RU2565542C2 - Улучшенная композиция для ингибирования пролиферации опухолевых клеток - Google Patents
Улучшенная композиция для ингибирования пролиферации опухолевых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2565542C2 RU2565542C2 RU2012137173/10A RU2012137173A RU2565542C2 RU 2565542 C2 RU2565542 C2 RU 2565542C2 RU 2012137173/10 A RU2012137173/10 A RU 2012137173/10A RU 2012137173 A RU2012137173 A RU 2012137173A RU 2565542 C2 RU2565542 C2 RU 2565542C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- tumor
- pro
- cells
- inflammatory
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 40
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title abstract description 31
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 179
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 153
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 134
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- BXNMTOQRYBFHNZ-UHFFFAOYSA-N resiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C(N(C(COCC)=N3)CC(C)(C)O)C3=C(N)N=C21 BXNMTOQRYBFHNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 claims description 27
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 27
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 23
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 23
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 21
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 21
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 19
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 claims description 15
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 claims description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims description 2
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 20
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 19
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 19
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 17
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 17
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 15
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 14
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- 101710085500 C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 12
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 12
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 101150064469 ndk gene Proteins 0.000 description 11
- 101150065457 ndkA gene Proteins 0.000 description 11
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 10
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 8
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 8
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 8
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 7
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 229950010550 resiquimod Drugs 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 4
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 4
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 4
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 3
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102100023609 Nucleoside diphosphate kinase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000023385 chemokine (C-C motif) ligand 5 production Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 description 1
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100023703 C-C motif chemokine 15 Human genes 0.000 description 1
- 101710155856 C-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010052382 CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 description 1
- 101150087313 Cd8a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 description 1
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 description 1
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000978376 Homo sapiens C-C motif chemokine 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100273740 Mus musculus Cd68 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101000794214 Staphylococcus aureus Toxic shock syndrome toxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000008230 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010060885 Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000014564 chemokine production Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005968 exogenous activation Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000049849 human CD86 Human genes 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000035802 rapid maturation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4648—Bacterial antigens
- A61K39/464821—Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимулированных дендритных клеток (ДК), и может быть использовано в медицине для иммунотерапии рака. Зрелую провоспалительную ДК получают путем ex vivo индуцирования ее созревания посредством обработки незрелой ДК такими веществами как натриевая соль полиинозиновой-полицитидиновой кислоты (поли-И:Ц), резиквимод (R848) и интерферон-гамма (ИФН-g), но не простагландином Е2 (ПГЕ2). Полученную ДК применяют при лечении рака у индивида посредством инъекции в опухоль. При этом указанная провоспалительная зрелая ДК является аллогенной по отношению к указанному индивиду. Изобретение позволяет эффективно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение в целом относится к области лечения рака. В частности, изобретение относится к иммунотерапии рака, а точнее к клеточной иммунотерапии для ингибирования пролиферации опухолевых клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вакцины давно используют для профилактики инфекционных заболеваний, таких как вирусные или микробные инфекции. Опосредуемая клетками ветвь иммунной системы активно участвует в формировании защиты организма, его восстановлении после инфекций, а также препятствует дальнейшему инфицированию тем же антигеном. Предполагается, что клеточно-опосредованные иммунные механизмы могут быть полезными при лечении рака.
Дендритные клетки (ДК), самые активные антиген-презентирующие клетки (АПК), играют центральную роль в инициации и регуляции иммунного ответа. Они обладают уникальной способностью праймировать наивные Т-клетки, а также вызывать и стимулировать эффективные ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Предшественники дендритных клеток присутствуют в циркулирующей крови и могут быть быстро привлечены в очаги инфицирования или воспаления. Когда предшественники ДК дифференцируются в незрелые ДК, эффективность захвата и обработки ими экзогенных белковых антигенов сильно повышается. В ответ на различные стимулы, вызывающие созревание, такие как бактериальные и вирусные компоненты, экспрессирующие лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR), воспалительные цитокины и/или специфические Т-клеточные взаимодействия (взаимодействие лигандов CD40/CD40), они инициируют процесс дифференцировки, который с одной стороны ведет к снижению захвата антигена и обрабатывающей способности, а с другой к повышенной экспрессии молекул, участвующих в одновременной стимуляции, а также белков главного комплекса гистосовместимости (МНС). Важно отметить, что мощность и продолжительность сигналов, индуцированных прямым распознаванием возбудителя (например, TLRs) или связыванием CD40, является критическим фактором, определяющим конкретные функции дендритных клеток. Таким образом, в периферических очагах дендритные клетки окончательно индуцируются активационными факторами, чтобы выполнить одну из двух взаимоисключающих функций, то есть мигрировать в лимфатические узлы (как зрелые мигрирующие ДК) для эффективного взаимодействия с Т-клетками, либо модифицировать микроокружение, производя большое количество медиаторов воспаления, в том числе хемокинов и цитокинов (как зрелые провоспалительные ДК).
Все существующие стратегии иммунотерапии рака, основанные на ДК, основаны на предпосылке, что качество Т-клеточного ответа зависит, главным образом, от способности мигрирующих ДК процессировать и презентировать опухолевые антигены Т-клеткам во вторичных лимфоидных органах, и создавать тем самым опухоль-специфичный ЦТЛ-ответ, который приводит к иммунологической атаке раковых клеток. Данные, полученные на различных моделях опухолей у мышей, показали, что такой ответ может быть запущен в соответствии с одной из трех основных стратегий, хорошо известных специалистам в этой области. Эти стратегии противоопухолевой иммунотерапии в настоящее время активно тестируют на людях, но все с ограниченным успехом.
Первая стратегия заключается в обеспечении активации и созревания мигрирующих ДК, загруженных антигеном пациента с опухолью ex vivo, ввести последующем введении их этому же пациенту. Нагрузку антигеном, как правило, осуществляют путем добавления антигенов, ассоциированных с опухолью (лизированные опухолевые клетки, белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антигены), к незрелым ДК моноцитарного происхождения, с последующей активацией/созреванием загруженных антигеном ДК различными комбинациями воспалительных факторов. Предполагается, что повторно введенные ДК мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где они инициируют опухоль-специфичные Т-лимфоциты. Праймированные дендритными клетками Т-лимфоциты, в частности, ЦТЛ, перемещаются затем к опухоли, где они впоследствии вызывают апоптоз опухолевых клеток.
Однако в клинических условиях ex vivo манипуляция собственными, т.е. аутологическими, дендритными клетками пациента отнимает много времени и подвергает пациента повышенному риску инфицирования. Кроме того, трудоемким является сам процесс манипуляции, при котором ДК стимулируют опухолевыми антигенами и активируют с получением мигрирующих ДК, которые эффективно презентируют опухолевые антигены.
Вторая основная стратегия, которая позволяет избежать ex vivo культивирования мигрирующих ДК, полученных от пациента, включает введение опухолевых антигенов, в том числе облученных аллогенных клеток опухоли или плазмид, кодирующих опухолевые антигены, в интактные здоровые ткани пациента посредством подкожных или внутримышечных инъекций. Опухолевые антигены дополняют так называемыми адъювантами, которые вводят с целью инициации ДК-опосредованного иммунного ответа in vivo. В качестве адъювантов чаще всего используют хемокины, цитокины или плазмиды, кодирующие эти факторы, и/или факторы, вызывающие созревание ДК, такие как фактор некроза опухоли (ФНО-α), и/или агонисты ЦТЛ.
Однако, введение экзогенных антигенов опухоли представляет собой трудоемкий процесс.
Третья основная стратегия относится к применению адъюванта, который вводят непосредственно в опухоль, эта стратегия позволяет избежать ex vivo культивирования мигрирующих ДК, полученных от пациента, что является частью первой основной стратегии, кроме того, позволяет избежать потребности в экзогенных опухолевых антигенах, что является частью второй основной стратегии. Таким образом, адъювант применяют для непосредственного воздействия на ДК in vivo, при этом опухоль пациента служит источником опухолевых антигенов. Протестированные адъюванты аналогичны тем, которые описаны во второй основной стратегии: хемокины, цитокины или плазмиды, кодирующие эти факторы, и/или факторы, вызывающие созревание ДК, такие как фактор некроза опухоли (ФНО-α) и/или агонисты ЦТЛ.
Тем не менее, жизнеспособная опухоль может быть слабым источником опухолевых антигенов для привлеченных незрелых ДК в связи с недостаточным количеством умирающих, главным образом вследствие апоптоза. опухолевых клеток которые могут быть поглощены этими ДК.
Все три вышеперечисленные стратегии были испытаны на онкологических пациентах, но с ограниченным успехом. Таким образом, существует очевидная потребность в более эффективных терапевтических вакцинах и более совершенных методах лечения рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, предпочтительная цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть указанные выше недостатки в данной области, как по отдельности, так и в любой комбинации, а также в решении, по меньшей мере, упомянутых выше проблем посредством обеспечения: провоспалительных зрелых дендритных клеток, которые продуцируют высокие концентрации желаемых хемокинов и интерлейкина 12 (ИЛ-12); композиции, которая содержит указанные провоспалительные дендритные клетки; способу получения указанных провоспалительных дендритных клеток, к применению указанных провоспалительных клеток или указанной композиции в качестве лекарственного средства, а также к применению указанных дендритных клеток или указанной композиции при лечении рака.
Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные дендритные клетки (ДК), которые были стимулированы до созревания ex vivo посредством обработки следующими веществами: натриевой солью полиинозиновой-полицитидиновой кислоты (поли-И:Ц), резиквимодом (R848) и гамма-интерфероном (ИФН-γ).
Во втором аспекте настоящего изобретения обеспечивается композиция, которая содержит провоспалительные дендритные клетки в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, а также мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).
В третьем аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ получения провоспалительных дендритных клеток согласно первому аспекту настоящего изобретения. Указанный способ включает стадии: обеспечения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), выделения моноцитов из указанных МКПК, получения из указанных моноцитов незрелых ДК (нДК), а также индуцирования созревания нДК путем добавления поли-И:Ц, R848 и ИФН-γ к нДК с получением провоспалительных ДК.
В четвертом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ получения композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения. Указанный способ включает стадии: обеспечения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и зрелых провоспалительных ДК в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, и смешивания указанных МКПК и указанных провоспалительных зрелых ДК.
В пятом аспекте настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные ДК, полученные в соответствии с первым аспектом данного изобретения или композиция, полученная в соответствии со вторым аспектом данного изобретения для применения в качестве лекарственного средства.
Согласно шестому аспекту настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные ДК, полученные в соответствии с первым аспектом данного изобретения или композиция, полученная в соответствии со вторым аспектом данного изобретения, для применения в качестве лекарственного средства у пациента, который не является источником провоспалительных зрелых ДК или МКПК.
Согласно седьмому аспекту настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные ДК, полученные в соответствии с первым аспектом данного изобретения или композиция, полученная в соответствии со вторым аспектом данного изобретения для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака.
Согласно восьмому аспекту настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные ДК, полученные в соответствии с первым аспектом данного изобретения, или композиция, полученная в соответствии со вторым аспектом данного изобретения, для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака у пациента, который не является источником указанных провоспалительных зрелых ДК или МКПК.
Дальнейшие варианты реализации настоящего изобретения определяются в зависимых пунктах формулы изобретения.
Настоящее изобретение отличается от предшествующего уровня техники тем, что после отмены активационных стимулов оно обеспечивает продуцирование высоких концентраций желаемых цитокинов, таких как хемокин (С-Х-С участок) лиганд 9 (CXCL9), также известный как MIG, СС-хемокин 3 (CCL3), также известный как макрофагальный воспалительный белок 1-альфа (MIP-1α), фактор некроза опухолей альфа (ФНО-α), ИЛ-1β и ИЛ-12, и, таким образом, подходит для применения, например в виде инъекций, без наличия экзогенных факторов, стимулирующих созревание.
При введении в опухоль пациента аллогенным образом, то есть пациенту, который не являлся донором, от которого получены указанные провоспалительные ДК или МКПК, используемые для создания провоспалительных ДК, такие провоспалительные ДК будут активировать собственные ДК пациента, которые вследствие этого превратятся в мигрирующие ДК, загруженные опухолевыми антигенами. Этот эффект обусловлен способностью введенных провоспалительных ДК производить в большом количестве комбинации желаемых цитокинов и ИЛ-12, включая хемокин MIP-1α/CCL3, который рекрутирует (привлекает) дендритные клетки, естественные киллеры (NK-клетки) и Т-клетки памяти, хемокин MIG/CXCL9, который рекрутирует NK-клетки и Т-клетки памяти, а также цитокин ИЛ-12, активирующий NK клетки. Кроме того, одно из преимуществ зрелых ДК, таких как провоспалительные зрелые ДК, по сравнению с незрелыми ДК, состоит в том, что они могут усиливать активацию NK-клеток посредством межклеточных контактов. Тот факт, что провоспалительные ДК не зависят от сильного экзогенного активирования, например действия факторов созревания, является их преимуществом, в противном случае, присутствие в опухоли сильных экзогенных активирующих факторов может вызвать дифференцировку собственных ДК пациента, привлеченных в опухоль, в специфичные для пациента, т.е. собственные, провоспалительные ДК, а не в желаемые мигрирующие ДК, специфичные для пациента. Таким образом, чтобы обеспечить оптимальную возможность активировать NK-клетки, для достижения высокого уровня экспрессии молекул, таких как CD86, вероятно, будет необходима минимум 18-часовая стимуляция созревающих ДК. На основании данных, известных в данной области техники, активированные/зрелые ДК не могут продуцировать значительное количество ИЛ-12 после 18 часов стимуляции. Выработка интерлейкина сохраняется, если прервать активацию всего через 8 часов. Однако, эти ДК не будут иметь достаточно времени для усиления экспрессии соответствующих молекул, активирующих NK клетки.
Более того, известно, что пересадка аллогенных органов, тканей или зрелых ДК вызывает сильную иммунизацию, приводящую к увеличению количества аллореактивных CD4+ Т-клеток, которые являются специфичными для аллогенных МНС-пептидов, презентируемых на молекулах «своих» белков МНС класса II (self-МНС class II molecules, так называемый непрямой путь аллогенного распознавания). При использовании аллогенных провоспалительных ДК для внутриопухолевой инъекции указанные ДК впоследствии будут убиты (отторгнуты) иммунной системой реципиента, и, таким образом, станут источником высоко иммуногенных эпитопов CD4+ Т-хелперов (аллогенные МНС-пептиды), которые будут захвачены собственными рекрутированными ДК что, скорее всего, приведет к нарушению CD8 толерантности пациента, у котрого присутствует опухоль, к опухолевым антигенам. Указанные провоспалительные ДК, таким образом, будут выступать в качестве адъюванта, а не в качестве мигрирующих ДК, что как является преимуществом настоящего изобретения, так и отличает его от предшествующего уровня техники в данной области. Например, если простагландин Е2 (PGE2) включить в другие коктейли для созревания ДК, зрелая ДК станет мигрирующей клеткой, которая быстро покинет место инъекции (опухоль) - процесс, который является неблагоприятным в рамках данного изобретения.
При использовании аллогенных ДК, например у пациента, не являвшегося источником или донором провоспалительных зрелых ДК или МКПК, не требуется индивидуально готовить такой потенциальный адъювант для каждого конкретного пациента, что позволяет использовать крупномасштабное производство с последующими более низкими затратами на производство. Кроме того, такая вакцина может быть заморожена и отправлена на большие расстояния, что еще больше повышает ее коммерческую ценность.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Эти и другие аспекты, особенности и преимущества, которые присущи данному изобретению, станут очевидны и будут разъяснены на основании нижеследующего описания вариантов реализации настоящего изобретения, со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
Фиг.1 Схематическая иллюстрация способа в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения.
Фиг.2 Схематическая иллюстрация способа в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.3 Графики, демонстрирующие продукцию CCL3/MIP-1α (фиг.3С), CCL5/RANTES (фиг.3А) и CXCL9/MIG (фиг.3В) провоспалительными зрелыми ДК в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.4 График, демонстрирующий продукцию ИЛ-12 провоспалительными зрелыми ДК в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.5 Графики, демонстрирующие продукцию ИЛ-1β и ФНО-α композицией в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.6 Графики, демонстрирующие продукцию ИЛ-1β и ФНО-α композицией в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.7 График, демонстрирующий продукцию ИФН-γ композицией в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения.
Фиг.8 Графики цитофлуориметрического анализа (FACS), демонстрирующие влияние различных веществ на созревание незрелых ДК; (Фиг.8А-8С).
Фиг.9 Графики цитофлуориметрического анализа, демонстрирующие влияние провоспалительных зрелых ДК, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, или композиции, в соответствии со вторым аспектом, на созревание незрелых ДК. (Фиг.9А-9D).
Фиг.10 График, демонстрирующий объем опухоли в исследовании, касающемся одного из вариантов реализации настоящего изобретения.
Фиг.11 Фотографии результатов гистопатологического анализа (первичная опухоль) в исследовании, касающемся одного из вариантов реализации настоящего изобретения.
Фиг.12 Фотографии контрольных результатов гистопатологического анализа (первичная опухоль) в исследовании, касающемся одного из вариантов реализации настоящего изобретения.
Фиг.13 Фотографии результатов гистопатологического анализа (вторичная опухоль) в исследовании, касающемся одного из вариантов реализации настоящего изобретения.
Фиг.14 Фотографии контрольных результатов гистопатологического анализа (вторичная опухоль) в исследовании, касающемся одного из вариантов реализации настоящего изобретения.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для того чтобы специалисты в данной области имели возможность осуществить изобретение ниже будут более подробно описаны несколько вариантов реализации настоящего изобретения со ссылками на прилагаемые чертежи. Тем не менее, настоящее изобретение может быть реализовано в различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное вариантами реализации, изложенными далее. Указанные варианты, главным образом, обеспечиваются для исчерпывающего и более тщательного описания изобретения, а также для полной передачи целей настоящего изобретения специалистам в данной области. Варианты реализации изобретения не ограничивают его, однако изобретение ограничивается только прилагаемыми пунктами формулы изобретения. Кроме того, терминология, используемая в подробном описании конкретных вариантов реализации, проиллюстрированных в прилагающихся чертежах, не предназначена для ограничения использования настоящего изобретения.
Адъюванты, вводимые в опухоль и предназначенные для индукции эффективного антиопухолевого иммунного ответа, скорее всего, должны вызвать 3 события в инъецированной опухоли, которые все важны для достижения ЦТЛ-опосредованного уничтожения опухоли.
Во-первых, незрелые ДК (нДК) должны быть привлечены в опухоль для контакта с опухолевым антигеном. В данной области техники хорошо известно, что хемокин MIP-1α/CCL3 активно стимулирует привлечение нДК, в том числе привлечение нДК в опухоль in vivo.
Во-вторых, чтобы сделать опухолевые антигены доступными для привлеченных нДК важно индуцировать апоптоз опухолевых клеток. В данной области техники существует несколько различных способов достижения этой цели, в том числе способы, которые вызывают привлечение в опухоль и активацию естественных киллеров (NK-клеток). На различных моделях у мышей неоднократно было показано, что первичное уничтожение чувствительных клеток опухоли NK-клетками, в основном за счет индукции апоптоза, эффективно вызывает последующее развитие ДК-опосредованного опухоль-специфичного ЦТЛ-ответа к родительским опухолевым клеткам, устойчивым к NK-клеткам. Известно, что NK-клетки экспрессируют рецептор хемокинов CXCR3. На нескольких моделях животных было продемонстрировано CXCR3-зависимое привлечение естественных киллеров. Одним из хорошо известных CXCR3-лигандов является MIG/CXCL9, существуют доказательства того, что NK-клетки накапливаются в опухоли после инъекции в нее MIG/CXCL9.
По-видимому, для эффективного уничтожения опухолевых клеток естественными киллерами также необходимо наличие факторов, активирующих NK-клетки, таких как ИЛ-12, который представляет собой мощный активатор антиопухолевой активности NK-клеток in vitro и in vivo.
В-третьих, должно быть индуцировано созревание привлеченных нДК в зрелые мигрирующие ДК.
Ранние стадии вирусной инфекции (обычно ведущие к Th1-опосредованному иммунному ответу), как правило, связаны с локальным привлечением и активацией, как ДК, так и NK-клеток. В недавнем исследовании проводилось изучение способности NK клеток периферической крови человека, которые были подвергнуты короткой (ночь) инкубации с ИЛ-12 или ИЛ-4, индуцировать созревание ДК. Примечательно, что только NK-клетки, которые были стимулированы ИЛ-12, могли вызвать существенное созревание ДК. Поэтому был сделан вывод, что NK-клетки, стимулированные ИЛ-12 в течение промежутка времени, сопоставимого со временем ответа in vivo, могут способствовать выбору соответствующих зрелых ДК для последующей инициации Th1-клеток во вторичных лимфоидных органах (5). Эти данные, полученные на иммунных клетках человека in vitro, соответствуют данным, полученным в ходе исследований на мышах in vivo, которые продемонстрировали, что Th1-опосредованные ответы значительно увеличиваются, когда введение мышам загруженных антигеном ДК сопровождается накоплением привлеченных NK-клеток, по сравнению с ситуациями, в которых привлечение NK-клеток отсутствует.
Также было показано, что созревание Th1-поляризующих ДК индуцируется растворимыми факторами, вырабатываемыми поликлонально активированными Т-клетками. Содержание нескольких растворимых факторов, включая CD40-лиганд, ФНО-α и ИФН-γ, было показано при обработке незрелых ДК кондиционированной Т-клетками средой (ТССМ), приготовленной из бесклеточных супернатантов анти-CD3-активированных Т-клеток или Т-клетками, активированными двойной стимуляцией антителами против CD3 и против CD28. Известно, что в отличие от умеренного усиления экспрессии ко-стимулирующих молекул, при добавлении среды кондиционированной отдельными цитокинами и моноцитами, обработка незрелых ДК ТССМ вызывает значительное дозазависимое увеличение экспрессии ко-стимулирующих молекул. Способность ТССМ вызывать такие фенотипические изменения дополнительно ингибируется нейтрализующими антителами, специфичными для CD40L, ФНО-α и ИФН-γ, что указывает на участие этих факторов, присутствующих в ТССМ, в созревании ДК. Важно отметить, что обработанные ТССМ ДК могут вырабатывать высокие уровни ИЛ-12, участвующего в развитии Th1 ответа.
Наконец, известно, что CD4+ Т-клетки играют ключевую роль в инициации, распространении и памяти, а также в выживании CD8+ ЦТЛ, помогая мигрирующим ДК во время межклеточного взаимодействия с антиген-специфичными CD8+ Т-клетками в дренирующих лимфатических узлах. Некоторые исследования в области иммунотерапии рака опирались на подход, заключающийся в том что, распознавание CD4+ Т-клетками II класса МНС-пептидов из опухолевого антигена дикого типа могло бы обеспечить необходимую помощь для ЦТЛ-индукции. Тем не менее, из-за развития толерантности CD4+ Т-клеток к указанным собственным белкам, которая возникает во время прогрессирования опухоли, помощь, которую обеспечивают пептиды из опухолевых антигенов, часто будет слабой или будет отсутствовать, что может ухудшить терапевтический эффект вакцины. Недавние исследования на мышах показали, что добавление в месте вакцинации чужеродных эпитопов CD4+ Т-хелперов к связанным с опухолью собственным белкам является достаточным условием для преодоления установленной CD8 толерантности к опухолевым антигенам.
Все вместе, эти данные свидетельствуют о том, что адъювант, вводимый в опухоль и предназначенный для индукции эффективного противоопухолевого адаптивного (Т-клеточного) иммунного ответа, должен характеризоваться высокой и устойчивой продукцией MIP-1α/MIP-1α/CCL3 (привлечение ДК, NK и Т-клеток), MIG/CXCL9 (привлечение NK-клеток и Т-клеток памяти), ИЛ-12р70 (высвобождение опухолевых антигенов и созревание мигрирующих ДК, опосредованное NK-клетками) и, наконец, наличием иммуногенных чужеродных белков, которые могут выступать в роли эпитопов CD4+ Т-клеток при ДК-опосредованном прайминге опухоль-специфичных CD8+ Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах.
Дендритные клетки человека моноцитарного происхождения потенциально способны вырабатывать высокие уровни MIP-1α/CCL3, ИЛ-12р70 и M1G/CXCL9 при постоянный стимуляции определенными TLR-лигандами, которые также приводят к созреванию ДК. Указанные устойчиво активированные провоспалительные зрелые ДК должны быть отмыты перед введением в опухоль. Если ДК не отмыты, то одновременное введение стимулирующих агентов (направленных на индукцию провоспалительных ДК ех vivo), скорее всего, приведет также к сильной и продолжительной активации привлеченных в опухоль незрелых ДК, которая вызовет их дифференцировку в зрелые провоспалительные ДК, вместо желаемой дифференцировки в мигрирующие зрелые ДК. К сожалению, известно, что устранение стимулов, индуцирующих созревание, таких как TLR4 лиганд или CD40L в те моменты времени, когда ДК дифференцировались в зрелые ДК (как правило, минимум после 12 часов стимуляции), вызывает быстрое подавление синтеза воспалительных цитокинов, включая выработку ИЛ-12. Таким образом, следует применять активационные способы, которые стимулируют дифференцировку ДК в зрелые провоспалительные ДК с устойчивым продуцированием желаемых факторов после прекращения действия активационных стимулов.
В ходе работы над настоящим изобретением был найден способ получения провоспалительных зрелых ДК, которые производят удивительно высокие уровни желаемых хемокинов и ИЛ-12 после прекращения устойчивой стимуляция сильными активирующими факторами, в результате чего формируется пул ДК, свободных от стимулирующих факторов. Такие провоспалительные зрелые ДК можно вводить пациенту аллогенным способом, то есть пациенту, который не являлся источником указанных ДК.
Указанные провоспалительные зрелые ДК можно смешивать с мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) с получением композиции. Указанные провоспалительные зрелые ДК можно покрыть суперантигеном, таким как энтеротоксин В золотистого стафилококка (SEB), который вызовет поликлональнуюй активацию Т-клеток в популяции МКПК.
При введении пациенту, указанные провоспалительные зрелые ДК или композиции вызовут иммунный ответ, который в свою очередь приведет к развитию клеточного иммунного ответа против опухоли, с последующим уничтожением опухолевых клеток.
Данные эффект особенно устойчив, если пациент не является ни донором МКПК, ни источником указанных провоспалительных зрелых ДК, то есть они аллогенны для пациента. В таком случае, указанные провоспалительные зрелые ДК или композиция будут действовать в качестве чужеродных эпитопов CD4+ Т-хелперов.
Указанные провоспалительные зрелые ДК или композиция будут способствовать привлечению собственных ДК, NK- и Т клеток пациента в место инъекции, благодаря способности провоспалительных зрелых ДК вырабатывать высокие уровни соответствующих хемокинов, таких как MIP-1α/CCL3, и активировать привлеченные NK-клетки посредством межклеточных взаимодействий, а также способности провоспалительных зрелых ДК вырабатывать высокие уровни цитокина ИЛ-12, что приведет к антигенной загрузке собственных привлеченных ДК пациента иммуногенным опухолевым материалом из опухолевых клеток, уничтоженных естественными киллерами.
В предпочтительном варианте реализации композицию 100 вводят непосредственно в опухоль. Очень важной является способность привлекать ДК по всему объему опухоли, так как у большинства обследованных онкологических пациентов ДК были найдены в основном на периферии опухолей, что может ограничить их взаимодействие с опухолевыми клетками. Важно отметить, что потенциал хемокинов привлекать собственные циркулирующие ДК пациентов в опухоль подвергает опухолевые клетки воздействию свежих созревших/привлеченных ДК (в отличие от локальных ДК), которые могут быть меньше подвержены иммуносупрессивному воздействию опухолевой среды.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения в соответствии с фиг.1, предложен способ 10, согласно которому обеспечивают 11 мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) 101. Моноциты 102 изолируют 12 из указанных МКПК 101. Незрелые ДК (нДК) 103 получают 13 из указанных моноцитов 102 и созревание нДК 103 индуцируют 14 путем добавления индукторов активации поли-И:Ц, R848 и ИФН-γ к нДК103, с последующей промывкой для удаления всех активирующих факторов, что в результате приведет к получению провоспалительных зрелых ДК 104 свободных от стимулирующих факторов.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения стадия индукции 14 созревания нДК 103 дополнительно включает в себя добавление, по меньшей мере, одного из веществ, выбранных из группы, состоящей из: ИФН-α, ИЛ-1β и ФНО-α.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения получение 13 нДК индуцируют путем культивирования моноцитов в водной среде, которая содержит ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 2-7 дней, например от 3 до 5 дней, или 3 или 5 дней.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения в соответствии с фиг.2А обеспечивается способ 20 получения композиции 100, такой как совместная культура провоспалительных ДК 104 и МКПК 101. Указанный способ включает обеспечение 21 мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) 101, получение 22 провоспалительных зрелых ДК 104, смешивание 23 указанных МКПК 101 и указанных провоспалительных зрелых ДК 104.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения в соответствии с фиг.2 В обеспечивается способ получения 20 композиции 100, который содержит дополнительную стадию обработки 22b провоспалительных зрелых ДК 104 суперантигеном 200 перед указанным смешиванием.
Указанные выше варианты реализации изобретения будут более подробно описаны далее.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Следующие способы экспериментальной реализации изобретения не ограничиваются конкретной формой, изложенной далее. Настоящее изобретение в некоторой степени ограничивается только прилагаемыми пунктами формулы изобретения и другие варианты реализации изобретения, отличные от вышеуказанных конкретных вариантов, в равной степени возможны в пределах формулы изобретения.
Выделение МКПК и моноцитов
Мононуклеары периферической крови (МКПК) 101 выделяли из периферической крови, полученной от здоровых доноров (Sahlgrenska sjukhuset, Гетеборг, Швеция), при помощи центрифугирования в градиенте плотности с использованием Lymphoprep (Nycomed, Pharma, Осло, Норвегия), хорошо известного специалистам в этой области. МКПК 101 ресуспендировали в среде Cellgro (Cell Genix, Фрайбург, Германия) до конечной концентрации 2,5β×106/мл с последующей инкубацией в плоскодонном 24-луночном иммунологическом планшете (1 мл/лунку) при 37°С, 6% С02. Через 2 часа не адгезированные клетки удаляли, в то время как оставшиеся прикрепившиеся клетки дважды промывали фосфатным буфером (ФБ, PBS), в результате были получены изолированные моноциты 102 (в основном состоящей из CD1 + клеток).
Получение ДК
Для того чтобы дифференцировать моноциты 102 в незрелые ДК 103, моноциты 102, взятые после процедуры выделения, культивировали в течение 3 или 5 дней в свежей водной среде, такой как среда Cellgro, дополненной индукторами, например рекомбинантным человеческим ИЛ-4 1000 Ед/мл и рекомбинантным человеческим ГМ-КСФ 1000 Ед/мл (все производства Cell Genix, Фрайбург, Германия).
Поучение незрелых ДК (нДК) моноцитарного происхождения 103 в среде с ИЛ-4 и ГМ-КСФ является повсеместно принятой in vitro моделью, и такие клетки могут рассматриваться как аналогичные периферическим тканевым ДК.
Созревание ДК
После 3 или 5 дней культивирования в среде Cellgro, дополненной ИЛ-4 и ГМ-КСФ, созревание незрелых ДК 103 было индуцированно добавлением к культуральной среде 20 мкг/мл поли-И:Ц (Sigma, Штайнхайм, Германия), иммуностимулятором, специфичным для TLR-3 рецепторов, также известным как полиинозиновая:полицитидиновая кислота, либо натриевой солью полиинозиновой:полицитидиновой кислоты и 2 мкг/мл R848 (Sigma, Штайнхайм, Германия), 7/8-лигандом Toll-подобного рецептора, также известного как резиквимод, либо комбинации поли-И:Ц и R848 дополненной 1000 Ед/мл гамма-интерферона (ИФН-γ, R&D systems, Миннеаполис, США). Для получения провоспалительных зрелых ДК 104 в соответствии с аспектом изобретения через 18 часов инкубации клетки отмывали три раза и затем вновь инкубировали в свежей среде (без добавления экзогенных активирующих факторов) в течение 24 часов.
Супернатанты культур собирали в соответствии с протоколами, хорошо известными специалистам в данной области.
Для определения уровней хемокина CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/Моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) и цитокина интерлейкин 12 (ИЛ-12) супернатанты подвергали твердофазному ИФА (ELISA), описанному ниже.
Смешанная культура ДК и МКПК
МКПК 101 и провоспалительные зрелые ДК 104 были получены в соответствии с методиками, описанными выше.
Для достижения быстрого созревания и поликлональной активации Т-клеток из МКПК 101, на стадии созревания ДК к культуре добавили 0,01 мкг/мл SEB (R&D systems, Миннеаполис, США) за 30 минут до отмывки. После трехкратной отмывки в ФБ провоспалительные зрелые ДК 104 (2,5×105 клеток/мл) совместно культивировали в течение 24 часов с 1×106 клеток/мл аллогенных МКПК (выделенных из периферической крови здоровых доноров, как описано выше), общий объем среды составлял 1 мл.
Супернатант культуральной жидкости, полученной из смешанной культуры провоспалительных зрелых ДК 104 и аллогенных МКПК, так называемый MLR супернатант, собирали и затем хранили при температуре -80°С. Супернатанты позже анализировали с помощью ELISA на наличие известных факторов активации или созревания ДК, таких как ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-1β, как описано ниже. Супернатанты были исследованы на наличие известных факторов индуцирующих фенотипическое созревание нДК, в соответствии с описанной ниже методикой.
ELISA
Уровни CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, ИЛ-12, ФНО-α, ИЛ-1β и γ-интерферона измеряли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с применением набора Duo Set ELISA Development System, производства R&D systems (Миннеаполис, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Оценка фенотипического созревания
Дендритные клетки моноцитарного происхождения 103 (нДК) были получены, как описано выше. После 5 дней инкубации в среде Cellgro, дополненной ИЛ-4 и ГМ-КСФ, незрелые ДК 103 инкубировали при 37°С в течение 24 часов в 300 мкл MLR супернатантов, описанных выше, и 100 мкл свежей среды Cellgro. ДК, культивированные без добавления супернатанта, использовали в качестве контроля. Чтобы определить, вызывают ли MLR супернатанты созревание, образцы окрашивали РЕ-конъюгированными антителами к CD86 человека в комбинации с FITC-конъюгированными антителами к CD83 человека. Мышиные IgG1 и IgG2, конъюгированные с FITC и РЕ, использовали в качестве изотипического контроля (все антитела производства BD Biosciences, Калифорния, США). Образцы анализировали методом проточной цитометрии (FACS) с помощью Cell Quest Software (BD Bioscience, Калифорния, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ниже обсуждаются результаты экспериментальной части.
Устойчивое продуцирование желаемых воспалительных хемокинов
Как показано на фигуре 3, продукция CCL3/MIP-1α (фиг.3С), CCL5/RANTES (фиг.3А) и CXCL9/MIG (фиг.3В) провоспалительными зрелыми ДК 104 от 3 исследованных доноров крови было выше, если нДК были индуцированы посредством культивирования в течение 5 дней в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4 перед комбинированной TLR стимуляции, т.е. индукции 14 созревания, по сравнению с культурой, инкубировавшейся в течение 3 дней в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4. Кроме того, комбинированная TLR стимуляция с добавлением ИФН-γ дала самые высокие уровни CCL3/MIP-1α и CXCL9/MIG, в то время как продукция CCL5/RANTES не зависела от добавления ИФН-γ.
Таким образом, провоспалительные дендритные клетки (ДК) стимулировали до созревания ex vivo, посредством обработки такими веществами как натриевая соль полиинозиновой-полицитидиновой кислоты (поли-И:Ц), резиквимодом (R848) и гамма-интерфероном (ИФН-γ).
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения провоспалительные дендритные клетки (ДК) были дополнительно стимулированы, по меньшей мере, одним из веществ, выбранных из группы, состоящей из интерферона а (ИФН-α), интерлейкина-1 бета (ИЛ-1β) и фактора некроза опухоли α (ФНО-α).
Примечательно, что зарегистрированные высокие уровни соответствующих хемокинов продуцировались после удаления стимулов, индуцирующих созревание. То, что провоспалительные зрелые ДК 104 свободны от сильных экзогенных активирующих факторов, например вызывающих созревание, является преимуществом, поскольку в противном случае присутствие сильных экзогенных активирующих факторов в опухоли может вызвать дифференциацию собственных ДК пациентов, привлеченных в опухоль, в собственные специфичные для пациента провоспалительные ДК, а не в желаемые мигрирующие ДК.
В течение 24 ч после отмены стимулов провоспалительные зрелые ДК производят не менее 25000 пг ИЛ-12/мл/106 клеток, в частности 120000 пг/мл/106 клеток, не менее 100000 пг CXCL9/мл/106 клеток, в частности 400000 пг/мл/106 клеток, и не менее 40000 пг CCL3/мл/106 клеток, в частности 180000 pg/мл/106 клеток.
В течение 24 ч после отмены стимулов провоспалительные зрелые ДК могут также производить CCL5/RANTES, в частности 17500 пг/мл/106 клеток.
Не было обнаружено определяемых количеств (предел обнаружения 312 пг/мл) CCL2/MCP-1 (данные не представлены). На фиг.3 показаны уровни CCL3/MIP-1 альфа (фиг.3С), CCL5/RANTES (фиг.3А) и CXCL9/MIG (фиг.3В), полученные с помощью ELISA. Результаты представлены в виде средних значений, полученных от трех человек, и стандартного отклонения среднего. Соответствующая ось ординат отражает количество соответствующего вещества, производимого в пг/мл/2,5×105 клеток в течение 24 ч после отмены стимулов. На оси абсцисс показаны различные проанализированные комбинации.
Устойчивое продуцирование ИЛ-12р70
Поскольку было установлено, что комбинированная TLR стимуляция, т.е. индукция 14 созревания, с или без одновременной стимуляции ИФН-γ вызывает устойчивую и сильную выработку провоспалительными зрелыми ДК 104 хемокинов, привлекающих NK-клетки (CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES и CXCL9/MIG), особый интерес представлял вопрос могут ли указанные ДК одновременно высвобождать ИЛ-12, такой как ИЛ-12р70, хорошо известный фактор активации естественных киллеров. Как показано на фигуре 4, двойная стимуляция TLRs (например, R848 и поли-И:Ц) вызывает сильное и устойчивое продуцирование ИЛ-12р70 после отмены индуцирующих созревание стимулов, таких как индукторы активации. Кроме того, добавление ИФН-γ при активации дополнительно усиливает продуцирование ИЛ-12р70. Как и при продукции хемокинов, продуцирование ИЛ-12р70 было оптимальным (в 3 из 4 экспериментов), когда моноциты культивировались в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 5 дней, по сравнению с инкубацией в течение 3-х дней перед активацией. На фиг.4 показано количество Ил-12р70, вырабатываемого после индукции созревания ДК. Результаты представлены в виде средних значений, полученных в трех экспериментах с различными донорами, и стандартного отклонения среднего. Ось ординат отражает количество вещества, производимого в пг/мл/2,5×105 клеток в течение 24 ч после отмены стимулов. На оси абсцисс показаны различные проанализированные комбинации.
Смешанная культура зрелых ДК или SEB-покрытых зрелых ДК с аллогенными МКПК индуцирует продуцирование факторов, вызывающих созревание ДК.
Как известно, провоспалительные растворимые факторы, которые выделяются активированными NK- и Т-клетками, способствуют созреванию минорных незрелых ДК. В связи с этим особый интерес представлял вопрос, могут ли провоспалительные зрелые ДК 104, при их совместном культивировании с аллогенными МКПК (имитирующими привлеченные иммунные клетки) в композиции 100, индуцировать выработку цитокинов, которые, как известно, важны для созревания ДК. Чтобы оптимизировать активацию Т-клеток, индуцированную дендритными клетками, ДК покрывали суперантигеном, таким как стафилококковым энтеротоксином В (SEB), посредством добавления SEB к культуре дендритных клеток в конце периода стимуляции (за 30 минут до отмывки) с двойным агонистом TLR и ИФН-γ. Как известно, суперантигены, в том числе SEB, образуют комплексы с молекулами II класса МНС на поверхности антиген-презентирующих клеток и стимулируют Т-клетки через взаимодействие с Т-клеточным рецептором. В ответ на SEB происходит быстрая поликлональная активация CD4+ и CD8+ Т-клеток, что приводит к увеличению продукции провоспалительных медиаторов, включая ФНО-αα, ИЛ-1 и ИФН-γ.
До 20% пула Т-клеток может быть стимулировано SEB, "гиперактивация" Т-клеток обычно происходит в течение 48 часов после воздействия SEB.
После повторных отмывок провоспалительные зрелые ДК 104, с или без одновременного "покрытия" SEB, совместно культивировали с аллогенными МКПК в течение 24 ч, после чего при помощи ELISA измеряли уровни ФНО-α, ИЛ-10 и ИФН-γ, выделенных в супернатант. Можно использовать другие типы суперантигенов, такие как стафилококковый энтеротоксин А, С, D, Е, F, G, Н и J, а также стафилококковый токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1). Как показано на фиг.5А смешанная культура аллогенных МКПК и провоспалительных зрелых ДК 104, покрытых SEB, (стимулированных комбинированными TLR лигандами), индуцировала существенную продукцию ИЛ-1β, в отличие от культуры незрелых ДК. Помимо этого, смешанная культура аллогенных МКПК и провоспалительных зрелых ДК 104, покрытых SEB, индуцировала существенную продукцию ФНО-α, которая была незначительно повышена при использовании зрелых ДК. Добавление ИФН-γ к двойной стимуляции TLR во время созревания ДК существенно не влияло на продукцию ИЛ-1β и ФНО-α. Примечательно, что покрытие SEB заметно способствовало высвобождению ИЛ-1β и ФНО-α в настоящей модели смешанных культур (фиг.6), это свидетельствует о том, что поликлонально активированые Т-клетки являются известным источником указанных цитокинов.
Таким образом, в течение 24 ч после отмены стимулов провоспалительные зрелые ДК могут продуцировать не менее 2000 пг ФНО-α/мл/106 клеток, в частности 32000 пг/мл/106 клеток и не менее 500 пг ИЛ-1β/мл/106 клеток, в частности 2500 пг/мл/106 клеток.
Было показано, что ИФН-γ, также как и ИЛ-1β и ФНО-α, наиболее активно продуцируется при использовании смешанной культуры зрелых ДК, которые были покрыты SEB (фиг.7), скорее всего, вследствие поликлональный активации Т-клеток. Добавление МКПК к TLR и ИФН-γ стимулированным ДК незначительно индуцировало продукцию ИФН-γ, который, возможно, выделяется естественными киллерами, активированными ИЛ-12, происходящим из провоспалительных зрелых ДК 104.
Фиг.5 демонстрирует уровни цитокина ИЛ-1β (фиг.5А) и ФНО-α (фиг.5 В), измеренные при помощи ELISA. Фиг.6 демонстрирует уровни цитокина ИЛ-1β (фиг.6А) и ФНО-β (фиг.6В), измеренные при помощи ELISA, но с добавлением среды, МКПК или МКПК/SEB. На фиг.5 результаты представлены в виде средних значений, полученных от четырех пациентов, и стандартного отклонения среднего. На фиг.6 показаны результаты одного эксперимента.
Фиг.7 демонстрирует уровни цитокина ИФН-γ в супернатантах, измеренные при помощи ELISA. На фиг.7 показаны результаты одного эксперимента.
Соответствующая ось абсцисс на рис 5, 6 и 7 показывает количество соответствующих веществ, производимых в пг/мл/2.5×105 клеток в течение 24 ч после отмены стимулов. Соответствующая ось ординат показывает различные проанализированные комбинации.
Фенотипическое созревание минорных незрелых ДК
Супернатанты смешанных культур провоспалительных зрелых ДК 104, с или без покрытия SEB, и аллогенных МКПК 101 затем исследовали на способность вызывать фенотипическое созревание минорных незрелых ДК. Таким образом, обеспечивается композиция 100, которая содержит провоспалительные зрелые ДК 104 в соответствии с любым из предшествующих пунктов и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) 101. Для стимуляции минорных незрелых ДК, полученных из прикрепленной культуры моноцитов в течение 5 дней культивирования в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4, использовали супернатанты смешанных культур. После 24 часов стимуляции клетки собирали для цитофлуориметрического анализа. Для изучения экспрессии совместно стимулирующих молекул (CD86) и маркеров созревания (CD83) использовали антитела к CD86 и CD83 человека, соответственно. Как показано на фиг.8, супернатанты совместных культур провоспалительных зрелых ДК 104, созревание которых было вызвано комбинированной стимуляцией TLR, то есть путем добавления поли-И:Ц, R848 к нДК 103, с последующим покрытием SEB, индуцировали значительную экспрессию CD86 и CD83 на поверхности минорных ДК. Таким образом, композиция 100 может содержать суперантиген. Как следует из фиг.8С, добавление ИФН-γ в течение TLR-опосредованного созревания ДК вакцины не способствовало дополнительному, супернатант-индуцированному, фенотипическому созреванию минорных незрелых ДК.
Фиг.8 демонстрирует влияние SEB и TLR лигандов, т.е. индукторов созревания, на незрелые ДК 103. Для получения нДК 103 прикрепленные моноциты инкубировали в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 5 дней. Супернатанты из MLR с SEB/TLR стимулированными провоспалительными зрелыми ДК 104 и МКПК 101 добавляли на 5-й день и затем осуществляли дополнительную инкубацию в течение 24 часов. Для изучения совместно стимулирующих молекул и маркеров созревания клетки собирали и окрашивали при помощи антител к CD86 и CD83 человека. TLR лиганды и SEB активно индуцировали экспрессию маркеров созревания и совместно стимулирующих поверхностных маркеров. Представлены результаты одного репрезентативного эксперимента из двух.
Как показано на фиг.9 В, супернатанты из культур клеток, содержащих только провоспалительные зрелые ДК 104, созревание которых было вызвано комбинированной стимуляцией TLR плюс ИФН-γ, индуцировали значительную экспрессию CD83 на поверхности минорных ДК. Из фиг.9С следует, что экспрессия CD83 еще больше усиливалась при добавлении супернатантов смешанных культур аллогенных МКПК и провоспалительных зрелых ДК 104. Наконец, из фиг.9D следует, что супернатанты от смешанных культур провоспалительных зрелых ДК 104, покрытых SEB, и аллогенных МКПК 101 индуцировали значительную экспрессию CD83. Это свидетельствует о том, что включение SEB в смешанную культуру 100 провоспалительных зрелых ДК 104 и аллогенных РВМС 101 важно для индукции максимального созревания минорных незрелых ДК, которое вызвано добавлением супернатанта.
С учетом вышеуказанных результатов, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечивается композиция 100 или провоспалительные зрелые ДК 104 для применения в качестве лекарственного средства.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечивается композиция 100 или провоспалительные зрелые ДК 104 для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечивается композиция 100 или провоспалительные зрелые ДК 104 для производства лекарственного средства для лечения рака.
Провоспалительные зрелые ДК 104 или композицию 100 можно вводить непосредственно в опухоль.
В одном из вариантов реализации изобретения вид рака выбран из группы, включающей: рак молочной железы, рак простаты, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак желудка и пищевода.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные зрелые ДК 104 или композиция 100 для применения в качестве лекарственного средства у пациентов, не являвшихся донорами провоспалительных зрелых ДК 104 или МКПК 101.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения обеспечиваются провоспалительные зрелые ДК 104 или композиция 100 для применения при лечении онкологических заболеваний у пациентов, не являвшихся донорами провоспалительных зрелых ДК 104 или МКПК 101.
Внутриопухолевая инъекция
Как указывалось выше, провоспалительные зрелые ДК 104 или композиция 100 могут быть введены непосредственно в опухоль для угнетения ее роста.
Чтобы продемонстрировать этот эффект Visionar Preclinical АВ (Уппсала, Швеция) было проведено исследование на крысах в соответствии со следующим ниже описанием.
В данном исследовании было использовано пятнадцать самок крыс линии Фишера. После акклиматизации (минимум одна неделя) 100 мкл суспензии клеток, содержащей 106 МАТ В III клеток (первоначально изолированных из аденокарциномы молочной железы крыс) в RPMI среде, вводили подкожно в заднюю часть левого бока животного (4 день).
Четыре дня спустя в задней части правого бока животного была индуцирована вторая опухоль (0 день). Через четыре дня после инсталляции второй опухоли (задняя часть правого бока, 4 день) в первую опухоль (задняя часть левого бока) вводили провоспалительные зрелые ДК 104 (как описано выше) или только контрольную среду (ФБ с 10% (по объему) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS)). Дозировка провоспалительных зрелых ДК 104 составляла 20 мл на животное, т.е. 105 провоспалительных зрелых ДК 104. Рост первой и второй опухоли регистрировался на протяжении всего исследования. Экспериментальная часть исследования на животных была одобрена региональным комитетом по этике экспериментальных работ на животных г.Упсала, Швеция (С320/9).
Обзор схемы экспериментов показан в таблице 1, представленной ниже.
| Группа | N | Идентификационный номер | Опухоль 1 | Опухоль 2 | Лечение |
| Контроль | 6 | 658, 659, | 1×106 клеток | 1×10 клеток | Контрольный |
| 662, 667, | Левая сторона | Правая сторона | раствор в опухоль, левая сторона | ||
| 668, 671 | (4 день) | (0 день) | (4 день) | ||
| Провоспали- | 9 | 657, 660, | 1×106 клеток | 1×106 клеток | 0,1×106ДК |
| тельные | 661,663, | Левая сторона | Правая сторона | 104 в опухоль, | |
| зрелые ДК | 664,665, | (4 день) | (0 день) | левая сторона | |
| 104 | 666, 669, 670 | (4 день) |
Таблица 1. Дизайн экспериментов. В первом столбце указана группа, затем указано число участвующих крыс (N), уникальный идентификационный номер участвующих крыс, описание индукции опухоли 1 и 2, и, наконец, описание лечения, соответственно.
В день введения вакцины в первую опухоль в задней части левого бока (4-й день), животные случайным образом распределяли на две различные группы в зависимости от объема левой опухоли. В обеих группах животных, инъецированных контрольной средой и провоспалительными зрелыми ДК 104, в опухоль вводили фосфатный буфер, содержащий 10% (по объему) эмбриональной телячьей сыворотки.
Рост опухоли у животных проверяли через день. Когда опухоль определялась при пальпировании, размер опухоли измеряли с использованием штангенциркуля. Записывалась длина и ширина опухоли. Объем опухоли рассчитывался по формуле: длина (см) × ширина (см) × ширина (см) × 0,44.
В соответствии с первоначальным планом предполагалось усыпить трех животных из группы, получавшей провоспалительные зрелые ДК 104, на 7 день, и всех других животных на 15 день (одиннадцать дней после введения второй опухоли). Тем не менее, на 7 день размер левой опухоли у одного контрольного животного и у семи животных в группе, получавшей зрелые провоспалительные ДК 104 (вводили контрольную среду или контрольную среду + клетки вакцины, соответственно), превышал 2 см3, поэтому восемь указанных животных были подвергнуты эвтаназии. Через два дня (9 день), размеры левой (первой) опухоли у семи оставшихся животных также превысили пределы, допускаемые этическими нормами, и животные были подвергнуты эвтаназии.
Опухоли иссекали, взвешивали, замораживали в сухом льду и хранили при -70°С для последующего гистопатологического исследования.
Ниже в таблице 2 представлено описание замороженных опухолей (левая и правая), которые были направлены в Micromorph для гистопатологического анализа. Восемь приготовленных криосрезов микронного размера были окрашены гематоксилином/эозином, а также антителами для визуализации ДК/макрофагов (мышиные антитела к CD68 крысы), NK-клеток (мышиные антитела к CD161a крысы) и CD8-положительных клеток (CD8+ Т-клетки, а также CD8+ ДК/макрофаги), в соответствии с методиками, хорошо известными специалистам в этой области.
Количество иммуногенных клеток в различных опухолях оценивалось слепым методом, как указано далее: несколько положительных клеток (1+), умеренное количество положительных клеток (2+) или большое число положительных клеток (3+).
| Идентификационный | Группа | Экспериментальный |
| номер | день | |
| 659 | Контроль | 7 |
| 661 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 7 |
| 662 | Контроль | 9 |
| 664 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 9 |
| 665 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 7 |
| 667 | Контроль | 9 |
| 670 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 9 |
Таблица 2. Таблица идентификации замороженных образцов опухоли, направленных на гистопатологический анализ. Столбцы показывают идентификационный номер крысы и экспериментальный день проведения эвтаназии, соответственно.
Анализ данных по объемам опухолей, полученных в разных группах, проводили с применением t-теста и дисперсионного анализа (ANOVA) повторных измерений (PASW версия 18 на HP Compac dc7700p). Ниже в таблицах 3 и 4 представлена описательная статистика, рассчитанная по имеющимся объемам опухолей.
| Контрольная среда | Провоспалительные зрелые ДК 104 | |||||||||||
| Опухоль | Опухоль | |||||||||||
| Первая опухоль | Вторая опухоль | Первая опухоль | Вторая опухоль | |||||||||
| Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | |
| OO день2 | 0,03 | 0,02 | 6 | 0 | 0,04 | 0,02 | 9 | 0 | ||||
| OO день4 | 0,20 | 0,05 | 6 | 0 | 0,20 | 0,06 | 9 | 0 | ||||
| OO день 6 | 1,17 | 0,16 | 6 | 0,04 | 0,02 | 6 | 1,40 | 0,22 | 9 | 0,01 | 0,01 | 9 |
| OO день7 | 2,02 | 0,61 | 6 | 0,09 | 0,04 | 6 | 3,35 | 0,55 | 9 | 0,05 | 0,02 | 9 |
| OO день9 | 4,43 | 0,25 | 5 | 0,68 | 0,08 | 5 | 4,32 | 1,04 | о | 0,36 | 0,04 | 2 |
| OO день2 | 0,03 | 0,02 | 6 | 0 | 0,04 | 0,02 | 9 | 0 | ||||
Таблица 3. Объем опухоли (ОО) в разные дни (день*). В таблице представлен средний объем опухоли (мл), стандартная ошибка среднего (SEM), а также количество животных (N) на протяжении всего исследования.
Для анализа объемов опухоли с 6 по 9 день применяли дисперсионный анализ (ANOVA) повторных измерений. Первая и вторая опухоли анализировали отдельно. Благодаря обработке отсутствующих значений в анализе повторных измерений последнее измеренное значение было перенесено вперед.
| Контрольная среда | Провоспалительные зрелые ДК 104 | |||||||||||
| Опухоль | Опухоль | |||||||||||
| Первая опухоль | Вторая опухоль | Первая опухоль | Вторая опухоль | |||||||||
| Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | |
| OO день 6 | 1,17 | 0,16 | 6 | 0,04 | 0,02 | 6 | 1,40 | 0,22 | 9 | 0,01 | 0,01 | 9 |
| OO день7 | 2,02 | 0,61 | 6 | 0,09 | 0,04 | 6 | 3,35 * | 0,55 | 9 | 0,05 | 0,02 | 9 |
| OO день9 | 4,53 * | 0,22 | 6 | 0,57* | 0,13 | 6 | 3,96 * | 0,48 | 9 | 0,12 ** | 0,05 | 9 |
Таблица 4. Средний объем опухоли (мл), стандартная ошибка среднего (SEM), а также количество животных (N) с последним измеренным значением перенесенным вперед. *Р<0,05 по сравнению с 6-м днем в группе. #Р<0,05 по сравнению со всеми с соответствующей опухолью в контрольной группе. **Р<0,05 по сравнению с соответствующей опухолью в контрольной группе.
Ниже в таблице 5 представлена описательная статистика веса опухоли.
| Контрольная среда | COMBIG-ДК | |||||||||||
| Опухоль | Опухоль | |||||||||||
| Первая опухоль | Вторая опухоль | Первая опухоль | Вторая опухоль | |||||||||
| Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | Среднее | Стандартная ошибка среднего | Значимое N | |
| ВО | 3,3491 | 1 | 0,1992 | 1 | 3,1209 | 0,3819 | 7 | 0,1423 | 0,0292 | 7 | ||
| день 7 | ||||||||||||
| ВО | 4,0094 | 0,3604 | 5 | 0,6090 | 0,0690 | 5 | 4,0201 | 0,3530 | 2 | 0,2740* | 0,0104 | 2 |
| день 9 | ||||||||||||
Таблица 5. Средний вес опухоли (ВО, г), стандартная ошибка среднего (SEM) и количество животных (N) в разные дни эвтаназии. *Р<0,05 по сравнению с соответствующей опухолью в контрольной группе (t-тест).
На фиг.10 показан объем (мл) различных опухолей в различных группах (COMBIG-ДК обозначает провоспалительные зрелые ДК 104). Когда животных исключали из исследования, последнее измеренное значение переносили вперед. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Очевидно, что крысы, получавшие провоспалительные зрелые 104 ДК, имели меньший объем как первой, так и второй опухоли.
Первая опухоль росла очень быстро, и в связи с большим объемом опухоли всех животных пришлось умертвить раньше, чем планировалось. Семь из девяти животных в группе, получавшей провоспалительные зрелые ДК 104, и одно из шести животных в контрольной группе пришлось умертвить на 7-й день, в то время как остальных животных на 9-й день. Для выполнения статистического анализа материала результат последнего измерения объема опухоли с 7-го дня был перенесен на 9-й день. Это могло, возможно, привести к ложному занижению величины объема первой опухоли (инъецированной вакциной) на 9-й день. Помимо этого, при анализе результатов по объему и весу первой (слева) опухоли следует учитывать тот факт, что большее количество животных было удалено из группы провоспалительных зрелых ДК 104. Для анализа объемов опухоли с 6 по 9 день использовали дисперсионный анализ повторяющихся измерений. Первая и вторая опухоли анализировали отдельно.
Большие по величине объемы первой опухоли в группе, инъецированной зрелыми провоспалительными ДК 104 на 7-й день, можно объяснить наличием постоянной воспалительной реакции на введенные дендритные клетки, так как иммуногистохимический анализ первой опухоли выявил в этой группе повышенное количество инфильтрирующих воспалительных клеток по сравнению с контрольной группой (см. ниже).
Объем второй опухоли в группе, инъецированной зрелыми провоспалительными ДК 104, был достоверно меньше объема опухоли в контрольной группе.
Кроме того, вес двух вторых опухолей, которые были иссечены на 9-й день в группе, инъецированной зрелыми провоспалительными ДК 104, был достоверно ниже веса опухолей в контрольной группе.
Опухоли были заморожены, а затем разрезаны и окрашены гематоксилином/эозином, а также антителами для визуализации ДК/макрофагов (мышиные антитела к CD68 крысы), NK-клеток (мышиные антитела к CD 161 а крысы) и CD8-положительных клеток (CD8+ Т-клетки, а также CD8+ ДК/макрофаги). Опухоли состояли из злокачественных клеток, окруженных рыхлой соединительнотканной капсулой переменной толщины. Волокна соединительной ткани были перемешаны с опухолевыми клетками. Во всех образцах наблюдались области некротизированных клеток опухоли. В некоторых из первых опухолей (инъецированных) наблюдались пулы кристаллизованного материала. Поскольку явление наблюдалось только в первых опухолях, то больше всего это напоминало введенный материал.
Ниже в таблице 6 представлен краткий обзор описанных результатов.
| Идент. № | Группа | День эксперимента | Опухоль | CD68 | CD161a | CD8a | г/э |
| 659 | Контроль | 7 | Первая | 1-2+ | 1-2+ | 1-2+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток |
| Вторая | 3+ | 2+ | 2-3+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток | |||
| 661 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 7 | Первая | 3+ | 2+ | 3+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток |
| Вторая | 3+ | 2+ | 3+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток | |||
| 662 | Контроль | 9 | Первая | 2+ | 1+ | 2+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток |
| Вторая | 2+ | 1+ | 2+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки | |||
| 664 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 9 | Первая | 1-2+ | 1+ | 2+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки |
| Вторая | 2+ | 1+ | 2+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки | |||
| 665 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 7 | Первая | 3+ | 2+ | 3+ | В основном некротизированные опухолевые клетки |
| Вторая | 3+ | 1-2+ | 2-3+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки | |||
| 667 | Контроль | 9 | Первая | 2+ | 1+ | 2+ | Приблизительно половина некротизированных опухолевых клеток |
| Вторая | 2+ | 1+ | 2+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки | |||
| 670 | Провоспалительные зрелые ДК 104 | 9 | Первая | 2-3+ | 1+ | 2-3+ | В основном некротизированные опухолевые клетки |
| Вторая | 3+ | 1-2+ | 2-3+ | В основном жизнеспособные опухолевые клетки |
Таблица 6. Результаты гистопатологического анализа в различные дни эвтаназии (день эксперимента.). Значения представлены в виде оценки числа ДК/макрофагов (CD68), NK-клеток (CD161a), ДК/ макрофагов (CD8a) и цитотоксических Т-клеток (CD8a).
Морфологическая оценка опухолей проводилась на срезах при помощи окрашивания гематоксилином/эозином.
Инфильтрирующие клетки, положительные на наличие CD8a, CD68 и CD161a, были обнаружены во всех проанализированных образцах опухолей. Положительные клетки были обнаружены как в окружающей опухоль капсуле, так и в области опухоли. Хотя результат не являлся убедительным, по-видимому, у животных, получавших провоспалительные зрелые 104 ДК, имелась тенденция к повышенному количеству исследуемых клеток.
Таким образом, была обнаружена следующая тенденция: инъекция провоспалительных зрелых ДК 104 в опухоль, вызывает повышенное привлечение в нее ДК/макрофагов, NK-клеток и цитотоксических Т-клеток с последующим сокращением объема и веса второй опухоли.
На фиг.11 представлены микрофотографии макрофагов, NK-клеток, цитотоксических Т-клеток (ДК/CD8+), полученные в результате гистопатологического анализа через 3 дня после инъекции провоспалительных зрелых ДК 104 в первичную опухоль.
На фиг.12 представлены микрофотографии соответствующего контрольного среза, полученные в результате гистопатологического анализа после инъекции только контрольной среды.
Таким образом, очевидно, что ДК/макрофаги, NK-клетки и цитотоксические Т-клетки были привлечены в опухоль после введения провоспалительных зрелых ДК 104, но не после введения контрольной среды. На фиг.13 представлены микрофотографии макрофагов, NK-клеток, цитотоксических Т-клеток (ДК/CD8+), полученные в результате гистопатологического анализа через 5 дней после инъекции провоспалительных зрелых ДК 104 в первичную опухоль.
На фиг.14 представлены микрофотографии соответствующего контрольного среза, полученные в результате гистопатологического анализа после инъекции только контрольной среды.
Таким образом, очевидно, что ДК/макрофаги, NK-клетки и цитотоксические Т-клетки были привлечены даже во вторичную опухоль (метастазы) после инъекции провоспалительных зрелых ДК 104 в первичную опухоль, но в меньшей степени после введения только контрольной среды.
Объединенные результаты настоящего исследования вакцины, проведенные на модели опухоли, свидетельствуют, что инъекция провоспалительных зрелых ДК 104 в опухоль вызывает значительное привлечение воспалительных клеток, включая ДК, NK-клетки и Т-клетки в место инъекции (первая опухоль). Подобное интенсивное привлечение воспалительных клеток, вероятно, объясняет наблюдаемое увеличение объема опухоли в первые 2-3 дня после инъекции. Инъекция провоспалительных зрелых ДК 104 в опухоль далее вызывает уменьшение удаленной опухоли (правая опухоль), что свидетельствует о системном противоопухолевом эффекте.
В одном из вариантов реализации изобретения рак выбран из группы, включающей: рак молочной железы, рак простаты, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак желудка и пищевода.
В одном из вариантов реализации изобретения провоспалительные зрелые ДК 104 или композиция 100, в соответствии с вариантами, описанными выше, содержат также фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как носители, консерванты, адъюванты и т.д.
В одном из вариантов реализации изобретения вспомогательное вещество представляет собой 2% САЧ, растворенный в физиологическом растворе хлористого натрия.
В одном из вариантов реализации изобретения зрелые ДК 104 и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) 101, аллогенные по отношению к испытуемому, то есть происходят от донора, который гистологически несовместим с испытуемым, например, полностью несовместим по главному комплексу гистосовместимости.
Преимуществом настоящего изобретения является то, что терапевтическая композиция может быть заранее подготовлена и хранится перед использованием, например в замороженном состоянии. Аллогенная природа композиции по отношению к пациенту также будет способствовать повышению ее эффективности, как обсуждалось выше.
В одном из аспектов настоящего изобретения обеспечивается способ лечения имеющего опухоль млекопитающего. Способ включает разовое или многократное введение пациенту терапевтически эффективного количества провоспалительных зрелых ДК 104 или композиции 100, причем донор, от которого получены провоспалительные зрелые ДК 104 и/или МКПК 101, не является пациентом.
Способом введения может быть инъекция.
В пунктах формулы изобретения термин "включает/включая" не исключает наличия других элементов или этапов. Кроме того, несмотря на индивидуальное перечисление, множество элементов или методических стадий может быть реализовано, например за один шаг. Более того, хотя индивидуальные особенности могут быть включены в различные пункты патентной формулы, они, возможно, могут успешно комбинироваться. Включение в различные пункты патентной формулы не означает, что комбинация особенностей не представляется возможной и/или преимущественной. Кроме того, отдельные ссылки не исключают плюрализма. Термины "a", "an", "первый", "второй" и т.д., не исключают плюрализма. Ссылочные позиции в пунктах формулы изобретения приводятся только в качестве уточняющего примера и в любом случае не должны толковаться как ограничивающие объем формулы изобретения.
Claims (14)
1. Зрелая провоспалительная дендритная клетка (ДК), созревание которой было индуцировано ex vivo посредством обработки незрелой ДК такими веществами, как натриевая соль полиинозиновой-полицитидиновой кислоты (поли-И:Ц), резиквимод (R848) и интерферон-гамма (ИФН-γ), но не простагландином Е2 (ПГЕ2), для применения при лечении рака у индивида посредством инъекции в опухоль, при этом указанная провоспалительная зрелая ДК является аллогенной по отношению к указанному индивиду.
2. Провоспалительная зрелая ДК по п. 1, которая дополнительно стимулирована по меньшей мере одним из веществ, выбранным из группы, состоящей из интерферона α (ИФН-α), интерлейкина-1 бета (ИЛ-1β) и фактора некроза опухолей α (ФНО-α).
3. Провоспалительная зрелая ДК по п. 1, продуцирующая в течение 24 ч после отмены стимулов не менее 25000 пг ИЛ-12/мл/106 клеток, не менее 100000 пг CXCL9/мл/106 клеток и не менее 40000 пг CCL3/мл/106 клеток.
4. Провоспалительная зрелая ДК по п. 3, дополнительно продуцирующая в течение 24 ч после отмены стимулов не менее 2000 пг ФНО-α/мл/106 клеток и не менее 500 мкг ИЛ-1β/мл/106 клеток.
5. Провоспалительная зрелая ДК по п. 1, отличающаяся тем, что указанный рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак пищевода и желудка.
6. Композиция, которая содержит эффективное количество провоспалительных зрелых ДК по любому из пп. 1-4, эффективное количество мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и фармацевтически приемлемый наполнитель, для лечения рака у индивида, по отношению к которому указанные зрелые ДК и МКПК являются аллогенными, причем указанную композицию вводят посредством инъекции в опухоль.
7. Композиция по п. 6, которая дополнительно содержит суперантиген.
8. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанный рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак пищевода и желудка.
9. Способ лечения опухоли у нуждающегося в этом пациента, который представляет собой млекопитающее, включающий разовое или многократное введение указанному пациенту посредством инъекции в опухоль терапевтически эффективного количества провоспалительных зрелых ДК по любому из пп. 1-4, причем указанные провоспалительные зрелые ДК являются аллогенными по отношению к указанному пациенту.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанная опухоль выбрана из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак пищевода и желудка.
11. Применение провоспалительной зрелой ДК по любому из пп. 1-4 при приготовлении медикамента для лечения рака у индивида, по отношению к которому указанные зрелые провоспалительные ДК являются аллогенными, при этом указанный медикамент вводят посредством инъекции в опухоль.
12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак пищевода и желудка.
13. Применение композиции по любому из пп. 6 и 7 при приготовлении медикамента для лечения рака у индивида, по отношению к которому указанные провоспалительные ДК являются аллогенными, при этом указанный медикамент вводят посредством инъекции в опухоль.
14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, включающей рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак кишечника, злокачественные глиомы, остеосаркому, злокачественную меланому, рак поджелудочной железы, злокачественные лимфомы и рак пищевода и желудка.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30315310P | 2010-02-10 | 2010-02-10 | |
| US61/303,153 | 2010-02-10 | ||
| SE1050133 | 2010-02-10 | ||
| SE1050133-6 | 2010-02-10 | ||
| PCT/EP2011/051952 WO2011098516A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-02-10 | Improved composition for inhibiting tumor cell proliferation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012137173A RU2012137173A (ru) | 2014-03-20 |
| RU2565542C2 true RU2565542C2 (ru) | 2015-10-20 |
Family
ID=43903832
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012137173/10A RU2565542C2 (ru) | 2010-02-10 | 2011-02-10 | Улучшенная композиция для ингибирования пролиферации опухолевых клеток |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9034317B2 (ru) |
| EP (1) | EP2534242B1 (ru) |
| JP (1) | JP5855018B2 (ru) |
| KR (1) | KR101770785B1 (ru) |
| CN (1) | CN102782123B (ru) |
| BR (1) | BR112012019267B1 (ru) |
| DK (1) | DK2534242T3 (ru) |
| ES (1) | ES2581277T3 (ru) |
| HU (1) | HUE028352T2 (ru) |
| PL (1) | PL2534242T3 (ru) |
| RU (1) | RU2565542C2 (ru) |
| SI (1) | SI2534242T1 (ru) |
| WO (1) | WO2011098516A1 (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2668816C2 (ru) * | 2012-12-18 | 2018-10-02 | Иммуникум Аб | Совместная дифференцировка моноцитов от аллогенных доноров |
| KR20180002679A (ko) * | 2015-05-07 | 2018-01-08 | 베이롤 칼리지 오브 메드신 | 수지상 세포 면역요법 |
| CN105462926A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 深圳市中美康士生物科技有限公司 | 一种免疫细胞瘤苗的制备方法及其应用 |
| CN105695403A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-06-22 | 深圳市中美康士生物科技有限公司 | 一种杀伤性免疫细胞的培养方法及其应用 |
| CN107574149B (zh) * | 2016-07-05 | 2022-02-18 | 上海细胞治疗研究院 | 一种树突状细胞的促成熟方法及其用途 |
| CN106085960A (zh) * | 2016-07-28 | 2016-11-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种培养dc细胞的培养基及培养方法 |
| US11976299B2 (en) | 2016-09-23 | 2024-05-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of preparing an isolated population of dendritic cells and methods of treating cancer using same |
| GB201711379D0 (en) * | 2017-07-14 | 2017-08-30 | Univ Cape Town | Maturation of dendritic cells |
| PL3460052T3 (pl) * | 2017-09-20 | 2020-05-18 | Immunicum Ab | Ulepszone allogeniczne komórki dendrytyczne do stosowania w leczeniu nowotworu |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348418C2 (ru) * | 2002-12-06 | 2009-03-10 | Норсуэст Байотерапьютикс, Инк. | Введение дендритных клеток, подвергнутых частичному созреванию in vitro, для лечения опухолей |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040214783A1 (en) * | 2002-05-08 | 2004-10-28 | Terman David S. | Compositions and methods for treatment of neoplastic disease |
| EP1840206A1 (en) | 2006-03-28 | 2007-10-03 | Gsf-Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit, Gmbh | Compositions for the preparation of mature dendritic cells |
| WO2008110569A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bioneer A/S | Method for determination of immunomodulatory effect |
| CA2702058A1 (en) * | 2007-10-08 | 2009-04-16 | Intrexon Corporation | Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer |
| US8728806B2 (en) * | 2008-12-06 | 2014-05-20 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions related to Th-1 dendritic cells |
| CN101481677B (zh) * | 2009-01-22 | 2011-12-14 | 复旦大学附属华山医院 | 体外刺激树突状细胞成熟的方法 |
-
2011
- 2011-02-10 DK DK11702471.1T patent/DK2534242T3/en active
- 2011-02-10 EP EP11702471.1A patent/EP2534242B1/en active Active
- 2011-02-10 KR KR1020127021390A patent/KR101770785B1/ko active IP Right Grant
- 2011-02-10 US US13/522,741 patent/US9034317B2/en active Active
- 2011-02-10 PL PL11702471.1T patent/PL2534242T3/pl unknown
- 2011-02-10 CN CN201180008012.3A patent/CN102782123B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-10 SI SI201130868A patent/SI2534242T1/sl unknown
- 2011-02-10 WO PCT/EP2011/051952 patent/WO2011098516A1/en active Application Filing
- 2011-02-10 JP JP2012552394A patent/JP5855018B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-10 HU HUE11702471A patent/HUE028352T2/en unknown
- 2011-02-10 BR BR112012019267-1A patent/BR112012019267B1/pt active IP Right Grant
- 2011-02-10 ES ES11702471.1T patent/ES2581277T3/es active Active
- 2011-02-10 RU RU2012137173/10A patent/RU2565542C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348418C2 (ru) * | 2002-12-06 | 2009-03-10 | Норсуэст Байотерапьютикс, Инк. | Введение дендритных клеток, подвергнутых частичному созреванию in vitro, для лечения опухолей |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FUJITA M. et al., Effective immunotherapy against murine gliomas using type 1 polarizing dendritic cells--significant roles of CXCL10, Cancer Res., 2009, v.69, n.4, p.1587-1595. GAUTIER G. et al., A type I interferon autocrine-paracrine loop is involved in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic cells, J. Exp. Med., 2005, v.201,n.9, p.1435-1446. GRAUER O. et al., Toll-like receptor triggered dendritic cell maturation and IL-12 secretion are necessary to overcome T-cell inhibition by glioma-associated TGF-beta2, J. Neurooncol., 2007, v.82,n.2,p.151-161. LEBRE M.C. et al., Differential expression of inflammatory chemokines by Th1- and Th2-cell promoting dendritic cells: A role for different mature dendritic cell populations in attracting appropriate effector cells to peripheral sites of inflammation, Immunology and Cell Biology, 2005, v.83, p.525"535. AHONEN C.L. et al., Dendritic cell maturation and subsequent enhanced T-cell stimulation induced with the nove * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUE028352T2 (en) | 2016-12-28 |
| EP2534242A1 (en) | 2012-12-19 |
| CN102782123A (zh) | 2012-11-14 |
| JP2013519363A (ja) | 2013-05-30 |
| RU2012137173A (ru) | 2014-03-20 |
| ES2581277T3 (es) | 2016-09-05 |
| US20120328662A1 (en) | 2012-12-27 |
| BR112012019267A2 (pt) | 2020-10-06 |
| US9034317B2 (en) | 2015-05-19 |
| DK2534242T3 (en) | 2016-07-18 |
| PL2534242T3 (pl) | 2016-11-30 |
| KR101770785B1 (ko) | 2017-08-23 |
| JP5855018B2 (ja) | 2016-02-09 |
| SI2534242T1 (sl) | 2016-08-31 |
| WO2011098516A1 (en) | 2011-08-18 |
| CN102782123B (zh) | 2016-05-11 |
| EP2534242B1 (en) | 2016-04-20 |
| BR112012019267B1 (pt) | 2022-03-03 |
| KR20120114358A (ko) | 2012-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2565542C2 (ru) | Улучшенная композиция для ингибирования пролиферации опухолевых клеток | |
| Liau et al. | Treatment of intracranial gliomas with bone marrow—derived dendritic cells pulsed with tumor antigens | |
| Petersen et al. | Exploiting the role of endogenous lymphoid-resident dendritic cells in the priming of NKT cells and CD8+ T cells to dendritic cell-based vaccines | |
| IL292009A (en) | In vitro methods and preparations for improving the activation of dendritic cells and t cells, and inducing a th-1 immune response | |
| Zapala et al. | Optimization of activation requirements of immature mouse dendritic JAWSII cells for in vivo application | |
| US20160040128A1 (en) | Method | |
| AU2016323066B2 (en) | Methods relating to activated dendritic cell compositions and immunotherapeutic treatments for subjects with advanced cancers | |
| JP7146732B2 (ja) | 宿主抗原提示並びに宿主抗腫瘍及び抗病原体免疫を最適化するためのプラットフォーム及び方法 | |
| US10716810B2 (en) | Canine autologous immunotherapy using dendritic cell induced cancer killing immunocytes | |
| US20120076827A1 (en) | Compositions and methods for generating an immune response in a subject | |
| Ali | Programming cells in situ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Changing information about inventors |