CN109022431B - 激活免疫反应的cpg-b型寡核苷酸及其应用 - Google Patents

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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Abstract

本发明公开了激活免疫反应的CPG‑B型寡核苷酸及其应用。本发明提供了一种CPG寡核苷酸，为如下1)或2)或3)：1)所示的CPG寡核苷酸含有TCGTCGTTTG的序列，该寡核苷酸为序列2所示的核苷酸；2)所示的CPG寡核苷酸含有TCGTCGTTTG的序列，该寡核苷酸为序列1所示的核苷酸；3)所示的CPG寡核苷酸为序列3所示的核苷酸。本发明的实验证明，本发明设计合成了Toll样受体9激动剂(CPG)CPG‑B型寡核苷酸，该寡核苷酸可以激活相应的免疫应答，并用于治疗癌症。

Description

激活免疫反应的CPG-B型寡核苷酸及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和治疗领域，具体涉及激活免疫反应的CPG-B型寡核苷酸及其应用。
背景技术
1998年，krieg等研究者发现一些富含CG(胞嘧啶，鸟嘌呤)的DNA序列具有刺激免疫反应的效应(Proc Natl Acad Sci.1998,95(21):12631-6)；后来，多个研究小组认为这些含有未甲基化CG二核苷酸的DNA序列，通常可以刺激先天免疫系统，尤其对小鼠脾脏细胞的IL-12的分泌具有明显的刺激作用。这类CPG寡核苷酸可以通过诱导Th1型的免疫应答，从而分泌相关的细胞因子，包括干扰素-r(IFN-r)、干扰素-a(IFN-a)、白介素-6(IL-6)以及白介素-12(IL-12)等，从而被用做癌症的免疫治疗剂。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种CPG寡核苷酸。
本发明提供的CPG寡核苷酸，为如下1)或2)或3)：
1)所示的CPG寡核苷酸含有TCGTCGTTTG的序列，且该寡核苷酸为序列2所示的核苷酸；
2)所示的CPG寡核苷酸含有TCGTCGTTTG的序列，且该寡核苷酸为序列1所示的核苷酸；
3)所示的CPG寡核苷酸为序列3所示的核苷酸。
上述的CPG寡核苷酸在如下1)-5)中任一所述中的应用或在制备具有如下1)-5)中任一所述功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)激活细胞或组织免疫应答；
2)激活细胞分泌IFN-r和/或IFN-a；
3)提高细胞或组织中IL-6、IL10、IL-12和/或IFN-r的表达量；
4)治疗肿瘤；
5)抑制肿瘤体积。
上述应用中，所述激活细胞或组织免疫应答通过激活细胞分泌IFN-r和/或IFN-a体现；和/或，提高细胞或组织中IL-6、IL10、IL-12和/或IFN-r的表达量体现。
上述应用中，所述治疗肿瘤通过抑制中肿瘤体积体现。
上述应用中，所述细胞为免疫细胞或体细胞；
和/或，所述细胞具体为树突状细胞或外周血单核细胞。
上述应用中，所述组织为肿瘤组织；
所述肿瘤为肺癌肿瘤。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述的CPG寡核苷酸。
上述产品具有如下1)-5)中任一功能：
1)激活细胞或组织免疫应答；
2)激活细胞分泌IFN-r和/或IFN-a；
3)提高细胞或组织中IL-6、IL10、IL-12和/或IFN-r的表达量；
4)治疗肿瘤；
5)抑制肿瘤体积。
上述产品中，
所述激活细胞或组织免疫应答通过激活细胞分泌IFN-r和/或IFN-a体现；和/或，提高细胞或组织中IL-6、IL10、IL-12和/或IFN-r的表达量体现；
或，所述治疗肿瘤通过抑制中肿瘤体积体现。
或，所述细胞为免疫细胞或体细胞；
和/或，所述细胞具体为树突状细胞或外周血单核细胞。
或，所述组织为肿瘤组织；
或，所述肿瘤为肺癌肿瘤。
上述中，所述产品为药物或试剂盒。
本发明的实验证明，本发明设计合成了Toll样受体9激动剂(CPG)CPG-B型寡核苷酸，该寡核苷酸可以激活相应的免疫应答，并用于治疗癌症。
附图说明
图1为CPG促进小鼠DC细胞IFN-r的分泌。
图2为CPG促进小鼠DC细胞内相关基因的表达。
图3为CPG激活人体外周血单核淋巴细胞(PBMC)的IFN-a，IFN-r的分泌。
图4为CPG抑制小鼠肺癌模型肿瘤的生长。
图5为CPG促进小鼠肺癌模型的肿瘤中相关基因的表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CPG序列的设计合成
本发明设计合成多核苷酸Toll样受体9激动剂(CPG)，具体序列如表1所示。
表1为CPG序列
序列名称 序列(5’-3’)
GP-CpG-2018A TCGTCGTTTGTCGTTTGACGTT(序列1)
GP-CpG-2018B TCGTCGTTTGACGTTTCGTTTG(序列2)
GP-CpG-2018C TGCTGCTTTGAGCTTTGCTTTG(序列3)
Dynavax-CpG-1018 TGACTGTGAACGTTCGAGATGA
NC TGACTGTGAACCTTAGAGATGA
CPG序列如下，全部都是单链DNA形式，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B和GP-CpG-2018C为，Dynavax-CpG-1018(以下简称为CpG-1018)为dynavax公司的cpg1018，为阳性对照，NC为阴性对照。所有CPG ODN都有苏州吉玛基因股份有限公司合成并纯化。
实施例2、CPG序列刺激小鼠树突状细胞(DC)分泌IFN-r
一、CPG刺激小鼠树突状细胞(DC)分泌IFN-r实验
1.取8-12周龄的C57BL/6雌性小鼠，取其脾脏，PBS清洗两遍，剪碎后，用DC细胞分离试剂盒(STEMCELL,货号18780)分离小鼠的DC细胞。
2.细胞计数后，取106数目的小鼠DC细胞放置在96孔板，分别加入1ug/ml的表1中的NC、GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C和Dynavax-CpG-1018，总体系为100ul的DMEM培养液，放置48小时。
3.取细胞培养液上清，800g离心1分钟，去除细胞残渣，-80度保存备用。
4.取步骤3中的样品，用abcam公司的IFN-r ELISA试剂盒检测样品中IFN-r的含量(abcam，货号ab100690)，具体按照试剂盒说明书。
结果如图1所示，可以看出，与阴性对照相比，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B作用细胞后，细胞中的IFN-r的含量远远高于对照，甚至高于阳性对照，作用最为显著的是GP-CpG-2018B；表明，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B能刺激小鼠树突状细胞(DC)分泌IFN-r。
二、CPG刺激小鼠DC细胞相关基因的表达
收取一中步骤2细胞培养液中的细胞，提取总RNA，进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用GAPDH为内参基因，通过实时定量PCR检测相关基因的表达。
用于检测的基因及引物如表2所示。
表2为检测的基因及引物
Figure BDA0001755178210000041
结果如图2，可以看出，与阴性对照相比，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B作用细胞后，细胞中的IL-6、IL-12和IFN-r的相对表达量远远高于对照，甚至高于阳性对照，作用最为显著的是GP-CpG-2018B；表明，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B能提高小鼠树突状细胞(DC)中IL-6、IL-12和IFN-r的相对表达量。
实施例3、CPG刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌IFN-r和IFN-a
取新鲜人外周血(样品均来自苏州大学附属第二医院甲乳外科)，与生理盐水1:1混匀后，取2ml样品，小心加于2ml细胞分离液面上：以400g，离心20min。
1.用Solarbio公司的PBMC分离试剂盒(货号P8610)分离PBMC，加入试剂盒中缓冲液后，离心管中由上至下细胞分为四层，分别血浆层、淋巴细胞层、透明分离液层、红细胞层。
2.收集第二层的淋巴细胞层，放入生理盐水，充分混匀，400g，离心20min。重复上述步骤一次。即得所需淋巴细胞
3.用DMEM培养基重悬，计数，用于后续实验。
4.将步骤4中的PBMC细胞按照2X106放置在96孔板中，加入1ug/ml的CPG及对照序列，培养48小时，收集细胞上清，用abcam公司的IFN-r ELISA试剂盒(货号ab46025)及IFN-aELISA试剂盒(货号ab213479)分别检测IFN-r和IFN-a的含量。
结果如图3所示，可以看出，与阴性对照相比，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B和GP-CpG-2018C作用细胞后，细胞中的IFN-r和IFN-a的含量远远高于对照，甚至GP-CpG-2018B高于阳性对照，作用最为显著；表明，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B和GP-CpG-2018C能刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌IFN-r和IFN-a。
实施例4、CPG抑制小鼠肺肿瘤
一、CPG抑制小鼠肺肿瘤模型的生长
1.LEWIS(LLC细胞)肺癌细胞(LLC细胞，中科院细胞库，货号：TCM7)在DMEM培养皿中培养至90％融合时，常规胰酶消化1分钟，PBS洗2次，制成单细胞悬液。
2.1000rpm离心3min，吸弃上清，加入无FBS的完全培养基。血球计数板计数，将细胞稀释至5×106细胞/ml。
3.用一次性注射器将lewis细胞悬液注入实验C57BL/6(5-6周龄雌性)，腋窝皮下，每只裸鼠皮下接种106个细胞，每只动物皮下注射0.2ml。
4.接种后第7天开始即可见到明显肿块，至瘤体体积接近100mm3时，肿瘤原位多点分别注射表1中的NC、GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C和Dynavax-CpG-1018，每种用量为1.5OD/只/次，一周两次，持续3周。
5.成瘤后每2-3天用游标卡尺测量瘤体最大长径(a)和最短径(b)，瘤体体积计算公示为a2*b/2。给药三周后处死所有动物，将瘤体按编号摆好，游标卡尺测量肿瘤瘤体长径及横径，称重、记录并拍各组成瘤组织图片。
实验结果如图4，可以看出，与阴性对照相比，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C能够显著抑制肿瘤体积，表明，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C可以抗肿瘤。
二、CPG促进小鼠肺癌模型中肿瘤内相关基因表达
收取上述一中步骤5里的肿瘤块，提取总RNA，进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用GAPDH为内参基因，通过实时定量PCR检测相关基因的表达。用于检测的基因及引物如实施例2的表2。
结果如图5，可以看出，与阴性对照相比，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C作用肿瘤后，肿瘤中的IL-10、IL-12和IFN-r的相对表达量远远高于阴性对照；表明，GP-CpG-2018A、GP-CpG-2018B、GP-CpG-2018C能提高肿瘤中IL-10、IL-12和IFN-r的相对表达量。
序列表
<110>苏州吉玛基因股份有限公司
<120> 激活免疫反应的CPG-B型寡核苷酸及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtcgtttg tcgtttgacg tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
tcgtcgtttg acgtttcgtt tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctgctttg agctttgctt tg 22

Claims (6)

1.一种CPG 寡核苷酸，为序列2所示的核苷酸。
2.权利要求1所述的CPG 寡核苷酸在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述治疗肿瘤通过抑制肿瘤体积体现。
4.根据权利要求2-3中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺癌肿瘤。
5.一种治疗肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1所述的CPG 寡核苷酸。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述产品为药物或试剂盒。
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