CN101481677B

CN101481677B - 体外刺激树突状细胞成熟的方法

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Publication number: CN101481677B
Application number: CN2009100459488A
Authority: CN
Inventors: 周良辅; 毛颖; 花玮; 朱剑虹; 姚瑜
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: CN101481677A

Abstract

本发明涉及用胶质瘤干细胞样抗原体外刺激树突状细胞成熟的方法，其中胶质瘤干细胞样抗原是用X射线辐照胶质瘤干细胞样细胞而制备的。该方法制备的成熟的树突状细胞能够显著提高其介导的CTL杀伤效果，从而提高恶性胶质瘤的治疗效果。另外，本发明还涉及由此制备的成熟的树突状细胞在治疗药物方面的应用、以及胶质瘤干细胞样抗原的制备方法和其应用等。

Description

体外刺激树突状细胞成熟的方法

一，技术领域

本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及用胶质瘤干细胞样抗原体外刺激树突状细胞成熟的方法。另外，本发明还涉及由此制备的成熟的树突状细胞在治疗药物方面的应用、以及胶质瘤干细胞样抗原的制备方法和其应用等。

二，背景技术

胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的肿瘤，其中恶性者(WHOIII、IV级)治愈率低，复发率高，预后差。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，与正常组织无明显分界，所以单靠手术无法根治。虽然术后辅助化疗、放疗，但效果仍不理想，恶性胶质瘤的中位生存期仅51周，需要进一步研究寻找更有效的治疗方案。

以往认为中枢神经系统是免疫豁免区，但近年来的研究表明中枢神经系统不但存在着树突状细胞(dendritic cell)，而且抗瘤效果明显，尤其是小胶质细胞在其中发挥了重要作用。例如，Fischer等人将小鼠的脑组织与GM-CSF一起培养，从中得到了依赖于星形细胞的具有良好的抗原提呈功能的树突状细胞。肖保国等人发现体外培养神经系统的小胶质细胞在GM-CSF的刺激下可以转变为树突状细胞样细胞。

树突状细胞是目前已知最强的抗原递呈细胞，具有启动初次免疫应答的能力，在抗肿瘤免疫治疗中具有重要地位。中国专利申请CN101090633A公开了用未成熟的树突状细胞来治疗肿瘤的方法，但是更多的报道是用成熟的树突状细胞来用于治疗。例如，中国专利申请CN1462195A公开了用成熟的树突状细胞治疗I型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫疾病，其中成熟的树突状细胞是通过IFN-gamma、TNF-alfa、TGF-beta、IL-10等细胞因子体外刺激未成熟的树突状细胞而制备得到的。中国专利申请CN1738619A也公开了用体外部分成熟的树突状细胞治疗患者结肠癌等肿瘤的方法，其中树突状细胞的部分成熟是在卡介苗、干扰素、脂多糖、肿瘤坏死因子等细胞成熟剂的刺激下完成的，在其实施例1中仅披露了与PKH67-A549肿瘤细胞，而不是与肿瘤相关抗原混合孵育。

中国专利CN1141975C公开了一种肿瘤相关抗原的制备方法，包括破碎、灭活肿瘤细胞，然后提取可溶性抗原蛋白，其中没有提示要使用X射线来处理肿瘤细胞抗原的步骤，也没有提示将其用于体外刺激未成熟的树突状细胞成熟而进行治疗。中国专利CN100392074C公开了电穿孔导入针对肝癌等的肿瘤抗原mRNA来刺激树突状细胞成熟的方法，该方法没有提示使用X射线来处理肿瘤相关抗原，相反还优选提示对成熟的树突状细胞进行灭活。中国专利申请CN1471575A公开了一种冷藏成熟的树突状细胞的方法，优选未成熟的树突状细胞是从CD14+或CD34+细胞制备的，但是没有提示处理肿瘤相关抗原的步骤。目前国内外研究的焦点绝大多数还集中在非干细胞样抗原。Pellegatta等人提出了一种制备肿瘤相关抗原的方法(Cancer Res.2006，66(21)：10247-10252)，但是没有提出分选诸如CD133+或A2B5+等干细胞样细胞的步骤，更没有提示包括X射线处理肿瘤相关抗原的步骤。

然而，胶质瘤具有一定的免疫逃避特性是目前胶质瘤免疫治疗效果不满意的主要根源。究其原因，我们认为与胶质瘤干细胞样细胞(stem-like cell)有因果关系。胶质瘤干细胞样细胞免疫原性弱，遗传性状高度不稳定，可通过突变而丧失肿瘤抗原，或通过肿瘤细胞等位基因缺失或表达下调而降低肿瘤抗原量，从而抑制了肿瘤细胞表面抗原的递呈。因此，上述现有技术会受困于胶质瘤的免疫逃避特性而效果不理想。

针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究，本发明人提出了一种新的体外刺激能用于治疗胶质瘤的树突状细胞成熟的方法，其中未成熟的树突状细胞与由胶质瘤干细胞样细胞经X射线处理制备得到的相应肿瘤相关抗原一起孵育，由此制得的树突状细胞能够显著提高其介导的CTL杀伤效果，从而提高胶质瘤的治疗效果；另外，本发明人优选出其中胶质瘤细胞的培养和收集方法，收集的胶质瘤干细胞样细胞(如CD133+或A2B5+细胞)制备而成的相应肿瘤相关抗原，最终也能通过与树突状细胞孵育，而进一步提高CTL杀伤效果。除了胶质瘤疗效改进之外，本发明还具有操作简便易行、成本较低、质量稳定等优点。

三，发明内容

本发明的目的在于提供了用胶质瘤干细胞样抗原体外刺激树突状细胞成熟的方法，其中用X射线辐照胶质瘤细胞培养物制备的胶质瘤相关抗原，从而能显著提高成熟的树突状细胞介导的CTL杀伤效果。而且，本发明的目的还在于在体外刺激树突状细胞成熟的方法中提供培养胶质瘤细胞的优选方案，也能进一步提高成熟的树突状细胞介导的CTL杀伤效果。另外，本发明还提供了由此制备的成熟的树突状细胞在治疗药物方面的应用、以及胶质瘤相关抗原的制备方法和其应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了体外刺激树突状细胞成熟的方法，其包括：

(1)培养胶质瘤细胞，并收集分选CD133+或A2B5+干细胞样细胞；

(2)用X射线辐照步骤(1)所收集的细胞，制成胶质瘤干细胞样抗原；

(3)未成熟的树突状细胞在树突状细胞成熟剂存在的条件下成熟，其中所述树突状细胞成熟剂包括步骤(2)制成的胶质瘤干细胞样抗原。

以上过程均在体外进行，获得成熟的树突状细胞。

本发明人经过研究发现，通过X射线辐照使步骤(1)所收集的细胞凋亡而制备的胶质瘤干细胞样抗原能取得更好的效果，因此制备胶质瘤干细胞样抗原的步骤(2)中采用X射线辐照处理。其中，X射线辐照的强度可以为7-9Gray，优选为6Gray。经X射线辐照使细胞凋亡后，可以简单地收集凋亡的细胞，例如反复吹打凋亡的细胞后高速离心收集蛋白混合物，即制成胶质瘤干细胞样抗原。该抗原可于-20℃冻存。

在本发明中，胶质瘤细胞可以是原代胶质瘤细胞系或胶质母细胞瘤细胞株，优选是来自人的原代胶质瘤细胞系或胶质母细胞瘤细胞株。例如，胶质瘤细胞可以是外科手术中获得的人胶质瘤细胞系，如在本发明具体实施方式中所用的SHG62或SHG66(可参见：中国临床神经科学，2008 16(6)：565-571，其作者可以在知情同意时发放，用于非商业目的)；胶质瘤细胞也可以是胶质母细胞瘤细胞系，如本发明具体实施方式中所用的U87或U251(购自中国科学院上海生命科学研究所)。本发明的具体实施方式特别优选胶质瘤细胞是胶质瘤细胞系U87。步骤(1)中培养胶质瘤细胞的培养基优选为无血清培养基，尤其优选本发明实施例中所使用的无血清培养基(简称为SFM)，其是DMEM/F12培养基，其中添加有20μg/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、20μg/ml表皮生长因子(EGF)和20μg/ml B27。这样培养出的细胞较少分化，保留有肿瘤干细胞样特性。

由于即使使用上述无血清培养基，其中大部分为干细胞样细胞，仍旧会有少量细胞会分化，因此优选步骤(1)中收集培养出的细胞的步骤包括分选CD133+或A2B5+干细胞样细胞的过程。这样，步骤(1)中收集的细胞为CD133+或A2B5+干细胞样细胞。由于CD133+细胞是目前公认的胶质瘤干细胞样细胞(Nature，2004，432：396-401)，因此更优选步骤(1)中收集培养出的细胞的步骤包括分选CD133+细胞的过程。这样，步骤(1)中收集的细胞为CD133+干细胞样细胞。这样便能够保留肿瘤干细胞样特性。

这样培养分选出的干细胞获得的抗原比在含血清的培养基中培养出的细胞抗原效果更好。因此，本发明的步骤(1)中培养出的细胞优选为CD133+细胞，也优选为A2B5+细胞或肿瘤干细胞样细胞。

由此，步骤(1)中收集培养出的细胞的步骤优选包括分选CD133+细胞的过程。即可以在步骤(1)收集培养出的细胞的过程中，包括分选出CD133+细胞的步骤。分选的方法可以采用磁化抗体来分离，例如可使用抗CD133的磁化抗体(购自Miltenyi biotec)来分选出CD133+细胞。

使用步骤(2)制备出的胶质瘤干细胞样抗原刺激未成熟的树突状细胞成熟。未成熟的树突状细胞的制备方法是现有已知的，如本文背景技术部分所列举的文献所述的，也优选使用本文实施例的制备方法，从外周血单核细胞制备出未成熟的树突状细胞。刺激未成熟的树突状细胞成熟的树突状细胞成熟剂优选还包括现有技术中常用的细胞成熟剂，如本文背景技术部分所列举的文献所述的那些。在本发明的具体实施方式中，所述树突状细胞成熟剂优选包括GM-GSF和IL-4。经过树突状细胞成熟剂处理后，优选还可以包括检测树突状细胞成熟的步骤，收集成熟的树突状细胞。检测树突状细胞成熟的技术是现有已知的，例如可以通过检测树突状细胞表面的HLA-A、HLA-DR及CD80、CD86等相关分子来进行，由此收集成熟的树突状细胞。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法刺激成熟的树突状细胞。本发明的成熟的树突状细胞由于优选了刺激方法中所用的胶质瘤干细胞样抗原，因而使其具能诱导出更优良的细胞毒性淋巴细胞(CTL)的细胞毒性。该成熟的树突状细胞可用于诱导CTL的杀伤能力，因而可用于临床治疗。本发明的成熟的树突状细胞可以采用任何适于给药的剂型和方式进行给药，优选配制成注射剂进行给药。例如，该成熟的树突状细胞可与药学上可接受的载体结合，通过注射器、导管或插管或皮下等给药。

因此，在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的成熟的树突状细胞在制备治疗胶质瘤的药物中的应用。成熟的树突状细胞可使用本领域技术人员熟知的方法与药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲液或稀释剂一起配制成药物，用于治疗患者的胶质瘤。成熟的树突状细胞也可作为药物，直接给与需要治疗的胶质瘤患者。例如，成熟的树突状细胞可直接注射入患者肿瘤内、肿瘤近旁或邻近肿瘤的血管或淋巴管内或皮下。例如，向胶质瘤患者注射成熟的树突状细胞，如每隔1周皮下注射2～4×10⁶个成熟的树突状细胞，共进行3周。

本发明的成熟的树突状细胞可用于单独给药进行治疗。此外，本发明的成熟的树突状细胞也可以与其他肿瘤治疗方法组合使用来治疗胶质瘤。例如，本发明的成熟的树突状细胞可与肿瘤外科手术、化疗(细胞毒性药物，凋亡试剂，抗体等等)、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法(如，给药其他抗原特异性成熟的活化树突细胞、NK细胞，肿瘤抗原特异性抗体、添加佐剂等)之一种或多种来组合使用。组合使用时，不同的疗法可以同时或依次进行。

除了涉及成熟的树突状细胞的发明外，本发明还涉及以下几个方面。

在第四方面，本发明提供了制备胶质瘤干细胞样抗原的方法，其包括：

(1)培养胶质瘤细胞，并收集分选培养出的细胞；

(2)用X射线辐照步骤(1)所收集的细胞，制成胶质瘤干细胞样抗原。

以上方法中的具体特征如本发明第一方面所述。例如其中，X射线辐照的强度特别优选为6Gray。又如其中，胶质瘤细胞特别优选是胶质瘤细胞系U87。

在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的方法制备的胶质瘤干细胞样抗原。用其刺激成熟的树突状细胞具有更好的诱导特性。

因而，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的胶质瘤干细胞样抗原在体外刺激树突状细胞成熟的方法中的应用。例如，该胶质瘤干细胞样抗原在本发明第一方面的方法中的应用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

四，附图说明

图1：诱导前(SFM中培养)的胶质瘤细胞球表达CD133和Nestin；Vimentin在细胞球和血清诱导分化的细胞均表达；胶质瘤细胞在血清诱导分化后可表达GFAP、CNPase和β-tubulin。

五，具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harborlaboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。

实施例1，胶质瘤细胞的培养和分选

胶质瘤细胞系SHG62和SHG66分别是来源于神经外科手术的胶质瘤细胞系(可参见：中国临床神经科学，2008 16(6)：565-571，其作者可以在知情同意时发放用于非商业目的)；胶质母细胞瘤细胞系U87可购自中国科学院上海生命科学研究所。

以上细胞分别以1×10⁵个细胞/mL的浓度在含血清的培养基(简称为SCM)和无血清培养基(简称为SFM)中各自培养。SCM是添加了10％胎牛血清的DMEM培养基；SFM是DMEM/F12培养基，其中添加有20μg/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、20μg/ml表皮生长因子(EGF)和20μg/ml B27添加因子。细胞培养条件为37℃、95％空气、5％CO₂和100％湿度，并且每周传代两次。

SHG62、SHG66和U87细胞都能在SCM和SFM中稳定传代。通过显微镜检查发现，SCM中培养的细胞贴壁分化为梭形，带有突出；而SFM中培养的细胞倾向于悬浮生长形成神经球样(以下称为肿瘤球)，仅有小部分分化，传代时弃去分化的细胞。分别用抗CD133(购自Miltenyi biotec)、抗Nestin(购自Chemicon)的小鼠抗人抗体等作为一抗，将FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，通过细胞免疫组织化学分析生长形成肿瘤球的细胞的表面标记。结果如图1所示。生长形成肿瘤球的细胞为CD133和Nestin阳性。

然后，对SFM中培养的细胞使用流式细胞仪分选，其过程为将SFM中培养的干细胞样细胞用0.2％胶原酶IV 37℃消化5分钟，再用400目钢筛过滤，制备单细胞悬液，然后根据厂商说明书记载，用CD133/1-PE(Miltenyi Biotech)标记后用流式细胞仪分选，收集阳性细胞，即分选出CD133+干细胞样细胞。

或者，代替使用流式细胞仪分选，可以对SFM中培养的细胞使用磁珠分选方法分选，其过程为同上制备单细胞悬液，然后根据厂商说明书记载，用CD133/1磁珠抗体(Miltenyi Biotech)标记后在磁场中过柱(相应厂商的配套专用柱)，撤除磁场后用1×PBS洗脱黏附于柱上的阳性细胞，即分选出CD133+干细胞样细胞。通过CD133/2-PE(Miltenyi Biotech)标记后流式细胞仪检测其纯度。

实施例2，胶质瘤肿瘤相关抗原的制备

将实施例1中用SCM培养的细胞和SFM培养以及经CD133分选出的细胞分别制备成肿瘤相关抗原。分别通过以下两种方法进行制备：

(1)冻融法

取1×10⁷个培养的细胞重悬于300μl PBS中，将其置于液氮中5分钟，然后取出立刻置于水浴中以37℃温浴5分钟，然后如此反复冻结和熔融，共进行三次，5000rpm离心，用吸管反复吹打后得到的混合物即为肿瘤相关抗原溶液。

(2)辐照法

取1×10⁷个培养的细胞用X射线以6Gray的强度照射3分钟，取样通过台盼蓝(trypan blue)染色确定大部分细胞死亡后，将辐照过的细胞收集后5000rpm离心，弃去上清，沉淀重悬于300μl PBS中，用吸管反复吹打后得到的混合物即为肿瘤相关抗原溶液。

以上两种方法制备的溶液分别通过Bradfrod蛋白质浓度测定法确定其蛋白浓度，然后用pH7.2的PBS将肿瘤相关抗原溶液调节为1μg/μl的蛋白浓度，并置于液氮保存。

实施例3，树突状细胞的成熟

根据Jonuleit等(Gene Ther.2003 10(3)：243-250)所述的方法，由外周血单核细胞(PBMC)制备树突状细胞。简而言之，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC，然后将PBMC以2.5～5×10⁷个细胞/孔的量接种于含每孔3mlRPMI1640培养基的六孔板(Coming/Costar，Bodenheim)的孔中，在37℃、5％CO₂的条件下孵育90分钟。加入添加有10％胎牛血清、5mg/ml谷氨酰胺、800U/mlGM-CSF和1000U/ml IL-4(R&D Systems)的RPMI1640培养基培养贴壁的细胞，于7天后收集未成熟的树突状细胞。

用1×PBS洗未成熟的树突状细胞两次，然后收集、计数。将未成熟的树突状细胞以2×10⁶个细胞/mL的量重悬于RPMI1640培养基中，并于37℃孵育18小时，其中该RPMI1640培养基含5ng/mL GM-CSF和5ng/ml IL-4以及150μg/μl实施例2制备的肿瘤相关抗原。由此，肿瘤相关抗原完成刺激树突状细胞成熟的过程。

用JAM测试(Cancer Res.2006，66(21)：10247-10252)检测由不同培养基并用不同抗原制备方法得到的肿瘤相关抗原刺激的树突状细胞诱导的CTL细胞毒性，其结果如表1所示。空白对照是未使用肿瘤相关抗原刺激的树突状细胞。结果表明，用肿瘤相关抗原刺激的树突状细胞更能诱导CTL细胞毒性。其中，使用无血清培养基中的干细胞样细胞制备的肿瘤相关抗原比使用使血清培养的肿瘤细胞最终能产生更好的CTL细胞毒性；使用磁珠分选后的阳性细胞制备的肿瘤相关抗原较分选前细胞制备的抗原最终能产生更好的CTL细胞毒性；使用辐照法制备的肿瘤相关抗原比使用冻融法制备的能最终产生更好的CTL细胞毒性。

表1不同肿瘤相关抗原刺激的树突状细胞诱导的CTL对相应肿瘤靶细胞的杀伤率

实施例4，胶质瘤的临床应用试验

应用上述描述的方法，本发明人针对复发胶质瘤病人首先采用了树突状细胞介导免疫疗法来治疗胶质瘤(已通过相关伦理审批)，方法简述如下：经病理证实的恶性胶质瘤患者(III或IV级)符合入选标准的再次手术时取2～5g肿瘤标本在体外培养扩增；采用实施例1中无血清培养基和CD133流式分选；采用实施例2中的辐照法制备肿瘤相关抗原。另外采集病人静脉血20毫升/次，共3次(术后1个月开始每周1次)，按实施例3中描述分离单核细胞，诱导树突状细胞；采用实施例3种方法刺激树突状细胞成熟。成熟的树突状细胞用PBS洗涤后调整体积为0.5～0.8ml，三角肌皮下注射3次(每周1次)。目前已完成3例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。

Claims

1.体外刺激树突状细胞成熟的方法，其包括：

(1)培养胶质瘤细胞，并通过分选CD133+细胞，收集培养出的CD133+细胞，其中培养胶质瘤细胞的培养基为无血清培养基，收集的CD133+细胞为干细胞样细胞；

(2)用强度为6GrayX的射线辐照步骤(1)所收集的CD133+细胞，制成胶质瘤干细胞样抗原；

(3)未成熟的树突状细胞在树突状细胞成熟剂存在的条件下成熟，其中所述树突状细胞成熟剂包括步骤(2)制成的胶质瘤相关抗原，以及GM-GSF和IL-4。

2.权利要求1所述的方法，其中胶质瘤细胞是胶质瘤细胞系U87。

3.一种成熟的树突状细胞，其特征在于使用权利要求1所述的方法刺激得到。

4.权利要求3所述的成熟的树突状细胞在制备治疗胶质瘤的药物中的应用。

5.制备胶质瘤干细胞样抗原的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)培养胶质瘤细胞，并通过分选CD133+细胞，收集培养出的CD133+细胞；

(2)用强度为6GrayX射线辐照步骤(1)所收集的CD133+细胞，制成胶质瘤干细胞样抗原。

6.权利要求5所述的方法，其中胶质瘤细胞是胶质瘤细胞系U87。

7.权利要求5所述的胶质瘤干细胞样抗原在体外刺激树突状细胞成熟的方法中的应用。