접종된 마우스로부터 수집하여 추가로 보강하지 않은 면역없는 마우스에 입양 전이시켰다. (도 13). 7주 이내, 입양 전이된 마우스의 SV는 일차 백신접종 받았던 마우스와 동일한 특징적 면역병리학을 보여주었다 (도 4E).
전립선은 그 전방 및 외측 엽들을 따라 경계를 공유하도록 SV에 인접하게 배치된다. 야생형 전립선 mRNA 및 용해물로 동종 부하된 DC가 투여되었으며 (도 12) MRI로 마우스를 모니터하였다. 정상 병리학을 유지하였던 대조군 마우스 (도 5A-C)와 비교하여, 백신-치료된 마우스는 보다 약한 전립선 MRI 신호를 보여주었는데 (도 5D) 이는 조직 손실에 대응하며 (도 5E) 백신접종된 SV와 유사한 면역병리학을 입증하였다 (도 5F). 전립선 백신접종 결과 섬유증은 관찰되지 않았으며, 그보다 전립선 조직이 완전히 사라지는 경향을 나타내었다 (도 5G- H). 발명자들은 추가로 부분적으로-HLA-일치된 사람 DC를 WPMY-1 항원 결정인자들과 함께 동종-부하함으로써 사람 정상 전립선 세포주 WPMY-1에 대해 향상된 CD8+ 반응들을 생성하는 능력을 보여주었는데 (도 14), 이는 사람 치료에 대한 응용가능성을 제시하는 것이다.
두 개의 항원적으로 그리고 공간적으로-관련된 자가-조직 시스템에 대한 백신 특이성의 생성은 면역학적 특이성 분별을 가능하게 하였다. 도시된 바와 같이, 마우스를 전립선-부하된 DC로 처리하였을 경우, 병리학적으로 전적으로 전립선-특이적이었다 (도 5I). 역으로, 마우스를 SV-부하된 DC로 처리하였을 경우, 병리학적으로 전적으로 SV 특이적이었다 (도 5J). 실제로, 면역학적 자기에 대한, 상이한 용량 범위에 걸친 69마리 마우스의 백신접종은 관찰가능한 오프-타겟 효과를 생성하지 않았다 (도시되지 않음). 종합적으로, 동종-부하된 DC로 백신접종한 마우스의 59% (37/63)에서 적절한 백신 반응성이 관찰되었으나 조직 용해물-부하된 DC로 백신접종된 마우스 (n=35, p<0.001)에서는 0% 그리고 조직 mRNA-부하된 DC로 백신접종된 마우스 (n=12, p<0.001)에서는 0% 였다.
실시예 5 - 생리학적 신생물 연구
이 전략의 생리학적 신생물 취급 능력을 결정하기 위하여, 발명자들은 다양한 상이한 모델 시스템을 이용하였다. 4T1 유방암 모델에서, 8일간 확립된 4T1 luc2-발현 종양들을 보유한 마우스의 코호트에 동종 백신 (luc2- 4T1 모세포들로부터 유도) 또는 보강제만을 단회 투여하였다. 보강제-처리된 마우스 6마리 중 5마리는 전이가 발병되어 사망하였으나, 백신접종된 마우스는 종양을 비교적 작게 유지시켰으며 실험 종료시 명확한 이환율을 나타내지 않았다 (도 15A-B). 이 모델에서 CD8+ 세포들 (그리고 그에 따른 TH1 면역성)에 대한 종양 제어 의존성을 입증하기 위하여, 면역이 없는 동물들에게 동종 백신을 2회 투여한 다음 CD8+ 세포를 고갈시켰다. 그 후 비장세포들을 수집하고 2.5 x 105 4T1-luc2 종양 세포들로 사전-접종시킨 공통유전자 동물들에 입양 전이하였다. 보는 바와 같이 (도 15C-D), 동형-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스는 CD8-고갈된 비장세포로 입양 전이된 마우스들에 비해 매우 현저한 생존 이점을 보였는데, 이는 일차 종양 제어 및 전이 확산 모두의 제어에 있어서 CD8+ 세포들의 중요한 역할을 나타내는 것이다. 흥미롭게도, 이종-백신접종된 (4T1 mRNA/B16.F10 용해물) 동물들로부터 유도된, 동형-고갈된 비장세포를 입양 전이시킨 마우스는 모두 중에서 가장 잘 지내지 못했다.
생리학적 적절성이 높은 모델에서 동종 백신접종의 효과를 결정하기 위하여, 발명자들은 전립선 상피에서 FGFR1 및 b-카테닌 신호전달 유도시 생리학적 자가유래 전립선 암이 발생하는 유전자삽입 Pro-Cat/JOCK1 모델을 이용하였다 (Carstens 외, 2014). 이 모델에서, 마우스는 전립선 과다형성 (8주)으로부터, 전립선 상피내 신생물 (mPIN, 12주), 선암종 (24주), 및 이행 육종 (60주) 단계들로 진행한다. 24주동안 전립선 선암종 유도 후, 마우스를 사망시키고, 암 전립선을 절제하여 선암종 단계 항원 조직표본을 생성하였다. 그 후 마우스의 후속 코호트들을 24주 동안 유도하고 동종-부하된 백신을 치료적으로 백신접종하였다. 추가 4개월 후 백신접종된 마우스를 사망시키고, H&E 염색된 전립선에 대한 맹검 병리학 점수로 암 진행을 결정하였다. 선암종-단계 항원들로 부하된 DC를 투여받은 마우스는 과다형성 단계로 진행하였으나 대부분 mPIN에서 정지되어있었으며, 이는 비교적 병리조직학적 선암종을 나타내지 않았다 (도 6B 및 6D). 추가적으로, 백신접종된 마우스는 백신접종 되지않은, 대조군-백신접종된, 또는 보강제만 접종된 그룹에서 관찰되지 않았던 림프구-침윤된 세엽 (예컨대, 도 6B.1 삽도)을 보였다. 보강제만을 투여받은 유도된 마우스는 전형적인 선암종을 나타냈다 (도 6C). 완전한 백신 요법을 받은 유도되지 않은 대조군 마우스는 정상 전립선과 교차-반응성을 전혀 나타내지 않았다 (도 6A). 더욱이, 백신접종은 용량-반응적 효과를 보이는 것으로 나타났다 (도 6E-J).
마지막으로, 발명자들은 임상 수의학 세팅에서 본 발명의 접근법의 실행가능성 및 안전성을 입증하기 위해 대형 동물계에서 자발성 뇌 종양에 대해 본 발명의 접근법을 테스트하였다. 요약하면, MRI로 CNS 악성 진단시, 소유주의 고지된 동의 후 두 마리의 대형 (> 25 kg) 수의학 개 환자들을 채용하였다. 개에게 표준 의료 완화 스테로이드를 투여하는 대신, 머리뼈절개 및 보존적 종양 절제를 실시하였다. 종양 표본을 용해성 용해물 및 mRNA 성분들로 세분하였다. 후속하여, 개 환자들을 G-CSF (Neupogen)를 사용하여 동원시켰으며 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC)을 수집하였다. 부착성 단핵구 분획을 종양 용해물 및 mRNA 하위분획들로 동시에 부하시켰던 DC로 분화시키고 성숙시켰다. 그 후 DC를 수집하고 초음파 촬영에 의해 심부 경부 림프절 부근에 주사하기 위하여 PBS에 재현탁시켰다. 백신접종과 함께, 동물들은 12 주 동안 주 3회 사람 IFN-a를 용량 당 2백만 내지 8백만 유닛으로 피하 투여하여 보충되었다. 본 발명의 접근법의 안전성 및 실행가능성을 증명하는 것 이외에도, 각각의 동물은 또한 백신접종 초기부터 신속하고 현저한 종양 수축을 보여주었다. 첫번째 동물은 5 x 105 백신 세포들을 단회 투여 받았으며 1개월 추적 진료시 50% 종양 퇴행을 보여주었다 (도 7A-D). 두번째 동물은 3회 투여 과정에 걸쳐 5 x 106 백신 세포들을 투여받았으며 1개월 추적 진료시 거의 80% 종양 퇴행을 보여주었다 (도 7E-H). 200일의 중위수 생존은 비교가능한 유사 대조군들의 중위수 생존 (69일)보다 거의 3배 더 컸다 (Rossmeisl 외, 2013).
이들 실시예들에서, 발명자들은 종래에 알지못했던 그리고 어느정도 예상치 못했던 DC 조절 관문에 관한 기계론적 기초를 확인하였으며, 이에 관해 명확히 설명하는 것은 백신 면역요법 분야에서 진료 목적을 달성함에 있어 매우 중요할 것이다. 종래의 그리고 현재의 연구는 동종 클래스 I 및 II 항원들과 함께 동시에 DC를 부하하는 것은 시험관내 및 생체내 DC TH1 분극 및 하위 CD8+ T-세포 반응들의 증대를 유도함을 나타낸다 (Decker 외, 2006; Decker 외, 2009). 본 출원에서 발명자들은 이러한 현상이 TH1 분극화 기능을 보유한 것으로 공지된 중요한 사이토킨인 AIMp1의 상향 조절된 분비에 기계적으로 연관되고, 이의 방출은 IL-12 분비를 상향조절하는 반면, CTLA-4 및 이에 상응하는 mRNA 전사체의 분비를 동시에 하향조절함을 입증한다. AIMp1은 AIMp1 siRNA 녹다운 및 운동 연구에 의해 입증된 바와 같이 sCTLA-4 및 IL-12 모두의 상위에서 작용하는 것으로 보인다. 중요하게는, 발명자들은 동종 항원 부하에 대해 반응한 AIMp1의 방출은 TLR-독립 방식으로 진행되었음을 입증하였다. TLR 효능성은 AIMp1 방출을 증대 또는 CTLA-4 분비를 감소시킬 수 없었을 뿐만 아니라, 이종 방식으로 추가될 경우 이러한 반응들을 자극할 수 있는 펩티드 결정인자들을 동일하게 제조할 수 없었다. b2-마이크로글로불린 또는 HLA-DM의 siRNA 녹다운은 동종 클래스 I 및 II 결합 펩티드들에 대해 반응하는 DC의 능력을 제거하였다. 더욱이, H2-DM이 없어 외인성 항원을 부하할 수 없는 쥐과 DC는 또한 MHC가 무손상 상태였고 패턴 인식 수용체들이 기능적인 상태로 유지되었다 하더라도 하위 CD8+ 반응들을 향상시키거나 분극화 될 수 없었다 (Strong 외, 2011). 그러나, Ii CLIP의 아미노산 서열과 중첩되는 합성 클래스 I 결합 펩티드로 H2-DM-/- DC를 부하하는 것은, 이들 세포들의 클래스 I 및 II를 동종 방식으로 부하하는 이론적으로 가능한 유일한 방식으로, 용량 반응적 방식으로 AIMp1/sCTLA-4의 야생형 비율을 방출하였으며 CD8+CD25+ T-세포를 생성하였다. 이러한 결과는 본 출원의 TH1 분극 방법에서 펩티드 결합에 관한 MHC의 역할을 명확히 제시하는 것이며, 이는 종래에는 기재되지 않았던 특유한 과정이다. TH1 분극이 선천적인 PRR 보다는 항원 상동성에 의존함을 추가로 입증하기 위하여, 발명자들은 3개 이상의 아미노산들의 연속적인 클래스 I 및 II 서열 상동성이 중단되도록, 두 개의 비-앵커 아미노산 치환체들을 종래에 특성화된 (Decker 외, 2009) 클래스 II 결합 펩티드에 부가하였다. 상동성의 이러한 작은 파괴는 분극화 AIMp1/sCTLA-4 비율을 제거하기에 충분하였다. 클래스 I 펩티드에 상보적인 아미노산 치환체들을 처리함으로써, 완전한 서열 상동성을 회복시키는 것은, 높은 AIMp1/CTLA-4 비율을 회복시키기에 충분하였다. 종합하면, 상기 데이터는 MHC 클래스 I과 II-결합 펩티드들 간의 높은 서열 상동성 정도에 따른 DC에 있어서의 특유한 TH1 분극화 체크포인트를 제시한다. 이러한 메커니즘이 의존하는 중요한 효과기 분자들을 식별하는 것 이외에도, 발명자들은 야생형 마우스에서, 종래에 보고된 바 없었던 현상인, 면역학적 내성을 파괴하고 정상적인 면역학적 자기를 퇴치시켰던 조직-특이적 백신을 생성함으로써 생리학적 적절성을 입증하였다. 추가 실험들은 또한 세 가지 상이한 모델 시스템에서 신생물 자체에 대한 현저한 활성을 입증하였는데, 자연발생적인, 이계교배 개 모델에서 희소돌기아교세포종에 대한 활성을 제시했던 실험들을 포함하였다.
종합하면, 발명자들은 전체-세포 시스템, 단일-항원 시스템, 및 다수 쌍들의 중첩 클래스 I 및 II MHC 결합 에피토프들을 비롯한 29가지 상이한 모델 시스템들 (표 1)을 사용하여, 동종-부하된 DC가 차등적 사이토킨 분비, 표면 표지자 발현, 전역적 전사 변형 (global transcriptional alterations), 및 CD8+ CTL의 생성을 향상시키는 능력을 비롯한 다양한 TH1-관련 특징들을 보임 (표 2)을 입증하였다. 이들 29가지 상이한 시스템들 각각에서, TH1 분극을 나타냈던 그룹들의 유일한 공통성은 DC에 부하되었던 클래스 I 및 클래스 II 항원들 간 높은 정도의 항원 또는 아미노산 서열 상동성이었다.
표 1. 사용된 항원 시스템, 테스트한 종, 및 DC에 대한 항원 전달 방법의 요약. * = 종래 공개된 시스템.
Figure pct00001
표 2. 동종 DC 부하의 선택 표지자 및 소견.
Figure pct00002
* *
본 출원에 개시된 그리고 본 출원의 청구범위에 기재된 모든 방법들은 본 출원의 개시내용을 고려하여 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 바람직한 구체예들을 고려하여 본 발명의 방법들을 기재하였으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 이러한 조성물 및 방법들, 그리고 본 출원에 기재된 방법의 단계들 또는 일련의 단계들에 변형이 이루어질 수 있음은 해당 분야의 숙련된 기술자에게 자명할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 제제들은 동일 또는 유사한 결과가 구현되는 한 본 출원에 기재된 제제들로 치환될 수 있음은 자명할 것이다. 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환들 및 변형들은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 고려된다.
참고문헌
하기 참고문헌은, 본 출원에 제시된 예시적인 절차 또는 다른 상세한 내용에 대한 보충내용을 제공하는 한, 본 출원에 구체적으로 참고를 위해 포함된다.
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Claims (84)

  1. 다음을 포함하는 질환있는 세포 집단을 가지는 피험체에서의 면역 반응 제공 방법:
    (a) 감작된 수지상 세포 집단을 수득하는 단계, 여기서 세포는 질환있는 세포 집단에 특이적인 하나 이상의 항원으로 감작되어 있으며; 그리고
    (b) 유효량의 감작된 수지상 세포 집단을 피험체에 투여하는 단계, 여기서 감작된 수지상 세포 집단은 다음과 같이 투여됨:
    (i) 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1과 함께; 그리고
    (ii) 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조질 부위에.
  2. 청구항 1에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1과 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 INF와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 제1형 INF는 INF-α임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-7 효능제와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, TLR-7 효능제는 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, 폴리(dT), 이미퀴모드, 가디퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 록소리빈, 및 ssRNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  7. 청구항 2에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-9 효능제와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, TLR-9 효능제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  9. 청구항 2에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 AIMp1와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  10. 청구항 2에 있어서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1은 감작된 수지상 세포 집단 이전 또는 본질적으로 동시에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  11. 청구항 2에 있어서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1은 감작된 수지상 세포 집단 이후에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  12. 청구항 10-11 중 어느 한 항에 있어서, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1은 감작된 수지상 세포 집단의 약 1주, 1일, 8시간, 4시간, 2시간 또는 1시간 이내 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  13. 청구항 2에 있어서, 유효량의 감작된 수지상 세포 집단 및, 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1을 포함하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 면역 관문 억제제를 피험체에 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 제1형 INF, TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1과 함께 투여되며, 감작된 수지상 세포 집단은 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조직 부위에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 림프 조직 부위는 질환있는 세포 집단을 둘러싸고 있는 조직을 배출시키는 림프 조직임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 피험체는 암, 및 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 가짐을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 질환있는 세포 집단은 종양임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 종양은 뇌 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 전립선 암, 유방암, 또는 만성 림프구 백혈병임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  23. 다음을 포함하는 면역원성 조성물: (i) 항원-감작된 수지상 세포 및 (ii) 제1형 인터페론 (INF), TLR-7 효능제, TLR-9 효능제 또는 AIMp1.
  24. 청구항 23에 있어서, 항원-감작된 수지상 세포는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환과 연관된 항원으로 감작되어 있음을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 항원-감작된 수지상 세포는 하나 이상의 종양 항원으로 감작되어 있음을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 종양은 뇌 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 전립선 암, 유방암, 또는 만성 림프구 백혈병임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  27. 청구항 23에 있어서, 제1형 INF를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 제1형 INF는 INF-α임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  29. 청구항 23에 있어서, TLR-7 효능제를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, TLR-7 효능제는 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, 폴리(dT), 이미퀴모드, 가디퀴모드, 레시퀴모드 (R848), 록소리빈, 및 ssRNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  31. 청구항 23에 있어서, TLR-9 효능제를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, TLR-9 효능제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  33. 청구항 23에 있어서, AIMp1을 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  34. 청구항 23에 있어서, 면역 관문 억제제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  36. 청구항 34에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  37. 적어도 제 1 항원으로 감작된 항원 제시 세포들의 집단의 존재하에서 T-세포 또는 T-세포 전구물질의 집단을 배양하는 단계를 포함하며 이 배양 단계는 AIMp1의 존재하에서 이루어지는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 항원 특이적 T-세포의 시험관내 확대 방법으로서 추가로 정의됨을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  39. 청구항 37에 있어서, 항원 제시 세포들은 수지상 세포를 포함함을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  40. 청구항 19에 있어서, 수지상 세포는 항원으로 동종 부하됨을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 수지상 세포 집단은 일차 수지상 세포들을 포함함을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  42. 청구항 37에 있어서, 상기 배양단계는 피험체에 대한 면역 관문 억제제의 존재하에서 이루어짐을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  44. 청구항 42에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  45. 다음을 포함하는 질환있는 세포 집단을 가지는 피험체에서의 면역 반응 제공 방법:
    (a) 감작된 수지상 세포 집단을 수득하는 단계, 여기서 세포는 질환있는 세포 집단에 특이적인 하나 이상의 항원으로 감작되어 있으며; 그리고
    (b) 유효량의 감작된 수지상 세포 집단을 피험체에 투여하는 단계, 여기서 감작된 수지상 세포 집단은 다음과 같이 투여됨:
    (i) TLR-3 효능제, 레티노산 유도 유전자-1 (RIG-1)-유사 수용체 리간드 또는 시토졸 DNA (CDS) 수용체 리간드와 함께; 그리고
    (ii) 피험체에서 질환있는 세포 집단에 가까운 림프 조질 부위에.
  46. 청구항 45에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 TLR-3 효능제와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, TLR 효능제는 폴리이노신-폴리시티딜릭 애시드(폴리(I:C)) 또는 RGC100임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  48. 청구항 45에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 RIG-1-유사 수용체 리간드와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, RIG-1-유사 수용체 리간드는 RIG-1, MDA5, LGP2, 또는 IPS-1 리간드로서 추가로 정의됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  50. 청구항 48에 있어서, RIG-1-유사 수용체 리간드는 MDA5 리간드, LGP2 리간드, ssRNA, dsRNA, 5'ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 및 폴리(I:C)로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  51. 청구항 45에 있어서, 감작된 수지상 세포 집단은 CDS 수용체 리간드와 함께 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, CDS 수용체 리간드는 cGAS-STING 리간드로 추가로 정의됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, cGAS-STING 리간드는 세균성 사이클릭-디뉴클레오티드 (CDNs)임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  54. 청구항 45에 있어서, TLR-3 효능제, RIG-1-유사 수용체 리간드, 또는 CDS 수용체 리간드는 감작된 수지상 세포 집단 이전 또는 본질적으로 동시에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  55. 청구항 45에 있어서, TLR-3 효능제, RIG-1-유사 수용체 리간드, 또는 CDS 수용체 리간드는 감작된 수지상 세포 집단 이후에 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  56. 청구항 45-55 중 어느 한 항에 있어서, TLR-3 효능제, RIG-1-유사 수용체 리간드, 또는 CDS 수용체 리간드는 감작된 수지상 세포 집단의 약 1주, 1일, 8시간, 4시간, 2시간 또는 1시간 이내 투여됨을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  57. 청구항 45에 있어서, 면역 관문 억제제를 피험체에 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  59. 청구항 57에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  60. 청구항 45에 있어서, 상기 림프 조직 부위는 질환있는 세포 집단을 둘러싸고 있는 조직을 배출시키는 림프 조직임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  61. 청구항 45에 있어서, 피험체는 암, 및 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 가짐을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  62. 청구항 60에 있어서, 질환있는 세포 집단은 종양임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 종양은 뇌 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 전립선 암, 유방암, 또는 만성 림프구 백혈병임을 특징으로 하는 면역 반응 제공 방법.
  64. 다음을 포함하는 면역원성 조성물: (i) 항원-감작된 수지상 세포 및 (ii) TLR-3 효능제, RIG-1-유사 수용체 리간드, 또는 CDS 수용체 리간드.
  65. 청구항 64에 있어서, 항원-감작된 수지상 세포는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환과 연관된 항원으로 감작되어 있음을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  66. 청구항 65에 있어서, 항원-감작된 수지상 세포는 하나 이상의 종양 항원으로 감작되어 있음을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  67. 청구항 66에 있어서, 종양은 뇌 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 전립선 암, 유방암, 또는 만성 림프구 백혈병임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  68. 청구항 64에 있어서, TLR-3 효능제를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  69. 청구항 68에 있어서, TLR-3은 폴리(I:C) 또는 RGC100임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  70. 청구항 64에 있어서, RIG-1-유사 수용체 리간드를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  71. 청구항 70에 있어서, RIG-1-유사 수용체 리간드는 MDA5 리간드, LGP2 리간드, ssRNA, dsRNA, 5'ppp-dsRNA, 폴리(dA:dT), 및 폴리(I:C)로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  72. 청구항 64에 있어서, CDS 수용체 리간드를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  73. 청구항 72에 있어서, CDS 수용체 리간드는 세균성 CDN임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  74. 청구항 64에 있어서, 면역 관문 억제제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  75. 청구항 74에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  76. 청구항 74에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  77. 적어도 제 1 항원으로 감작된 항원 제시 세포들의 집단의 존재하에서 T-세포 또는 T-세포 전구물질의 집단을 배양하는 단계를 포함하며 이 배양 단계는 폴리(I:C)의 존재하에서 이루어지는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 항원 특이적 T-세포의 시험관내 확대 방법으로서 추가로 정의됨을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  79. 청구항 77에 있어서, 항원 제시 세포들은 수지상 세포를 포함함을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  80. 청구항 61에 있어서, 수지상 세포는 항원으로 동종 부하됨을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  81. 청구항 79에 있어서, 수지상 세포 집단은 일차 수지상 세포들을 포함함을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  82. 청구항 77에 있어서, 상기 배양단계는 피험체에 대한 면역 관문 억제제의 존재하에서 이루어짐을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  83. 청구항 82에 있어서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 길항제임을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.
  84. 청구항 82에 있어서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙임을 특징으로 하는 항원 특이적 T-세포 배양 방법.

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