BR112012019267A2 - célula dendrítica (dc) pró-inflatório englobando célula dendrítica (dc) madura pró- inflamatória, metodo para produção célula dendrítica(dc)madura pro- inflamatoria - Google Patents
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Abstract
CÉLULA DENDRÍTICA (DC) PRÓ-INFLAMATÓRIA, COMPOSIÇÃO ENGLOBANDO CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ-INFLAMATÓRIA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ-INFLAMATÓRIA, esta invenção pertence à imunoterapia de câncer, através do fornecimento de uma célula dendrítica pró-inflamatória (DC), estimulada para maturação ex vivo através de tratamento específico, um método para cada tratamento e uma composição compreendendo a DC pró-inflamatória. A DC pode ser utilizada como imunoterapia baseada na célula para inibição da proliferação celular do tumor.
Description
' + 1/30 ' CÉLULA DENDRÍTICA (DC) PRÓ-INFLAMATÓRIA, COMPOSIÇÃO . ENGLOBANDO CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ- INFLAMATÓRIA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO CÉLULA DENDRÍTICA (DC) so MADURA PRÓ-INFLAMATÓRIA Campo da Invenção i Esta invenção pertence em geral ao campo de terapia de câncer.
A invenção está mais particularmente relacionada à imunoterapia de câncer e mais particularmente a uma imunoterapia celular para inibição da proliferação de célula tumoral.
Histórico As vacinas têm sido utilizadas para a prevenção de doenças infecciosas, como infecções virais ou microbianas.
O braço mediado por células do sistema imunológico está amplamente envolvido em fornecer o 16 hospedeiro com a habilidade de defender, recuperar-se de infecções e prevenir infecções adicionais pelo mesmo antígeno.
Os mecanismos imunológicos mediados por células também são considerados úteis contra o câncer.
As células dendríticas (DCs), as mais potentes células apresentadoras de antígeno (APC), têm um papel importante na iniciação e regulação das respostas imunológicas.
Elas têm a excepcional habilidade de preparar as células T nãive , obter e induzir a eficiência das respostas dos linfócitos T citotóxicos (CTL). As DCs precursoras estão presentes no sangue | . circulante e podem ser rapidamente recrutadas para os locais de infecção e | inflamação.
Quando as DCs precursoras se diferenciam em DCs imaturas elas | 25º se tornam mais eficazes em preparar e processar antígenos proteicos exógenos.
Em resposta a vários estimulos de maturação, como componentes | bacterianos e virais expressando ligantes foll-sínile (TLR), citocinas inflamatórias e/ou interações específica de célula T (CD40/ CD40 interações- . ligantes), elas iniciam um processo de diferenciação levando à diminuição da captação de antígeno e processo de capacidades e expressão melhorada de co-estimulatórias e moléculas MHC.
Consideravelmente, a força do sinal e a persistência dos sinais induzidos pelo reconhecimento do patógeno direto (ex, TLRs) ou ligação CD40 mostrou serem críticos determinantes de funções
. o 2/30 ' específicas das DCs.
As DCs são desta forma, terminalmente induzidas por - “ fatores de ativação em locais periféricos, para realizar 1 ou 2 funções mutuamente exclusivas, ou seja, tanto para migrar para linfonodos (como DCs ' maduras migratórias) para a interação eficiente de célula T ou para condicionar o microambiente para produzir grandes quantidades de mediadores inflamatórios incluindo quimiocinas e citocinas (como as DCs maduras pró- inflamatórias.
Estratégias de imunoterapia de câncer existentes que focam nas DCs são todas baseadas na premissa que a qualidade da resposta da célula T depende principalmente da habilidade das DCs migratórias para processar e apresentar antígenos tumorais para as células T em órgãos linfoides tumorais e então criar uma resposta CTL específica do tumor, levando a um ataque imunológico às células cancerosas.
Dados a partir de diferentes modelos de tumores em camundongo demonstraram que tal resposta pode ser provocada de acordo com uma das três estratégias principais, bem conhecidas por uma pessoa habilitada na área.
Essas estratégias imunoterapêuticas anti- câncer são agora ativamente testadas em humanos, mas todas com sucesso limitado.
A primeira estratégia é ativar e maturar DCs migratórias carregadas de antígenos a partir de páciente portador de tumor ex vivo e subsequentemente reintroduzi-los no mesmo paciente.
O carregamento de antígeno é tipicamente realizado pela adição de antígenos associados ao tumor (células tumorais lisadas, proteinas, peptideos ou ácidos nucleicos codificados | para tais antígenos) para DCs imaturas derivadas de monócitos seguidas por ativação/maturação de DCs carregadas de antigenos com diferentes combinações de fatores inflamatórios.
As DCs reintroduzidas devem migrar para os linfonodos drenados onde elas preparam linfócitos T específicos do tumor.
Os linfócitos T preparados pelas DCs, particularmente CTLs, então se movem até o local do tumor onde subsequentemente induzem a apoptose da célula tumoral.
No cenário clínico, a manipulação ex vivo dos próprios pacientes, ou seja, autólogo, portanto, as DCs consomem tempo e expõe o paciente a um risco aumentado de infecção.
Ademais, o processo de manipulação, no qual as DCs são pulsadas com antígenos tumorais e ativadas | ' | e » 3/30 | para DCs migratórias que apresentam antígenos tumorais dé forma eficiente, é * * tedioso i A segunda estratégia principal, que evita a necessidade ] da propagação ex vivo de DCs migratórias derivadas do paciente, compreende administração de antígenos tumorais incluindo células tumorais alogênicas ? irradiadas ou código plasmídeo para antígenos tumorais, dentro dos tecidos normais intactos, incluindo injeções subcutâneas ou intramusculares. Os antígenos tumorais são suplementados pelos conhecidos adjuvantes, com o objetivo de provocar a resposta imune mediada por DC in vivo. Mais frequentemente, as quimiocinas, citocinas ou códigos plasmídeos para estes fatores, e/ou fatores maturacionais das DCs tais como fator de necrose tumoral à (TNFá) e/ou os agonistas TLR são utilizados como adjuvantes.
Contudo, a administração de antígeno tumoral exógeno é um processo maçante.
A terceira estratégia principal que também evita a necessidade da propagação ex vivo de DCs migratórias derivadas do paciente, incluída na primeira estratégia principal, e, além disso, evita a necessidade de antígeno tumoral exógeno, incluída na segunda estratégia principal, considera um adjuvante que é injetado diretamente dentro dos tumores. Assim, o adjuvante tem como objetivo atingir DCs in vivo e o tumor do paciente age como uma fonte para os antígenos associados ao tumor. Adjuvantes que foram testados são similares àqueles descritos na segunda estratégia principal: quimiocinas, citocinas ou códigos plasmideos para estes fatores, e/ou fatores maturacionais das DCs como os TNF-á e o8 agonistas TLR.
Contudo, um tumor viável pode ser uma fonte fraca de tumor associada ao antígeno para DCs imaturas recrutadas, devido aos números insuficientes de morte, preferivelmente induzidas por apoptose, células tumorais que podem ser esmagadas por estas DCs.
Todas as três estratégias mencionadas acima foram testadas em seres humanos com câncer, mas com sucesso limitado. Portanto, há uma necessidade óbvia de vacinas terapêuticas mais eficientes e melhores métodos para o tratamento de câncer.
Resumo eo 4/30 % Desta forma, a presente invenção procura o preferencialmente superar as deficiências identificadas na literatura simplesmente ou em qualquer combinação e pelo menos resolver os : problemas mencionados acima fornecendo uma célula dendriítica madura pró- inflamatória que produza altos níveis de quimiocinas e interleucina 12 (11-12) desejáveis), uma composição compreendendo tal célula dendrítica pró- inflamatória, um método de produção como a célula dendrítica madura pró- inflamatória, um uso de mencionada célula dendrítica madura pró-inflamatória ou composição mencionada como um medicamento e um uso da mencionada célula dendrítica ou da mencionada composição para tratamento de câncer.
Assim, em um primeiro aspecto, uma célula dendrítica pró-inflamatória (DC), estimulada para maturação ex vivo por tratamento com substâncias como sal sódico de ácido poliinosinico-policitidílico (poli-l:C), resiquimod (R848) e interferon gama (IFN-y), é fornecida.
Em um segundo aspecto, uma composição compreendida de DC pró-inflamatória de acordo com o primeiro aspecto e células mononucleares de sangue periférico (CMSP) é fornecida.
Em um terceiro aspecto, é fornecido um método para produção de DC pró-inflamatória de acordo com o primeiro aspecto. O método mencionado compreende as etapas de fornecer células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), monócitos isolados das mencionadas PBMCs, geram DCs imaturas a partir dos mónócitos e induzem a maturação das iDCs adicionando-se poli-|:C, R848 e IFN-y para obter DC pró-inflamatória.
. Em um quarto aspecto, é fornecido um método para produzir uma composição de acordo com o segundo aspecto. O método mencionado compreende as etapas de fornecer células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), obter DC madura pró-inflamatória de acordo com o | primeiro aspecto e misturar as mencionadas PBMCs e a mencionada DC madura pró-inflamatória.
Em um quinto aspecto, uma DC pró-inflamatória é fornecida de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, para o uso como medicamento.
Em um sexto aspecto, uma DC pró-inflamatória é fornecida de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo a ma 5/30 á | com o segundo aspecto, para o uso como medicamento em um indivíduo o exceto a fonte da DC madura pró-inflamatória ou PBMCs. | - Em um sétimo aspecto, uma DC pró-inflamatória é | fornecida de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, para o uso no tratamento de câncer.
Em um oitavo aspecto, uma DC pró-inflamatória é fornecida de acordo com o segundo aspecto para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo exceto a fonte da DC madura pró-inflamatória ou PBMCs.
Configurações adicionais da invenção estão definidas nas reivindicações dependentes.
A presente invenção se difere da literatura anterior porque produz altos níveis desejáveis de citocinas, como quimiocina (C-X-C Motif) ligante 9 (CXCL9), também conhecida como MIG, quimiocina C-C Motif 3 (CCL3), conhecida também como proteina inflamatória de macrófago-1 alfa (MIP-1á), fator de necrose tumoral á(TNF-d), IL-18 e IL-12 após a retirada dos estímulos de ativação e assim estão adequadas para o uso, como injeção, sem a presença de fatores estimulantes exógenos maduros.
Quando injetadas intratumoralmente no paciente de maneira alogênica, ou seja, o paciente é diferente do doador cuja DC pró- inflamatória ou as PBMCs utilizadas para criar a DC pró-inflamatória original, tal DC pró-inflamatória ativará os pacientes donos das DCs de maneira que eles desenvolvam em tumores carregados por DCs migratórias. Este efeito é devido à habilidade da DC pró-inflamatória injetada produzir grandes quantidades de uma combinação desejável de citocinas e 11-12, incluindo a DC, célula NKe célula-T de memória recrutando MIP-1 alifa/CCL3, a célula NK e célula-T de memória recrutando quimiocina MIG/CXCL9, assim como a NK ativar a citocina IL-12. Ademais, uma vantagem das DCs maduras, como a DC madura pró- infiamatória sobre as DCs imaturas, pode potencializar a ativação da célula NK através de contato célula-célula. O fato é que as DCs pró-inflamatórias estão livres a partir da ativação exógena forte, como a maturação, fatores é uma vantagem, desde que a presença de fortes fatores ativadores exógenos dentro do tumor pode de outra forma provocar uma diferença entre os pacientes com suas próprias DCs recrutadas intratumoralmente e um paciente em específico,
B à 6/30 1 — ou seja, próprio, as DCs pró-inflamatórias e não em DCs migratórias eo específicas recrutadas de um paciente desejável. Assim, pelo menos 18 horas | de estímulo serão provavelmente necessários para atingir uma alta expressão de moléculas como a CD86 em uma DC madura, com o objetivo de otimizar a | 5 habilidade de ativar uma célula NK. De acordo com a literatura anterior DCs | maduras/ativadas são incapazes de produzir quantidades significantes de IL-12 após 18 horas. Se abortar a ativação após 8 horas apenas, a produção é mantida. Contudo, essas DCs não tiveram tempo de super-regular moléculas ativadoras de NK relevantes.
Transplante com órgãos alogênicos, tecidos ou DCs maduras é também conhecido por induzir uma imunização forte levando à expansão de células T alorreativas CD4+ específicas para alogênicos MHC- derivados de peptídeos apresentados nas próprias moléculas MHC classe | (chamadas de caminho indireto do alorreconhecimento). Através do uso de DC pró-inflamatória — alogênica como injeção intratumoral a DC será subsequentemente morta (rejeitada) pelo sistema imunológico hospedeiro e desse modo se tornar uma fonte de CD4+ altamente imunogênica auxiliares de epitopos celulares (alogênicos MHG - derivados de peptídeos) que serão capturados pelas próprias DCs recrutadas e mais provavelmente contribuirão para quebrar a tolerância de CD8 àos antígenos do tumor em pacientes portadores de tumores. A DC pró-inflamatória agiria então como adjuvante e ' não como DCs migratórias, o que é vantajoso para ambos e diferente se comparados à literatura anterior. Por examplo, se a prostaglandina E2 (PGE2) | for incluída em diferentes coquetéis de maturação da DC, a DC madura se | 25 tornará se tornará DC migratória que rapidamente deixará o local da injeção (tumor), o que é desvantajoso dentro do contexto desta invenção. | Utilizando-se DO alogênica, ou seja, em um indivíduo diferente da fonte ou doador de DC madura pró-inflamatória ou as PBMCs, tal potencial adjuvante não tem que ser individualmente preparada para cada paciente em específico e permite a produção em larga escala com subsequentes preços de custos mais baixos. Além disso, a vacina pode ser congelada e entregue em grandes distâncias, melhorando ainda mais sua viabilidade comercial.
Breve Descrição dos Desenhos !
4 + 7/30 | Estes e outros aspectos, características e vantagens os o quais a invenção é capaz, será aparente e elucidativa a partir da descrição das configurações a seguir da presente invenção, tem sido feita referência às figuras, nas quais: Figura 1 é uma ilustração esquemática de um método de acordo com o terceiro aspecto; Figura 2 é uma ilustração esquemática de um método de acordo com o quarto aspecto; Figura 3 são gráficos mostrando a produção de CCL3/MIP-1á (Figura 3C), CCLS/RANTES (Figura 3A) e CXCL9/MIG(Figura 3B) por DC madura pró-inflamatória de acordo com o primeiro aspecto; Figura 4 é um gráfico mostrando produção de 11-12 por DC pró-inflamatória de acordo com o primeiro aspecto; Figura 5 são gráficos mostrando a produção de IL-18 e 16 TNF-á por uma composição de acordo com o segundo aspecto; Figura 6 são gráficos mostrando a produção de IL-18 e TNF-á por uma composição de acordo 6om o segundo aspecto; Figura 7 é um gráfico mostrando a produção de IFN-y por uma composição de acordo com 6 segundo aspecto; Figura 8 são gráficos FACS demonstrando a influência de diferentes substâncias na maturação de DCs; Figura 9 são gráficos FACS mostrando a influência da DC madura pró-inflamatória de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, na maturação das iDCs; Figura 10 é um gráfico mostrando o volume do tumor em um estudo em relação a uma configuração; Figura 11 mostra fotos de resultados de estudo histopatológico (tumor primário) em referência a uma configuração; Figura 12 mostra fotos de resultados de controles histopatológicos (tumor primário) em um estudo em referência a uma configuração; Figura 13 mostra fotos de resultados histopatológicos (tumor secundário) em um estudo em referência a uma configuração; e
| Po... ..m..C€0 oo” . -b SO 9) € “iwõ Ps 2 o s"" = A 0 o oo" eo”eo )oP . . *P“ N 8/30 | Figura 14 mostra fotos de resultados de controles O histopatológicos (tumor secundário) em um estudo em referência a uma configuração. Descrição das Configurações Várias configurações da presente invenção serão descritas mais detalhadamente abaixo com referência aos desenhos que acompanham, com o objetivo de capacitar os habilitados na área a acompanhar a invenção. A invenção pode, portanto, ser configurada em muitas formas diferentes e deve ser configurada em muitas formas diferente e não deve ser interpretada como limitada às configurações apresentadas neste texto. Por outro lado, essas configurações são fornecidas para que esta divulgação seja meticulosa e completa, e expressará completamente o escopo da invenção para os habilitados da área. As configurações não limitam a invenção, mas a invenção está apenas limitada pelas reivindicações de patente anexas. Além disso, a terminologia utilizada na descrição detalhada das configurações particulares ilustradas nos desenhos que acompanham não tem a intenção de ser restritiva da invenção.
Adjuvantes injetados intratumoralmente com o objetivo de induzir uma resposta imune antitumoral eficiente mais provavelmente tem que induzir três eventos dentro do tumor injetado, tudo importante para atingir a erradicação do tumor mediada por CTL.
Primeiramente, a DC imatura (IDC) precisa ser recrutada para o tumor, com o intuito dê ser exposta ao antígeno do tumor. Está bem estabelecido dentro da literatura que a quimiocina MIP-164/CCL3 tem uma forte habilidade para estimular o recrutamento da iDC, incluindo o recrutamento intratumoral de iDC in vivo.
Em segundo lugar, é importante induzir a apoptose das células tumorais com o objetivo de fazer com que os antígenos do tumor estejam disponíveis para a iDC recrutadas. Vários diferentes métodos para atingir esse objetivo dentro da literatura, incluindo métodos que provoquem o recrutamento intratumoral e a ativação das células NK (natural killer). Morte de suscetíveis células tumorais mediada por células NK primárias, principalmente devido a indução da apoptose, em modelos de camundongos diferentes vem sendo mostrada para de forma eficiente despertar um desenvolvimento
A . % 9/30 | subsequente mediado por DC das respostas de células-T citotóxicas o específicas do tumor ao parenteral, resistência da célula NK e células tumorais. Células NK são conhecidas por expressar o receptor quimiocina CXCR3 e o recrutamento dependente de CXCR-3 das células NK vem sendo demonstrado em vários modelos animais. Um ligante bem conhecido o CXCR3 é o MIG/CXCL8 e há evidência de que as células NK se acumulam após a injeção intratumoral de MIG/CSCL9.
A fim de as células NK recrutadas matarem | efetivamente as células tumorais, a presença dos fatores ativadores de célula NK como IL-12, um potente ativador da atividade assassina da célula NK in vitro e in vivo, é também muito mais necessária. | Em terceiro plano, a maturação da iDC recrutada dentro da DC migratória madura pode ser induzida.
Estágios iniciais de infecções virais (normalmente conduzindo para repostas imunes desviadas por Th-1) são comumente associados ao recrutamento local e ativação de ambas DCs e células NK. Em um estudo recente, células NK de sangue periférico humano que tinham sido ' expostas a |11-12 ou a IL-4 durante uma incubação breve (durante a noite) foram investigadas por terem a habilidade de induzir a maturação da DC.
Notavelmente, somente as células NK estimuladas por IL-12 foram capazes de induzir uma maturação da DC substancial. Desta forma, concluiu-se que as células NK expostas a IL-12 por um intervalo de tempo compatível com repostas in vivo podem favorecer à seleção de DCs maduras apropriadas para preparação da célula Thi subsequente em órgãos linfoides secundários (5).
Esses dados humanos in vitro estão de acordo com os dados in vivo em modelos de camundongo mostrando que as respostas Thi se tornam significantemente aumentadas quando à injeção de DC carregada por antigeno em camundongos é seguida por um recrutamento acumulado de células NK, comparadas a situações nas quais nenhum recrutamento de NK foi observado.
A maturação dê DCs polarizadas Th1 têm também demonstrado serem induzidas por fatores solúveis produzidos por ativação policlonal das células T.O tratamento de célula DC imatura por um meio condicionado de célula T (TCCM) preparado a partir de células livres supernatantes de células T ativadas anti-CD3 ou células T ativadas por duplo
. 4 10/30 estimulo com anti-CD3 e anti-CD28 demonstrou conter vários fatores solúveis oo incluindo ligante CD-40, TNF-á e IFn-y. Em oposição, para moderar a super- regulação das moléculas co-estimuladoras através da adição de citocinas individuais ou através de meio condicionado por monócito, o tratamento de DC imatura com TCCM mostrou induzir um aumento marcante na expressão de moléculas co-estimuladoras de uma maneira dose-dependente. A habilidade da TCCM para induzir tais alterações fenotípicas está ainda anulada pela neutralização de anticorpos específicos para CD40L, TNF-á e IFN-y indicando que esses fatores presentes na TCCM estão implicados principalmente na maturação da DC. De grande importância, DC tratada por TOCM pode produzir altos níveis de 11-12 desviado por Th1.
Finalmente, é sabido que as células CD4+T desenvolvem papéis cruciais na preparação, expansão e memória e na sobrevivência de CD8+CTLs por “ajudarem” as DCs migratórias durante sua interação cognata com antígenos específicos das células CD8+T na drenagem de linfonodos. Um número de estudos dentro da área de imunoterapia de câncer confiou na abordagem do reconhecimento da célula T CD4+ do MHC classe || de peptídeos a partir do antígeno para o tumor do tipo selvagem forneceria a ajuda necessária para à indução de CTL. Contudo, a ajuda fornecida pelos peptídeos a partir de antígenos tumorais será sempre fraca ou ausente devido à indução da tolerância das células CD4+T voltada para essas próprias proteínas que evolui durante à progressão do tumor, o que dificultaria o efeito terapêutico de uma vacina. Recentes descobertas demonstram que a adição de epítopes facilitadores de CD4+ T não-próprios ao tumor associado às próprias proteínas no local de vacinação é suficiente para quebrar a tolerância à CD8 estabelecida para antigenos associados em modelos de camundongo.
Reunidos, todos esses dados indicam que um adjuvante injetado intratumoralmente cujo objetivo é induzir uma resposta imune (mediada por célula T) adaptativa antitumoral eficiente deve ser caracterizada por uma produção alta e prolongada de MIP-1á/MIP-16/CCL3 (DC, NK e recrutamento de célula T de memória), MIG/CXCLS9 (célula NK e recrutamento de célula T de memória), 11-12p70 (liberação de antígenos tumorais mediada por célula NK e maturação das DCs migratórias mediada por
. x 11/30 i célula NK) e finalmente, a presença de proteínas imunogênicas não-próprias 2 que possam atuar como epítopos facilitadores de célula T CD4+ durante preparação mediada por DC de tumor específico de células CD8+ na ' drenagem do linfonodo.
DCs humanas derivadas de monócitos têm o potencial de produzir altos níveis de MIP-1á/CCL3, I11L-12p70 e MIG/CXCL9 durante estímulo persistente com certos ligantes TLR que também levam à sua maturação. Com o objetivo de injetar tais DCs maduras pró-inflamatórias persistentemente ativadas intratumoraimente, elas têm que ser lavadas antes da instalação intratumoral. Caso contrário, a administração coincidente de agentes estimuladores (destinadas a indução de DCs pró-inflamatórias ex vivo) conduzirá mais provavelmente a uma ativação forte e persistente de DCs imaturas recrutadas intratumoralmente, levando à sua diferenciação dentro das DCs maduras pró-inflamatórias no lugar da diferenciação desejada dentro das DCs maduras migratórias. Infelizmente, a descontinuação dos estímulos de maturação como ligantes TLR4 ou CD40L em pontos de tempo quando as DCs se diferenciam em DCs maduras (normalmente após período de mais de 12 horas de estímulos) conhecidas por induzir uma regulação rápida e baixa de produção de citocina, incluindo a produção de IL-12. Métodos de ativação devem, desta maneira, ser utilizados para ativar as DCs em DC maduras pró- inflamatórias com produção prolongada de fatores desejáveis após a descontinuação de fatores indutores de ativação.
Os presentes inventores encontraram um método para ' produzir DC madura pró-inflamatória, a qual após a retirada do estímulo persistente com fatores ativadores fortes, assim produzem DCs livres dos fatores de estimulação, o que surpreendentemente produz altos níveis de quimiocinas desejáveis e 1L-12. As DCs maduras e pró-inflamatórias podem ser administradas em um paciente de máneira alogênica, ou seja, em um paciente que não seja fonte de DC.
As DCs maduras pró-inflamatórias podem ser misturadas às células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), formando assim uma composição. As DCs maduras pró-inflamatórias podem ser revestidas com superantigeno, como Enterotoxina B Staphylococcus aureus
. & 12/30 (SEB), causando uma ativação policlonal de células T dentro da população * PBMC. Quando administada em um paciente, as DCs maduras pró-inflamatórias ou as composições induzirão a uma resposta imune levando a uma resposta celular imune contra o tumor que mata o tumor.
O efeito é extremamente forte se o paciente não for o doador das PBMCs ou como tal ou como fonte de DCs maduras pró- inflamatórias, ou seja, elas são alogênicas ao paciente. Desta maneira, as DCs maduras pró-inflamatórias ou a composição agirá como epítopes facilitadores de CD4+ T não-próprios.
As DCs maduras pró-inflamatórias ou a composição | contribuirão para atrair DC do próprio paciente, células NK e células T para o | local da injeção, pela habilidade das DCs maduras pró-inflamatórias de produzirem aitos níveis de citocina relevantes, como MIPa/CCL3 e ativar e células NK recrutadas, por interações dependentes célula-célula e a habilidade das DCs maduras pró-inflamatórias de produzir altos níveis de citocina IL-12, que conduzirá ao carregamento do antígeno de DCS recrutadas dos próprios pacientes com material tumoral imunogênico a partir da morte das células tumorais pela célula NK, Preferencialmente, à composição 100 é injetada diretamente dentro do tumor. A habilidade de atrair DCs dentro e por todos os tumores é importante, visto que na maioria dos pacientes estudados com câncer, as DCs foram encontradas principalmente na parte periférica dos tumores, podendo limitar sua interação com as células tumorais.
Consideravelmente, a capacidade das quimiocinas em recrutar pacientes com suas próprias DCs circulantes ao redor do local do tumor expõe as células tumorais a recentes DCs geradas/recrutadas (em oposição às DCs locais), podendo ser menos afetada por um meio tumoral imunossupressivo. Em uma configuração de acordo com a Figura 1, um método 10 é fornecido onde as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) 101 são proporcionadas
11. Monócitos 102 são isolados à partir das mencionadas PBMCs 101. DCs imaturas (iDCs) 103 são geradas a partir de monócitos 102 e maturação das iDCs 103 é induzida 14 adicionando os indutores de ativação poli-I:C, R848 e IFN-y para as iDCs 103, seguida por lavagem para remover todos os fatores
« 4 13/30 i ativantes resultando assim fator livre de estímulo, DC madura pró-inflamatória “104 Em uma configuração, a indução 14 da maturação das iDCs 103 ainda compreendem adicionando-se pelo menos uma das substâncias escolhidas do grupo constituído de: IFN- á IL-18 e TNF-a.
Em uma configuração, a geração 13 das iDCs é induzida por cultura de monócitos em um meio aquoso compreendendo IL-4 e GM-CSF por 2 a 7 dias, como também de 3 a 5 dias ou de 3 ou 5 dias.
Em uma configuração de acordo com a Figura 2A, um método 20 é fornecido para a produção de uma composição 100, como co- .
| cultura de DCs pró-inflamatórias 104 e PBMCs 101. O método compreende . fornecer 21 células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) 101, obtendo 22 DCs maduras pró-inflamatórias 104, e misturar 23 as mencionadas PBMCs | 101 e das mencionadas DCs maduras pró-inflamatórias 104.
Em uma configuração de acordo com a Figura 2B, o método 20 para produzir uma composição 100 ainda compreende a etapa, antes da mistura, de tratar 22h a DO madura pró-inflamatória 104 com um superantígeno 200.
As configurações acima serão descritas abaixo em mais detalhes.
Experimental A configuração experimental a seguir não tem a intenção de ser limitada a uma específica forma apresentada aqui. Em vez disso, a invenção está limitada somente por reivindicações anexas e outras configurações diferentes das específicas configurações mencionadas acima, | igualmente possíveis dentro do escopo das reivindicações anexas. | Isolamento de PBMC e Monócitos Células —moónonucleares de sangue periférico (PBMC)101 foram separadas do sangue periférico obtidos de doadores saudáveis (Sahlgrenska sjukhuset, Gôteborg, Suécia) por centrifugação gradiente de densidade utilizando Lymphoprep (Nycomed, Pharma, Oslo, Noruega), bem conhecido por uma pessoa habilitada da área. PBMCs 101 foram re-suspensas em meio Celgrium (Cell Genix, Freiburg, Alemanha) em uma concentração final de 2,5 x 10º /mL seguidas de incubação em uma á ç 14/30 placa de fundo liso de 24-poços (1 mi/poço) em 37ºC, 6% CO,. Após 2 O horas, as células não-aderentes foram removidas, enquanto que as células aderentes remanescentes foram lavadas duas vezes com PBS, tendo como resultado monócitos isolados 102 (principalmente constituídos de células CD14+).
Criação de DCs Com o intuito de diferenciar os monócitos 102 das DCs imaturas 103, os monócitos 102 foram isolados a partir de cultura em meio aquoso e fresco, como o meio Cellgro, suplementado com indutores, ou seja, 1000U/mL de iL-4 humana recombinante e 1000 U/ml GM-CSF recombinante humana (todos da CellGenix, Freiburg, Alemanha) em 3 ou 5 dias.
A criação de DCs imaturas derivadas de monócitos (iDCs) 103 in IL.-4 e GM-CSF é bem aceita em modelo in vitro, e as células podem ser consideradas análogas pára os tecidos periféricos das DCs.
Maturação das DOs Após 3 ou 5 dias de cultura em meio Cellgro suplementado com |L-4 e GM-CSF, à maturação das DCs imaturas 103 foi induzida adicionando-se tanto 20ug/ml de poli-:C (Sigma, Steinheim, Alemanha), um imuno-estimulante específico para o receptor TLR-3 também conhecido como ácido poliinosínico:policitidíico ou sal sódico de ácido poliinosinico-policitidílico, e 2,5 uag/mL de R848 (Sigma, Steinheim, Alemanha), receptor ftoll-like do ligante 7/8 também conhecido como resiquimod, para o meio de cultura, ou a combinação poli-I:C e R848 suplementado com 1000U/ml de interferon gama (IFN-y, R&D systems, Mineápolis, EUA). Após 18 horas de incubação, as células foram lavadas três vezes e depois incubadas em meio fresco (sem adição de fatores ativantes exógenos) por 24 horas para obter DC madura pró-inflamatória 104 de acordo com um aspecto.
Culturas supernatantes a partir de culturas foram colhidas de acordo com os protocolos bem conhecidos de pessoa habilitada na área.
Foi realizada uma análise ELISA nos supernatantes como descrito abaixo, com o objetivo de analisar níveis de quimiocinas CCL3/MIP-1a, CCLS/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/ Proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) e a citocina interleucina 12 (11-12).
s ; 15/30 : Co-culturas de DC e PBMCs oo PBMCs 101 foram obtidos de acordo com o descrito acima e as DCs maduras pró-inflamatórias 104 foram também obtidas como o descrito acima.
Para atingir uma rápida maturação e ativação policlonal de células T de PBMCs 101, 0,01ug/nl SEB (R&D systems, Mineápolis, EUA) foi adicionado à cultura na etapa de maturação, 30 minutos antes de lavar. Após a lavagem em PBS por três vezes à DC madura pró-inflamatória 104 (2,5 x 10ºcélulas/ml) foram co-cultiradas com 1 x 10º células/ml de PBMC alogênicos (isoladas a partir de sangue periférico de doadores saudáveis mo descrito acima) em um volume total de 1 mL por 24 horas.
A cultura de supernatantes a partir de co-cultura de DC madura pró-inflamatória 104 e PBMCs alogênicas, também chamados de supernatantes MLR, foram colhidos é subsequentemente estocados a — 80ºC.
Os supernatantes foram mais tarde analisados quanto à presença dos conhecidos fatores de maturação e ativação de DC: IFN-y, TNF-a e ILIB por ELISA como descrito acima. Os supernatantes foram também estudados quanto a indução de maturação fenotípica de iDCs, também descritos abaixo.
ELISA Níveis de COL3/MIP-10, CCLS/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, 11-12, TNF-a, ILIB e IFN-y foram mensurados pelo ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) utilizando o kit duplo ELISA da R&D systems, Mineápolis, EUA de acordo com as instruções do fabricante.
Exame de maturação fenotípica Células dendriticas derivadas de monócitos 103(iDCs) foram criadas como o descrito acima. Após 5 dias de incubação na Cellgro suplementada com IL4 e GM-CSF, as DCs imaturas 103 foram incubadas a 37ºC por 24 horas em 300yul dos supernatantes MLR acima citados e 100ul meio Cellgro fresco. As DCs cultivadas sem a adição de supernatantes foram utiizadas como controle. Para determinar os supernatantes MLR estão induzindo a maturação, as amostras foram tingidas com PE anti-CD86 humano em conjunto com FITC anti- CD83 humano. Camundongo I|9G1 e IgG2 marcados com FITC e PE foram utilizados como controles isótopos (todos da s x 16/30 . —BD Biosciences, Califórnia, EUA). As amostras foram analisadas por citometria "de fluxo (FACS) usando software Ceil Quest (BD Biosciences, Califórnia, EUA). . Resultados Abaixo, os resultados da parte experimental estão comentados.
Produção prolongada de quimiocinas inflamatórias desejáveis Como demonstrado na Figura 3, a produção de CCL3/MIP-1a (figura 3C), CCLS/RANTES (Figura 3A) e CSCL9/MIG (Figura 3B) por DC madura pró-inflamatória 104 a partir de 3 doadores de sangue investigados foi maior se as iDCs tivessem sido induzidas por cultura durante 5 dias em GM-CSF e IL-4 antes do estímulo TLR combinado, ou seja, indução 14 de maturação, se comparado a cultura por 3 dias em GM-CSF e IL-4. Ademais, o estímulo TLR combinado com adição de IFN-y apresentou os níveis mais 16 altos de CCL3/MIP-la e CXCL9/MIG, enquanto que a produção de CCL5/RANTES não foi afetada pela adição de IFN-y.
Desta forma, a célula dendrítica pró-inflamatória (DC), foi estimulada à maturação ex vivo através de tratamento com as substâncias sal sódico de ácido poliinosínico-policitidílico, resiquimod R848 e interferon gama (IFN-y).
Em uma configuração, a célula dendrítica pró- inflamatória (DC) tem ainda sido estimulada por pelo menos uma das substâncias escolhidas a partir do grupo constituído de interferon a (IFN-a), interleucina (IL-18) e fator de necrose tumoral a (TNFa).
Notavelmente, 08 níveis mais altos registrados de quimiocinas relevantes foram produzidos após a retirada dos estímulos de maturação. O fato é que a DC madura pró-inflamatória 104 está livre da ativação exógena forte, como a maturação, fatores é uma vantagem, desde . que a presença dos fatores exógenos fortes dentro do tumor possa de outra forma provocar uma diferença eêntre 08 pacientes com DCs recrutadas intratumoralmente deles mesmos, do paciente específico, ou seja, próprio, DCs pró-inflamatórias e não em um paciente desejável com DCs migratórias específicas.
D r 17/30 : A DC madura pró-inflamatória produz pelo menos * 25.000 pg IL-12/mL/1 0º células, como 120.000 pg /mL/10º células, pelo menos ' 100.000 pg CXCL9/mL/10º células, como 400.000 pg/ mL/10º células e pelo i menos 40.000 pg CCL3/mL/10º células, como 180.000 Pg ImL/10º células, durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
A DC pró-inffamatória pode também produzir CCLS5/RANTES, como 17.500 pg /mL/10º células durante 24 horas após a retirada dos estímuios.
Onde encontrou níveis não detectáveis (nível de detectação 312 pg/ml) de CCL2/MCP-1 (dados não mostrados). Figura 3 mostra níveis de CCL3/MIP-1 alfa (Figura 3C), CCL5/RANTES (Figura 3A) e CXCLI/MIG (Figura 3B), obtidos através da análise ELISA.
Os resultados mostrados são valores médios + SD de 3 indivíduos.
O respectivo eixo Y . - mostra a quantidade da respectiva substância produziu em pg/mL/2,5 x 10º células, durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
O eixo X mostra as diferentes combinações mensuradas, Produção prolongada de 1L-12p70 Desde que 6 estimulo TLR combinado, ou seja, a indução 14 da maturação, com ou sem estímulo coincidente com IFN-y foi descoberto por induzir uma produção prolongada e forte de quimiocinas recrutadas por células NK (CCL3/MIP-1a, CCL5/RANTES e CXCL9/MIG) em | DC madura pró-inflamatória 104, houve o interesse em investigar se tais DCs coincidentemente podiam liberar IL-12, tais como I1L-12p70, um fator ativador da tão conhecida célula NK.
Como foi demonstrado na Figura 4, a dupla estimulação de TLRs (como R848 e Poli-1:0) foi mostrada por induzir a uma produção forte e prolongada de IL-12p70 após a retirada dos estímulos de maturação, como os indutores de ativação.
Ademais, a adição de IFN-y durante a ativação melhorou a produção de ll-12p70. Similar à produção de quimiocinas, a produção de 11-12p70 foi ótima (em 3 dos 4 experimentos) - quando os monócitos foram colocados em meio de cultura de GM-CSF e IL-4 por 5 dias, assim comparado aos 3 dias, antes da ativação.
A figura 4 mostra a produção de IL-12p70 após indução da maturação de DC.
Os dados apresentados estão em uma média +SD a partir dos 3 experimentos com doadores diferentes, O eixo Y mostra a quantidade de substância produzida em
“ » 18/30 . pa/mL/2,5 x 10º células, durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
O eixo OX mostra as diferentes combinações mensuradas.
Co-cultura de DCs maduras ou DCs maduras revestidas de SEB com PBMCs alogênicas induzindo produção de fatores de maturação das DCs.
Fatores solúveis pró-inflamatórios produzidos por células NK ativadas e células T são conhecidos por promoverem maturação de DCs imaturas bystander.
Desta maneira foi interessante examinar se a DC madura pró-inflamatória 104, quando em co-cultura com as PBMCs alogênicas (imitando células imunes recrutadas) em uma composição 100, foram capazes de induzir a produção de citocinas conhecidas por serem importantes na maturação das DCs.
Com o intuito de otimizar a ativação da célula T induzida por DC, as DCs foram revestidas com o superantígeno Staphylococcal enterotoxin B (SEB) adicionando-se SEB à cultura de DC ao final (30 minutos antes da lavagem) do período de estimulo com TLR agonistas duplos e IFN-y.
Superantígenos, incluindo SEB, são conhecidos por formarem complexos com MHC classe || nas APCs e estimular as células T através de receptor célula T.
Uma rápida ativação policlonal e ambas as células T, CD4+ e CD8+, ocorrem | em resposta ao SEB levando a uma produção aumentada de mediadores pró- — inflamatórios, incluindo TNF-a, IL-1 e IFNy.
Tanto quanto 20% do repertório de células T pode ser estimulado por SEB e a “hiperativação" das células T comumente ocorre dentro de 48 horas após a exposição à SEB.
Depois de repetidas lavagens, a DC madura pró- inflamatória 104, com ou sem a “cobertura” concorrente com SEB, foram colocados em co-culturas com PBMCs alogênicos por 24 horas e os niveis de | TNF-a, IL-168 e IFN-y liberados no supernatante foram mensurados por ELISA.
Outros tipos de super-antigenos, como Stâphylococcal enterotoxin A, B, C, D, E, F, GH e J e toxina 1 da sindrome do choque tóxico por Staphylococcal | 30 pode também ser utilizados.
Como demonstrado, se a figura SA, co-cultura de | SEB-revestida de DC madura pró-inflamatória 104 (estimulada por ligantes combinados TLR), mas não DCs imaturas induziu uma produção substancial de IL-1B após co-cultura com PBMCs alogênicos, A co-cultura de SEB-revestida de DCs imaturas com alogênicos PBMC induziu uma produção substancial de z % 19/30 TNF-a que foi ligeiramente melhorada pelo uso de DCs maduras. A produção oo de IL-18 ou TNF-a não foi substancialmente afetada pela adição de IFN-y à estimulação dupla TLR durante a maturação da DC. Notavelmente, o revestimento por SEB contribuiu notoriamente para a liberação de IL-18 e TNF- a no atual modelo de co-cultura (Figura 6), indicando células T policionalmente ativadas como uma fonte proeminente para essas citocinas.
Deste modo, a DC madura pró-inflamatória pode produzir pelo menos 2.000 pg IL-1B/mL/10º células, como 32.000 pg /mL/10º células e pelo menos 500 pg IL-18/mL/10º células, e 2.500 pg /mL/10º células, durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
Similar à produção de |L-18 e TNF-a, a produção de IFN-y foi mostrada por ser produzida abundantemente quando utiliza DCs maduras que tinham sido revestidas com SEB nas co-culturas (Figura 7), mais provalmente devido à ativação policlonal de células T. A adição de PBMCs ao TLR e DCs estimulados por IFN-y induziu sutilmente a produção de IFN-y, possivelmente secretada por células NK ativadas por 11-12 produzidas por DC madura pró-inflamatória 104, A figura 5 mostra Os níveis de citocina de IL-1B(Figura SA) e TNF-a (Figura 58) mensurados por ELISA. Figura 6 mostra os níveis de citocina de IL-18 (Figura 6A) e TNF-a (Figura 6B) mensurado por ELISA, mas com adição de meio, PBMC ou PBMC/SEB. Os dados mostrados na Figura 5 são valores médios +SD a partir de 4 indivíduos e a Figura 6 mostra resultados de um experimento. A figura 7 mostra níveis de citocina de IFN-y em | 25 supernatantes mensurados por ELISA. Os dados mostrados na Figura 7 são de um experimento. | O eixo X correspondente nas Figuras 5, 6 e 7 mostra a | quantidade da respectiva substância produzida em pg/ml/2,5 x 10º células, durante 24 horas após a retirada dos estimulos. O eixo Y correspondente mostra as diferentes combinações mensuradas.
Maturação fenotípica de DCs imaturas bystander Os supernatantes de co-culturas de não-revestidos ou DC 104 madura revestida por SEB e PBMCs alogênicas foram subsequentemente investigadas quanto à habilidade de induzir uma maturação t 20/30 fenotípica das DCs maduras bystander. Desta maneira, uma composição é oo fornecida 100 compreendendo DC madura pró-inflamatória 104 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes e células mononucleares de sangue periféricas (PBMCs) 101. Supernatantes destas células, co-culturas foram utilizadas para estimular as DCs imaturas bystander obtidas de monócitos aderentes em cultura por 5 dias em GM-CSF e IL-4. Após 24 horas de estímulos, as células foram colhidas através de análise FACS, CD86 e CD83 anti-humana foram utilizadas para examinar a expressão de moléculas co-estimuladoras (CD868) e marcadores de maturação (CDB83), respectivamente. Os supernatantes a partir de co-culturas de célula madura pró-inflamatória 104 que tinham sido maturadas com estímulo TLR combinado, ou seja, através da adição de poli-l:C, R848 às iDCs 103, seguidos por revestimento SEB induziu uma expressão proeminente de CD86 e CD83 de DCs bystander, como o mostrado na Figura 8. Desta maneira, a composição 100 pode compreender um antígeno. À adição de IFN-y durante a maturação mediada por TLR de vacinas de DCs não contribuiu com qualquer adicional, supernatante induzido, maturação fenotípica de DCs imaturas bystander, como vimos na Figura 8C.
A figura 8 mostra à influência dos ligantes SEB e TLR, ou seja, indutores de maturação nãs DCs imaturas 103. Monócitos aderentes foram incubados em GM-CSF e |L-4 por 5 dias para obter iDCs 103. Os supernatantes de MLR com SEB/TLR estimulou a DC madura pró-inflamatória 104 e PBMCs 101 foram adicionadas no dia 5 seguido de outra incubação por 24 horas. Com o objetivo de estudar as moléculas co-estimuladoras e marcadores de maturação, as células foram colhidas e marcadas com CD86 e CDB83 anti-humano. A maturação e marcadores de superfície co-estimuladores foram levemente induzidos por ligantes TLR e SEB. Os resultados demonstrados são de um experimento representativo dentre dois. Supernatantes a partir de culturas celulares contendo somente DC madura pró-inflamatória 104 que tenham sido maturadas com combinados estímulos de TLR e IFN-y induziu uma expressão substancial de CD83 nas DCs bystander, como visto nã Figura 9B. Vimos na Figura 9C, que a expressão CD83 foi assim melhorada por supernatantes a partir de co-culturas com PBMCs alogênicos e DC madura pró-inflamatória 104. Finalmente os
4 O 21/30 .— Supernatantes a partir de co-culturas de DC madura revestida com SEB 104 e o PBMCs 101 induziram a expressão mais forte de CD83, vista na Figura 9D, indicando que a inclusão de SEB em co-culturas 100 de DC madura pró- inflamatória 104 e PBMC alogênica 101 é importante para induzir a maturação máxima induzida por supernatante de DCs imaturas bystander.
Na leitura dos resultados mencionados acima, de acordo com um aspecto, uma DC madura pró-inflamatória 104 ou uma composição 100 é fornecida para o uso como medicamento.
De acordo com um aspecto, uma DC madura pró- inflamatória 104 ou uma composição 100 é fornecida para o uso no tratamento de câncer.
De acordo com um aspecto, uma DC madura pró- inflamatória 104 ou uma composição 100 é fornecida para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
Uma DC madura pró-inflamatória 104 ou uma composição 100 pode ser injetada intratumoralmente.
Em uma configuração, o câncer é escolhido a partir do grupo: câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, câncer pancreático, linfomas malignos e câncer esofágico.
De acordo cóm um aspecto, uma DC madura pró- inflamatória 104 ou uma composição 100, para uso como medicamento em um indivíduo diferente do utilizado na fonte deste, como um doador, a DC madura pró-inflamatória 104 ou PBMCs 101 à fornecida.
De acordo com um aspecto, uma DC madura pró- inflamatória 104 ou uma composição 100, para uso no tratamento de câncer em um indivíduo diferente do utilizado na fonte deste, como um doador, a DC madura pró-inflamatória 104 ou PBMCs 101 é fornecida.
Injeção intratumoral Como declarado acima, a DC madura pró-infliamatória 104 ou uma composição 100 pode ser injetada intratumoralmente para produzir um efeito inibitório no crescimento do tumor.
1 % 22/30 . Para demonstrar isto, um estudo com camundongo foi o realizado pela Visionar Preclinicial AB em Uppsala, Suécia, de acordo com a : descrição a seguir.
Quinze ratos da raça Fisher do sexo feminino foram utilizadas neste estudo.
Após aclimatização (mínimo de uma semana), uma suspensão de 100ul células compreendendo 10º células MAT B II (originalmente isoladas a partir de um adenocarcinoma na glândula mamária do rato) em meio RPMI foi injetado subcutaneamente no lado esquerdo traseiro dos animais (Dia 4). Quatro dias depois um segundo tumor foi induzido no lado direito traseiro (Dia 0). Uma DC madura pró-inflamatória 104 (produzida como foi descrito acima) ou apenas o veículo (um tampão com 10% (volume) de soro | fetal bovino)) foi injetado dentro da primeiro tumor (lado esquerdo traseiro) | quatro dias após a instalação do segundo tumor (lado direito traseiro) (Dia 4). À dosagem de madura pró-inflamatória 104 foi de 20 ul por animal, compreendendo 10º células DC madura pró-inflamatória 104. O crescimento do primeiro e do segundo tumor foi registrado por todo o estudo.
A parte experimental animal do estudo foi aprovada pelo Comitê Regional de Ética em Experimento com animais em Uppsala, Suécia (C320/9). Uma visão geral do desenho do experimento é visto na Tabela 1 abaixo.
Gupo — Nº ID Tumoi Tumor2g Tratamento =|| “Controle — — & 658659 1 x 10 7 x 10º Veículo 662, 667, células células intratumoralmente 668, 671 Lado Lado ESQUERDO (Dia 4) esquerdo — direito (Dia -4) (Dia O) DC madura pró- 9 657,660, 1 x 10º 1 x 10º 01 x 10º DC 104 inflamatória 104 661, cêlulas células intratumoralmente 663, 664, Lado Lado ESQUERDO (Dia 4) 665, 666, esquerdo direito (Dia 669,670 —(Dia-4) o) . Tabela 1. Desenho experimental.
A primeira coluna é o grupo, seguida pelo número de ratos participantes (N), ID única de ratos participantes,
« « 23/30 .— especificação da indução Tumor 1 e Tumor 2, e finalmente especificação do o tratamento, respectivamente.
No dia da vacinação intratumoral no primeiro, lado direito traseiro, tumor (Dia 4), os animais foram randomizados em 2 grupos diferentes tendo como base o volume do tumor esquerdo.
Tanto no grupo de | controle quanto no grupo da DC madura pró-inflamatória 104, as injeções | intratumorais foram dadas com um veículo de tampão PBS com 10% (Volume) soro fetal bovino. | À cada 2 dias os animais eram verificados quanto ao crescimento do tumor.
Quando palpáveis, o tamanho dos tumores era mensurado com o uso de um paquímetro.
O comprimento e a largura do tumor eram registrados.
O volume do tumor foi calculado pela fórmula: comprimento (cm) x largura (cm) x largura (cm) x 0,44, O plano original foi eutanizar três animais do grupo DC madura pró-inflamatória 104 no Dia 7 e todos os outros animais no Dia 15 (onze dias após a injeção do segundo tumor). Contudo, no Dia 7 os tumores esquerdos em um animal do controle e em sete animais do grupo DC madura pró-inflamatória 104 (dado veículo ou veículo + células de vacina, respectivamente) estavam maiores que 2 cmº e esses oito animais foram então eutanizados.
Dois dias depois (Dia 8), o tumor esquerdo (primeiro) nos sete animais remanescentes teve também um erescimento que ultrapassava o limite ético e os animais foram também eutanizados.
Os tumores foram dissecados, pesados e congelados em gelo seco e estocados a — 70º € para histopatologia posterior.
Os tumores congelados (esquerdo e direito) levados ao MicroMorph para análise histopatológica são vistos na Tabela 2 abaixo.
Oito um de criosecção foram preparadas e tingidas com hematoxilina/eosina e para | DCs/macrófagos (anticorpo monocional de rato anti-CD68), células NK | (anticorpo monoclonal de rato anti-CD161a) e células positivas CD8 (CD8+ células T e também CD8+ DCs/macrófagos), de acordo com os métodos bem conhecidos de pessoa habilitáda na àrea, O número de células imunogênicas nos diferentes tumores foi pontuada de maneira céga à seguir: poucas células positivas (1+),
4 x 24/30 . número moderado de células positivas (2+) ou altos números de células ' positivas (3+). ID Grupo Dia do experimento 659 Controle 7 6681 DC madura pró-inflamatória 104 7 662 Controle 9 Í 684 DC madura pró-inflamatória 104 9 6685 DC madura pró-inflamatória 104 7 667 Controle 9 670 DC madura pró-inflamatória 104 9 Tabela 2. Tumores congelados enviados para análise histopatológica. As colunas mostram |D Rato, Grupo e Dia da eutanásia no experimento, respectivamente, A análise dos resultados dos diferentes grupos em referência aos volumes do tumor foi realizada utilizando o testet e mensurações repetidas ANOVA (PASW v. 18 em um computador HP Compac de de 7700p). Estatística descritiva do volume do tumor é apresentada na Tabela 3 e 4 abaixo. Veículo controle DC madura pró-infltamatória 104 Número Número Número Número SEM SEM SEM . SEM válido válido válido válido
TV 003 | 0,02 0,94 | 0,02 da
TV 0,20 d4
TV 117 | 0,168 0,02 0,22 0,01 | 0,01 dê
TV 2,02 0,04 335 | 0,55 dr
2 hs 25/30 Tabela 3: Volume do tumor (TV) dias diferentes (d*). A tabela mostra o volume o médio do tumor (mL), média de erro padrão (SEM) e número de animais (N) no decorrer do estudo. Uma mensuração repetida ANOVA foi utilizada para analisar o volume do tumor do Dia 6 ao Dia 9. O primeiro e segundo tumor foi analisado separadamente. Devido ao manuseio dos valores perdidos nas repetidas análises de mensuração, o último valor mensurado foi levado adiante.
TETETEE válido válido válido válido
TV Ile see eee ee
TV Lg jon e jenjen o lelan| + Jem om| + |
TV Free ==) Tabela 4. O volume médio do tumor (mL), média de erro padrão (SEM) e número de animais (N) com o último valor mensurado levado adiante. *P< 0,05 comparado ao Dia 6 dentro do grupo. XP< 0,05 comparado a todos com o tumor correspondente no grupo controle. XP<0,05 comparado ao tumor correspondente no grupo de controle. Estatística descritiva do peso do tumor são apresentadas na Tabela 5, abaixo. e fem an is so Tam ue nas fes [o válido válido válido válido Tw pb eo pesso feel | a + 26/30
TW EFE FPF) : Tabela 5. O peso médio do tumor (TW,.g), média de erro padrão (SEM) e número de animais (N) em diferentes dias de eutanásia. *P< 0,05 comparado ao tumor correspondente no grupo de controle (teste-t).
A Figura 10 é um gráfico que mostra o volume do tumor (mL) de diferentes tumores em diferentes grupos (COMBIG-DC denota DC madura pró-inflamatória 104). Quando 08 animais foram removidos do estudo, o último valor mensurado foi levado adiante. Os valores são médias +SEM. Pode se ver claramente que ratos tratados com DC madura pró-inflamatória 104 tiveram um volume de tumor menor, ambos em referência ao primeiro e segundo tumor.
O primeiro tumor cresceu muito rápido e todos os animais tiveram que ser eutanizados mais cedo do que o planejado devido ao | grande volume do tumor. Sete dos nove animais do grupo DC madura pró- | 15 inflamatória 104 e um dos seis animais do grupo de controle tiveram que ser ' eutanizados no dia 7 e os animais remanescentes no Dia 9. Para ser possível realizar a análise estatística no material, o último volume de tumor mensurado do dia 7 foi carregado para o dia 8. Isto possivelmente poderia falsamente representar um volume mais baixo do primeiro tumor (injetado pela vacina) no dia 9 e o fato de que mais animais foram removidos do grupo DC madura pró- inflamatória 104, poderiam ser considerados quando fossem analisados os resultados no volume e peso do primeiro (esquerdo) tumor. Uma mensuração ANOVA repetida foi então utilizada para analisar os volumes do tumor do Dia 6 ao Dia9. O primeiro e segundo tumor foi analisado separadamente.
Os grandes volumes de tumor do primeiro tumor no grupo DC madura pró-inflamatória 104 no dia 7 poderiam ser explicados através de uma resposta inflamatória em andamento às células dendrítica injetadas visto que a imunohistoquimica revelou números aumentados de células inflamatórias infiltrantes nesses primeiros tumores no grupo DC madura pró-inflamatória 104 comparado ao grupo dé controle (veja abaixo).
O segundo tumor no grupo DC madura pró-inflamatória 104 teve uma redução estatisticamente significante no volume do tumor
E + 27/30 , comparado ao grupo de controle. Além disso, foi encontrado um peso mais * baixo estatisticamente significante de dois segundos tumores que foram . removidos no dia 9 no grupo DC madura pró-inflamatória 104 em comparação ao grupo de controle.
Os tumores foram congelados e criosecções foram preparadas e tingidas com hematoxilina/eosina e para as DCs/macrófagos (anticorpo monocional de rato anti-CD68), células NK (anticorpo monoclonal de rato anti-CD161a) e células positivas CD8 (CD8+ células T e também CD8+ DCs/macrófagos). Os tumores eram compostos de células tumorais malignas cercados por uma cápsula conectiva solta de largura variável. Filamentos de fibras conectivas foram encontrados entrelaçados com as células tumorais. Áreas de células tumorais necrosadas foram vistas em todas as amostras. Um conjunto de material cristalizado foi visto em alguns dos primeiros tumores (injetados). Uma vez que foi encontrado apenas nos primeiros tumores é muito provável ser um resquício do material injetado.
Um resumo é apresentado abaixo na Tabela 6. e EreEEE a 8a 1- 659 | Controle 7 Primeiro | 1-2+ | 1.2+ | 2+ | Aprox. metade do tumor necrótico | Segundo | 3+ 2+ 2- ij Aprox. metade do tumor necrótico | 3+ DC madura pró- 7 Primeiro | 3+ 2+ 3+ | Aprox. metade do tumor necrótico inflamatória Segundo | 3+ 22 3+ | Aprox. metade do tumor necrótico 104 "= Aprox. metade do tumor necrótico "e eres Segundo | 2+ 2" 2+ viáveis DC madura Maioria das células tumorais prô- Primeiro | 1-2+ 1 2+ | viáveis | inflamatória Segundo | 2+ 1" 2+ | Maioria das células tumorais - 104 BR viáveis [95 BETA | 7 Ipe | [AR reomaamtTas — |
“ [ 28/30 pró- Segundo | 3+ 1-2+ 2- | necróticas o inflamatória 3+ | Maioria das células tumorais cm | pigs | | o Aprox. metade do tumor necrótico | 667 | Controle Primeiro | 2 Y* 2 Maioria das células tumorais Segundo | 2+ 1 2+ viáveis DC madura 2- | Maioria de células tumorais . pró- Primeiro | 2-3+ | 23+ | 3+ | necróticas inflamatória Segundo | 3+ 2-3+ 2- | Maioria das células tumorais 104 3+ | viáveis Tabela 6. Os resultados da análise histopatológica em diferentes dias da | eutanásia (Dia Exp.). Os valores são resultados do número de DCs/macrófagos | (CD68), células NK (CD161a), DCs macrófagos (CD8a) e células T citotóxicas (CD8a). A avaliação morfológica dos tumores foi feita em seções com tintura HE.
Infiltradas no tumor CD8a, CD68 e CD161a as células positivas foram encontradas em todas as amostras analisadas. As células | positivas foram vistas na cápsula ao redor do tumor assim como dentro das áreas do tumor. Embora o resultado não fosse conclusivo pareciam ser uma tendência de que os animais tratados com DC madura pró-inflamatória 104 tivessem uma presença maior de células investigadas.
Desta forma, houve uma tendência do tratamento com injeção intratumoral de DC madura pró-inflamatória 104 induzisse um recrutamento aumentado de DCs/macrófagos, células NK e células T . citotóxicas aos tumores com a seguinte redução em volume e peso do segundo tumor.
Figura 11 mostra fotos de resultados histopatológicos para os macrófagos, células NK, células T citotóxicas (DCs/CD8+) 3 dias após a injeção intratumoral de DC madura pró-inflamatória 104 no tumor primário.
Figura 12 mostra fotos de resultados histopatológicos do correspondente controle, com injeção intratumoral de veículo apenas.
Portanto, pode ser visto que DCs/macrófagos, células NK e células T citotóxicas foram recrutadas para o tumor após a injeção com ;
| ” ú 29/30 . — DC madura pró-inflamatória 104, mas não após a injeção contendo apenas o “veículo A figura 13 mostra fotos de resultados histopatológicos de . DCs/macrófagos, células NK e células T citotóxicas dos tumores secundários 5 dias após a injeção intratumoral de DC madura pró-inflamatória 104 no tumor primário.
Na figura 14 mostra fotos de resultados histopatológicos de controle correspondente, com injeção intratumoral contendo apenas o veículo.
Portanto, pode ser visto que DCs/macrófagos, células NK e células T citotóxicas foram recrutadas até mesmo para o tumor secundário (metástase) após a injeção com DC madura pró-inflamatória 104 no tumor primário, mas em um nível mais baixo após a injeção contendo apenas o veículo.
Resumindo-se, este estudo de vacina em um modelo de tumor pode indicar que a injação intratumoral de DC madura pró- inflamatória 104 induz um recrutamento proeminente de células inflamatórias, incluindo DCs, células NK e células T ao local da injeção (primeiro tumor). Tal intenso recrutamento de células inflamatórias provavelmente explica o aumento observado no volume do tumor 2-3 dias após a injeção. A injeção intratumoral de DC madura pró-inflamatória 104 induz a uma redução de um tumor distante (tumor direito), indicando um efeito sistêmico anti-tumor.
Em uma configuração, o câncer é escolhido a partir do grupo: câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, câncer pancreático, linfomas malignos e câncer esofágico. Em uma configuração, a DC madura pró-inflamatória | 104, ou uma composição 100 de acordo com citado acima, também compreende excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como portadores, preservativos, adjuvantes, etc.
Em . uma configuração o excipiente soroalbumina humana a 2%, forneceu solução fisiológica de NaCl, Em uma configuração, tanto as DCs maduras 104 e as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) 101 são alogênicas em ê , 30/30 , — relação ao sujeito, ou seja, originárias de um doador que é MHC incompatível como sujeito, sendo totalmente MHC incompatível. . Isto tem uma vantagem de que a composição terapêutica pode ser pré-produzida e estocada, como em um estado de congelamento, antes do uso. A natureza alogênica da composição em relação ao paciente também causará a composição para ser mais eficaz, assim como o discutido acima.
Em um aspecto um método de tratar um paciente mamífero está fornecido. O método compreende administrar o paciente, uma ou algumas vezes, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma DC madura pró-inflamatória 104, ou uma composição 100, onde o dono, de onde as DCs maduras pró-inflamatórias 104 e/ou as PBMCs são tiradas, não é o paciente.
A administração pode ser injeção intratumoral.
Nas reivindicações, o termo “compreende/compreendido" não exclui a presença de outros elementos ou etapas. — Ademais, embora listado individualmente, uma pluralidade de elementos ou fases do método pode estar implementada, por exemplo, em uma etapa apenas. Além disso, embora fatores individuais possam estar incluídos em reivindicações diferentes, eles podem possivelmente ser combinados de forma vantajosa e a inclusão em diferentes configurações não implica que uma combinação de fatores não seja praticável e/ou vantajoso. Ademais, referências simples não excluem a pluralidade. Os termos “um”, “uma”, “primeiro”, “segundo”, etc não impedem uma pluralidade. Sinais de referências nas configurações são fornecidos simplesmente para esclarecer um exemplo e não será limitante do áscopo das configurações de qualquer maneira.
Claims (10)
1. CÉLULA DENDRÍTICA (DC) PRÓ-INFLAMATÓRIA, caracterizada pelo fato de ser estimulada por maturação ex vivo por tratamento com as substâncias sal sódico de ácido poliinosínico-policitidílico (poli-1:C), resiquimod (R848) e interferon gama (IFN-y), mas não com prostaglandina E2 (PGE2), para uso no tratamento de câncer em um individuo diferente da fonte da DC madura pró-inflamatória, onde a DC é injetada intratumoralmente.
2. CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ- INFLAMATÓRIA, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a qual em adição foi estimulada com pelo menos uma das substâncias escolhidas a partir do grupo compreendendo a (IFN- o), interleucina 1, beta (IL-1B) e fator de necrose tumoral a (TNF- a).
3. CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ- INFLAMATÓRIA, de acordo com reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de produzir pelo menos 25 000 pg IL-12/mL/10º células, pelo menos 100 000 pg CSCL9/mL/10º células e pelo menos 40 000 pg CCL3/mL/105º células durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
4. CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ- INFLAMATÓRIA, de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de aém de produzir pelo menos 2 000 pg TNF- a /mL/10º células, pelo menos 500 pg IL-18/mL/10º células durante 24 horas após a retirada dos estímulos.
5. COMPOSIÇÃO ENGLOBANDO CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ-INFLAMATÓRIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de conter células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), para uso no tratamento de câncer em um individuo diferente da fonte da DC madura pró-inflamatória ou PBMCs, onde a composição é injetada intratumoralmente.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com reivindicação 5, caracterizada pelo fato de também compreender um super antígeno.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com reivindicação 5, caracterizada pelo fato de também compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ- INFLAMATÓRIA, ou a composição, de acordo com qualquer das reivindicações 1,2,3,4,5,6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o câncer é escolhido a partir do grupo: câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, câncer pancreático, linfomas malignos e câncer esofágico.
9. USO DE UMA CÉLULA DENDRÍTICA (DC) MADURA PRÓ-INFLAMATÓRIA, de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de ser fornecida para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo diferente da fonte da DC madura pró-inflamatória, onde o medicamento é injetado intratumoralmente.
10. USO, de acordo com reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o câncer é escolhido a partir do grupo: câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, câncer pancreático, linfomas malignos e câncer esofágico.
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