CN105018426A - 长链非编码rna、其序列及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长链非编码RNA、其序列及用途。具体而言，本发明涉及SEQ？ID？NO:1或SEQ？ID？NO:2所示的序列(即lnc-DC)或其杂交或同源序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能中的应用或在制备调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用，以及相应的试剂盒和方法。本发明可应用于调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能，和/或进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及一种长链非编码RNA——lnc-DC，其在促进专职抗原提呈细胞——树突状细胞的成熟和功能中的应用。
背景技术
哺乳动物基因组可转录多种长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，而其中仅鉴定出少数lncRNA的功能。虽然已报道某些lncRNA在某些过程和疾病中起到重要作用，但关于lncRNA与免疫系统之间的研究并不多，更没有任何涉及lncRNA与树突状细胞之间关系的研究报道。
树突状细胞(dendritic cells，DC)是免疫系统中重要的抗原递呈细胞，其功能特点是能激发初始型T细胞(naive T cells)免疫反应，是目前所发现的最重要的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)，它在机体抗肿瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的预防与治疗中发挥着重要作用。树突状细胞的成熟和功能状态决定着免疫应答的走向和强度，在免疫反应中发挥着重要的调控作用。许多临床疾病都是由于树突状细胞的发育和功能异常导致的。
在肿瘤的临床治疗中，可以用肿瘤抗原致敏的树突状细胞体内回输从而诱导出抗原特异性免疫应答反应，这种治疗策略称为DC疫苗治疗。近年来DC疫苗在抗肿瘤免疫和抗感染免疫中得到应用。
众多的细胞膜表面分子、信号分子、转录因子等在DC的分化成熟中发挥着重要作用，如GM-CSF、Flt3/Flt3L以及PU.1、STAT3等，也确定了很多DC功能相关的蛋白分子，如CD80/86、CD40、MHC等。但是，尚不清楚对DC免疫功能调控的作用机制。
因此，从DC中寻找新型调控分子有助于实现对DC的功能调控及对机体免疫应答的调控，也可用于确定在免疫相关疾病防治中具有一定应用价值的基因。为方便临床和科研应用，本领域中迫切需要研究和开发出可调节树突状细胞(尤其是常规 树突状细胞)成熟和功能的特异性分子。
发明内容
本发明的主要目的之一在于提供一种调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的物质——lnc-DC及其杂交或同源序列、其表达产物、或它们的抑制剂或促效剂。本发明的另一目的在于提供以上物质在调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能中的应用以及相应的药物和试剂盒。
在本发明的第一方面中，提供了选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能中的应用：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。
在本发明的第二方面中，提供了选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在制备调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。
在本发明的一些实施方式中，所述序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列或SEQ ID NO:16所示的同源序列。
在一些实例中，所述常规树突状细胞来源于哺乳动物，优选人、大鼠、小鼠、犬、猴、猩猩、猪、马、牛或羊，更优选人。
在本发明的一些实施方式中，所述成熟状态选自：细胞表面共刺激分子的表达CD80/86、CD40，抗原递呈分子HLA的表达，免疫活化细胞因子IL-12的产生；所述功能选自：激活初始T细胞应答、启动免疫应答、调控免疫应答、维持免疫应答、摄取抗原、加工处理抗原和递呈抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物、或其促效剂促进常规树突状细胞的成熟和/或促进其功能，优选与未接触所述序列或其表达产物、或其 促效剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，增加成熟树突状细胞表面表达的功能分子(如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD40)、提高IL-12分泌、使树突状细胞活化CD4+T细胞的能力提高(如T细胞分泌的IFN-γ和IL-2增加)、和/或使树突状细胞促进T细胞增殖的能力提高。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物的抑制剂阻碍常规树突状细胞的成熟和/或阻碍其功能，优选与未接触所述抑制剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，减少成熟树突状细胞表面表达的功能分子(如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD40)、降低IL-12分泌、使树突状细胞活化CD4+T细胞的能力降低(如T细胞分泌的IFN-γ和IL-2减少)、和/或使树突状细胞促进T细胞增殖的能力降低。
在本发明的一些实施方式中，所述促效剂选自：包含所述序列的表达载体、所述序列的外源性表达产物、促使所述序列高表达的试剂；所述序列或其表达产物的抑制剂选自：针对所述序列的RNAi、反义寡核苷酸、用于阻遏或降低所述序列表达的特异性抑制剂或阻碍其功能的分子化合物等试剂。
在一些实例中，所述RNAi的序列如SEQ ID NO:11或12所示。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估。
在一些实例中，所述免疫相关疾病选自：肿瘤、自身免疫病。
在本发明的第三方面中，提供了一种药物或试剂盒，其包含：
i)有效量的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；
ii)药学或免疫学上可结合的载体或辅料。
在一些实例中，所述药物或试剂盒还包含：未成熟或成熟、经或未经致敏的常规树突状细胞和/或其前体细胞，例如用肿瘤抗原致敏的常规树突状细胞；树突状细胞致敏剂。
在本发明的第四方面中，提供了一种调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的方法、或诱导产生所需成熟状态和/或功能的常规树突状细胞或的方法，所述 方法包括使选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂接触常规树突状细胞和/或其前体细胞的步骤：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括：
在所述接触步骤之前、之时或之后，使所述常规树突状细胞和/或其前体细胞与树突状细胞致敏剂接触，优选所述致敏剂为肿瘤抗原。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：lnc-DC在各类免疫细胞中的表达量的qRT-PCR检测。图中，一个点代表一个样品重复。
图2：lnc-DC在单核细胞到树突状细胞分化成熟过程中表达量的qRT-PCR检测。图中所示结果为平均值±标准差(n=3)。
图3：qRT-PCR检测人单核细胞分化来的树突状细胞中lnc-DC的RNA水平，从而证实lnc-DC干扰RNA的干扰效率；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
图4：流式检测树突状细胞表面分子的表达，证明在lnc-DC干扰后树突状细胞功能相关的分子的表达受到明显抑制；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
图5：ELISA检测lnc-DC干扰后对树突状细胞分泌细胞因子IL-12的影响；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
图6：qRT-PCR检测IL-12A mRNA的表达，确定lnc-DC干扰后对LPS诱导IL-12产生的作用；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
图7：混合淋巴细胞实验检测树突状细胞在lnc-DC干扰后刺激活化同种异体CD4+T细胞增殖的能力；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
图8：混合淋巴细胞实验检测树突状细胞在lnc-DC干扰后刺激活化同种异体CD4+T细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-2的能力；结果显示为平均值±标准差(n=3)。
以上图中，ctrl＝对照。
具体实施方式
本发明人从转录组芯片和RNA-seq二代测序的结果中，发现了数百个差异表达的lncRNA，并从中筛选出了树突状细胞特异性表达并能促进树突状细胞成熟和功能的lnc RNA——lnc-DC。在单核细胞分化为树突状细胞的过程中干扰lnc-DC后结果发现：成熟DC表面表达的功能分子显著下降，如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD40。同时，DC分泌的IL-12也在lnc-DC干扰后显著降低。在DC功能上，lnc-DC干扰的DC与对照组DC相比活化CD4+T细胞的能力减弱，表现为T细胞分泌的IFN-γ和IL-2减少，同时促进T细胞增殖的能力也降低，表现为T细胞的数量与对照组相比减少。实验证实了lnc-DC对于人树突状细胞的成熟和功能是必需的。
本发明中进一步提供了长链非编码RNA lnc-DC有效促进人树突状细胞成熟和功能的新用途。lnc-DC表达量的检测可应用于免疫相关疾病中与免疫功能的检测，对疾病的诊断预后等给出提示信息，或对疾病的治疗策略方法等给出指导信息。针对lnc-DC表达量的调控，包括高表达和干扰抑制表达等一切改变lnc-DC量的干预措施，可应用于免疫相关疾病的治疗，实现对免疫应答的正向或负向的调控，从而达到治疗疾病的目的。在DC疫苗中，lnc-DC表达量的改变可以辅助完成树突状细胞的成熟，抗原的摄取和递呈，从而促进特异性免疫应答，发挥抗肿瘤的效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概 念。
如本文所用，术语“树突状细胞”是指常规树突状细胞(conventional dendritic cell，cDC)，是指由通过常规DC来源途径产生的树突状细胞，也称髓系DC(myeloid dendritic cells，mDC)，该术语区别于树突状细胞的另一分类为——浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells，pDC)。
如本文所用，术语“树突状细胞前体”是指可产生常规树突状细胞任何细胞类型或状态，例如单核细胞、单核前体细胞、单核粒细胞前体细胞、髓系共同前体细胞、淋巴系共同前体细胞、造血干细胞。可用适当的试剂和方法诱导所述前体细胞向树突状细胞转化，例如可参考本领域中的相关文献。
如本文所用，术语“表达”在描述lnc-DC是指其RNA水平。
Lnc-DC及其杂交和同源序列
如本文所用，术语“lnc-DC”是指(a)常规树突状细胞cDC中特异性表达长链非编码RNA分子(lncRNA)的基因，其基因序列可如SEQ ID NO:1(GenBank accession number:KJ020271)或SEQ ID NO:2所示(Gene symbol LOC645638，Gene ID:645638)；(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列(例如SEQ ID NO:16所示的小鼠同源序列)。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。
本发明的RNA全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。
药物或试剂盒
本发明还提供了一种药物(尤其是药物组合物或疫苗组合物)或试剂盒，其用于调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能，和/或进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估。所述药物或试剂盒含 有有效量的本发明的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂以及药学上或免疫学上可接受的载体或辅料。
所述“药学上或免疫学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上/免疫学上可接受的载体”指用于治疗剂或疫苗给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物/疫苗制剂应与给药方式相匹配，例如，本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备，以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。
可根据防治、预后的原理和方法，按照需要在本发明的药物和试剂盒中配备试剂或试剂组。例如，本发明的药物或试剂盒中可进一步包含：未成熟或成熟、经或未经致敏的常规树突状细胞和/或其前体细胞，例如用肿瘤抗原致敏的常规树突状细胞；以及树突状细胞致敏剂。
此外，本发明的试剂盒还可根据需要包括：容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本发明的优点
本发明的主要优点在于：
(1)证明了lnc-DC对于树突状细胞的正常分化和功能是必需的，对其进行干扰抑制后能够实现对DC成熟和功能的调控，以及对DC相关免疫应答的调控。
(2)为免疫相关的干预治疗或诊断预后检测以及DC疫苗的制备提供了简便而有效的工具和方法。
序列表的对应关系(见下表)
| SEQ ID NO: | 序列名称 | SEQ ID NO: | 序列名称 |
| 1 | 人Lnc-DC基因序列 | 9 | GAPDH上游引物 |
| 2 | 人Lnc-DC基因序列 | 10 | GAPDH下游引物 |
| 3 | lnc-DC上游引物 | 11 | RNAi-1 |
| 4 | lnc-DC下游引物 | 12 | RNAi-2 |
| 5 | CA4上游引物 | 13 | 无关对照RNAi |
| 6 | CA4下游引物 | 14 | IL-12A上游引物 |
| 7 | HEATR6上游引物 | 15 | IL-12A下游引物 |
| 8 | HEATR6下游引物 | 16 | 小鼠Lnc-DC基因 |
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.单核细胞到树突状细胞的培养过程
根据文献记载在体外使人单核细胞分化成熟为DC[Liu,S.,Yu,Y.,Zhang,M.,Wang,W.& Cao,X.“The involvement of TNF-alpha-related apoptosis-inducing ligand in the enhanced cytotoxicity of IFN-beta-stimulated human dendritic cells to tumor cells”.J Immunol.2001;166(9):5407-5415.]。
健康人的外周血样品来自上海长海医院血液中心，在经过聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque，Mediatech Cellgro)密度梯度离心之后，得到人外周血单核细胞 (human peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用抗-CD14微珠(Miltenyi Biotech)的磁珠分选获得PBMC中的单核细胞。
将分选得到的单核细胞培养于37℃的细胞培养箱中(24孔板，5×105个细胞/孔，1mL/孔RPMI-1640(PAA)细胞培养液，其中含10%(v/v)FCS(PAA)，外加100ng/mL人GM-CSF和20ng/mL人IL-4(R&D Systems，Minneapolis,MN)。在培养的第三天(day3)和第五天(day5)，半量更换含有GM-CSF和IL-4的新鲜培养液(含10%FCS(PAA)的RPMI-1640(PAA)细胞培养液)。培养至第五天时，单核细胞已经分化为未成熟DC(immature DC)，当天加入300ng/ml LPS(0111:B4,Sigma)诱导其成熟。至第七天(day7)，DC成熟，进行相应检测，或在实验中注明的其它时间点进行检测。
实施例2：lnc-DC及其基因组附近基因的定量实时PCR(qRT-PCR)检测
取实施例1中用于分选的原代人外周血细胞或单核细胞到树突状细胞培养的各个时间点的细胞、以及其它各种免疫细胞，采用TRIzol(Invitrogen公司)提取其中的RNA样品。对所得RNA进行反转录，然后进行qRT-PCR。
各种免疫细胞如下：
单核细胞来源巨噬细胞的培养同样来自PBMCs的单核细胞。培养条件是RPMI-1640细胞培养液含10%(v/v)FCS加20ng/mL人M-CSF(R&D Systems)，培养至第五天即得到单核细胞来源的巨噬细胞。
单核细胞、浆细胞样树突状细胞、常规树突状细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等其它原代免疫细胞由PBMC经MoFlo(DACO Cytomatix,Denmark)分选得到。常规树突状细胞为人外周血分选得到，代表体内存在的常规树突状细胞，一般认为健康人体内血液中的树突状细胞处在成熟状态。
反转录使用的是高速逆转录试剂盒(TOYOBO公司，First Strand cDNA Synthesis Kit，Code No.FSK-100)。反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟，4℃10分钟。
qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Code：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
lnc-DC qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGG GAC TGC AAC CCC GGA GA-3'(上游，SEQ ID NO:3);
5'-AAC CCC TCT TCC CTG CCT CCC-3'(下游，SEQ ID NO:4)。
作为无变化对照的lnc-DC基因组附近基因CA4qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-CTG GTG CTA CGA GGT TCA AGC-3'(上游，SEQ ID NO:5)；
5'-GAA GAA GAA GCG TCC CAG TTT-3'(下游，SEQ ID NO:6)。
作为无变化对照的lnc-DC基因组附近基因HEATR6qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-ATG GCT GCT GTG CAA GTT GT-3'(上游，SEQ ID NO:7)；
5'-CGA AAC CCA TTG CCT CGC T-3'(下游，SEQ ID NO:8)。
qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(以GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGT GGG CAT CAA TGG ATT TGG-3'(上游，SEQ ID NO:9)；
5'-ACA CCA TGT ATT CCG GGT CAA T-3'(下游，SEQ ID NO:10)。
测试结果如图1和图2所示。
图1中的数据显示：lnc-DC仅在常规树突状细胞中高表达，而在其它免疫细胞亚群中不表达或表达量很低。
图2中的数据显示：lnc-DC在外周血单核细胞分化为树突状细胞的过程中(第0天～第7天)表达量显著上调，在树突状细胞完全成熟时(第7天)达到最高值。而作为无关对照的其它两个基因HEATR6和CA4的表达量在树突状细胞分化成熟的过程中没有明显变化。
以上结果表明：
Inc-DC仅在常规树突状细胞中特异性表达，其在常规树突状细胞中的表达水平区别于其它免疫细胞。
并且，Inc-DC在常规树突状细胞中的表达水平与所述细胞的成熟状态正相关，可用于确定常规树突状细胞的成熟状态，并可进一步用于确定与常规树突状细胞成熟状态相对应的功能。
实施例3：lnc-DC的定量实时PCR(qRT-PCR)检测
将序列如下所示的lnc-DC的siRNA序列RNAi-1、RNAi-2或无关对照序列插入到shRNA表达载体pSIF siRNA表达载体(购自System Biosciences公司)中，从而得到了表达lnc-DC shRNA的载体及其对照载体。
RNAi-1(SEQ ID NO:11)：5'-GAG TTA TCT TAA GGA TCA T-3'；
RNAi-2(SEQ ID NO:12)：5'-GGA GTT CCT TGA CTA GG-3'；
无关对照RNAi(SEQ ID NO:13)：5'-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3'。
然后，采用Lentivector Expression Systems(System Biosciences)在HEK293T细胞中包装成慢病毒。在如实施例1所述的单核细胞分化为DC的过程中于第1天，用包装好的lnc-DC RNAi慢载体及其对照载体(对照RNAi)感染细胞(MOI=100)。在成熟DC中(第7天)收细胞。用TRIzol(Invitrogen公司)提取RNA。对所得RNA进行反转录，然后进行qRT-PCR。
反转录使用的是高速逆转录试剂盒(TOYOBO公司，First Strand cDNA Synthesis Kit，Code No.FSK-100)。反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟，4℃10分钟。
qRT-PCR定量检测lnc-DC的表达量，使用的是SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Code：QPK-201)并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
lnc-DC qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGG GAC TGC AAC CCC GGA GA-3'(上游，SEQ ID NO:3)；
5'-AAC CCC TCT TCC CTG CCT CCC-3'(下游，SEQ ID NO:4)
qRT-PCR反应参数为：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGT GGG CAT CAA TGG ATT TGG-3'(上游，SEQ ID NO:9)；
5'-ACA CCA TGT ATT CCG GGT CAA T-3'(下游，SEQ ID NO:10)。
实验结果如图3所示。结果显示：在lnc-DC RNAi的DC中，lnc-DC的表达量被明显抑制。
该结果表明：lnc-DC RNAi能够很好的发挥干扰lnc-DC表达的作用，从而说明后续lnc-DC功能检测的可靠性(图3)。
实施例4：DC细胞表面功能相关分子的流式检测
如实施例1和3中所述，在单核细胞monocyte分化为DC的过程中，用包装好的lnc-DC RNAi慢载体及其对照载体(Control RNAi)感染细胞(MOI=100)。在成熟DC中(第7天)收细胞(即收集经转染的成熟DC)，并采用流式细胞术检测细胞表面分子CD11c、CD14、CD40、CD86、CD80和HLA-DR。
所用细胞流式抗体标记是cytofix/cytoperm试剂盒(eBioscience)，按照其标准操作流程进行。流式细胞检测用的是FACS LSRII流式细胞仪，软件为FACSDiva(BD Biosciences)。具体步骤可参见本实验室之前发表的论文(Zhang,M.等，The beta2integrin CD11b attenuates polyinosinic:polycytidylic acid-induced hepatitis by negatively regulating natural killer cell functions.Hepatology.2009;50(5):1606-1616；Li,H.,Han,Y.,Guo,Q.,Zhang,M.&Cao,X.Cancer-expanded myeloid-derived suppressor cells induce anergy of NK cells through membrane-bound TGF-β1.The Journal of Immunology.2009;182(1):240-249).
实验结果如图4所示。结果显示：lnc-DC干扰后DC功能相关的表面分子的表达都有明显的降低，而单核细胞表面标识分子CD14则有一定程度的增高。
上述结果表明：lnc-DC能够促进从单核细胞到树突状细胞的分化成熟。
实施例5：DC细胞分泌IL-12的功能检测
如同实施例1和3中所述，在单核细胞分化为DC的过程中，用包装好的lnc-DC RNAi慢载体及其对照载体(Control RNAi)感染细胞(MOI=100)。在第七天DC成熟后，收集细胞培养上清，采用ELISA(R&D公司)检测人IL-12p70，具体步骤参照ELISA试剂盒说明书。
与上述实验同步进行如下实验：在LPS刺激后的0小时(0h)、12小时(12h)、24小时(24h)，收集细胞，用TRIzol(Invitrogen公司)提取RNA。对所得RNA进行反转录，然后进行qRT-PCR。
反转录使用的是高速逆转录试剂盒(TOYOBO公司，First Strand cDNA Synthesis Kit，Code No.FSK-100)。反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟，4℃10分钟。
反转录后qRT-PCR定量检测IL-12A mRNA的表达量，使用的是SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Code：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
IL-12A qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-CCT TGC ACT TCT GAA GAG ATT GA-3'(上游，SEQ ID NO:14)；
5'-ACA GGG CCA TCA TAA AAG AGG T-3'(下游，SEQ ID NO:15)。
qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGT GGG CAT CAA TGG ATT TGG-3'(上游，SEQ ID NO:9)；
5'-ACA CCA TGT ATT CCG GGT CAA T-3'(下游，SEQ ID NO:10)
实验结果如图5和图6所示。该结果显示：lnc-DC干扰后DC分泌IL-12的能力明显下降。
由于分泌IL-12是DC成熟后功能的一个显著特征，而IL-12能够调控免疫细胞功能，发挥后续激活免疫应答的作用，因此上述结果表明lnc-DC能够促进人DC细胞的成熟和功能。
实施例6：DC细胞活化同种异体CD4
+
T细胞功能的检测
用磁珠分选法抗-CD4微珠(Miltenyi Biotech公司)从人外周血单核细胞PBMC中分选CD4+T细胞。在同种异体DC和T细胞共培养实验中，在96孔板的每孔中加入T细胞(1×105个)，然后按照10:1或50:1(T细胞：DC)的比例加入同种异体的经过相应处理(即诱导成熟+转染)的DC细胞(第7天，如实施例1和3)。共培养5天后用CountBrightTM absolute counting beads(Invitrogen公司)流式检测T细胞数量，从而反映T细胞的增殖情况(图7)；上清用ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌情况(R&D公司)，从而反映T细胞的活化情况(图8)。
实验结果如图7和图8所示。结果显示：lnc-DC干扰后DC活化T细胞的能力明显减弱，表现为CD4+T细胞的增殖下降和CD4+T细胞分泌细胞因子的能力下降。该结果表明：lnc-DC对于DC活化T细胞的能力而言是必需的，lnc-DC能够促进人DC活化同种异体T细胞的能力。
综上所述，实施例3-6中所得的结果表明，Inc-DC对于人树突状细胞的正常分化和功能是必需的，对其进行干扰抑制后能够实现对DC成熟和功能的调控，以及对DC相关免疫应答的调控。因此，Inc-DC可应用于免疫相关的干预治疗或诊断预后检测，同时可应用于DC疫苗的制备。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能中的应用：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。
2.选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在制备调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述序列是SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的序列或SEQ ID NO:16所示的同源序列。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述成熟状态选自：细胞表面共刺激分子的表达CD80/86、CD40，抗原递呈分子HLA的表达，免疫活化细胞因子IL-12的产生；所述功能选自：激活初始T细胞应答、启动免疫应答、调控免疫应答、维持免疫应答、摄取抗原、加工处理抗原和递呈抗原。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，
所述序列或其表达产物、或其促效剂促进常规树突状细胞的成熟和/或促进其功能，优选与未接触所述序列或其表达产物、或其促效剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，增加成熟树突状细胞表面表达的功能分子(如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD40)、提高IL-12分泌、使树突状细胞活化CD4+T细胞的能力提高(如T细胞分泌的IFN-γ和IL-2增加)、和/或使树突状细胞促进T细胞增殖的能力提高；
所述序列或其表达产物的抑制剂阻碍常规树突状细胞的成熟和/或阻碍其功能，优选与未接触所述抑制剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，减少成熟树突状细胞表面表达的功能分子(如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD40)、降低IL-12分泌、使树突状细胞活化CD4+T细胞的能力降低(如T细胞分泌的IFN-γ和IL-2减少)、和/或使树突状细胞促进T细胞增殖的能力降低。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述促效剂选自：包含所述序列的表达载体、所述序列的外源性表达产物、促使所述序列高表达的试剂；所述序列或其表达产物的抑制剂选自：针对所述序列的RNAi、反义寡核苷酸、用于阻遏或降低所述序列表达的特异性抑制剂或阻碍其功能的分子化合物等试剂。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估。
8.一种药物或试剂盒，其包含：
i)有效量的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列；
ii)药学或免疫学上可结合的载体或辅料。
9.一种调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的方法、或诱导产生所需成熟状态和/或功能的常规树突状细胞或的方法，所述方法包括使选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂接触常规树突状细胞和/或其前体细胞的步骤：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述接触步骤之前、之时或之后，使所述常规树突状细胞和/或其前体细胞与树突状细胞致敏剂接触，优选所述致敏剂为肿瘤抗原。
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