CN105132373A - 一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗原致敏的树突状细胞(Dendritic？Cells，DC)制备方法。一方面，本发明提供了一种用于抗原致敏DC制备的培养基，其由基础培养基和其它成分组成，它们可以在使用前方便地混合成为培养基用于DC培养。所述其他成分包括药用级人白蛋白、重组人胰岛素等。所述培养基具有成分明确、无动物源性成分等特点。另一方面，本发明提供了一种利用本发明所述培养基制备抗原致敏DC的方法，单个核细胞经本发明的培养基培养和诱导得到未成熟DC细胞；利用高静水压制备强免疫原性肿瘤抗原，联合黄芪多糖作为免疫佐剂，对未成熟DC进行抗原致敏，获得抗原致敏DC。所述制备方法具有安全有效、简单易行等优点。可通过本方法为临床提供特异性治疗用途的DC疫苗。

Description

一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法，属于细胞工程与生物医药技术领域。

背景技术

体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种(非人体)的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断和预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞(LymphokineActivatedKillerCells，LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TumorInfiltrativeLymphocytes，TIL)、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞(IVS)等。国内的免疫细胞治疗较多应用于治疗肿瘤及病毒性感染疾病如肝炎、艾滋病等。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免疫活性细胞(单个核细胞)，回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CytokineInducedKillerCells，CIK)免疫治疗、树突状细胞(DendriticCells，DC)免疫治疗、DC-CIK细胞免疫治疗、自然杀伤细胞(NatureKiller，NK)免疫治疗等。

树突状细胞(DendriticCells，DC)是1973年美国Rockeflle大学Steinman和Cohn在观察脾脏细胞时发现的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。DC来源于造血干细胞，广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中，是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，其膜表面高表达MHC-II类分子，能有效刺激初始型T细胞活化，其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和B细胞。因此，DC是机体免疫应答的主要启动者，在肿瘤免疫中亦发挥关键作用。国内外学者应用各种方法将DC进行处理，在体外扩增活化，并予以相应的抗原刺激以制成DC疫苗，然后回输至患者体内进行免疫治疗。

然而DC在体内的数量极少，难以满足临床治疗研究的需要，随着研究的深入，体外诱导制备DC的技术取得了很大的进步，目前应用最为广泛的是用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GranulocyteMacrophageColonyStimultingFactor，GM-CSF)和白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)共同刺激单核细胞，使其分化为不成熟DC并进一步分化为成熟DC。也可用GM-CSF和肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)与来源于骨髓或外周血的CD34+造血祖细胞共同培养，获得大量DC。

体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、人AB型血清或自身血清的完全培养基，也可以使用无血清培养基进行无血清培养。血清在细胞培养中的作用主要包括：a.提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供基础培养基所缺乏的营养物质；b.提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而祈祷稳定和调节上述物质活性的作用，此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用；c.提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子；d.提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤；e.提供pH缓冲物质，调节培养基pH；f.影响培养基系统中的某些物理特性如剪切力、粘度、渗透压和气体传递速率等。但是，血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应形成有细胞毒作用的聚精胺。此外，血清中的补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。胎牛血清及人异体血清有外来抗原和感染的可能，易引起过敏反应，而且有MHC限制等。而自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子和白介素-10是DC分化、成熟的抑制剂，从而导致使用自体血清培养DC产率低。上述使用血清进行DC扩增培养存在的问题大大限制了其在肿瘤免疫治疗中的进一步应用，而相较而言，无血清培养基在基础培养基的基础上，引入成分完全确定或部分明确的血清替代物，使培养基既能满足细胞生长的基本需求，又能有效避免上述因为使用血清带来的诸多不利因素，因此无血清培养基诱导制备DC有着广阔的临床应用前景。

无血清培养过程中添加血清替代成分的方式有两种，一种是在新研发的无血清培养基成分中已经包含了各种血清替代成分，可直接进行培养；另一种是单独提供血清替代物，在培养时代替血清添加进入培养体系中，还需另行添加部分血清替代成分如生长因子、激素等。用于DC培养的无血清培养基在国内外均有可商购的产品，以用于免疫细胞培养的无血清培养基为例，进口产品有Sigma-Aldrich公司的StemlineTMDendriticCellMaturationMedium、R&DSystems公司的StemXVivoTMSerum-FreeDendriticCellBaseMedia、CellGenix公司的CellGroGMPSerum-freeDendriticCellMedium、Celprogen公司的HumandendriticPrimaryCellCultureSerumFreeMedia、Lonza公司的X-vivo、Gibco公司的AIMV培养基等，国内产品如百恩维的BW12002等。

虽然无血清培养基具有许多传统的含血清培养基无法比拟的优势，但是其仍存在以下的不足有待改善：a.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便；b.针对性强，不同类型的细胞、甚至不同细胞系或细胞株对培养基营养成分的需求都不同；c.使用无血清培养基进行原代细胞分离时细胞得率偏低；d.细胞功能可能被改变导致细胞功能不全；e.目前大部分无血清培养基所必需的胰岛素和转铁蛋白仍以动物为来源，并没有消除血清带来的安全隐患；f.成本较高。

为改善和解决上述问题，研究者们也在不断探索和改进免疫细胞无血清培养基的配方，专利CN201110081988.5提供了一种人源性无血清培养基，是由治疗用人血清白蛋白、人重组胰岛素、人转铁蛋白、人胆固醇、人过氧化氢酶、2-巯基乙醇、抗坏血酸、亚油酸、乙醇胺、人玻连蛋白、L-谷氨酰胺组成的，其所添加的蛋白质和脂类均来源于人的血浆、血清或组织，为药物级或高度纯化的人源蛋白或人重组蛋白，不含动物源成分，该发明虽然避免了动物源性物质的安全隐患，但是人源蛋白或人重组蛋白价格昂贵，不利于大规模推广使用；专利CN201310082166.8提供了一种化学成分明确、无动物源的用于淋巴细胞的培养和增殖的无血清培养基，组成成分复杂，包含有IMEM基础培养基、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、微生物、微量元素、氢化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸和柠檬酸铁。然而该产品仅适用于淋巴细胞的培养增殖，而且使用的人重组蛋白或人源蛋白价格昂贵，在使用上具有很大的局限性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗原致敏的树突状细胞(DendriticCells，DC)的制备方法。

本发明的一个目的在于提供一种用于制备抗原致敏的DC的无血清替培养基，其具有成分明确、无动物源性成分、蛋白成分含量低、不含转铁蛋白、不含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等特点。

本发明的第二个目的在于提供一种利用本发明的培养基制备抗原致敏的DC的方法。所述方法具有安全有效、简单易行、易于推广实践等优点，可通过本方法为临床提供特异性治疗用途的DC疫苗。

本发明的第一个目的是这样实现的：

提供了一种用于制备抗原致敏的DC的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由基础培养基和其它成分组成。

其中，所述其它成分包含以终浓度计50-200mg/L药用级人白蛋白、10-100mg/L重组人胰岛素、50-500mg/L重组人纤连蛋白、500-5000mg/L亲脂性铁鳌合剂、500-2000mg/L柠檬酸铁、10-100mg/L脂质、1.5-50mg/L微量元素、10-100mg/L激素、500-3000mg/L剪切力保护剂、0.01-100mg/LCP-64131、50-5000IU/ml重组人白细胞介素4(rhIL-4)。

优选地，所述其它成分包含以终浓度计100-200mg/L药用级人白蛋白、30-80mg/L重组人胰岛素、100-200mg/L重组人纤连蛋白、100-2000mg/L亲脂性铁鳌合剂、100-1500mg/L柠檬酸铁、20-80mg/L脂质、2-30mg/L微量元素、20-50mg/L激素、1000-2000mg/L剪切力保护剂、0.1-10mg/LCP-64131、100-2000IU/mlrhIL-4。

更优选地，所述其它成分包含以终浓度计100mg/L药用级人白蛋白、100mg/L重组人胰岛素、100mg/L重组人纤连蛋白、1500mg/L亲脂性铁鳌合剂、1000mg/L柠檬酸铁、40mg/L脂质、5mg/L微量元素、30mg/L激素、1500mg/L剪切力保护剂、0.5mg/LCP-64131、200IU/mlrhIL-4。

其中，所述亲脂性铁螯合剂包含但不限于甘氨酰甘氨酸(glycylglycine，GG)、亚氨基二乙酸(iminodiaceticacid，IDA)、二羟乙基甘氨酸(dihydroxyethylglycine，DHEG)、乙醇胺(ethanolamine)、N-二甲基乙酰替苯胺亚氨基二醋酸(N-(2-hydroxyethyl)imnimodiaceticacid，HIDA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)等；所述脂质包含但不限于花生四烯酸、胆固醇、油酸、亚油酸、硫辛酸、亚麻酸等；所述微量元素包含但不限于铁、铜、锌、硒、钴、镍、锰等；所述激素包含但不限于地塞米松、孕酮、胆固醇等；所述剪切力保护剂包含但不限于泊洛沙姆等。

其中，所述基础培养基包括但不限于RPMI1640培养基、DMEM培养基等。

其中，本发明的其它成分在使用前可通过本领域技术人员公知的方法方便地与基础培养基混合，形成完整的培养基，用于DC培养。

其中，本发明的培养基的其他成分中所述的CP-64131和rhIL-4优选仅在有必要时加入，即，在诱导DC细胞时加入。

本发明的第二个目的是这样实现的：

提供了一种抗原致敏的DC的制备方法，其特征在于：

采用密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMC)，经本发明的培养基培养和诱导，得到未成熟DC细胞(immatureDC，iDC)；利用高静水压(HighHydrostaticPressure，HHP)制备具有强免疫原性肿瘤抗原，联合黄芪多糖(AstragalusPolysaccharids，APS)作为免疫佐剂，对iDC进行抗原致敏，引发机体发生抗肿瘤特异性免疫反应，获得抗原致敏的树突状细胞。其典型地包括以下三个步骤：

步骤一：在体外于适当温度下利用适当强度的高静水压对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡，制备具有强免疫原性肿瘤抗原。具体操作如下：

在体外对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞在一定适当温度下利用适当强度的HHP进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡；在肿瘤细胞发生凋亡的48小时后，可以检测其免疫原性细胞死亡标志物分子的表达水平，收集细胞并以一定细胞密度冻存于液氮中备用。

步骤二：利用本发明的培养基，从人单个核细胞诱导未成熟的树突状细胞。具体操作如下：

采用密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMC)，小心吸取富含单个核细胞的细胞层以，再经离心、洗涤，获得PBMC；PBMC经末次离心后弃上清，利用贴壁法并配合使用本发明的培养基培养和诱导，得到未成熟DC细胞(immatureDC，iDC)。

步骤三：利用HHP所获得的凋亡的肿瘤细胞，活化未成熟树突状细胞，诱导获得成熟树突状细胞，即所述抗原致敏的树突状细胞。具体操作如下：

将HHP处理后的肿瘤细胞与适量的APS溶液混合，用以对iDC细胞进行活化，得到所述抗原致敏的树突状细胞；使用流式细胞仪对DC细胞特定表面分子表达量的水平进行检测，检测DC的成熟度；将自体淋巴细胞与一定比例的成熟DC(matureDC，mDC)进行混合培养，检测特异性T淋巴细胞的激活情况。

在一个优选的实施方案中，本发明采用如下方法获得肿瘤细胞：

(1)在体外对不同类型的人肿瘤细胞用HHP进行处理，处理条件为HHP＝100MPa-600MPa，处理温度4℃-40℃，处理时间10分钟-60分钟。

(2)将HHP处理后的肿瘤细胞继续培养48小时，收集细胞，并以一定细胞密度冻存于液氮中备用。

在另一个优选的实施方案中，本发明采用如下方法获得iDC：

(1)将PBS缓冲液稀释后的外周血样本沿管壁小心铺在细胞分离液上，在温度为10-40℃、离心转速为500-5000rpm的条件下进行离心10-60分钟，停止离心后，PBMC在分离液和血浆的交界面形成比较明显的云雾层，利用移液管将云雾状细胞条带吸出置入另一离心管中，加入Hank’S液，于500-500rpm的条件下离心5-60分钟，洗涤1-5次。

(2)末次离心后弃上清，加入本发明的培养基(不含CP-64131和rhIL-4)重悬细胞，调整细胞浓度于5％CO₂、37℃孵育2-10h后，吸出培养液于另一支离心管备用(用于制备自体淋巴细胞悬液)；应用PBS溶液2-3ml轻轻清洗培养瓶，加入本发明的培养基(含CP-64131和rhIL-4)4ml，继续于5％CO₂、37℃连续培养5-7天，在培养第3天半量换液，同时补加CP-64131和rhIL-4保持其终浓度不变，得到iDC。

在又一个优选的实施方案中，本发明采用如下方法获得抗原致敏的mDC：

(1)将获得的iDC以10⁶/ml接种于6孔培养板中，每孔1-2ml。将处理后的肿瘤细胞，按照肿瘤细胞：iDC为1∶2至1∶50的比例与未成熟的DC等体积混合；在37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下孵育6-24小时。

(2)取出培养板，加入配制好的APS溶液进行刺激活化，使iDC转化为mDC。

其中，肿瘤细胞中的细胞表面热激蛋白70(HeatShockProtein70，Hsp70)、热激蛋白90(HeatShockProtein90，Hsp90)等家族蛋白可以在肿瘤细胞凋亡时，与肿瘤细胞内的抗原肽结合形成复合物，该复合物可与肿瘤细胞表面的MHCI类分子结合，通过MHCI类分子将抗原递呈给DC，或者肿瘤特异性T淋巴细胞，促进后者活化，诱导机体的抗肿瘤免疫反应(王清，王林艳《细胞与分子免疫学报》2013，29(1))。钙网织蛋白(Calreticulin，CRT)展示到肿瘤细胞表面后可以作为“eatme”信号，吸引具有抗原递呈作用的DC细胞与肿瘤细胞发生粘附，使后者活化后，启动肿瘤特异性免疫反应(洪超，高晓明《生物物理学报》2012，28(8))；细胞内活化的caspase-3(Activecaspase-3)则是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。

在又一个优选的实施方案中，对所述的DC进行形态学观察、流式细胞术检测：

对收获的DC细胞进行形态学观察，以及流式细胞术检测；将完成检测的DC细胞以一定细胞密度冻存于液氮中备用。

优选的DC成熟度的检测指标包括：形态学观察、DC细胞表面标志物CD80、CD83和CD86等。在大多数组织中，DC以不成熟形式存在，主要发挥着“哨卫”的作用，有强大的摄取抗原的功能。DC成熟后，其抗原捕获能力迅速下降，已捕获的抗原经其加工、处理后可迅速与其胞质内的MHC-II类分子结合形成MHC-II/肽复合体，表达于DC表面，同时表达高水平的协同刺激因子，如CD80、CD86等。成熟DC能有效的内化、加工和提呈可溶性抗原，并能激活初始T细胞，启动T细胞介导的特异性免疫应答。另外，它能刺激B淋巴细胞增殖和分化，激活自然杀伤(NK)细胞，同时具有向局部淋巴结迁移的能力。

在又一个优选的实施方案中，对本发明所述抗原致敏的DC细胞特异性激活T淋巴细胞进行检测：

将自体T淋巴细胞与一定比例的本发明所述的抗原致敏的DC细胞进行混合培养，在不同的培养基处理下，检测特异性T淋巴细胞的激活情况。

特异性T淋巴细胞激活的检测指标包括：使用流式细胞仪分析产生INF-γ的CD8+T淋巴细胞的比例等。特异性T淋巴细胞活化水平的检测方法包括细胞因子检测法和靶细胞杀伤能力测定法。特异性T细胞在活化后可以分泌一些具有特定功能的细胞因子，例如INF-γ，介导细胞毒性杀伤作用。特异性T淋巴细胞分为不同亚群，一般情况下，CD8+T淋巴细胞是发挥细胞毒杀伤活性的主要T淋巴细胞亚群。此外，活化后的特异性T淋巴细胞可以通过细胞表现的T细胞受体(TcellReceptor，TCR)等分子，识别某些表达特异性抗原分子的细胞，例如肿瘤细胞的表面分子，与其结合后通过释放穿孔素，颗粒酶等物质，杀伤靶细胞；或者通过Fas受体(Fasligand)介导靶细胞发生凋亡(潘景轩，马涧泉《免疫学杂志》1997，01)。

附图说明

图1是T47-D肿瘤细胞在不同培养基处理下刺激DC后，DC细胞表面标志物(CD80、CD83、CD86)的检测结果比较图。

图2是H1299肿瘤细胞在不同培养基处理下刺激DC后，DC细胞表面标志物(CD80、CD83、CD86)的检测结果比较图。

图3是T47-D肿瘤细胞在不同培养基处理下刺激DC后，成熟DC细胞激活T淋巴细胞的检测结果比较图(INF-γ的CD8⁺T淋巴细胞的比例)。

具体实施方案

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1用于抗原致敏的树突状细胞制备的培养基A的制备

本发明的用于抗原致敏的树突状细胞制备的培养基由基础培养基和其它成分组成。优选地，所述基础培养基为RPMI1640培养基，所述其它成分由配方A组成，其中配方A如表1所示。

表1用于抗原致敏的树突状细胞制备的配方A

其中，药用级人白蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白、rhIL-4购自R&Dsystem，所述其余试剂均购自Sigma-Aldrich公司。所述配方A制备方法如下：

1.制备胆固醇溶液：称取50mg胆固醇粉末，加入20mlRPMI1640培养基中，超声波振荡器于4℃震荡1小时，使之完全乳化，即得胆固醇储存液(2.5mg/ml)，于-30℃保存。

2.制备亚油酸溶液：称取80mg亚油酸溶于20ml标准乙醇中，充分震荡溶解，即得亚油酸储备液(4mg/ml)，于8℃储存。

3.其余成分均溶解于RPMI1640培养基中，得储备液。其中，药用级人白蛋白储备液(10mg/ml)、重组人胰岛素储备液(10mg/ml)、rhIL-4(20000IU/ml)于-20℃储存；甘氨酰甘氨酸(150mg/ml)、柠檬酸铁(100mg/ml)、硫酸亚铁(0.2mg/ml)、硫酸铜(0.02mg/ml)、硫酸锌(0.1mg/ml)、亚硒酸钠(0.01mg/ml)、氯化钴(0.1mg/ml)、氯化镍(0.05mg/ml)、氯化锰(0.02mg/ml)、地塞米松(0.5mg/ml)、泊洛沙姆188(150mg/ml)、CP-64131(0.05mg/ml)储备液于8℃储存。

4.将上述各组分的储备液各10ml加入容器中混合并搅拌均匀，加入RPMI1640培养基(北京东方华辉生物医药科技有限公司)将总体积补充至900ml，采用0.45um和0.22um滤膜各一张(上层为0.45um，下层为0.22um)进行过滤除菌，并用5％NaHCO3调节pH到7.2，再加入RPMI1640培养基将体积补充至1000ml，即得本发明培养基A。

实施例2利用HHP制备具有强免疫原性肿瘤抗原

1.分别选用人乳腺癌细胞T47-D和人非小细胞肺癌细胞H1299用HHP进行处理(肿瘤细胞系均购自中国协和医科大学基础医学研究所)，处理条件为HHP＝250MPa，处理温度25℃，处理时间20分钟。处理后，细胞用含有10％FBS的RPMI1640在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养继续培养48小时。

2.所获细胞样品中的细胞密度为10⁶/ml，保存体积为1ml，用无血清冻存液(CryostorCS10，美国BiolifeSolutions公司)重悬后，冻存于液氮中。

实施例3采用本发明的培养基A诱导PBMC来源的iDC细胞

1.将5ml细胞分离液(人单个核细胞分离液1.077，货号25710，北京东方华辉生物医药科技有限公司)加入到15ml离心管(德国SARSTEDT公司)，再将5mlPBS缓冲液(北京东方华辉生物医药科技有限公司)1∶1稀释后的外周血样本沿管壁小心铺在细胞分离液上，在温度为20℃，离心转速为2000rpm的条件下进行离心15分钟。

2.停止离心后，PBMC在分离液和血浆的交界面形成比较明显的云雾层，利用移液管将血清层吸出并弃置不用，再利用移液管小心将云雾状细胞条带吸出置入另一离心管中，加入5倍体积的Hank’S液(北京东方华辉生物医药科技有限公司)，于1500rpm条件下离心10min，洗涤细胞2次。

3.末次离心后，弃上清，分别加入不同培养基培养，分组如表2所示。应用不同培养基重悬细胞(其中培养基A中不含CP-64131和rhIL-4)，调整细胞浓度为1-1.5×10⁸/ml。于5％CO237℃孵育2-3h后，吸出培养液于另一支离心管备用(用于制备自体淋巴细胞悬液)；应用PBS溶液2-3ml轻轻清洗培养瓶，组1、2、3中加入含以终浓度计500IU/mlrhGM-CSF、200IU/mlrhIL-4的相应培养基，组4中加入本发明的培养基A(含CP-64131和rhIL-4)，继续于5％CO2、37℃连续培养5天，在培养第3天半量换液，同时补加两种细胞因子保持其终浓度不变，得到未成熟DC细胞(immatureDC，iDC)。

表2不同培养基诱导iDC细胞的实验分组

编号	培养基	说明
			1	完全培养基	加入含有10％小牛血清的RPMI 1640培养基
2	X-VIVO 15(LONZA)	进口无血清培养基
			3	国产培养基	国产无血清培养基
4	培养基A	本发明无血清培养基

实施例4HHP处理后的肿瘤细胞与黄芪多糖联合使用对iDC细胞的活化作用

1.将实施例3中所获得的iDC以10⁶/ml接种于6孔培养板中，每孔1ml，实验分组如表3所示。将HHP处理后的肿瘤细胞按照肿瘤细胞：iDC＝1∶5的比例与iDC等体积混合；在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下孵育12小时。

2.取出培养板，将配制好的APS溶液(天津赛诺制药有限公司，国药准字Z20040086)加入含有肿瘤细胞和iDC的培养孔中，终浓度为150μg/ml，其中阴性对照组加入等体积的PBS进行刺激活化，使iDC转化为成熟DC(matureDC，mDC)。

表3肿瘤细胞致敏树突状细胞的实验分组

编号	培养基	iDC活化方式
			1	完全培养基	PBS
2	完全培养基	T47-D肿瘤细胞+APS
			3	X-VIVO 15(LONZA)	T47-D肿瘤细胞+APS
4	国产培养基	T47-D肿瘤细胞+APS
			5	培养基A	T47-D肿瘤细胞+APS
6	完全培养基	H1299肿瘤细胞+APS
			7	X-VIVO 15(LONZA)	H1299肿瘤细胞+APS
8	国产培养基	H1299肿瘤细胞+APS
			9	培养基A	H1299肿瘤细胞+APS

3.培养12小时后，收获细胞，使用流式细胞仪检测不同组DC细胞表面分子表达量的水平，分析DC的成熟度。具体检测方法为：分别收集不同组的DC细胞，于1000rpm条件下离心10分钟，弃去上清，加入PBS重悬，计数，将细胞浓度调整为10⁶/ml。

4.用于检测的样品用4％多聚甲醛室温固定10分钟。每组取5×10⁵细胞用于流式检测，离心弃去上清，重悬于PBS中，加入不同的荧光标记抗体进行染色，避光室温孵育15min。孵育后样品用PBS洗样品一次，再用PBS重悬于500μl，用流式细胞仪检测上述分子在细胞表面或者细胞内的含量。检测的细胞表面分子分别为CD80(FITC标记的小鼠抗人CD80单抗(BeckmanCoulter，Cat.No.IM1853U))、CD83(PC5标记的小鼠抗人CD83单抗(BeckmanCoulter，Cat.No.IM3240U))、和CD86(PE标记的小鼠抗人CD86单抗(BeckmanCoulter，Cat.No.IM2729U))。以阴性对照组的CD80、CD83和CD86的平均荧光强度值为基础，将不同处理组的三种分子的平均荧光强度值，与之比较计算相对倍数，判断各处理组DC的活化水平。

实验结果如图1和2所示，图1、图2分别为T47-D和H1299两种肿瘤细胞在不同处理方法下刺激DC后，DC细胞表面标志物(CD80、CD83、CD86)的检测结果比较图。

检测结果表明，使用本发明的培养基培养的DC细胞，在使用肿瘤细胞联合APS刺激活化后，其细胞表面成熟分子的表达上调水平明显高于完全培养基和国产培养基，而与进口无血清培养基(X-VIVO15(LONZA))效果相当。说明采用本发明提供的抗原致敏的树突状细胞的制备方法可以有效地制备抗原致敏的树突状细胞。

实施例5本发明所述抗原致敏的树突状细胞特异性激活T淋巴细胞的检测

将实施例4中所述的肿瘤细胞系T-47D处理的mDC细胞用不同的培养基重悬，实验分组见表4。将mDC接种到U型底96孔板中，每孔2x10⁴个DC，接种体积100ul。按照T淋巴细胞：DC＝10∶1的比例，将自体T淋巴细胞与iDC细胞混合，培养孔内的终培养体积为200ul，将培养板放入37℃、5％CO₂、饱和湿度的环境中培养。

表4致敏的树突状细胞特异性激活T淋巴细胞的实验分组

编号	培养基	iDC活化方式
			1	完全培养基	PBS
2	完全培养基	T47-D肿瘤细胞+APS
			3	X-VIVO 15(LONZA)	T47-D肿瘤细胞+APS
4	国产培养基	T47-D肿瘤细胞+APS
			5	培养基A	T47-D肿瘤细胞+APS

第3天加入IL-2(R&Dsystem)，终浓度为20IU/ml。培养第7天，使用流式细胞仪分析产生INF-γ的CD8⁺T淋巴细胞的比例，检测DC的生物学效能。具体方法为，检测前先使用BrefeldinA处理细胞一小时，再使用固定液将细胞处理2小时，收集细胞使用PE标记的INF-γ抗体和CD8⁺抗体对T淋巴细胞进行标记，以检测可分泌INF-γ的特异性T淋巴细胞的水平(白细胞介素-2(IL-2，PeproTech，Cat.No.200-02)，PE标记的小鼠抗人INF-γ抗体(eBioscience，Cat.No.12-7319-42)，APC标记的小鼠抗人CD8抗体(Exbio，Cat.No.1A-207-T025))。

实验结果如图3所示，其为T47-D肿瘤细胞在不同培养基处理下刺激DC后，成熟DC细胞激活T淋巴细胞的检测结果比较图(INF-γ的CD8⁺T淋巴细胞的比例)。

结果显示，使用本发明抗原致敏的DC细胞制备方法制备的mDC在体外活化T淋巴细胞的能力强于采用完全培养基和国产培养基制备的mDC，且略高于进口无血清培养基(X-VIVO15(LONZA))处理组。

Claims (9)

1.一种用于抗原致敏的树突状细胞制备的培养基，其特征在于：其由基础培养基和其它成分组成。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述其它成分可以在使用前通过一定工艺方便地与基础培养基混合成为培养基，用于树突状细胞培养；所述基础培养基包括但不限于RPMI1640培养基、DMEM培养基等。

3.根据权利要求1至2中任意一项所述的培养基，其特征在于：所述其他成分包含药用级人白蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白、亲脂性铁鳌合剂、柠檬酸铁、脂质、微量元素、激素、剪切力保护剂、CP-64131和重组人白细胞介素4(rhIL-4)。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的培养基，其特征在于：所述其它成分包含以终浓度计50-200mg/L药用级人白蛋白、10-100mg/L重组人胰岛素、50-500mg/L重组人纤连蛋白、500-5000mg/L亲脂性铁鳌合剂、500-2000mg/L柠檬酸铁、10-100mg/L脂质、1.5-50mg/L微量元素、10-100mg/L激素、500-3000mg/L剪切力保护剂、0.01-100mg/LCP-64131、50-5000IU/ml重组人白细胞介素4(rhIL-4)。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的培养基，其特征在于：所述其它成分优选包含以终浓度计100-200mg/L药用级人白蛋白、30-80mg/L重组人胰岛素、100-200mg/L重组人纤连蛋白、100-2000mg/L亲脂性铁鳌合剂、100-1500mg/L柠檬酸铁、20-80mg/L脂质、2-30mg/L微量元素、20-50mg/L激素、1000-2000mg/L剪切力保护剂、0.1-10mg/LCP-64131、100-2000IU/mlrhIL-4。

6.根据权利要求1至4中任意一项所述的培养基，其特征在于：所述其它成分更优选包含以终浓度计100mg/L药用级人白蛋白、100mg/L重组人胰岛素、100mg/L重组人纤连蛋白、1500mg/L亲脂性铁鳌合剂、1000mg/L柠檬酸铁、40mg/L脂质、5mg/L微量元素、30mg/L激素、1500mg/L剪切力保护剂、0.5mg/LCP-64131、200IU/mlrhIL-4。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的培养基，其特征在于：所述亲脂性铁螯合剂包含但不限于甘氨酰甘氨酸(glycylglycine，GG)、亚氨基二乙酸(iminodiaceticacid，IDA)、二羟乙基甘氨酸(dihydroxyethylglycine，DHEG)、乙醇胺(ethanolamine)、N-二甲基乙酰替苯胺亚氨基二醋酸(N-(2-hydroxyethyl)imnimodiaceticacid，HIDA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)等；所述脂质包含但不限于花生四烯酸、胆固醇、油酸、亚油酸、硫辛酸、亚麻酸等；所述微量元素包含但不限于铁、铜、锌、硒、钴、镍、锰等；所述激素包含但不限于地塞米松、孕酮、胆固醇等；所述剪切力保护剂包含但不限于泊洛沙姆等。

8.一种利用权利要求1至7中任意一项所述的本发明的培养基制备抗原致敏的树突状细胞的方法。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：其采用密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞，经本发明的培养基培养和诱导，得到未成熟树突状细胞；利用高静水压制备具有强免疫原性肿瘤抗原，联合黄芪多糖作为免疫佐剂，对未成熟树突状细胞进行抗原致敏，获得抗原致敏的树突状细胞。