KR20070058255A

KR20070058255A - 골수 간엽줄기세포를 포함하는 악성 뇌교종 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20070058255A
Application number: KR1020050117261A
Authority: KR
Inventors: 강석구; 전신수
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2005-12-03
Filing date: 2005-12-03
Publication date: 2007-06-08
Also published as: KR100770669B1

Abstract

본 발명은 암(악성 뇌교종) 치료를 위한 골수 간엽줄기세포이 이용에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 골수 간엽줄기세포를 포함하는 악성 뇌교종 치료용 조성물 및 골수 간엽줄기세포의 면역효과세포로의 분화 및 활성화 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 다양한 사이토카인으로 활성화된 MSCs는 뇌교종 세포주에 대한 강력한 세포독성을 나타내므로 본 발명의 조성물은 악성 뇌교종에 걸린 성인 및 아동에서 효과적인 입양(adoptive) 세포 전달의 소스로서 사용될 수 있을 것이다.

Description

골수 간엽줄기세포를 포함하는 악성 뇌교종 치료용 조성물{Composition for treating malignant glioma comprising marrow stromal cells}

도 1 본 발명의 효과 세포와 배양한지 5일 후 생존 표적세포의 GFP 밀도를 분석하고 비교한 결과를 도시한 것이다.

도 2는 72h 후 다양한 사이토카인으로 활성화되거나 되지않은 후 rMSCs에서 다양한 면역 효과세포 (CD3, CD4, CD8, 및 CD161a)의 빈도를 유동 세포측정법으로 결정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 사이토카인 활성화되거나 되지않은 rMSC로부터의 배양 상층액을 시각 생존세포 측정법과 ELISA법에 의해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs에 의한 표적세포의 DNA 단편화 실험결과를 도시한 사진이다.

도 5는 IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs와 비활성화된 rMSCs를 perforin, γ-INF 및 FasL 유전자에 대해 RT-PCR 분석한 결과를 보여주는 사진이다.

악성 뇌교종(gliomas)은 성인보다는 아동에 덜 빈번하지만, 동일한 나쁜 예후(poor prognosis)를 공유한다 [Kalifa C et al., (1999) Childs Nerv Syst 15:498-505; Huncharek M et al, (1999) Anticancer Res 19:3569-3574]. 외과 절제술 [Heideman RL et al., (1997) Cancer 80:497-504; Wisoff JH et al, (1998) J Neurosurg 89:52-59] 및 방사선요법 [Johnson JH Jr, Phillips PC (1996) Cancer Investig 14:609-621; Barker FG II et al., (1996) J Neurosurg 84:442.448]은 아동의 예후에 관련된다고 믿어진다. 보강 화학요법의 첨가는 이들 환자의 중간(median) 생존 기간의 약간의 개선을 제공한다 [Kalifa C et al., (1999) Childs Nerv Syst 15:498-505; Wolff JE et al., (2002) Cancer 94:264-271]. 이들 공격적 치료법에도 불구하고, 이들 종양의 결과에는 미약한 개선만을 가져온다. 따라서, 이들 질병의 새로운 치료법이 절실히 요구된다.

악성 뇌교종을 위해 현재 연구되고 있는 새로운 치료법들중에, 세포 면역요법이 높은 종양-특이적 세포독성(cytotoxicity)의 능력을 제공하기 때문에 매우 매력적이다 [Parney IF et al., (2000) Neurosurgery 46:778-791; discussion 791-772; Soling A, Rainov NG (2001) Mol Med 7:659-667]. 림포카인 활성화된 킬러 (LAK) 및 세포독성 T 임파구(CTL)의 입양(adoptive) 전달이 악성 뇌교종 [Hayes RL et al., (1995) Cancer 76:840-852; Kang SG et al., (2004) Childs Nerv Syst 20:154-162] 뿐만 아니라 다른 기관의 암들 [Rosenberg SA et al., (1987) N Engl J Med 316:889-897; Takayama T et al., (2000) Lancet 356:802-807]의 치료를 위한 비교적 유명한 방법으로 개발되었다. 최근에, 사이토카인-유도된 킬러(CIK) 세포가 다양한 암들에 대한 입양 세포 전달로서 사용되었다 [Shi M et al., (2004) World J Gastroenterol 10:1146-1151; Linn YC et al., (2002) Br J Haematol 116:78-86]. 20여년에 걸처, 입양 세포 면역요법으로 암을 치료하기 위한 시도들이 행하여졌다. 인간 암에 대한 이 치료법의 성공적 적용에 대한 주요 도전은 LAK, CTL 및 CIK 세포와 같은 적당한 효과 세포의 동정 및 확장이었다. 그러나, 아직까지 입양 전달 세포의 치료적 유효성은 그들 세포를 많은 수로 생성하는 곤란성에 의해 방해받아 왔다 [Morse MA et al., (2002) Expert Opin Biol Ther 2:237-247; Carlens S et al., (2001) Hum Immunol 62:1092-1098]. 또한, 이들 세포의 다른 제한은 그들이 장기간(long-lived) 면역을 이끌지 못한다는 것이다 [Abbas AK et al., (2000) Cellular and molecular immunology, 4th edn. Saunders, Philadelphia].

줄기세포(SCs)가 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있다는 것을 잘 밝혀진 사실이다 [Weissman IL (2000) Science 287:1442-446; Fuchs E, Segre JA (2000) Cell 100:143-155]. 골수(Bone marrow)는 2가지 원형(prototypical) SC 집단을 함유한다: 순환계를 연속적으로 재증식시키는 조혈모세포(hematopoietic cells), 및 일반적으로 중간엽(mesenchymal) 유도체들로만 발생되는 중배엽(mesodermal) 요소 인 간엽줄기세포(stromal cells) [Friedenstein AJ (1976) Int Rev Cytol 47:327-359; Short B et al., (2003) Arch Med Res 34:565-571]. 골수의 기질 구획내에 있는 중배엽 줄기세포, 소위 골수 간엽세포(marrow stromal cells; MSCs)가 처음 동정되었고 [Friedenstein AJ et al., (1966) J Embryol Exp Morphol 16:381-390], 그들은 뼈, 지방, 연골 및 근육을 포함하는 결합조직 계의 세포로 분화하는 능력을 가진다 [Barry FP (2003) C Embryo Today 69:250-256; Short B et al., (2003) Arch Med Res 34:565-571; Majumdar MK et al., (1998) J Cell Physiol 176:57-66]. 또한, 그들은 골수에서 조혈모 줄기세포를 위한 기질지지 시스템을 제공하는 역할도 한다 [Barry FP (2003) C Embryo Today 69:250-256]. 여러 최근 보고들은 특정 실험조건에서 MSCs가 그들의 정상적 레퍼토리가 아닌 세포인 심근세포 [Orlic D et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98:10344-10349; Makino S et al., (1999) J Clin Invest 103:697-705], 간세포 [Petersen BE et al., (1999) Science 284:1168-1170], 글리아(glia) 및 뉴론 [Woodbury D et al., (2002) J Neurosci Res 69:908-917; Azizi SA et al., (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95:3908-3913]으로도 분화될 수 있다는 것을 증명하였다. 이들 현상은 형성성(plasticity) [Brazelton TR et al., (2000) Science 290:1775-1779; Krause DS et al., (2001) Cell 105:369-377], 비정통(unorthodox) 분화 [Bianco P, Cossu G (1999) Exp Cell Res 251:257-263] 또는 트랜스분화(transdifferentiation) [Anderson DJ et al., (2001) Nat Med 7:393-395; Lagasse E et al., (2000) Nat Med 6:1229-1234]라고 일컬어 진다.

따라서, 본 발명자들은 MSCs의 형성성을 이용하여 MSCs를 면역 효과세포로 분화시킬 수 있다고 가정하였다. 만약 이것이 가능하다면, 상기 MSCs는 입양 세포 면역요법의 새로운 세포 소스로 사용될 수 있다. 지금까지, 악성 뇌교종 세포에 대한 세포독성을 유도하기 위해 MSCs를 면역 효과세포 (활성화된 MSCs)로 분화시키려는 시도는 보고되지 않았다. 본 발명이 처음으로 9L 쥐 뇌교종 세포주에 대한 쥐 골수 간엽세포(rMSCs) 및 활성화된 rMSCs의 시험관내 세포독성을 측정하였다. 더욱이, 본 발명자들은 rMSCs 및 활성화된 rMSCs의 세포 표현형과 분비된 단백질을 측정하였으며, 이 세포독성에 아팝토시스가 관련되어 있는지와 어느 유전자가 관련되는지를 조사하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 새로운 입양 세포 면역 요법의 소스로서 악성 뇌교종 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골수 간엽줄기세포의 면역효과세포로의 분화방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 골수 간엽줄기세포(MSC)를 유효성분으로 포함하는 악성 뇌교종(glioma) 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 골수 간엽줄기세포는 인터루킨-2 (IL-2) 단독, 인터루킨-15 (IL-15) 단독, IL-2 및 IL-15 조합, 과립구 대식세포-콜로니 자극인자 (GM-CSF) 단독, 또는 GM-CSF 및 IL-2 조합으로 활성화된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 활성화된 골수 간엽줄기세포는 활성화되기 전보다 퍼포린(perforin), γ-INF 및 FasL를 더 많이 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 악성 뇌교종의 치료는 아팝토시스(apoptosis)의 유발에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 골수 간엽줄기세포를 시험관내(in vitro)에서 인터루킨-2 (IL-2) 단독, 인터루킨-15 (IL-15) 단독, IL-2 및 IL-15 조합, 과립구 대식세포-콜로니 자극인자 (GM-CSF) 단독, 또는 GM-CSF 및 IL-2 조합으로 처리하는 것을 특징으로 하는 면역효과세포로의 분화방법을 제공한다.

본 발명의 분화방법에 있어서, 바람직하게는 상기 면역효과세포는 처리되기 전보다 CD8, CD161a, IL-4, 또는 γ-INF을 더 많이 발현하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

골수 간엽줄기세포(Marrow stromal cells; MSCs)는 정통적 및 비정통적 형성성(plasticity)의 능력을 가지고 있다고 보여졌다. 본 발명에서, 쥐로부터의 MSCs의 시험관내 세포독성을 밝히고 또한 MSCs의 면역 효과(effector) 세포로 분화시키려고 시도하였다. 이를 위하여, 쥐 MSCs (rMSCs)를 표준 방법으로 분리하고 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-15 (IL-15), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF) 및 그 조합으로 활성화하여 효과 세포로 만들었다. 표적세포(9L 쥐 뇌교종 세포주)에 대한 rMSCs 및 활성화된 rMSCs의 세포독성을 시각 생존세포 측정법으로 측정하 였다. 이들 다양한 활성화된 세포의 표현형을 유동 세포측정법으로 결정하였다. 효과 세포로부터 분비된 단백질들을 ELISA법으로 측정하였다. 면역응답 관련 유전자들의 발현을 측정하였다. 그 결과, 다양한 사이토카인 조합으로 활성화된 rMSCs의 현저한 세포독성이 있었다. rMSCs의 다양한 사이토카인 활성화후에, 면역효과세포 (CD8, CD161a)의 집단과 면역반응-관련 단백질 (IL-4, γ-INF)이 증가하였다. 아팝토시스가 활성화된 rMSCs에 의한 표적세포의 용해 메카니즘의 하나일 것이다. 그에 기여하는 유전자는 γ-INF, FasL 및 perforin일 수 있다. 결론적으로 본 발명은 rMSC가 악성 뇌종양에 걸린 환자의 입양(adoptive) 전달 요법으로 사용될 수 있다는 것을 제시한다.

본 발명은 활성화된 rMSCs가 악성 뇌교종 세포에 대해 효과적인 세포독성을 보인다는 것을 제시한다. 또한, 활성화된 rMSCs는 더한 면역 효과세포를 가지고, 더한 면역 단백질을 분비하며, 표적세포(9L 쥐 뇌교종 세포)의 아팝토시스를 유발하고, 아팝토시스와 면역반응과 관련된 더한 유전자들을 발현한다.

본 발명자들은 다양한 사이토카인을 사용하여 rMSCs가 면역 효과세포로 분화하도록 시도하였다. 이를 위하여, rMSCs를 IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합으로 활성화시켰다. rMSCs 단독의 세포독성은 기대할 수 없었다. 그러나, 본 발명자들은 악성 뇌교종 세포에 대한 rMSCs 단독의 세포독성 능력을 발견할 수 있었다 (도 1b). 이 결과는 MSCs에서 배출된 용해성 인자들에 의해 폐암 세포의 성장이 억제된다는 종래 연구 결과와 상응한다 [Hombauer H, Minguell JJ (2000)Br J Cancer 82:1290-1296; Maestroni GJ et al., (1999) Cell Mol Life Sci 55:663-667]. 이들 발견은 MSCs가 임파구 번식과 T 세포 응답을 저해한다는 다른 저자의 연구결과들과 대조된다 [Bartholomew A et al., (2002) Exp Hematol 30:42-48; Kim DW et al., (2004) Blood 103:1941-1948]. 더욱이, MSCs는 다른 세포들의 증식을 매개하는 다양한 사이토카인과 면역 조절 매개인자를 구조적으로(constitutively) 생산한다 [El-Badri NS et al., (2004) Stem Cells Dev 13:463-472].

종래에는 대부분 신경(neural) 줄기세포가 생체내(in vivo)에서 뇌교종 세포를 살포하기 위한 [Aboody KS et al., (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:12846-12851] 강력한 향성(tropism)에서 유래된 IL-12 [Ehtesham M et al., (2002) Cancer Res 62:5657-5663] 또는 종양괴사인자 [Ehtesham M et al., (2002) Cancer Res 62:7170-7174]의 효과적인 전달 비히클로 사용되었다. MSCs는 또한 다른 암들에 대한 IL-2 [Stagg J et al., (2004) Hum Gene Ther 15:597-608] 및 β-interferon [Studeny M et al., (2002) Cancer Res 62:3603-3608]의 전달 비히클로도 사용이 시도되어왔다. 최근에, MSCs는 또한 유전자 비히클로서 뇌교종에 적용되었다 [Nakamura K et al., (2004) Gene Ther 11:1155-1164]. 또한, 골수에서 유래된 SCs가 뇌혈관장벽(bbb)을 통과하여 이동하고 생체내에서 마이크로글리아(microglia)로 트랜스분화(transdifferentiate)하는 능력을 가진다고 밝혀졌다 [Simard AR, Rivest S (2004) FASEB J 18:998-1000]. 본 발명자들은 rMSCs를 유전자 전달용 비히클이 아니라 면역 효과세포로 지향(directing)하기 위해 최초로 적용을 시도하였다. 활성화된 rMSCs 및 활성화된 rMSCs로부터의 배양 상층액의 효과 적인 세포독성을 본 실험에서 증명하였다.

인터루킨들은 증폭 또는 억제에 필요한 신호를 제공함으로써 면역반을을 지휘한다. 지난 10년에 걸쳐, IL-2가 종양세포를 사멸하기 위해 면역 시스템을 부스팅하기 위해 널리 사용되었으며, 말초혈 단핵세포를 고 투여량의 IL-2와 세포외(ex vivo)로 배양하면 이질적 그룹의 비제한 킬러 세포(LAK 세포)들의 출현을 초래할 수 있는데, 상기 세포는 악성 뇌교종 세포를 포함한 다양한 종양세포 표적을 사멸할 수 있다 [Bhagwati SN (1989) Childs Nerv Syst 5:38-40; Naganuma H et al., (1997) Brain Tumor Pathol 14:71-74]. IL-15는 활성화된 T 세포의 증식을 유도하고 자연 킬러 (NK) 세포의 세포독성 기능을 향상시키는 다면성(pleiotropic) 사이토카인이다 [Yamaguchi T et al., (1998) Cancer Immunol Immunother 47:97-103]. GM-CSF는 조혈인자이고 염증성 사이토카인이다 [Franzen R et al., (2004) Neurosci Lett 361:76-78]. 그것은 미엘로이드 전구세포, 뉴트로필 전구세포, 단핵세포, 대식세포 및 호산구의 증식과 성숙을 자극한다. IL-2와 조합하여 GM-CSF를 주입하면 뇌내 뇌교종을 갖는 쥐의 생존율을 증가시킬 수 있다 [Jean WC et al., (2004) J Neuro-oncol 66:39-49]. 따라서, 본 발명자들은 rMSCs를 면역 효과세포로 활성화 또는 분화시킬 수 있는 사이토카인으로서 IL-2, IL-15 및 GM-CSF를 선택하였다.

MSCs는 신경 성장인자(NGF)를 포함하는 여러 신경영양(neurotrophic) 인자들을 생산하는데 [Li Y et al., (2002) Neurology 59:514-523], 상기 NGF는 시험관내에서 C6 뇌교종 세포의 분화 및 성장 저해를 유도할 수 있다 [Kimura S et al., (2002) J Neuro-oncol 59:199-205]. 9L 뇌교종 모델에서, MSCs에 의해 생산된 NGF는 메카니즘으로서 분화 및 성장 억제의 유도에 기여할 수 있다 [Nakamura K et al., (2004) Gene Ther 11:1155-1164]. 그러나, 본 발명자들은 rMSCs의 또 다른 세포독성 메카니즘을 제안할 수 있다. 다양한 사이토카인 활성화후에, 면역표현형이 세포독성 T 세포(CD8) 및 자연 킬러 세포(CD161a)와 같은 면역 효과 세포쪽으로 더 변화될 수 있다 (도 2c, d). 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포의 마커의 일종인 IL-4 및 γ-INF의 분비 증가가 본 실험에서 보여졌다 (도 3b, c). 이는 활성화된 rMSCs가 면역반응에 관련된 단백질들을 생산하고 분비할 수 있다는 것을 보여준다.

표적세포는 적어도 2가지 메카니즘에 의해 사멸된다: 아팝토시스(apoptosis) 및 네크로시스(necrosis) [Abbas AK et al., (2000) Cellular and molecular immunology, 4th edn. Saunders, Philadelphia]. 표적 세포의 아팝토시스는 Fas/FasL 상호작용 또는 그랜자임(granzymes)을 포함하는 다수의 메카니즘에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 결과들은 사이토카인으로 활성화되거나 활성화되지 않은 rMSCs에 의한 9L 뇌교종 세포주의 사멸을 책임지는 가능한 메카니즘을 보여준다. 또한, 이들 결과는 활성화된 rMSCs와 공배양된후 표적 세포의 사멸이 아팝토시스와 관련된다는 것을 제시한다 (도 4). 그에 기여하는 유전자들은 아팝토시스 신호 경로에 관련된 perforin 및 FasL과 면역 효과 세포의 강력한 자극인자인 γ-INF이다 (도 5).

본 발명의 조성물은 통상의 세포요법(cell therapy)에 사용되는 주사제 또는 액제의 형태로 제조될 수 있으며, 필요에 따라 통상의 사이토카인을 더 포함할 수 있으며, 정맥내 투여하거나 외과수술로 환부에 직접 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우 1-1000 mg/1회 이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 쥐 골수 간엽줄기세포의 분리 및 배양(Rat marrow stromal cells isolation and culture)

150-200g의 웅성 Sprague.Dawley 쥐를 희생한 후, 대퇴골과 티비아스(tibias)로부터 멸균 피하 주사기를 사용하여 2% 소태아혈청(FBS; Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)이 보충된 Hanks’ 평형염액으로 된 15 ml 버퍼로 줄기(shaft)를 플러싱하여 rMSCs를 수집하였다. 세포를 버퍼로 50 ml까지 희석하고 1,000×g로 30분간 밀도구배(Ficoll-Paque-Plus; 1.077 g/ml; Pharmacia)로 원심분리하였다. 단핵세포를 수집하고, 저 글루코스 Dulbecco’s 변형이글배지(DMEM; Gibco, Rockville, MD, USA), 20% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민으로 구성된 배양 배지에 현탁하고, 2×10⁶ cells/10 cm²의 농도로 파종하였다. 배양은 5% CO²를 함유하는 습한 분위기에서 37℃로 유지시켰다. 본 실험에 상용된 rMSCs 는 시험관내(in vitro)에서 3회 계대배 양시켰다.

실시예 2: 세포주 배양(Cell line cultures)

9L 쥐 뇌교종(glioma) 세포주를 American Type Culture Collection로부터 얻고, 모든 실험은 원래 스탁으로부터 <15 계대배양의 세포를 사용하여 수행하였다. 9L 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 이들 세포주는 단층배양으로 성장시켰다.

실시예 3: 녹색 형광 단백질 안정한 세포주(target cells)의 확립(Establishment of green fluorescence protein stable cell lines)

녹색 형광 단백질 (GFP) 안정한 세포주를 종래 기술된 방법 [Kang SG et al., (2004) Childs Nerv Syst 20:154-162]에 따라 제조하였다. 상기 9L 세포를 10% 소태아혈청을 함유하는 DMEM에서 배양하고, 리포펙션(lipofection) 기술을 이용하여 pEGFPN1 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환한지 48 시간후에, 세포를 10:1 비율로 분할하고, 400 μg/ml 네오마이신 유사체-G418 (Gibco, Rockville, MD, USA)의 존재하에 배양하였다. 선택배지에서 21일 후, 각각의 G418-내성 콜로니들을 분리하였다. 다음, GFP를 항상 발현하는 안정한 9L 세포주가 확립되었다. 따라서, 만약 표적 세포 (9L) 가 살아있다면, 그들은 항상 녹색 형광을 발현할 것이다. 본 실험에서는 살아있는 표적 세포를 형광현미경으로 직접 관찰할 수 있었다.

실시예 4: 사이토카인에 의한 rMSC의 활성화(Activation of rMSC with cytokines (effector cells))

상기 rMSCs를 인터루킨-2 (IL-2, R&D Systems, Minneapolis, MN 55413, USA), 인터루킨-15(IL-15, R&D Systems) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF, LGPhD) 단독 또는 다양한 조합으로 시험관내(in vitro)에서 활성화시켰다. 세포 (3×10⁵)를 20% FBS 및 다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)이 보충된 7 ml의 DMEM을 함유하는 100-mm 배양 접시에서 72 h동안 37℃에서 배양하였다. 활성화 사이토카인의 농도는 다음과 같다: IL-2, 50 ng/ml; IL-15, 20 ng/ml; GM-CSF/Sargramo-stim, 40 ng/ml. 대조군 배양 접시는 사이토카인이 없는 배지에 세포를 함유하였다. 상기 활성화 기간후에 세포를 Fisherbrand Cell-Scrapers를 이용하여 수확하고, DMEM로 2회 세척하고, Careside H-2000 (Culver, CA, USA) 전자 세포계수기를 이용하여 계수하였다. 다음 상기 세포를 이용하여 유동 세포측정법(flow cytometry)에 의해 면역표현형을 위해 염색된 세포독성(cytotoxicity) 측정(visual survival cell assay)을 실시하였다. 또한, 다양한 사이토카인으로 활성화된 rMSC에서 IL-4 및 γ-인터페론 (γ-INF)의 농도를 종래 기술된 ELISA 법 [Kumagai N et al., (2000) Investig Ophthalmol Vis Sci 41:1448-1453]에 의해 결정하였다.

실시예 5: 활성화 rMSCs의 세포독성의 시각 생존세포 측정(Visual survival cell assay for the cytotoxicity of activated rMSCs)

다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)으로 활성화된 rMSCs와 활성화없는 rMSCs의 동일한 개수를 GFP를 발현하는 안정한 표적 세포(9L)에 대한 세포독성 능력에 대해 시험하였 다. 효과(effector) 세포 및 GFP 안정한 세포를 혼합하여 24-well 플레이트에서 1.5 ml의 DMEM 배지/well중 0:1, 10:1, 50:1 및 100:1의 효과/표적 비율을 얻었다. GFP 안정한 9L의 표적세포 수는 1×10³/ml이었다. 상기 플레이트를 5일간 37℃에서 배양하였다. 상기 표적 세포의 GFP 밀도를 다음 공초점 현미경(Bio-Rad MRC1024) 및 컴퓨터 이미지 분석 시스템(Quantity One, Bio-Rad v 4.2)을 사용하여 결정하였다. 다음, 표적 세포의 GFP 밀도를 5일후 측정하였다. 만약 효과 세포와의 공배양 기간후에 표적세포의 GFP 밀도가 높다면 다수의 표적 세포가 살아있는 것이다. 만약 표적세포의 GFP 밀도가 낮다면, 효과 세포가 다수의 표적세포를 사멸한 것이다.

실시예 6: 유동 세포측정 분석(Flow cytometric analysis (immunophenotype))

다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)으로 활성화되거나 활성화되지 않은 rMSCs (3×10⁵)를 72 h동안 배양하였다. 72 h후에, 세포를 수확하고 빙냉된 PBS로 세척하였다. 다음, 상기 세포를 FITC 항-CD3 (BD Biosciences), FITC 항-CD4 (Serotec), PE 항-CD161a (BD Biosciences) 및 PE 항-CD8 (Serotec)로 인큐베이팅하였다. 세포 형광도를 FACSCalibur 유동 세포측정기 (BD Biosciences)로 측정하고, 데이터를 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 동일한 결과를 3번의 독립된 실험으로 얻었다.

실시예 7: 세포독성과 ELISA를 위한 시각 생존세포 측정에 의한 배양 상층액 분석(Culture supernatant analysis by visual survival cell assay for the cytotoxicity and ELISA)

다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)으로 활성화되거나 활성화되지 않은 rMSCs (3×10⁵)를 72 h동안 배양하였다. 다음, 배양 상층액을 얻어서, 표적 세포 (GFP 안정한 쥐 뇌교종 9L 세포주)의 배양접시 첨가하였다. 5일 후, 상기와 같이 각 배양 상층액의 세포독성에 대한 시각 생존세포 측정을 실시하였다. 또한, ELISA 측정 키트 (R&D Systems)를 이용하여 세포로부터 분비된 IL-4 및 γ-INF 단백질 농도를 정량하였다. 96-well 플레이트를 항인간 IL-4 및 γ-INF 단클론 항체로 코팅하였다. 제조사의 프로토콜에 따랐으며, 각 well의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (MR5000; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA)로 450 nm 파장에서 결정하였다. 케모카인 단백질의 농도를 표준곡선에 기초하여 계산하였다.

실시예 8: DNA 단편화 측정(DNA fragmentation assay)

상기 표적 세포 (GFP 안정한 쥐 뇌교종 9L 세포주) 및 효과 세포 (다양한 자극인자로 활성화되거나 활성화되지 않은)를 혼합하고 (효과/표적 비율 50:1), 5일간 배양하였다. 5일 후, 세포를 수확하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 0.1 ml의 용해 버퍼 (10 mM Tris.HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 및 0.2% Triton X-100)에 재현탁하고, 볼텍싱하고, 빙상에서 20분간 인큐베이팅하였다. 10분간 12,000 rpm에서 원심분리한 후, 0.1 부피의 5.0 M NaCl 및 0.5 부피의 이소프로필 알콜의 첨가에 의해 상층액으로부터 DNA를 침전시켰다. -20℃에서 보관한 후, 상기 샘플을 10분간 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 결과의 펠렛을 프로테인아제 K (300 μg/ml) 및 Rnase A (100 μg/ml)를 함유하는 50 μl의 Tris/EDTA 버퍼에 재현탁하고, 30 분간 50℃에서 인큐베이팅하였다. 상기 샘플을 다음 0.5×Tris borate/EDTA 버퍼에서 1.5% 아가로스 젤을 통해 전기영동하였다.

실시예 9: 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석(RT-PCR analysis for the gene expression)

다양한 사이토카인 (IL-2 및 IL-15 조합 및 GM-CSF 단독)으로 활성화된 rMSCs에서 Fas 리간드 (FasL), 퍼포린(perforin) 및 γ-INF 유전자의 발현 레벨을 결정하기 위하여 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 기술을 사용하였다. 활성화는 상기와 같이 실시하였다. 상기 활성화된 rMSCs로부터 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)에서 얻은 TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 분리하였다. 1mg의 RNA을 DMSO (1% 최종농도)의 첨가를 제외하고 표준 절차에 따라 150 ng의 올리고 dT 프라이머를 사용하여 역전사하고, 42℃에서 30 s간 인큐베이팅하고, 샘플을 95℃에서 5분간 가열하여 역전사를 종료하였다. 다음 20 pmol의 각 프라이머(FasL를 위해, 5'-AGG GGC AGG TTG TTG CCA GA-3' 및 5'-CAC CCC AGT CCA CCC CCT GA-3', perforin을 위해, 5'-GTT GCA TCT CAC CCT CAT GGG ACC AGA CTT-3' 및 5'-TAA GCC CAC CAG CAATGT GCA TGT GTC TGT-3' 및 γ-INF를 위해, 5'-TCC AAC GCA AAG CAA TAC ATG-3' 및 5'-CGC TTC CCT GTT TTA GCT GC-3'), 2.5 mM MgCl2, 200 μM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (DNTPs) 및 5% DMSO를 포함하는 50-μl 반응 혼합물에서 10 μl의 cDNA에 대해 PCR을 수행하였다. FasL, perforin 및 γ-INF을 위해 사용된 온도조건 을 다음과 같다: PCR 증폭을 94℃에서 30 s간 변성, 56℃에서 30 s간 어닐링 및 72℃에서 30 s간 연장의 30 사이클로 수행하였다. 상기 PCR 산물을 에티디움 브로마이드-염색된 2% 아가로스 젤상에서 전기영동에 의해 가시화하였다. 대조군으로서, β-투블린(tubulin) 유전자 발현을 동일한 절차 및 그 적당한 프라이머, 5'-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACC TA-3' 및 5'-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA AT-3'를 사용하여 측정하였다. 모든 프라이머 세트는 RNA 분비에서 DNA 오염으로부터의 어떤 잠재적 신호도 제거하도록 고안하였다. FasL, perforin, 및 γ-INF 유전자의 발현레벨을 동일한 방법으로 비활성화된 rMSCs에서 측정하였다.

실험결과 1: GFP 안정한 쥐 뇌교종 9L 세포주에 대한 활성화된 rMSCs의 세포독성

표적세포 (GFP 안정한 쥐 뇌교종 9L 세포주)에 대한 효과 세포(활성화된 rMSCs)의 시험관내 세포독성을 시각 생존세포 측정법을 사용하여 분석하였다. 생존 표적세포는 녹색 형광을 발현할 수 있으므로 본 실험은 생존 표적세포의 GFP 밀도를 측정할 수 있다 (도 1a). 5일 후, 표적세포의 GFP 밀도는 효과 세포와 혼합이 없는 경우 78.0±13.7 (SD)로 측정되었고, rMSCs와 혼합된 경우 10:1, 50:1 및 100:1의 E/T 비율에서 72.7±5.1, 54.0 ±7.0 및 42.0±5.6로 측정되었다. 이는 활성화가 없는 rMSCs도 또한 50:1 및 100:1의 E/T 비율에서 표적세포에 대한 세포독성을 보일 수 있다는 것을 보여준다 (p<0.05) (도 1b). 다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)에 의해 활성화된 rMSC와 함께 배양한 후 생존 표적세포의 밀도는 10:1, 50:1 및 100:1의 E/T 비율에서 rMSCs 단독으로 배양한 후의 것보다 현저히 낮아졌다 (p<0.05) (도 1c). 이는 활성화된 MSCs가 활성화되지 않은 rMSCs보다 표적세포에 대해 더 강한 세포독성을 가진다는 것을 보여준다.

도 1 본 발명의 효과 세포와 배양한지 5일 후 생존 표적세포의 GFP 밀도를 분석하고 비교한 결과를 도시한 것이다. 도 1a에서, 활성화되거나 되지않은 rMSCs와 공배양후에 GFP를 발현하는 시험관내 생존 세포를 형광 현미경으로 결정할 수 있다. 효과 세포의 비율이 증가할 수록 모든 그룹에서 생존세포의 수가 감수하였다. 활성화없는 rMSC와 비교하여, 사이토카인 활성화된 rMSCs는 더 많은 표적세포를 사멸시켰다. 배율 ×200. 도 1b에서, rMSCs 단독으로 공배양된 표적세포의 GFP 밀도는 표적세포만의 것보다 더 낮았으며, 이는 rMSCs 단독도 또한 표적세포를 사멸시킬 수 있음을 가리킨다. 상부 4개의 사각박스는 생존하는 녹색 형광 표적세포를 나타낸다. 도 1c의 그래프는 활성화없는 rMSCs와 활성화된 rMSCs사이의 세포독성을 비교한 것이다. 5일 후 모든 E/T 비율에서 활성화된 rMSCs와 배양후 생존 표적세포의 밀도가 rMSCs 단독과 배양후의 것보다 현저히 낮았다 (p<0.05). 이들 결과는 5일 후 쥐 뇌교종 세포주(9L)에 대한 다양한 사이토카인으로 활성화된 rMSCs의 세포독성이 더 큼을 증명한다. 바(Bars)는 SE를 의미한다. *p<0.05

실험결과 2: 활성화된 rMSCs의 면역표현형(Immunophenotypes)

효과 세포의 면역표현형의 변화를 결정하기 위하여, 유동 세포측정을 실시하였다. 이들 분석 결과는 도 2a (CD3.common T cell marker), 도 2b (CD4.helper T cell marker), 도 2c (CD8.cytotoxic T cell marker) 및 도 2d [CD161a. natural killer (NK) cell marker]에 보여진다. 다양한 사이토카인 (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)의 활성화후에 CD3⁺ 세포의 세포집단의 유의한 증가는 없었다 (도 2a). IL-15로 활성화된 rMSCs에서 활성화되지 않은 rMSC에 비해 CD4⁺ 세포가 현저히 증가하였다 (p<0.05) (도 2b). 모든 활성화된 rMSCs에서 활성화되지 않은 rMSCs에 비해 세포독성 T 세포의 마커인 CD8⁺의 발현이 현저히 더 높았다 (p<0.05) (도 2c). IL-2 단독 또는 IL-2 및 IL-15 조합 또는 GM-CSF 단독으로 활성화된 rMSCs에서 활성화되지 않은 rMSCs에 비해 쥐 NK 세포의 마커인 CD161a 발현이 현저히 더 높았다 (p<0.05) (도 2d).

도 2는 72h 후 다양한 사이토카인으로 활성화되거나 되지않은 후 rMSCs에서 다양한 면역 효과세포 (CD3, CD4, CD8, 및 CD161a)의 빈도를 유동 세포측정법으로 결정한 결과를 나타낸 그래프이다. % 양성 세포의 값은 5개의 서로다른 샘플들로부터 유래된 중간값(means)이다. rMSCs 단독으로부터의 양성세포를 활성화된 rMSCs와 비교하였다 도 2a는 CD3; 도 2b는 CD4; 도 2c는 CD8; 도 2d는 CD161a이다. 바는 SE를 의미한다. *p<0.05

실험결과 3: 배양 상층액의 세포독성과 rMSCs에서 분비된 IL-4 and γ-INF 단백질 농도의 정량화

표적세포 (GFP 안정한 쥐 뇌교종 9L 세포주)에 대한 효과세포 (활성화되거나 활성화되지않은)의 배양 상층액의 시험관내 세포독성을 상기와 같은 시각 생존세포 측정법을 이용하여 분석하였다. (IL-2 단독, IL-15 단독, IL-2 및 IL-15 조합, GM-CSF 단독, 및 GM-CSF 및 IL-2 조합)으로 활성화되거나 활성화되지않은 rMSCs로부터의 배양 상층액과 배양 후 생존 표적세포의 밀도는 표적세포의 것이 비해 현저히 저하되었다 (p<0.05) (도 3a). 또한, 활성화되거나 활성화되지 않은 rMSCs의 배양 상층액으로부터 분비된 IL-4 및 γ-INF 단백질 농도를 비교하였다. 다양한 사이토카인으로 활성화한지 72시간후에 상층액에서의 IL-4 (도 3b) 및 γ-INF (도 3c) 단백질 레벨을 ELISA법으로 측정하였다. IL-2로 활성화된 rMSCs를 제외하고 모든 활성화된 rMSCs로부터의 배양 상층액에서 현저히 더 높은 (p<0.05) 농도의 IL-4가 검출되었다. γ-INF는 유사한 농도의 변화를 보여주었으나, 현저히 더 높은 (p<0.05) 그룹은 GM-CSF로 활성화된 rMSC뿐이었다.

도 3은 사이토카인 활성화되거나 되지않은 rMSC로부터의 배양 상층액을 시각 생존세포 측정법과 ELISA법에 의해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 사이토카인 활성화는 72 h동안 실시하였다. 도 3a에서, 활성화되거나 되지않은 rMSCs로부터의 배양 상층액과 혼합후 생존 표적세포의 밀도는 표적세포만의 그룹에 비해 현저히 낮았다 (p<0.05). 이들 결과는 5일 후 쥐 뇌교종 세포주(9L)에 대한 활성화되거나 되지않은 rMSCs로부터의 배양 상층액의 세포독성을 증명한다. 상부의 7개의 사각박스는 생존 녹색 형광 표적세포들을 나타낸다. 도 3b에서, 상당히 고농도의 IL-4가 IL-2를 제외한 모든 활성화된 rMSCs로부터의 배양 상층액에서 검출되었다. 도 3c에서, γ-INF는 유사한 농도 변화를 보여주었으나, 유의하게 높아진 그룹은 GM-CSF로 활성화된 rMSC의 배양 상층액뿐이었다. 바는 SE를 의미한다. *p<0.05

실험결과 4: DNA 단편화의 분석

다양한 사이토카인으로 활성화된 rMSCs가 표적세포를 아팝토시스(apoptosis)로 유발하는지 여부를 결정하기 위해 DNA 단편화를 측정하였다. DNA 단편화를 측정하기 위해, 활성화된 rMSCs로 처리된 표적 세포를 사용하였다. 5일 후, 수확된 세포로부터 DNA를 추출하고, 아가로스 젤상에 전개시켰다. 도 4는 DNA 단편화 실험결과를 도시한 사진이다. 대조군 표적세포에서는 DNA 단편화의 신호가 관찰되지 않은 반면, IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs로 처리된 표적세포(9L)에서는 전형적인 DNA 래더(ladders)가 검출되었다 (도 4). 이들 결과는 표적 세포 사멸이 아팝토시스와 관련된다는 것을 가리킨다.

실험결과 5: 활성화된 rMSCs에서 RT-PCR에 의한 유전자 발현 분석

IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs를 perforin, γ-INF 및 FasL 유전자 발현에 대해 RT-PCR로 분석하였다. 비활성화된 rMSCs도 또한 동일 유전자들에 대해 시험하였다. 도 5는 IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs와 비활성화된 rMSCs를 perforin, γ-INF 및 FasL 유전자에 대해 RT-PCR 분석한 결과를 보여주는 사진이다. 도 5에서는 IL-2, IL-15 및 GM-CSF로 활성화된 rMSCs가 비활성화된 rMSCs에 비해 더 강한 perforin, γ-INF 및 FasL 밴드를 가진다는 것을 보여준다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 (1) 9L 쥐 뇌교종 세포주에 대한 rMSCs의 시험관내 세포독성을 증명하였고, 활성화된 rMSCs를 rMSCs 단독과 비교하였다. (2) rMSCs의 다양한 사이토카인 활성화후에, 면역 효과세포의 집단이 증가될 수 있었다. (3) 아팝토시스가 활성화된 rMSCs에 의한 표적세포 사멸의 메카니즘의 하나이고, 그에 기여하는 유전자들은 perforin, γ-INF 및 FasL이다. 최근에, MSCs는 재생 의약 분야에서 세포 치료법의 가장 좋은 자원중 하나로 생각되었다. 그러나, 본 발명은 재생 의약 분야가 아닌 신경-종양학 분야에서 MSCs에 대한 새로운 관점을 제시하였다. 본 발명의 결과들은 다양한 사이토카인으로 활성화된 MSCs가 악성 뇌교종에 걸린 성인 및 아동에서 효과적인 입양(adoptive) 세포 전달의 소스로서 사용될 수 있다는 것을 제시한다.

Claims

골수 간엽줄기세포(MSC)를 유효성분으로 포함하는 악성 뇌교종(glioma) 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 골수 간엽줄기세포는 인터루킨-2 (IL-2) 단독, 인터루킨-15 (IL-15) 단독, IL-2 및 IL-15 조합, 과립구 대식세포-콜로니 자극인자 (GM-CSF) 단독, 또는 GM-CSF 및 IL-2 조합으로 활성화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 활성화된 골수 간엽줄기세포는 활성화되기 전보다 퍼포린(perforin), γ-INF 및 FasL를 더 많이 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 악성 뇌교종의 치료는 아팝토시스(apoptosis)의 유발에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
골수 간엽줄기세포를 시험관내(in vitro)에서 인터루킨-2 (IL-2) 단독, 인터루킨-15 (IL-15) 단독, IL-2 및 IL-15 조합, 과립구 대식세포-콜로니 자극인자 (GM-CSF) 단독, 또는 GM-CSF 및 IL-2 조합으로 처리하는 것을 특징으로 하는 면역효과세포로의 분화방법.
제 5항에 있어서, 상기 면역효과세포는 처리되기 전보다 CD8, CD161a, IL-4, 또는 γ-INF을 더 많이 발현하는 것을 특징으로 하는 분화방법.