CN106893695A - 一种新型调节性树突状细胞及其联合dc-cik的新型免疫疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型调节性树突状细胞及其联合DC-CIK的新型免疫疗法。具体地，本发明涉及在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞，以获得irf4+irf8+的调节性树突状细胞，本发明还涉及所述irf4+irf8+的调节性树突状细胞联合临床DC-CIK治疗的免疫过继疗法。

Description

一种新型调节性树突状细胞及其联合DC-CIK的新型免疫疗法

技术领域

本发明涉及生成新型调节性树突状细胞及其在免疫治疗的用途的领域。具体地，本发明涉及一种利用间充质干细胞诱导造血干祖细胞分化成irf4+irf8+调节性树突状细胞regDC的方法，及其联合DC-CIK的新型免疫疗法。

背景技术

尽管现代医学发展迅速，恶性肿瘤仍然是无法攻克的一大难题。目前，治疗恶性肿瘤的方法主要为外科手术、化学治疗、放射治疗和生物学治疗。前三种治疗方法为治疗大部分早期局限性肿瘤以及放化疗敏感性肿瘤提供了选择。但针对复发难治性肿瘤，肿瘤残留，肿瘤耐药，生物学治疗具有其他治疗方法不可替代的优势。其中，肿瘤免疫学治疗具有特异性强、适用性广、副作用轻等优点，可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的。

过继免疫疗法是通过把在体外扩增的大量特异性效应细胞回输给患者后，产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。CIK(Cytokine Induced KillerCell)，细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种高效杀伤活性的异质性细胞群，外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一群以CD3+CD56+T为主的异质细胞，包括CD4+辅助T细胞，CD8+杀伤性T细胞及NK/T细胞。具有显著的抗病毒、抗肿瘤活性，具有高效、广谱杀伤、非MHC限制的特点。其机制为：释放颗粒酶和穿孔素直接杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞，Fas/Fasl通路诱导肿瘤细胞凋亡，及分泌细胞因子(IFN-,TNF-,IL-6等)抑制肿瘤生长和病毒复制，提高机体免疫功能。DC-CIK是将具有高表达MHC-I、II类分子及共刺激分子的树突状细胞(即传统型树突状细胞conventional dendritic cell)负载肿瘤抗原，提呈给CIK细胞，进一步增强CIK免疫治疗功能的方法。目前，DC-CIK免疫过继治疗技术较成熟，在国内外得到大量应用。

间充质干细胞(MSC)是存在于人体多种组织中的具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群。MSCs通过构成HSC耐以生存的“niche”(微环境)以及对造血功能的免疫调节两方面来调节骨髓造血功能。在动物实验及一些临床研究报道中已证实了其具有体外扩增造血干祖细胞的作用。而且，MSC具有调节多种免疫细胞功能的作用。

本发明拟开发一种造血干祖细胞来源的irf4+irf8+新的调节性树突状细胞，其具有增强T及NK细胞分泌IFN-γ及向肿瘤区迁移免疫功调节作用。并且，在肿瘤免疫过继治疗中，采用这种新的调节性树突状细胞联合DC-CIK方案，增强CIK对肿瘤的杀伤作用，达到清除机体内残留肿瘤细胞，消除复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于，提供一种利用间充质干细胞诱导造血干祖细胞分化成富含irf4+irf8+调节性树突状细胞(irf4+irf8+regDC)的方法，以获得irf4+irf8+调节性树突状细胞。该新型调节性树突状细胞具有独特的免疫调节能力：经过CpG ODN刺激，irf4+irf8+regDC促进T细胞增殖及促进CD4+T细胞及CD8+T细胞分泌IFN-γ的免疫调节功能；成熟irf4+irf8+regDC能刺激NK细胞扩增及增加其细胞毒性；促进cDC(conventional dendritic cell)，NK细胞和CD8+T细胞向肿瘤组织区域趋化。利用irf4+irf8+regDC上述三个调节免疫功能的作用，将其与DC-CIK细胞免疫治疗联合，提高DC-CIK抗肿瘤免疫的能力。

一方面，本发明提供了一种生成成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞的方法，所述方法包括步骤：

a)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；

b)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤a)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；

c)共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到不成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞；

d)从步骤c)获得不成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞在诱导剂存在下，在适合细胞生长和增殖的条件下培养；

e)从步骤的d)的悬浮培养液中回收成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞。

进一步地，根据本发明的方法，其中所述造血干细胞中CD34+造血干细胞含量为80％以上。

进一步地，根据本发明所述的方法，其中所述哺乳动物间充质干细胞分离自胎盘、骨髓、脂肪组织。

进一步地，根据本发明所述的方法，其中步骤b)中的哺乳动物间充质干细胞是体外培养至第1至10代的间充质干细胞。

进一步地，根据本发明的方法，其中步骤d)中的诱导剂是CpGODN。或其他诱导本树突状细胞成熟的诱导剂。

另一方面，本发明提供了根据本发明的方法获得的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞在制备调节免疫的药物中的用途。

另一方面，本发明提供了根据本发明的方法所获得的细胞悬液，其中所述细胞悬液含有1-99％的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞。

再一方面，本发明提供了根据本发明的细胞悬液在制备调节免疫的药物中的用途。

另一方面，本发明提供了根据本发明的方法获得的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞在制备抗肿瘤的药物中的用途。

再一方面，本发明提供了根据本发明的细胞悬液在制备抗肿瘤的药物中的用途。

附图说明

图1：体外培养人间充质干细胞的形态。

图2A至2H：人间充质干细胞的免疫表型。

图3：分选后获得的外周血CD34+造血干祖细胞形态。

图4：分选后获得的外周血CD34+造血干祖细胞流式检测表型。

图5：人间充质干细胞与外周血造血干祖细胞共培养细胞形态，第1天。

图6：人间充质干细胞与外周血造血干祖细胞共培养细胞形态，第7天。

图7：流式检测间充质干细胞与造血干祖细胞共培养后获得细胞为较单一群体。

图8：共培养获得细胞为树突状细胞样形态。

图9：流式检测共培养获得的树突状细胞表型，提示为调节性树突状细胞。

图10：western blot检测共培养获得树突状细胞为irf4、irf8低表达。经过含CpG ODN 10μg/ml孵育6h诱导成熟体外刺激后，irf4、irf8表达明显增强，为成熟调节性树突状细胞。

图11-12.irf4+irf8+regDC促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞增殖。

图13.irf4+irf8+regDC促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ。

图14.irf4+irf8+regDC对NK细胞的促增殖作用。

图15.irf4+irf8+regDC促进NK细胞分泌IFN-γ。

图16.irf4+irf8+regDC与NK细胞及CD8+T细胞具有协同抗肿瘤作用。

图17.irf4+irf8+regDC促进cDC，NK细胞及CD8+T细胞向肿瘤组织迁移。

具体实施方式

为实现本发明的目的，本发明涉及以下几个方面：

第一方面，本发明方法的涉及一种获得新型树突状细胞的方法：

1.间充质干细胞的获取：

适用于选自不同来源健康无关供者或亲属(胎盘，骨髓，脂肪等)的，符合国际公认的定义间充质干细胞，常规标准培养方法，体外培养至第2-5代后进行后续处理。

2.造血干祖细胞的获取：

(采用已经明确的成熟标准方法获得)在人体：经过G-CSF标准方法动员的外周血单个核细胞混合物，或收集健康供者骨髓，CD34+造血干祖细胞含量为80％以上；

3.间充质干细胞与造血干祖细胞共培养：

1)共培养的时机，在共培养前12h先以2×10^4/ml的细胞浓度，将常规方法获得的第3代间充质干细胞接种于加入24孔板培养，以使其贴壁。12h后加入分离纯化的CD34+造血干祖细胞进行共培养。

2)两种细胞数目比：间充质干细胞与造血干祖细胞之比为1:5～1:10。

3)共培养条件：含100U/ml链霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培养基，5％CO2，37℃恒温培养。

4)耗材：可根据实验需要在24孔板、6孔板或其他具备相同功能材料。

5)培养天数：1～7天。

6)收获细胞方法：吸取共陪养体系悬液，PBS洗涤后，收集悬浮细胞待鉴定。

7)鉴定方法：用流式细胞仪法和westernblot检测诱导生成的调节性树突状细胞表型及irf4+和irf8+蛋白表达。

第二方面，本发明的涉及一种新型irf4+irf8+树突状细胞：

来源于共培养后获得的移植物成分：含有1％～99％调节性树突状细胞造血干祖细胞混合物。

第三方面，本发明涉及这种新型irf4+irf8+树突状细胞具有调节多种免疫细胞的能力。

1.经过CpG ODN刺激成熟后，irf4+irf8+regDC促进T细胞及NK细胞增殖；

2.成熟irf4+irf8+regDC能促进T细胞及NK细胞分泌IFN-γ；

3.成熟irf4+irf8+regDC能促进多种免疫细胞向肿瘤组织趋化；

4.成熟irf4+irf8+regDC能抑制肿瘤生长。

第四方面，本发明涉及应用这种新型irf4+irf8+调节性树突状细胞联合DC-CIK进行肿瘤免疫治疗。

1.irf4+irf8+regDC的应用时间

在开始DC-CIK治疗每个疗程的前一天进行回输上述诱导获得的irf4+irf8+regDC，第二天开始，进行DC-CIK细胞的诱导、培养、扩增和回输(根据临床常规方案)。

2.irf4+irf8+regDC的应用剂量

经静脉给予输注10⁶/kg含1％-99％的irf4+irf8+regDC的造血干祖细胞混合物。

3.irf4+irf8+regDC的回输方式：

与DC-CIK回输方式相同。静脉输注。

4.DC-CIK回输的安排：(根据临床情况可灵活安排)

1)效应T淋巴细胞回输：2～3个疗程，8次/疗程，1×10^9/次。细胞扩增至第4-5天后，冻存细胞，回输前复苏。

2)DC-CIK回输：1×10^9/次，2～4次/疗程。每次取出部分细胞回输，余下细胞添加培养基继续培养。

本发明的共培养诱导方法适用于各种组织来源的2～5代次间充质干细胞。该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率较高。

本发明还利用共培养收获的irf4+irf8+调节性树突状细胞对机体多种免疫细胞具有重要的免疫调节功能。通过间充质干细胞与造血干祖细胞移植物共培养的方法，诱导后者生成富含irf4+irf8+调节性树突状细胞移植物，并联合临床DC-CIK细胞治疗针对肿瘤免疫过继治疗的过程，可简述为：

将脂肪组织或骨髓以标准方法收获的间充质干细胞，标准方法培养获得的第3代间充质干细胞以一定密度接种于培养瓶，待其长满后，以1：5～1：10比例加入来源于骨髓或外周血造血干祖细胞共培养1～7天后，分离共培养体系产生的悬浮细胞，鉴定占收获共培养细胞的1％～99％的irf4+irf8+调节性树突状细胞的产生，并对该细胞的特殊免疫功能进行验证。即:1.经过CpG ODN刺激成熟后，irf4+irf8+regDC促进T细胞及NK细胞增殖；2.成熟irf4+irf8+regDC能促进T细胞及NK细胞分泌IFN-γ；3.成熟irf4+irf8+regDC能促进多种免疫细胞向肿瘤组织趋化；4.成熟irf4+irf8+regDC能抑制肿瘤生长。最后，将这种新型irf4+irf8+的regDC与临床DC-CIK方案联合进行抗肿瘤免疫治疗。

本领域技术人员熟知，本发明所列出的上述培养和诱导的方法步骤仅是例证的目的，可能并非实现本发明所述方法的最佳方案，本领域技术人员可以对上述方法步骤做出适当的改变而仍能实现本发明的目的，这样的改动也落入本发明要求保护的范围。当然，本发明所述方法所使用的间充质干细胞并不限于第3代间充质干细胞，其来源可选择骨髓、脂肪组织、脐带以及其他国际认可的间充质干细胞来源组织。应用本发明的irf4+irf8+调节性树突状细胞进行联合DC-CIK治疗的方法、剂量及应用时间并不局限本发明的方案。

本发明方法得到的间充质干细胞诱导供者造血干祖细胞分化成富含irf4+irf8+调节性树突状细胞，利用后者的免疫调节特性，联合DC-CIK方案对肿瘤患者体内残留恶性细胞进行杀伤，以达到进一步提高肿瘤免疫疗效的目的。为临床上清楚手术及放化疗后病人体内残留恶性细胞，减少复发率，提高治愈率提供了新的免疫过继疗法。

实施例

实施例1主要实验试剂及耗材

(1)主要实验试剂

青霉素、链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自GIBCO公司。

人淋巴细胞分离液(Ficoll，天津灏洋生物制品公司)

抗体：小鼠抗人CD11c，CD80,CD40,CD86,CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106，CD117、Flk-1、HLA-ABC、CD3单抗、CD28单抗和HLA-DR抗体，抗小鼠NK1.1mAb，抗小鼠CD8+T细胞mAb，兔抗小鼠CD16/CD56,CD8,CD3,CD19流式抗体(BectonDickinson公司，biolegend公司)；

CpG ODN(invitrogen公司)；

磁珠分选试剂盒：CD34，CD4，CD8，NK细胞(MiltenyiBiotec公司)；

ELISA试剂盒：IFN-γ(BD Pharmingen公司)；

CFSE染色液试剂盒(碧云天公司)

细胞培养液成分：MCDB(Sigma公司)，DMEM/F-12(GibcoBRL公司)，RPMI-1640(GibcoBRL公司)，X-VIVO-15，gt-t551无血清培养基(BioWhittaker公司)；D-Hanks平衡盐溶液，Ficoll(1.077g/cm3)(Pharmacia公司)；胎牛血清(Gibco公司)；

胰蛋白酶(GibcoBRL公司)，EDTA(天津市化学试剂一厂)；谷氨酰胺(GibcoBRL公司)，地塞米松，β-甘油磷酸钠，抗坏血酸，牛血清白蛋白(Sigma公司)；

(2)主要实验相关耗材

15ml，50ml离心管，T-25cm2、T-75cm2细胞培养瓶(costar公司)、24孔板，96孔凹底培养板(Corning公司)

(3)实验动物和细胞

B16黑色素瘤细胞系购自中国医学科学院细胞中心；SPF级C57BL/6小鼠购自军事医学科学院，饲养在中国医学科学院基础医学研究所动物中心。

实施例2、irf4+irf8+调节性树突状细胞(irf4+irf8+regDC)的体外诱导方法

步骤1.人骨髓来源的第三代间充质干细胞的分离、培养和鉴定(图1-2)

(1)分离

1.无菌采集健康志愿者的骨髓5-10ml于无菌的肝素管中。

2.取一无菌的离心管，用D-Hanks液适当稀释骨髓。

3.取一新的离心管，分别加入恢复至室温的Ficoll和上述稀释后的骨髓，加入时仔细操作勿破坏界面,二者的比例为1:1。

4.将上述离心管配平后放入常温台式离心机中,20℃以1800转/分钟的速度离心20分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hanks液洗涤两次并计数。

(2)培养

1.将上述单个核细胞以1×10^6/cm2的密度接种于25cm2的培养瓶中，细胞培养体系均为含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF，1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin，LA-BSA)，50μMβ巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素的培养液，37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱培养。

2. 24小时后，去除悬浮细胞，补充培养基，细胞每隔三天换液一次，待细胞长至70-80％汇合时，用0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化传代。3-4代的间充质干细胞冻存于液氮罐备用。

当然，本发明也可以使用本领域公知的其他间充质干细胞的分离培养方法来获得第3代间充质干细胞或者直接使用市售可得的第3代间充质干细胞而无需自行分离培养获得。

(3)鉴定

1.前两步得到的第3代间充质干细胞的细胞形态见图1。

2.用间接免疫荧光法检测第3代间充质干细胞的表型，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106，CD117、Flk-1、HLA-ABC和HLA-DR抗体(抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为ACCURI C6(Becton Dickinson)。

结果见图2，横坐标表示细胞荧光强度，纵坐标表示细胞数；P1表示所选细胞群体。表型结果显示，第3代间充质干细胞的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Flk-1和HLA-ABC均为阳性，CD34、和HLA-DR分子均为阴性。

步骤2.人外周血来源造血干祖细胞的提取和鉴定(图3-4)

提取

1.采用rhG-CSF 5μg/kg/d，连续5天，皮下注射动员造血干祖细胞到外周血。

2.取用肝素抗凝管采血10ml，以含0.6％ACD-A的PBS 1:1体积稀释一倍。

3.将Ficoll与外周血以1:2体积分层置于离心管，小心将血缓慢的加于Ficoll上，切勿使界面混淆，置于4℃水平离心机中离心(1800rpm，20min)。关闭离心机刹车，待自动缓慢停机后，取出离心管，可见管内界面清楚，分为4层，自上而下依次为：血浆，单个核细胞层，Ficoll液，粒细胞和红细胞层。

4.用毛细吸管轻轻插到单个核细胞层(白膜层)上，小心将白膜层细胞吸入管内，移入另一试管中，尽量勿吸下层的Ficoll液。加入含0.6％ACD-A的PBS离心洗涤3次(1000rpm,10min)。

5.弃上清，加入含0.6％ACD-A的PBS 300μl，准备行免疫磁珠分离纯化CD34+细胞。

6.检查细胞活力，将1滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝液，5min后检查200个细胞中有多少核染深蓝色的细胞(死细胞)，求出百分比。活细胞比例要求在95％以上。

X＝配制培养体系总体积(ml)×4/4个大格的有核细胞总数(ml)

结果：其纯度大于96％，台盼兰染色观察单个核细胞活性，存活细胞率大于95％。

7.将1×10^8个单个核细胞层悬于300μl 0.5％BSA和0.6％ACD-A的PBS缓冲溶液中，加入Fc受体阻断剂100μl，以阻断Fc受体介导的非特异结合。

加入100μl抗CD34免疫磁珠，混匀后在4℃孵育30min。离心洗涤2次(1000rpm,10min)，加500μl缓冲溶液悬浮。

8.将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱，洗脱去除CD34-细胞。

9.将分离柱移出磁场，加1ml MACS缓冲液加压洗脱分离柱,收集组分为CD34+细胞并计数。

(2)鉴定

光镜下观察收获的CD34+造血干祖细胞，呈小圆形。

用流式细胞仪分析磁珠分选后CD34+细胞纯度，纯度约98.9％。

步骤3.骨髓间充质干细胞和造血干祖细胞共培养方法(图5-6)

1.将骨髓间充质干细胞以2×10^4/ml的细胞浓度加入24孔板培养，使其贴壁。

2.吸去间充质干细胞原有培养基，加入免疫磁珠分选收获的CD34+造血干祖细胞(两者比例为5:1)及RPMI-1640完全培养基继续培养。

3.培养条件：含100U/ml链霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培养基，5％CO2，37℃恒温培养。

4.培养过程中，为防止间充质干细胞分化及凋亡，每3-4天用新的间充质干细胞置换。具体方法：

(1)先吸出悬浮细胞，置于离心管内。

(2)用0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化贴在间充质干细胞上的细胞。

(3)用Ficoll去除死细胞和间充质干细胞。

(4)将获得的细胞和(1)中悬浮细胞混合，洗涤后计数，并加入贴有新间充质干细胞的24孔板继续培养。

5.在培养结束时，细胞立即经PBS洗涤后用流式细胞仪检测细胞表型。

实施例3、irf4+irf8+调节性树突状细胞(irf4+irf8+regDC)的形态及鉴定

(1)形态(图7)

由间充质干细胞诱导造血干祖细胞生成的调节性树突状细胞(regDC)在光镜下观察，可见细胞膜有突触生成。

(2)表面标志因子鉴定(图8)

检测有关细胞表面标志因子及共刺激分子的表达，提示诱导生成的新型调节性树突状细胞(regDC)低表达CD11c，弱表达CD80,CD86,CD40。

(3)诱导生成调节性树突状细胞数量(图9)

经过间充质干细胞与造血干祖细胞共培养7天后，收获悬浮细胞。流式检测提示获得较单一群细胞，约占全部悬浮细胞的56.9％。

(4)调节性树突状细胞的诱导成熟方法

共培养获得的regDC以每孔5-10×10^4个细胞浓度接种于96孔板中，用含CpG ODN 10μg/ml孵育6h的X-VIVO-15无血清培养基继续培养3天。收获悬浮细胞后即成熟regDC。

(5)Westernblot检测共培养后不成熟及诱导成熟后regDC的特征性蛋白irf4，irf8的表达(图10)

irf4，irf8为炎症调控相关蛋白，同时也是树突状细胞的发育调控分子。在共培养1～7天后，两个蛋白为低表达，即irf4+irf8+低表达的regDC。而当使用CpG ODN诱导regDC成熟后，irf4，irf8两个蛋白表达明显增强，即irf4+irf8+强表达的regDC。而作为对照的GAPDH蛋白不变。具体方法参照westernblot常规实验步骤。

实施例4、irf4+irf8+调节性树突状细胞(irf4+irf8+regDC)的免疫调节功能

(1)促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞增殖(见图11-12)

本实验检测共培养诱导获得的低表达irf4+irf8+的不成熟regDC和诱导成熟后高表达irf4+irf8+的regDC对CD4+T淋巴细胞的促增殖反应。见图11,12。提示受激活成熟的irf4+irf8+regDC具有促进T细胞增殖作用。具体步骤如下：

1.收集共培养后irf4+irf8+regDC并使用CpG ODN 10μg/ml孵育6h诱导成熟，加入到96孔培养板中，每孔1×10^5个细胞。

2.取用肝素抗凝的健康志愿者外周血5ml，用含2mM EDTA和0.5％BSA的PBS缓冲溶液1:1体积稀释。用Ficoll液分离白膜层单个核细胞。

3.依照Miltenyi MACS说明方法使用抗CD4及CD8免疫磁珠分选出CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞。用流式细胞仪分析两种细胞纯度。

4.分选后经PBS洗涤，加等量CFSE稀释液(5μM)入淋巴细胞悬液中，充分混匀，37℃下轻荡10分钟后，加入等量冰冷RPMI1640(10％胎牛血清)中止反应，1分钟后PBS洗涤两次，悬浮于完全培养基备用；

5. 2×10^5人外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞各100μl，加入含有共培养诱导获得的未成熟和诱导成熟后irf4+irf8+regDC的96孔U型底培养板中。37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养7天。

6.收集培养的淋巴细胞，PBS洗涤后上流式细胞仪检测CFSE阳性细胞数。

(2)促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ(图13)

将上述实验获得的CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞用ELISA法检测其分泌IFN-γ的能力。相比不成熟rf4+irf8+regDC，CpG ODN激活的rf4+irf8+regDC具有促进两种淋巴细胞分泌更多IFN-γ的能力。(共培养3天)

(3)刺激后对NK细胞的促增殖作用及促进NK细胞分泌IFN-γ(图14-15)

本实验检测共培养诱导获得的不成熟regDC和诱导成熟后的regDC促增殖作用及促进NK细胞分泌IFN-γ。见图13,14。具体步骤如下：

1.首先从健康志愿者外周血单个核细胞中采用Miltenyi MACS磁珠分选出NK细胞，方法同前。

2.将分选得到的NK细胞分别与irf4+irf8+regDC以1:1比例于RPMI-1640中共培养7天。

4.收集细胞上清，用ELISA测细胞因子IFN-γ的浓度。

5.应用CFSE染色(具体方法同上)法检测NK细胞增殖能力。

(4)irf4+irf8+regDC与NK细胞及CD8+T细胞具有协同抗肿瘤作用(图16)

1.构建B16皮下移植瘤小鼠模型：每组6只C57BL/6小鼠。腋下皮下注射5×10^5B16肿瘤细胞连续6天；

2.第7天瘤内注射未活化或CpG处理6h后的regDC 2×10^6，检测肿瘤大小变化；

3.PBS对照组为空白对照；

4.另外两组对照组处理：

1)去除体内CD8+T细胞：-2～0天，使用抗小鼠CD8+T细胞mAb静脉注射200μg/只/天，此外实验期间每6天重复剂量腹腔注射一次。协同CpG活化的regDC处理；

2)去除体内NK细胞：-2，-1，0，2天，使用抗小鼠NK1.1mAb100μg/只/天协同CpG活化的regDC处理；

5.处死动物，取出肿瘤组织，计算肿瘤最宽处横断面面积以评估大小；

6.可见CpG活化的regDC具有抗肿瘤生长的功能，并且与NK细胞及CD8+T细胞具有协同抗肿瘤的作用。

(5)促进cDC，NK细胞及CD8+T细胞向肿瘤组织迁移(图17)

1.上述条件干预第14天，处死B16荷瘤小鼠，胶原酶消化肿瘤组织，提取单个核细胞，流式分析肿瘤组织中cDC(传统型树突状细胞，表达CD11+,CD3-,CD19-)、NK细胞(CD3-,CD16+/CD56+)及CD8+T细胞的数目(每立方厘米体积肿瘤组织)；

2.提示相比PBS及未活化regDC组，CpG活化的regDC处理组诱导cDC、NK细胞及CD8+T细胞向肿瘤组织区迁移。

实施例5、irf4+irf8+调节性树突状细胞联合DC-CIK进行肿瘤免疫治疗。

步骤1.irf4+irf8+regDC的应用剂量及时间

在开始DC-CIK治疗的第一天，经静脉给予输注10⁶/kg含1％-99％的经CpG ODN-2216(10ug/ml)激活的irf4+irf8+regDC的造血干祖细胞混合物；第二天开始，进行DC-CIK细胞的诱导、培养、扩增和回输(根据临床常规方案)。

步骤2.进行DC-CIK治疗的准备

采集患者外周血70ml(也可通过血液分离机采集)，常规分离白膜层单个核细胞。生理盐水重悬细胞后分成三份，各50ml。分别做DC-CIK(第一疗程培养)，DC-CIK(第二疗程培养，先冻存)，效应T淋巴细胞诱导培养(两疗程)。离心2300rpm，10min，弃上清后，用2ml的gt-t551培养基重悬DC-CIK，效应T淋巴细胞加入40ml的X-15培养基。

步骤3.效应性T淋巴细胞的诱导、培养和扩增

1)CD3包被瓶的准备：取192ul的CD3单抗(1mg/ml)加入到96ml的PBS(PH为8.6-9.2)，混匀后加入到8个T75培养瓶中，每瓶12ml，摇匀后平置于4°冰箱，24h后方可使用(一个疗程需要4个包被瓶)。使用前，每瓶15ml盐水静置两分钟，洗两遍；

2)向包被瓶中各加入20ml X-15培养基+2.5ml的细胞悬液，放入培养箱培养；剩余的20ml细胞悬液置于超净台内(大离盖子不要盖紧)，6h后使用；

3)3h后加入anti-CD28(以下均为终浓度)2μg/ml，IL-2100U/ml，IL-1210ng/ml，IL-410μg/ml；

4)6h后将超净台内剩余的20ml细胞悬液平均加入到8个培养瓶内，放入培养箱后继续培养；

5)22h后收集培养基和瓶底细胞，盐水洗涤两次，2300rpm，10min离心后将8个培养瓶内细胞合并在1个离心管中；

6)将细胞悬液离心去上清，加入20ml X-15重悬细胞，并加入CD3单抗1μg/ml，anti-CD281μg/ml，IL-2(10μg/L)，IL-7(10μg/L)，到8个T175瓶中(每个培养瓶各含80-100ml X-15+8ml血浆)，置于培养箱中培养；

7)观察细胞的生长情况，第4-5天冻存细胞。

步骤4.DC-CIK的准备

1)准备3个T75瓶，分别标记DC、CIK、CIK，向DC瓶中加入19ml 1640，另两个CIK瓶内各加入19ml T551培养基+1ml血浆；

2)将分离好的第一疗程的DC-CIK(2ml细胞悬液)以700ul，600ul，600ul的分别加入到DC瓶和两个CIK瓶内；

3)向两个CIK瓶内分别加入20ul的rhIFN-γ1000u/ml后放入培养箱培养；

步骤5.DC的诱导、培养和扩增(这里的DC指的是传统型树突状细胞cDC)

1)细胞悬液DC瓶放入培养箱1.5h后换液，加入14ml gt-t551(含300U/L IL-2)培养基+1ml血浆+15ul 1000U/ml IL-4+10.65ul 1000U/LGM-CSF(加入的时候不要吹打细胞面，DC是贴壁细胞)；

2)第3天，补加1ml血浆+15ul 1000U/ml IL-4+15ul 1000U/LGM-CSF；

3)第5天，未成熟DC收获(竖直培养)：

用培养瓶内的培养基吹打细胞面，盐水洗瓶2次，离心1500rpm，6min去上清，吸取10ml培养基，8ml加入到1个T75瓶中，2ml加入到离心管中，重悬细胞；

4)向离心管中分别加入10ul 1000U/ml IL-4+10ul 1000U/LGM-CSF+10ul 10ng/ml TNF-α+500ul血浆，转移至T75瓶中于培养箱中竖直培养；

5)第7天，收获成熟DC：

培养基吹打瓶底，用10ml盐水洗瓶底2次，将培养基转移至50ml离心管中，转移至离心管中，离心，1500rpm，8min，去上清，加入2ml gt-t551(含300U/L IL-2)，混匀，用5ml注射器转移至DC-CIK培养袋中。

步骤6.CIK细胞的诱导、培养和扩增

1)上接4.-3)，24h后补加因子：20ul 300U/L IL-2，60ul 100U/LIL-1α，20ul anti-CD3抗体50ng/L；

2)第4天，补加19ml gt-t551(含300U/L IL-2)和1ml血浆，置于培养箱中继续培养；

3)第6天，转袋(最终体系为240ml)：将2瓶CIK瓶中的培养基转移至培养袋中，按顺序加入下述液体：15ml GT-T551(含300U/LIL-2)(洗瓶后)，8ml血浆(5％)，152ml T551(含300U/L IL-2)，培养袋中最终的体系为240ml。盖帽，加紧管子，置于培养箱中培养；

4)第8天，填液480ml(5％血浆+gt-t551培养基(含il-2))，最终体系为720ml；

5)第10天，填液720ml(5％血浆+gt-t551培养基(含il-2))，最终体系为1440ml(抽取袋中的5ml留样，同时在这一天进行效应T淋巴细胞的第一次回输)

步骤7.DC-CIK的回输

1)DC-CIK回输：1×10^9/次，4次/疗程。每次取出部分回输，余下添加培养基继续培养。

2)将培养袋摇匀后，倒出500ml的培养液于10个50ml离心管中，并留取200ul用于计数，离心，2000rpm，8min；

3)离心结束后，去上清，用10ml盐水重悬细胞，10管并1管，再用10ml盐水洗管2次，补充盐水至50ml；

4)离心，2000rpm，8min，去上清，用移液枪吸取3ml盐水吹匀细胞，再吸取2ml盐水洗枪头，补充盐水至50ml；

5)离心，1800rpm，8min，上清留样(内毒素检测)，用移液枪从离心管中取3ml盐水吹匀细胞，再取1ml盐水洗枪头(2次)，加入1ml血浆，200ul 300U/L IL-2(盐水混匀)，混匀，用20ml注射器将细胞悬液转移至100ml转移袋中；

6)取10ml盐水洗管，再转移到100ml转移袋内，补充80ml盐水至100ml转移袋中，热合管子，送样；

7)向培养袋中补加适量的GT-T551(含300U/L IL-2)(第一次280ml；第2次补加180ml，第3次补加100ml)混匀，取5ml培养液菌检，盖帽，放于培养箱中培养。

步骤8.效应T淋巴细胞回输

1)效应T淋巴细胞回输：共三个疗程，8次/疗程，1×10^9/次。细胞扩增至第4-5天后，冻存细胞，回输前复苏。

2)将化冻的效应T淋巴细胞转移到大离中，混匀，离心，1200rpm，6min；

3)去上清，加入20ml盐水混匀，离心，1200rpm，6min；

4)上清留样(内毒素检测)，取2ml盐水重悬细胞，再取7ml盐水洗移液管，加入1ml7号液；用注射器将细胞悬液转入100ml转移袋中；留取20ul细胞悬液用于计数和活力；

5)向大离中加入10ml盐水洗管，用注射器转移至100ml转移袋中，再向转移袋中补充盐水40ml，热合管子，准备回输。

Claims (10)

1.一种生成成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞的方法，所述方法包括步骤：

a)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；

b)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤a)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；

c)共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到不成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞；

d)从步骤c)获得不成熟的irf4+irf8+调节性树突状细胞在诱导剂存在下，在适合细胞生长和增殖的条件下培养；

e)从步骤的d)的悬浮培养液中回收成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述造血干细胞中CD34+造血干细胞含量为80％以上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳动物间充质干细胞分离自胎盘、骨髓、脂肪组织。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的哺乳动物间充质干细胞是体外培养至第1至10代的间充质干细胞。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中步骤d)中的诱导剂是CpG ODN。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法获得的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞在制备调节免疫的药物中的用途。

7.根据权利要求1至5任一项所述的方法所获得的细胞悬液，其中所述细胞悬液含有1-99％的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞。

8.根据权利要求7所述的细胞悬液在制备调节免疫的药物中的用途。

9.根据权利要求1至5任一项所述的方法获得的成熟irf4+irf8+调节性树突状细胞在制备抗肿瘤的药物中的用途。

10.根据权利要求7所述的细胞悬液在制备抗肿瘤的药物中的用途。