CN106929509A - 一种新的长链非编码RNA即lnc‑Smad3、其序列、免疫效应及用途 - Google Patents

一种新的长链非编码RNA即lnc‑Smad3、其序列、免疫效应及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种新的长链非编码RNA、其序列、免疫效应及用途，本发明涉及SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA(即lnc‑Smad3)或其互补或同源RNA序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂在调控调节性T细胞的分化发育和/或成熟状态和/或功能中的应用、或在制备调控调节性T细胞的分化发育和/或成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用，以及相应的试剂盒和方法。本发明可应用于调控调节性T细胞的分化发育和/或成熟状态和/或功能，和/或进一步用于调控机体免疫稳态、防治结肠炎等自身免疫性疾病、免疫干预方案选择和/或预后评估，具有广泛的应用前景。

Description

一种新的长链非编码RNA即lnc-Smad3、其序列、免疫效应及 用途
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，是一种长链非编码RNA——lnc-Smad3，其在调控调节性T细胞的分化发育、成熟和功能中的应用。
背景技术
哺乳动物基因组可转录多种长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，然而其中仅有少数lncRNA的序列和功能被明确。近年来，lncRNA在生命生理过程以及疾病进程中的作用不断受到关注，但是关于lncRNA与免疫系统之间的研究并不多，尤其是lncRNA与调节性T细胞的分化发育、成熟以及其维持的免疫稳态之间的报道几乎空白。
调节性T细胞是免疫稳态中重要的调控细胞，它可以从初始状CD4+T细胞分化发育而来。调节性T细胞可以通过抑制效应性T细胞的活化和增殖，负向调控过激的免疫应答，控制炎症反应。而另一方面，调节性T细胞分泌的细胞因子IL-10、转化因子TGF-β等又参与肿瘤微环境的形成，与肿瘤转移有着一定的关联。调节性T细胞的分化发育、成熟和功能状态决定了免疫应答的走向和强度，在机体免疫稳态的维持中发挥着重要的调控作用。
众多的转录因子和细胞因子等在调节性T细胞的分化成熟中发挥着重要作用，如Foxp3、IL-2以及TGF-β等，也确定了很多调节性T细胞功能相关的膜表面受体，如CD25/CTLA-4/GITR等。但是，目前为止没有报道过参与调控调节性T细胞分化成熟和功能的特异性长链非编码RNA，因此尚不清楚长链非编码RNA对调节性T细胞免疫功能调控的作用机制。
许多临床疾病都是由于调节性T细胞的发育和功能异常导致的。如小鼠会因为调节性T细胞功能缺陷而引发自身免疫性炎症性疾病，Scurfy病。相应的在人类中，调节性T细胞关键分子Foxp3的基因突变则会引发先天性免疫缺陷综合征，IPEX病。在自身免疫性疾病的临床治疗中，小剂量IL-2输注可以使得调节性T细胞在体内扩增，达到抑制机体过度免疫应答的效应。然而调节性T细胞的体外转化和扩增在临床应用中尚不成熟。调节性T细胞在众多免疫相关疾病如感染，炎症，自身免疫性疾病，肿瘤的发生发展和干预治疗中发挥着重要作用，然而调节性T细胞分化成熟和功能调控机制的缺乏使得调节性T细胞在临床上的转化应用仍十分有限。因此，从调节性T细胞中寻找新型调控分子有助于实现对调节性T细胞的分化成熟和功能调控，及其所介导的免疫稳态维持的调控，并进一步可用于免疫相关疾病的干预治疗。为方便临床和科研应用，本领域中迫切需要研究和开发出可调控调节性T细胞的分化发育、成熟和功能的特异性分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控调节性T细胞的分化发育和/或其成熟状态和/或其功能的物质：lnc-Smad3及其杂交或同源序列、其表达产物、或它们的抑制剂或增效剂。本发明的另一目的在于提供以上物质在调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能中的应用以及相应的药物和试剂盒。
本发明从小鼠Smad3的基因位点附近筛选出了由初始状CD4+T细胞特异性表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)分子lnc-Smad3(LOC102639582，Gene ID:102639582，GenBank accession number:KY652933，SEQ ID NO:1)，并明确其精确的序列。初始状CD4+T细胞在极化剂作用下分化发育为调节性T细胞的过程中，lnc-Smad3的表达水平呈现不断下降的趋势。在调节性T细胞分化发育的过程中，过表达lnc-Smad3后结果发现：调节性T细胞的分化发育受阻，功能性表面受体的表达显著降低，如CD25、CTLA-4和GITR。同时，调节性T细胞分泌的IL-10也在过表达lnc-Smad3后显著下降。在调节性T细胞功能上，过表达lnc-Smad3的调节性T细胞与对照组相比，抑制效应性T细胞增殖的能力减弱，表现为效应性T细胞的数量与对照组相比减少。实验证实了调节性T细胞分化发育过程中，lnc-Smad3的减少对于调节性T细胞的成熟和功能是必需的。
本发明中进一步提供了长链非编码RNA lnc-Smad3有效抑制调节性T细胞成熟和功能的新用途。lnc-Smad3表达量的检测可应用于免疫相关疾病中免疫功能的检测，对疾病的诊断治疗和预后等给出提示或指导信息。针对lnc-Smad3表达量的调控，包括干扰抑制表达和高表达等一切影响lnc-Smad3量的干预手段，可应用于免疫相关疾病的治疗。本发明可以辅助完成调控调节性T细胞的分化发育、成熟和免疫抑制功能，通过实现对免疫应答的正向或负向的调控，发挥抑制自身免疫性疾病进展或抗肿瘤逃逸转移的效果，从而达到治疗疾病的目的。在此基础上，完成了本发明。
本发明的第一方面，提供选自下组的RNA序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂在调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能中的应用：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
本发明的第二方面，提供选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂在制备调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
在本发明的优选实施方式中，所述RNA序列是SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA。
在本发明的一些实施方式中，所述调节性T细胞来源于哺乳动物，优选小鼠、人、大鼠、犬、猴、猩猩、猪、马、牛或羊，更优选小鼠。
在本发明的一些实施方式中，所述分化发育选自：关键转录因子Foxp3的表达；所述成熟状态选自：细胞表面淋巴细胞归巢受体CD44/CD62L的表达、抑制性受体CD25/CLTA4/GITR的表达、免疫抑制性细胞因子IL-10的产生；所述功能选自：抑制效应性T细胞的增殖和活化、负向调控免疫应答、抑制炎症、维持免疫稳态。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物、或其增效剂抑制调节性T细胞的分化发育、成熟和/或抑制其功能，优选与未接触所述序列或其表达产物的抑制剂的对照调节性T细胞或其前体初始状CD4+T细胞相比，减少调节性T细胞表达的标志性分子和功能分子(如关键转录因子Foxp3、抑制性受体CD25/CLTA4/GITR)、减弱IL-10分泌、使调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖和活化的能力降低。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物的抑制剂促进调节性T细胞的分化发育和/或成熟和/或促进其功能，优选与未接触所述序列或其表达产物的抑制剂的对照调节性T细胞或其前体初始状CD4+T细胞相比，增加调节性T细胞表达的标志性分子和功能分子(如关键转录因子Foxp3、抑制性受体CD25/CLTA4/GITR)、增强IL-10分泌、使调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖和活化的能力提高。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物、或其增效剂选自：包含所述序列的表达载体、所述序列的外源性表达产物、促使所述序列高表达的试剂；所述序列或其表达产物的抑制剂选自：针对所述序列的RNAi、反义寡核苷酸、用于阻碍或降低所述序列表达和/或其功能的特异性抑制剂和/或分子化合物等试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂进一步用于调控机体免疫稳态、防治自身免疫性疾病、免疫干预方案选择和/或预后评估。
在本发明的优选实施方式中，所述自身免疫性疾病为结肠炎。
本发明的第三方面，提供一种调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能的药物或试剂盒，其包含：
i)有效量的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列；
ii)药学或免疫学上可结合的载体或辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物或试剂盒还包含：未成熟或成熟、经或未经极化的调节性T细胞和/或其前体初始状CD4+T细胞；调节性T细胞极化剂。
本发明的第四方面，提供一种调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或其功能的方法、或诱导前体初始状CD4+T细胞成功分化发育成调节性T细胞、或诱导产生所需成熟状态和/或功能的调节性T细胞的方法，所述方法包括使选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂接触调节性T细胞和/或其前体CD4+T细胞的步骤：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列；
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括：
在所述接触步骤之前、之时或之后，使所述调节性T细胞和/或其前体初始状CD4+T细胞与调节性T细胞极化剂接触；优选的所述极化剂为转化因子TGF-β。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用，术语“表达”在描述lnc-Smad3是指其RNA水平。
Lnc-Smad3及其杂交和同源序列
如本文所用，术语“lnc-Smad3”是指(a)由初始状CD4+T细胞特异性表达的长链非编码RNA分子(lncRNA)，其序列如SEQ ID NO:1所示；(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的RNA全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。
药物或试剂盒
本发明还提供了一种药物或试剂盒，其用于调控调节性T细胞的分化发育和/或成熟状态和/或功能，和/或进一步用于对机体免疫应答的调控、防止免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估。所述药物或试剂盒包含有效量的本发明的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂以及药学上或免疫学上可接受的载体或辅料。
所述“药学上或免疫学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上或免疫学上可接受的载体”指用于治疗剂或疫苗给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物/疫苗制剂应与给药方式相匹配，例如，本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备，以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。
可根据防治、预后的原理和方法，按照需要在本发明的药物和试剂盒中配备试剂或试剂组。例如，本发明的药物或试剂盒中可进一步包含：未成熟或成熟、经或未经极化的调节性T细胞和/或其前体初始状CD4+T细胞；以及调节性T细胞的极化剂。
此外，本发明的试剂盒还可根据需要包括：容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本发明优点在于：
1、证明了lnc-Smad3的水平降低对于调节性T细胞的正常分化成熟和功能是必需的，对其进行过表达后能够实现对调节性T细胞成熟和功能的调控，以及对调节性T细胞介导的相关免疫应答的调控；
2、为免疫相关性疾病的诊断治疗和预后提供了简便而有效的工具和方法；
3、本发明可应用于调控调节性T细胞的分化发育和/或成熟状态和/或功能，和/或进一步用于调控机体免疫稳态、防治结肠炎等自身免疫性疾病、免疫干预方案选择和/或预后评估，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：lnc-Smad3在各类免疫细胞中的表达量的qRT-PCR检测。图中，一个点代表一个样品重复。
图2：lnc-Smad3在初始状CD4+T细胞向成熟调节性T细胞分化成熟过程中表达量的qRT-PCR检测。图中所示结果为平均值±标准差(n＝3)。
图3：qRT-PCR检测初始状CD4+T细胞分化来的调节性T细胞中lnc-Smad3的RNA水平，从而证实lnc-Smad3慢病毒(lenti-lnc-Smad3)的过表达效率；结果显示为平均值±标准差(n＝3)。
图4：qRT-PCR检测初始状CD4+T细胞分化来的调节性T细胞中Foxp3的RNA水平，从而证实在利用lnc-Smad3慢病毒增加了lnc-Smad3的表达后，调节性T细胞的关键转录因子的表达受到明显抑制；结果显示为平均值±标准差(n＝3)。
图5：流式检测初始状CD4+T细胞分化来的调节性T细胞中Foxp3的蛋白水平，从而证实在利用lnc-Smad3慢病毒增加了lnc-Smad3的表达后，初始状CD4+T细胞往调节性T细胞的分化发育受阻碍。
图6：流式检测调节性T细胞表面受体的表达，证实在利用lnc-Smad3慢病毒增加了lnc-Smad3的表达后，调节性T细胞功能相关的表面受体的表达受到明显抑制；结果显示为平均值±标准差(n＝3)。
图7.ELISA检测在利用lnc-Smad3慢病毒增加了lnc-Smad3的表达后，调节性T细胞分泌的IL-10的水平降低；结果显示为平均值±标准差(n＝3)。
图8.调节性T细胞抑制实验检测调节性T细胞在过表达lnc-Smad3后抑制效应性T细胞增殖的能力；结果显示为平均值±标准差(n＝3)。
以上图中，lenti-CTR＝对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.初始状CD4+T细胞分化成调节性T细胞的培养过程
根据文献记载在体外使小鼠来源的初始状CD4+T细胞分化培养成调节性T细胞(Roychoudhuri,R.et al.BACH2represses effector programs to stabilize T(reg)-mediated immune homeostasis.Nature 498,506-510(2013).)。
利用初始状CD4+T细胞分离试剂盒(Stemcell)从小鼠脾脏细胞中分离出初始状CD4+T细胞。将分选得到的初始状CD4+T细胞培养于37℃的细胞培养箱中[24孔板，1×106个细胞/孔，1mL/孔RPMI-1640(PAA)细胞培养液，其中含10％(v/v)FCS(PAA)，外加anti-CD3(1μg/ml)，anti-CD28mAbs(1μg/ml)，anti-IFN-γ(10μg/ml)，anti–IL-4(10μg/ml)，IL-2(5ng/ml)以及重组人TGF-β(10ng/ml)]。培养置第三天时，初始状CD4+T细胞分化成成熟的调节性T细胞。
实施例2：lnc-Smad3及其基因组附近基因的定量实时PCR(qRT-PCR)检测
取实施例1中利用试剂盒分选得到的初始状CD4+T细胞(图1)或往调节性T细胞分化培养的各个时间点的细胞(图2)，采用TRIzol(Invitrogen公司)提取其中的RNA样品。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR Green Realtime PCR Master MixCode：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
lnc-Smad3的qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-AGGCCAACGATCCAGGTTTA-3'(上游，SEQ ID NO:2)；
5'-ACATGTCTGGAGGCAATGGA-3'(下游，SEQ ID NO:3)。
作为无变化对照的lnc-Smad3基因组附近基因Iqch qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-TGGGCATGTTAACAATCGGTG-3'(上游，SEQ ID NO:4)；
5'-TCTTCCTCCTCTTTGCTCTGT-3'(下游，SEQ ID NO:5)。
反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟。
qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(以GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(上游，SEQ ID NO:6)；
5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(下游，SEQ ID NO:7)。
测试结果如图1和图2所示。
图1中的数据显示：lnc-Smad3仅在初始状CD4+T细胞中高表达，而在其它免疫细胞亚群中不表达或表达量很低。
CD8+T细胞是采用抗CD8磁珠(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏细胞中分离而出；B细胞是采用抗B220磁珠(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏细胞中分离而出；树突状细胞是利用小鼠骨髓细胞外加100ng/mL小鼠GM-CSF和10ng/mL小鼠IL-4细胞因子(R&D Systems，Minneapolis,MN)培养七天而获得；巨噬细胞是往小鼠腹腔注射肉汤，三天后抽取腹水而获得。
图2中的数据显示：lnc-Smad3在初始状CD4+T细胞分化为调节性T细胞的过程中(第0天～第3天)表达量显著下调，在调节性T细胞分化成熟时(第3天)达到最低值，低于初始状CD4+T细胞(第0天)中表达量的10％。而作为无关对照的其它基因Iqch的表达量在CD4+T细胞分化为调节性T细胞的过程没有明显变化。
以上结果表明：
lnc-Smad3仅在初始状CD4+T细胞中特异性表达，其在初始状CD4+T细胞中的表达水平可区别于其它免疫细胞。
并且，lnc-Smad3在初始状CD4+T细胞往调节性T细胞的分化发育过程中呈现出下降的趋势，lnc-Smad3在调节性T细胞中的表达水平与所述细胞的成熟状态负相关，可用于确定调节性T细胞的成熟状态，并可进一步用于确定与调节性T细胞成熟状态相对应的免疫功能。
实施例3：lnc-Smad3的定量实时PCR(qRT-PCR)检测
用小鼠CD4+T细胞的cDNA为模板，设计引物分别PCR扩增出小鼠lnc-Smad3序列；将扩增片段引入pCDH-CMV-MCS-EF1-puroEGFP载体中，利用Lentivectors表达体系(SystemBiosciences)构建表达lnc-Smad3的慢病毒(lenti-lnc-Smad3)。
在初始状CD4+T细胞分化发育为调节性T细胞的过程中，用表达lnc-Smad3的慢病毒及其对照载体(lenti-CTR)感染细胞(MOI＝100)。第三天收细胞采用TRIzol(Invitrogen公司)提取其中的RNA样品。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR GreenRealtime PCR Master Mix Code：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
lnc-Smad3的qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-AGGCCAACGATCCAGGTTTA-3'(上游，SEQ ID NO:2)；
5'-ACATGTCTGGAGGCAATGGA-3'(下游，SEQ ID NO:3)。
反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟。
qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(以GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(上游，SEQ ID NO:6)；
5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(下游，SEQ ID NO:7)。
测试结果如图3所示。
实施例4：Foxp3的定量实时PCR(qRT-PCR)检测
在初始状CD4+T细胞分化发育为调节性T细胞的过程中，用表达lnc-Smad3的慢病毒及其对照载体(lenti-CTR)感染细胞(MOI＝100)。第三天收细胞采用TRIzol(Invitrogen公司)提取其中的RNA样品。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR GreenRealtime PCR Master Mix Code：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。
Foxp3的qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3'(上游，SEQ ID NO:8)；
5'-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3'(下游，SEQ ID NO:9)。
反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟。
qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30秒，40循环。
RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(以GAPDH为内参)。
GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(上游，SEQ ID NO:6)；
5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(下游，SEQ ID NO:7)。
测试结果如图4所示。
实施例5：调节性T细胞内Foxp3的流式检测
在初始状CD4+T细胞分化发育为调节性T细胞的过程中，用表达lnc-Smad3的慢病毒及其对照载体(lenti-CTR)感染细胞(MOI＝100)。第三天收细胞，并采用流式细胞术检测细胞胞内Foxp3的蛋白水平。
所用细胞流式抗体标记是cytofix/cytoperm试剂盒(eBioscience)，按照其标准操作流程进行。流式细胞检测用的是FACS LSRII流式细胞仪，软件为FACSiva(BDBiosciences)。具体步骤可参见本实验室之前发表的论文(Liu,J.等Rhbdd3controlsautoimmunity by suppressing the production of IL-6by dendritic cells via K27-linked ubiquitination of the regulator NEMO.Nature Immunology.2014；15:612-622.)
实验结果如图5所示。结果显示：过表达lnc-Smad3后调节性T细胞的关键性转录因子Foxp3的表达有明显的降低，说明调节性T细胞的分化发育受到阻碍。
实施例6：调节性T细胞表面抑制性受体CD25/CTLA-4/GITR的流式检测
在初始状CD4+T细胞分化发育为调节性T细胞的过程中，用表达lnc-Smad3的慢病毒及其对照载体(lenti-CTR)感染细胞(MOI＝100)。第三天收细胞，并采用流式细胞术检测细胞表面抑制性受体CD25/CTLA-4/GITR的水平。检测方法同实施例5。
实验结果如图6所示。结果显示：过表达lnc-Smad3后调节性T细胞的表面抑制性受体CD25/CTLA-4/GITR的水平均有明显的降低，说明调节性T细胞的成熟受到阻碍。
实施例7：调节性T细胞分泌IL-10的功能检测
在初始状CD4+T细胞分化发育为调节性T细胞的过程中，用表达lnc-Smad3的慢病毒及其对照载体(lenti-CTR)感染细胞(MOI＝100)。第三天收细胞培养上清，采用ELISA(R&D公司)检测IL-10，具体步骤参照ELISA试剂盒说明书。
实验结果如图7所示。该结果显示：lnc-Smad3过表达后调节性T细胞分泌IL-10的能力明显下降。
由于分泌IL-10以及表达抑制性受体CD25/CTLA-4/GITR是调节性T细胞成熟并具有免疫抑制功能的显著特征，因此上述结果表明lnc-Smad3参与抑制调节性T细胞的成熟和功能。
实施例8：调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖功能的检测
5×104CFSE标记后的CD4+效应T细胞(来自CD45.1小鼠)与1×104CD11c+DC共培养于96孔圆底板中。按照实例3-7处理的调节性T细胞以2.5×104的细胞量加入体系中。给予anti-CD3(1μg/ml)刺激3天后，用流式细胞术通过检测CD45.2+的T细胞数量，来分析T细胞的增殖情况，从而评估体系中调节性T细胞所发挥的抑制作用。
实验结果如图8所示。结果显示：过表达lnc-Smad3后调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖的能力明显减弱。
综上所述，实施例3-8中的结果表明，在初始状CD4+T细胞往调节性T细胞分化发育的过程中，lnc-Smad3表达的下降是调节性T细胞正常分化、成熟和具备功能是必需的。对lnc-Smad3进行过表达后能够实现对调节性T细胞成熟和功能的调控，以及对调节性T细胞介导的相关免疫应答的调控。因此，lnc-Smad3可用于免疫相关疾病的诊断、治疗和预后评估。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种新的长链非编码RNA即lnc-Smad3、其序列、免疫效应及用途
<130> /
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
cggcgcgtgc gcacaggacg ggacgggagg gcggagcgac tgcgcagatc aggaaaattg 60
tcacctctgg cctcagggaa actgaggctc tgagcagtta agaggccaac gatccaggtt 120
tatgctatca gtgtctgaga tacaattaag tcaccttttt gggtgacatt tcccttgact 180
agtacctcaa gattatgatc caggtggacc atccctccat tgcctccaga catgtctatg 240
acgctaccta gggattgtga agatttacca cctggtggaa aattaaaaaa aaagacttat 300
tctgcaaatt gaccaagctt aagagataca gcactgagaa ttcacccact acagagctgg 360
taaccaggcc ttcagagtaa gctgtgatgt atagccattc tcctcagcag cctgtttgac 420
tgagggatat aggaatgact gcccttaccc atgtttttgt tcagatttat ggttctaaat 480
ctgatggaaa atctatcatt ggaccatttg attcttccta aagaaaggcc aaaccacctg 540
tcaaacccac gagcaacaca gcaatggcta agctgaagaa gccaagttat atgtctagct 600
cctctgtggg tggcaggatc cagctgtggg gagtccaagg ttccttgtgt tcttctggct 660
tgactatgat atttccaatt tggaggcaca aagaattgag aacttgggga tccactgagg 720
tctgaggcat ggtggtacca gaagaaataa aggggccatc agcatgaagc tggtctccca 780
ttgacagcac cctgacttct ccatcaggtt ctatcagcat gtctactgtg aggttggtga 840
cgctgtctgc aggtgggtat gcttcaatca cgccacctgg tcaggaaacc atggagtaga 900
ggaaaagaca cagtcaaggg aatgctatgc ttatagcagg aggaaatgct ctgtgtttta 960
gcaagggaac ttagactatc tcacacctgt catatcctgg gaaactttgg gtgagtagtt 1020
caacctttgg cctccttttc cttatttata gaatggaggc ataatatcta ccttgccaag 1080
cttttgtgaa gtttgagaaa ctgagtctat ggtatttagc ctggtacttg gaacatggga 1140
gggctcaatg aacagtaagt agtctttatt atgatcataa ttacaaatat tacaaatact 1200
ttataaaagc catacttaga acaactcatt acgttaataa agaatccaag gattgtggtc 1260
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggccaacga tccaggttta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acatgtctgg aggcaatgga 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgggcatgtt aacaatcggt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcttcctcct ctttgctctg t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccatcccca ggagtcttg 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
accatgacta ggggcactgt a 21

Claims (10)

1.选自下组的RNA序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂在调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能中的应用：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
2.选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂在制备调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RNA序列是SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述分化发育选自：关键转录因子Foxp3的表达；所述成熟状态选自：细胞表面淋巴细胞归巢受体CD44/CD62L的表达、抑制性受体CD25/CLTA4/GITR的表达、免疫抑制性细胞因子IL-10的产生；所述功能选自：抑制效应性T细胞的增殖和活化、负向调控免疫应答、抑制炎症、维持免疫稳态。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RNA序列或其表达产物、或其增效剂抑制调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能；所述RNA序列或其表达产物的抑制剂促进调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RNA序列或其表达产物、或其增效剂选自：包含所述序列的表达载体、所述序列的外源性表达产物、促使所述序列高表达的试剂；所述RNA序列或其表达产物的抑制剂选自：针对所述序列的RNAi、反义寡核苷酸、用于阻碍或降低所述序列表达和/或其功能的特异性抑制剂和/或分子化合物。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RNA序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂进一步用于调控机体免疫稳态、防治结肠炎等自身免疫性疾病、免疫干预方案选择和/或预后评估。
8.一种调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或功能的药物或试剂盒，其包含：
i)有效量的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列；
ii)药学或免疫学上可结合的载体或辅料。
9.一种调控调节性T细胞的分化发育、成熟状态和/或其功能的方法、或诱导前体初始状CD4+T细胞成功分化发育成调节性T细胞、或诱导产生所需成熟状态和/或功能的调节性T细胞的方法，所述方法包括使选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或增效剂接触调节性T细胞和/或其前体CD4+T细胞的步骤：
(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；
(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；
(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和
(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述接触步骤之前、之时或之后，使所述调节性T细胞和/或其前体初始状CD4+T细胞与调节性T细胞极化剂接触。
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