CN102215873A - 树突状细胞调节分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供树突状细胞调节分子，该分子调节并优选抑制哺乳动物树突状细胞的分化和成熟。本发明还提供包含所述树突状细胞调节分子和同源物及其活性片段以及它们的抗体的药物组合物，以及利用此类分子的治疗方法和筛选方法。

Description

树突状细胞调节分子
技术领域
本发明涉及树突状细胞(DC)调节分子。本发明特别涉及调节并优选抑制哺乳动物DC(尤其是人类DC)的分化和成熟的分子。能够从节肢动物唾液、且更具体为蜱唾液中分离出此类分子。本发明还涉及此类分子在治疗中的应用，并具体涉及此类分子在治疗自身免疫性疾病、过敏及其他超敏反应、移植排斥及移植物抗宿主疾病、传染病(包括由蜱传播的传染病)、癌症(包括血液系统恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病(包括与上述疾病相关的炎症)中的应用。
背景技术
哺乳动物特别是人类的免疫系统由两部分组成，即先天性免疫系统和适应性免疫系统。先天性免疫系统的细胞以一般方式识别并响应传染原。虽然先天性免疫系统是抵御感染的重要直接屏障，但其并不提供特异性的、持久的保护来抵御外来实体(例如侵入性病原体)。与此相反，适应性免疫系统的细胞识别特定的外来实体，并且在宿主体内诱发对这些特定实体的免疫记忆。
在经病原体感染后，DC很快与先天性免疫系统的组成部分接触，而且还形成哺乳动物适应性免疫响应的核心部分。DC从前体细胞分化为未成熟DC。全身上下都存在未成熟DC；虽然免疫系统的其他细胞也参与此功能，但是未成熟DC是主要通过其触发T细胞活化的能力来负责启动适应性免疫响应的主要细胞类型。
未成熟DC通过诸如Toll样受体(TLR)等模式识别受体(PRR)持续地从其周边环境中取样以获得诸如病毒、细菌和寄生物等传染原，所述模式识别受体识别外来实体表面(例如在病原体表面)上的特定化学信号。一旦将实体(例如病原体)鉴定为外来实体，未成熟DC即将该实体或其片段内化，从而将蛋白抗原和脂抗原降解为肽及糖肽或脂片段并将其呈递至该DC的表面。
在响应于外来实体识别和/或细胞内环境的其他信号(例如炎性细胞因子)时，未成熟DC经历若干变化(统称为“成熟”)并且开始发育为成熟DC。成熟中的DC上调主要组织相容性复合体(MHC)和MHC相关分子(例如CD1)的表达，MHC与源自外来实体的肽和糖肽结合并使其呈递在DC表面，而MHC相关分子与源自外来实体的脂类结合并使其呈现在DC表面。与此同时，DC上调称作协同刺激分子的细胞表面受体(包括CD80、CD86和CD40)的表达，所述细胞表面受体在T淋巴细胞活化中担任协同受体。此外，DC开始跟随趋化信号向淋巴组织(例如淋巴结和/或脾)迁移。当处于淋巴组织中时，DC通过向T淋巴细胞呈递源自外来实体的肽和糖肽或脂片段并传递适当的协同刺激信号来活化T淋巴细胞。这种经活化的T细胞负责传播适应性免疫响应。所述外来实体可以是病原体、过敏原或在自身免疫响应情况下被身体误鉴定为外来抗原的自身抗原。
除了通过抗原呈递和协同刺激来触发T细胞活化的作用外，成熟DC还参与T细胞调节(例如将辅助性T细胞极化为Th1、Th2、Th17或调节性(Treg)细胞)、细胞毒性T细胞的活化和对T细胞归巢(例如，进入皮肤或肠及其他粘膜部位)的调节。
DC在适应性免疫响应中所起的核心作用已经引起了对以治疗为目的的DC功能调节的兴趣，而且动物模型已表明DC调节因子可以用于治疗自身免疫性疾病及其他炎性疾病(Subklewe等，Human Immunology，2007，68(3)，147-155)。另外已有提示，DC调节因子可以用于治疗癌症。显而易见，有益的是鉴定充当用于治疗目的的DC调节因子的其他分子。
具体而言，需要对具有DC调节活性特别是具有抑制活性的化合物进行鉴定，并且需要开发所述化合物在治疗自身免疫性疾病及其他炎性疾病和癌症中的用途。
发明内容
因此，本发明提供一种分离出的DC调节分子，其中所述分子调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和成熟。
在一个实施方式中，所述分离出的DC调节分子调节并优选抑制人类DC的分化和成熟。本发明的DC调节分子可以从节肢动物特别是吸血节肢动物中分离出。所述分离出的DC调节分子可以是蛋白质。
吸血节肢动物吸附到其宿主(包括诸如人等哺乳动物)上并长期进行吸食。其传递到宿主的成分，包括唾液中的成分，能够潜在地诱发宿主免疫响应。此类响应可能对该节肢动物有害，因此该节肢动物可能需要抑制这些响应。鉴于DC在触发免疫性中的核心作用，对所述节肢动物而言产生抑制DC功能的分子将是有益的。
吸血节肢动物、特别是蜱可以通过对宿主接种多种抗炎成分和免疫调节成分来抑制宿主的免疫系统(Ribeiro等，Infectious Agents and Disease，1992，4(3)，143-152)。
已经在蜱唾液中鉴定出若干种免疫调节分子，其中包括巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的同源物(Jaworski等，Insect Molecular Biology，2001，10(4)，323-331)、白细胞弹性蛋白酶抑制剂(其由人类巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞所分泌)的同源物(Leboulle等，The Journal ofBiological Chemistry，2002，277(12)，10083-10089)、糖基化的蛋白p36(据认为其抑制丝裂原所促进的小鼠脾细胞体外增殖)(Bergman等，Journal of Parasitology，2000，86，516-525)、B细胞抑制性蛋白(BIP)(Hannier等，Immunology，2004，113，401-408)和B细胞抑制因子(BIF)(Yu等，Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，343，585-590)。然而，这些分子中很多都没有明确的细胞靶标，而且这些分子中没有一个经鉴定对哺乳动物DC特别是人类DC的分化和成熟均具有抑制效果。
Salp15是一种存在于蜱唾液中的蛋白，已发现其作用于未成熟的人类DC(Anguita等，Immunity，2002，16，849-859；Hovius等，Vector borne and Zoonotic diseases，2007，7(3)，296-302)。然而，涉及在免疫调节刺激物存在时未成熟的人类DC与Salp15的温育的检验已表明，Salp15并不抑制协同刺激分子(如CD86)的上调。因此Salp15并不抑制人类DC的成熟。
前列腺素E2(PGE2)是一种存在于蜱唾液中的非蛋白分子，其可能调节未成熟的小鼠DC的活性，但是对这些小鼠DC的成熟影响甚微(Sa-Nunes等，The Journal of Immunology，2007，179，1497-1505)。PGE2能够增进人类DC的成熟，但是尚无证据表明其能够起到抑制人类DC的分化和成熟的作用。
另外已有提示，蜱唾液和唾液腺提取物(SGE)可能能够调节小鼠DC的分化和成熟(Cavassani等，Immunology，2005，114，235-245；Skallova等，Journal ofImmunology，2008，180，6186-6192)。然而，尚未分离出负责提供这些活性的分子，并且至今尚无证据表明蜱唾液具有抑制人类DC的分化和成熟的能力。
令人惊奇的是，本发明人现已分离出一种分子，其调节并优选抑制哺乳动物DC特别是人类DC的分化和成熟。
术语“分离出”旨在表达所述分子不再处于其自然环境中。该术语包括已经脱离自然环境的分子以及与其相同但是通过合成制得的分子。一般而言，本发明中分离出的分子基本纯净。“基本纯净”意为所述组合物包含至少约50％的所关注的分子。在一些实施方式中，所述组合物可以包含至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多的所述分子。换言之，所述组合物可以包含低于约50％的其他分子。在其他实施方式中，所述组合物可以包含低于约40％、低于约30％、低于约20％、低于约10％、低于约5％、低于约1％或更少的其他分子。
本发明的分子的活性
本发明的分子“调节”(即改变)或“抑制”(即减少)哺乳动物DC的分化和成熟。在一个实施方式中，这些细胞可以是人类DC。下文描述了适当的测试，所述测试用于评估DC分化和成熟所受到的调节或抑制。对技术人员而言显而易见的是，本文所述的用于评估分化和成熟所受到的调节或抑制的标记物仅以实例的方式给出，并非试图进行限制。在一个实施方式中，例如通过下文所讨论的测试，经测量本发明的分子将DC的分化和成熟都减少了至少20％。在其他实施方式中，对DC的分化和成熟的抑制可以是30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上。
“DC的分化”意为细胞前体(例如骨髓源祖细胞或血单核细胞)发育为未成熟的DC。使用本领域已知的标准测试，能够在表型上并最终在功能上评估对DC分化的调节，例如评估对DC分化的抑制。
能够使用细胞标记物来评估前体在表型上向未成熟DC的分化所受到的抑制，所述标记物的表达随所述前体细胞分化为未成熟DC而发生改变。举例而言，如在图23及所附描述中所述，单核细胞为DC的前体，其呈CD14阳性和CD1阴性。未成熟DC呈CD14阴性和CD1阳性。所以，单核细胞向未成熟DC的分化可以通过CD14的降低和CD1的升高来检测。通过CD14阳性且CD1阴性的前体细胞的持续存在，可以检测到由本发明的分子对前体细胞向未成熟DC的分化的抑制。
通过使用根据其活性将前体细胞和已分化的DC区分开的任何测试，能够评估前体细胞和发育完全的DC在功能上的分化。举例而言，与前体细胞不同，发育完全的DC(特别是受到如下所述的刺激之后)在体外测试中能够触发T细胞的增殖。常见的T细胞增殖测试包括同种异基因的混合白细胞反应(MLR)和氧化性有丝分裂发生。
“DC的成熟”是指在前体细胞已分化为未成熟DC之后所出现的过程。具体而言，该术语涉及在已分化的未成熟DC遭遇刺激物且转变为成熟DC时所发生的变化。所述刺激物可以是下述物质的成分：通过PRR(如TLR)感知的传染原(如病原体)、某些通过细胞因子受体而起作用的细胞因子、和/或其他细胞类型的特化细胞表面分子(例如活化的T细胞的CD154)。与未成熟DC的成熟有关的变化通常包括协同刺激分子(例如CD80和CD86)的表达上调以及DC表面的抗原呈递，所述抗原来自病原体所发源的成分，且其形式通常为肽-MHC复合体和脂质-CD1复合体。未成熟DC的成熟还可能与所述DC向次级淋巴组织的迁移有关。
本发明的分子可以对这些与未成熟DC的成熟有关的变化中的任何一种进行调节和抑制。因此可以通过本发明的分子使CD86和/或CD80和/或MHC分子的表达下降的能力，来评估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以通过本发明的分子使TNFα的表达和/或分泌下降的能力，来评估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以选择性地在进行聚(I:C)、LPS或IFNγ刺激后评估本发明的分子抑制DC成熟的能力。可以选择性地在进行CD40L、IFNα或者TLR7或TLR8配体(如CL097)刺激后评估本发明的分子抑制DC成熟的能力。在实施例中描述了用于对未成熟DC的成熟的抑制进行评估的实验。本领域技术人员应知晓对未成熟DC的成熟的抑制进行评估的其他方法。
如上所述，本发明的分子调节并优选抑制前体细胞分化为未成熟DC，而且调节并优选抑制随后发生的未成熟DC成熟为成熟DC。如下文更详细所述，这种对DC的分化和成熟所进行的调节或抑制可能在整体上对免疫系统具有下游调节效果。
将未经抗原呈递细胞活化的T淋巴细胞称为“初始”的。每个T淋巴细胞都特异于特定的抗原，且只能由呈递同源抗原(cognate antigen)的特化抗原呈递细胞(例如DC)来活化。常规的T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)来识别抗原-MHC复合体，所述T细胞受体是包含α链和β链的异源二聚体。然而，在无协同刺激的情况下，通过TCR进行的信号传递导致抗原不响应或无能状态，或者导致中断性活化(abortive activation)及细胞死亡。所以，协同刺激分子对于T淋巴细胞的活化至关重要，所述协同刺激分子在成熟过程中在未成熟DC表面受到上调并且由诸如CD28(对应于CD80和CD86的情况)或CD154(对应于CD40)等T淋巴细胞表面的受体分子对其进行识别。
在本发明的一个方面中，由上述分子所提供的对DC分化和成熟的抑制引起T淋巴细胞活化的下降。“T淋巴细胞活化”是指辅助性T细胞(包括Th1、Th2、Th17或Treg细胞)的活化，并且可选地指细胞毒性T细胞的活化，其通常依赖于辅助性T细胞的预先活化。
通过本领域已知的方法可以对T细胞活化的下降进行评估。可以通过以下方法来评估T细胞的活化，例如但不限于：通过对细胞因子分泌[例如白细胞介素(IL)-2的产生]或DC触发的T细胞增殖进行体外测试(例如同种异基因的MLR和氧化性有丝分裂发生)，或通过在体内测试T细胞在正常或转基因动物中对模型抗原(例如卵清蛋白)的响应，所述体内测试对在抗原再刺激之前和之后离体分离的T细胞使用类似的测试。
在一个实施方式中，与不存在抑制DC分化和成熟的分子的标准测试相比，本发明的分子使T淋巴细胞的活化下降了至少约20％。在其他实施方式中，对DC分化和成熟的抑制可以使T淋巴细胞的活化下降至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上。
在本发明的一个方面中，上述分子所提供的对DC分化和成熟的调节或抑制导致对T淋巴细胞调控的调节。特别而言，本发明的分子可以对T淋巴细胞向Th1、Th2、Th17、调节性T(Treg)细胞或滤泡样辅助性T(Thf)细胞的极化进行调节。通过在体外测试中测量源自T淋巴细胞的细胞因子，可以评估本发明的分子对T淋巴细胞极化的调节作用，所述细胞因子通常与不同类型的CD4和CD8T淋巴细胞有关。对于Th1细胞，所述细胞因子包括IFN-γ；对于Th2细胞，所述细胞因子包括IL-4、IL5和IL-13；对于Th17细胞，所述细胞因子包括IL-17；而对于Treg细胞，所述细胞因子包括IL-10和TGFβ。通过分别测量T-bet、GATA-3、ROR-γ-t和FoxP3的表达，或者通过针对Thf细胞测量Bcl6的表达，还能够对各类CD4细胞进行测试。作为另一选择，能够对不同细胞的表型进行表型评估，例如可通过评估其所表达的趋化激素受体和其他表型标记物来进行评估。
T淋巴细胞是哺乳动物免疫响应中的一种主要促进因子。因此，如上所述，通过本发明的分子对T淋巴细胞的激活的减少，或者该T淋巴细胞的极化的改变，将会导致对免疫响应的整体调节，而且特别会引起与所述免疫响应相关的细胞因子的水平的变化。举例而言，本发明的分子可以具有一般性免疫抑制效果。
对本领域技术人员而言显而易见的是，使用多种方法中的任何一种都可以对免疫响应中的调节(例如免疫抑制效果)进行测量。通过寻找在响应TLR刺激时最快产生的促炎性细胞因子(例如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-α、干扰素-β或通常在感染后立即产生的细胞因子(例如IL-6或IL-12))的水平降低，能够对整体免疫响应的下降或调节进行测量。本发明的分子还可以使抗炎性细胞因子(例如IL-10或TGFβ)的水平升高。
在一个实施方式中，与不存在抑制DC分化和成熟的分子的标准测试相比，本发明的分子使促炎性细胞因子的水平下降或使抗炎性细胞因子的水平上升至少约20％。在其他实施方式中，对DC分化和成熟的抑制可以使促炎性细胞因子的水平下降或使抗炎性细胞因子的水平上升至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上。
还可以通过多种其他方法来对免疫抑制效果进行评估，例如局部炎症减少或所产生的抗原特异性T细胞和B细胞库的大小或活性的减少。
可以从中分离出本发明分子的节肢动物
可以从节肢动物中分离出本发明的分子。“节肢动物”定义为属于节肢动物门的动物，其包括昆虫、甲壳类动物和蜘蛛类动物。节肢动物的特征是分节的躯体和由几丁质构成的坚硬外骨骼。
在本发明的一个方面中，可以从吸血节肢动物中分离出本发明的分子。术语“吸血节肢动物”包括所有从适合的宿主吸食血液的节肢动物。其包括昆虫、蜱、虱、跳蚤和螨。通常称其为血液吸食节肢动物，并且这两种术语在本申请中将会交替使用。
在本发明的另一个方面中，隔离出的吸血节肢动物可以是蜱。术语“蜱”是给予蜱总科中的小型蜘蛛类动物的统称，其包含于吸血节肢动物中。蜱是外寄生物，靠哺乳动物、鸟类和爬行动物的血液生活。
约900个蜱物种存在，且其见于世界各地。不同蜱物种的特征在于其偏好的栖息场所和其地理分布。大多数蜱物种能够对多种宿主物种(包括人类)进行吸食。如上文所讨论，节肢动物、特别是蜱，可通过对宿主接种多种抗炎成分和免疫调节成分来抑制宿主的免疫系统。
可以从任何已知的蜱物种中分离出本发明所分离的DC调节分子，所述蜱物种包括下述群体中的物种：硬蜱亚科(Ixodinae)、凹沟蜱亚科(Bothriocrotoninae)、花蜱亚科(Amblyomminae)、血蜱亚科(Haemaphysalinae)、扇头蜱亚科(Rhipicephalinae)、璃眼蜱亚科(Hyalomminae)、纳蜱科(Nuttalliellidae)、软蜱亚科(Argasinae)、残喙蜱亚科(Otobinae)、匙喙蜱亚科(Antricolinae)、Nothoaspinae、钝缘蜱亚科(Ornithodorinae)，举例而言，包括任何一种下述蜱物种：具尾扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)、囊状扇头蜱(Rhipicephalus bursa)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)、卡延钝眼蜱(Amblyomma cajennense)、希伯来钝眼蜱(Amblyomma hebraeum)、彩饰钝眼蜱(Amblyomma variegatum)、微小牛蜱(Rhipicephalus(Boophilus)microplus)、具环牛蜱(Rhipicephalus(Boophilus)annulatus)、消色牛蜱(Rhipicephalus(Boophilus)decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安氏革蜱(Dermacentor andersoni)、边缘革蜱(Dermacentor marginatus)、变异革蜱(Dermacentor variabilis)、铁角血蜱(Haemaphysalis inermis)、犬血蜱(Haemaphysalis leachii)、刻点血蜱(Haemaphysalis punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、骆驼璃眼蜱(Hyalomma dromedarii)、边缘璃眼蜱(Hyalomma marginatum marginatum)、蓖子硬蜱(Iodes ricinus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)、肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、六角形硬蜱(Iodes hexagonus)、波斯锐缘蜱(Argas persicus)、鸽锐缘蜱(Argas reflexus)、游走鸟蜱(Ornithodoros erraticus)、毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata moubata)、猪钝缘蜱(Ornithodoros moubataporcinus)和萨氏钝缘蜱(Ornithodoros savignyi)。
本发明的蛋白质
本发明的分子可以是蛋白质。如在实施例3～实施例18中所详细讨论，发明人已从蜱物种具尾扇头蜱中鉴定并分离出一种抑制哺乳动物DC分化和成熟的节肢动物蛋白。本文中将该蛋白称为Japanin，其氨基酸序列示于图15和SEQ ID NO：2中。
因此，在本发明的一个方面中，本发明的分子可以包括：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白；
ii)i)中所定义蛋白的同源物
iii)上文i)中所定义蛋白的活性片段，或上文ii)中所定义同源物的活性片段；或
iv)i)、ii)或iii)的功能等价物。
本发明的分子可以是由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白，或者该蛋白的活性片段。
本文中的术语“功能等价物”用来描述使用上述测试时具有调节并优选抑制DC分化和成熟的能力的任何分子，所述分子以对应于包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的Japanin蛋白全序列的方式起作用。这包括通过合成制得的蛋白、所述蛋白的合成变体、提供对应活性但具有不同序列的蛋白分子、具有对应活性的天然存在的非蛋白分子以及具有对应活性的合成的非蛋白分子。
特别地，将设计为模仿Japanin分子的三级结构或活性位点的合成分子视作功能等价物。在一个实施方式中，功能等价物具有调节并优选抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或对T淋巴细胞极化的调节。在另一实施方式中，功能等价物具有调节并优选抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述导致对免疫响应的抑制。
糖基化
如在实施例26中所示，Japanin貌似可能在两个位点被糖基化。用于天冬酰胺连接糖基化的天冬酰胺残基属于共有序列的一部分，且位于Japanin氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第59位和第155位。在缺少前导肽序列的成熟蛋白中，所述位置等同于第35位和第131位。
所以，本发明的蛋白可以在一个或多于一个位置发生糖基化。在一个实施方式中，所述蛋白可以在一个、两个、三个或更多位置发生糖基化。本发明的蛋白可以发生N-糖基化，但是该蛋白还可以在一个或多于一个位置的位点发生O-糖基化。
本发明的蛋白可以发生自然糖基化。在下述情况下尤其如此：如果该蛋白是自然产生并分离的，或者如果该蛋白是在宿主细胞中重组产生的且所述宿主细胞真实反映了自然产生所述蛋白的生物体的糖基化模式。作为另一选择，可能有必要对本发明的蛋白进行人工糖基化。在下述情况下尤其如此：如果该蛋白是化学合成的，或者如果该蛋白是在不真实反映所述蛋白自然糖基化模式的生物体中重组产生的。此外，为了变更或改进所述蛋白的性质，可以出现额外的糖基化修饰。
脂质运载蛋白的结构及脂质结合性质
如在实施例11中所示，本发明人已发现Japanin是脂质运载蛋白(lipocalin)。脂质运载蛋白是共同拥有类似折叠结构的蛋白家族。特征性脂质运载蛋白折叠是八股反平行β桶，其形成内部配体结合位点。脂质运载蛋白通常含有在间隔分布的位置上的至少2个、更常见为4个半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基形成可以稳定所述脂质运载蛋白折叠的内部二硫键。在本发明的一个方面，所述分子可以是脂质运载蛋白。因此，本发明的范围所囊括的同源物、片段和功能等价物可以包含常见于蜱脂质运载蛋白中的基序Cys/TyrXLeu Trp。
鉴于其推测性脂质运载蛋白结构，Japanin蛋白可能与脂质或脂样分子联结。术语“脂质”旨在涵盖任何可溶于有机溶剂但不溶于水的疏水性分子或两性分子，其包括脂肪、油、三酰甘油、糖脂、磷脂及类固醇、脂酰、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、醣脂质、聚酮、甾醇脂和异戊烯醇脂。术语“脂样分子”涵盖具有与脂质相似或相同性质的任何分子。术语“脂样分子”还包括任何与非脂质分子复合的脂质，其包括糖脂、磷脂、磷酸糖脂、经标记脂质和乙酰化脂质。
在体内，在本发明的蛋白在内质网中折叠期间或紧随其后、或者在从此位置输出所述蛋白的后续阶段，所述蛋白可以与脂质分子结合。
在本发明的范围内，本发明的蛋白可以在其产生过程中与脂质联结。举例而言，如果本发明的蛋白从自然来源分离出或通过重组产生，该蛋白可以无需任何干预而自动与脂质联结。作为另一选择，可以将脂质加到包含本发明蛋白的组合物中，从而使所述脂质和所述蛋白之间可以发生复合。特别地，如果蛋白是化学合成的，可以将脂质外源性地加到包含所述蛋白的组合物中来形成复合。
如上所述，本发明的蛋白可以与脂质“联结”或“复合”。在本文中这些术语可互换使用，用来描述脂质和本发明的蛋白之间的任何类型的接触。特别地，在脂质和本发明的蛋白之间可以存在相互作用。在一个实施方式中，该相互作用可能完全是结构性的，即脂质可以通过镶嵌关系契合至蛋白内的结合口袋中。在另一实施方式中，脂质可以通过任何引力来与蛋白进行物理相互作用。此类引力可以包括静电相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用、范德华力、氢键和共价相互作用。脂质和蛋白间的相互作用可以由结构性相互作用和引力的组合形成。
在一个实施方式中，本发明的蛋白可以与脂质联结。在另一实施方式中，脂质可以是类固醇或甾醇，例如胆固醇。在又一实施方式中，脂质可以是胆固醇的代谢产物，例如维他命D3。如在实施例23中所示，已显示Japanin可结合胆固醇。在一个实施方式中，本发明的蛋白可以结合胆固醇的代谢产物。特别的是，本发明由此提供包含或仅包含Japanin和脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)的复合物。
Japanin蛋白、同源物和片段的功能等价物也可以与脂质或包括脂样分子在内的其他疏水性分子联结。特别地，Japanin蛋白、同源物和片段的功能等价物可以与胆固醇或胆固醇的代谢产物联结。
由于已显示Japanin可结合胆固醇，本发明人设想：经改造用来运载脂质但未保留Japanin生物活性的分子可能具有有用的性质。因此本发明包括运载分子(carriermolecule)，其结合脂质并靶向DC表面上的受体。这种运载分子本身并不具有生物活性。在一个实施方式中，可以通过改造Japanin来产生运载分子，从而阻止其生物活性。在另一实施方式中，由运载分子运载的脂质可以通过结合至细胞受体来发挥生物功能。因此术语“功能等价物”包括运载分子。
受体结合
如在实施例24中所示，认为Japanin可结合C型凝集素细胞表面受体。这表示Japanin通过结合靶细胞表面受体并触发引起抑制的内部细胞信号传导途径来起到调节并优选抑制DC分化和成熟的作用。
在一个实施方式中，蛋白可以与靶细胞(例如DC)外表面上的受体结合。在另一实施方式中，蛋白可以结合二价阳离子依赖型受体，特别是C型凝集素受体。在一个实施方式中，蛋白可以结合受体并模拟该受体的天然配体。对本领域的技术人员而言显而易见的是，所述蛋白的任何部分都可能与受体结合。特别是如果蛋白经糖基化和/或与脂质分子结合，与靶细胞上的受体结合的可能是碳水化合物部分或所联结的脂质。
在一个实施方式中，本发明包括一种复合物，所述复合物包含或仅包含本发明的蛋白和受体。在另一实施方式中，所述复合物可以包含或仅包含本发明的蛋白、受体(例如诸如C型凝集素受体等二价阳离子依赖型受体)和脂类(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)。
同源物和片段
如上所述，本发明包括Japanin蛋白的同源物和活性片段，所述Japanin蛋白显示为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明还包括这些同源物和活性片段的功能等价物。
术语“同源物”旨在涉及保留了调节并优选抑制DC分化和成熟能力的Japanin序列的旁系同源物和直系同源物，所述Japanin序列在SEQ ID NO：2中公开。同源物可以具有调节并优选抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或形成对T淋巴细胞极化的调节。在另一实施方式中，同源物具有抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述形成对免疫响应的抑制。在又一实施方式中，同源物可以具有结合脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)的能力和/或与膜结合受体(例如诸如C型凝集素受体等二价阳离子依赖型受体)结合的能力。
同源物可以源自除具尾扇头蜱之外的蜱物种，包括血红扇头蜱、囊状扇头蜱、美洲钝眼蜱、卡延钝眼蜱、希伯来钝眼蜱、彩饰钝眼蜱、微小牛蜱、具环牛蜱、消色牛蜱、网纹革蜱、安氏革蜱、边缘革蜱、变异革蜱、铁角血蜱、犬血蜱、刻点血蜱、小亚璃眼蜱、骆驼璃眼蜱、边缘璃眼蜱、蓖子硬蜱、全沟硬蜱、肩突硬蜱、六角形硬蜱、波斯锐缘蜱、鸽锐缘蜱、游走鸟蜱、毛白钝缘蜱、猪钝缘蜱和萨氏钝缘蜱。同源物还可以源自：蚊物种，包括属于库蚊属、按蚊属和伊蚊属的物种，特别是致乏库蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)；跳蚤物种，例如猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)(猫蚤)；白蛉；墨蚊；舌蝇；虱；螨。
通常而言，同源物可以源自任何已知的蜱物种，例如属于硬蜱亚科、凹沟蜱亚科、花蜱亚科、血蜱亚科、扇头蜱亚科(包括璃眼蜱亚科)、纳蜱科、软蜱亚科、残喙蜱亚科、匙喙蜱亚科和钝缘蜱亚科的物种。
对于本文所述的分离出的Japanin蛋白的序列同源物的鉴定方法对本领域的技术人员而言是清楚可见的。举例而言，可以通过对公共的和私人的序列数据库进行同源性搜索来鉴定同源物。方便起见，可以使用公用数据库，但是私人的或商用的数据库同样有用，特别是如果其包含未在公共数据库中呈现的数据。一级数据库是存有原始核酸或氨基酸序列数据的站点，其可以是公用的或商用的。公用一级数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.acjp/)、SWISS-PROT蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(参见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、蛋白质数据库(the Protein Data Base)(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)，以及二级数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商用数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq(Incyte Pharmaceuticals Inc.)。
通常认为，两个多肽(优选对于特定的区域)间的一致性超过30％即认为表明功能等价性，并且由此表明这两种蛋白是同源的。在一个实施方式中，同源蛋白与Japanin蛋白序列(SEQ ID NO：2)的序列一致性程度超过60％。在其他实施方式中，同源蛋白与SEQ ID NO：2的分离节肢动物蛋白序列的序列一致性程度分别超过70％、80％、90％、95％、98％或99％。使用BLAST(版本2.1.3)且用NCBI(美国国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所指定的缺省参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚分(gap open penalty)＝11，空位延伸罚分(gap extension penalty)＝1]来确定本文所指的一致性百分比。
只要保留了野生型蛋白序列所展示的对DC分化和成熟的调控(优选抑制)，SEQ ID NO：2的Japanin蛋白序列的同源物包括与野生型序列相比包含氨基酸取代、插入或缺失的突变蛋白。突变蛋白可以具有调节并优选抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的下降或形成对T淋巴细胞极化的调节。在另一实施方式中，突变蛋白具有抑制DC分化和成熟的能力，从而如上所述导致对免疫响应的抑制。
因此突变蛋白包括含有保守氨基酸取代的蛋白，且所述取代不会对蛋白的功能或活性造成不利影响。该术语还旨在包括天然生物变异体(例如等位变异体，或本发明分离出的节肢动物蛋白所源自的物种的地理变异)。通过对蛋白序列中的特定残基进行系统突变或诱发突变，还可以设计出与野生型蛋白序列相比在调节或抑制DC分化和成熟方面活性提高的突变蛋白。
如实施例20中所述，本发明人已在安氏革蜱中鉴定出Japanin同源物。如实施例21中所述，本发明人已分别从下述物种中鉴定出Japanin同源物：微小牛蜱(2种同源物)、美洲钝眼蜱和具尾扇头蜱。这些序列在图24～图29中示出，且与SEQ ID NO：4、6、8、10和12对应。
因此，在本发明的另一方面，本发明所分离出的分子可以包括：
i)包含SEQ ID NO：4、6、8、10或12中任何一个氨基酸序列的蛋白；
ii)i)中所定义蛋白的同源物；
iii)上文i)中所定义蛋白的活性片段，或上文ii)中所定义同源物的活性片段；或
iv)i)、ii)或iii)的功能等价物。
虽然本发明人不希望受理论束缚，但假定这些序列可以不是全长序列。因此本发明规定在包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、6、8、10或12的分子的N端和/或C端可以有其他氨基酸。
本发明还提供分离出的Janapin分子及其同源物的“活性片段”。此定义中包括保留了全长Japanin分子调节或抑制哺乳动物DC分化及调节的能力的任何片段。
此类片段不仅包括本文所定义的分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的片段，还包括上述蛋白的同源物的片段。这种同源物的片段与分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的片段的一致性通常会超过60％，但是更优选的同源物的片段与分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的片段的一致性程度会分别显示为超过70％、80％、90％、95％、98％或99％。
分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的这些活性片段及其同源物的片段调节并优选抑制DC的分化和成熟。在一个实施方式中，分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的活性片段及其同源物的片段调节并优选抑制DC的分化和成熟，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的下降或对T淋巴细胞极化的调节。在另一实施方式中，分离出的节肢动物蛋白(SEQ ID NO：4、6、8、10和12)的活性片段及其同源物的片段调节并优选抑制DC的分化和成熟，从而如上所述对免疫响应进行抑制。当然，通过对野生型蛋白序列进行系统突变或片段化并随后进行适合的活性测试，可以理性地设计出在调节或抑制DC分化和成熟方面活性提高的片段。
在一个实施方式中，同源物可以具有结合脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)的能力和/或结合膜受体(例如诸如C型凝集素受体等二价阳离子依赖型受体)的能力。
在一个实施方式中，对于上述分离出的节肢动物蛋白的片段，其长度可以是至少约100个氨基酸。在其他实施方式中，对于上述分离出的节肢动物蛋白的片段，其长度可以是至少约90个、至少约80个、至少约70个、至少约60个、至少约50个、至少约40个、至少约30个、至少约20个、至少约10个或至少约5个氨基酸。
抗体
本发明还提供抗体，该抗体结合本发明的分子并特别结合上述Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物。可以将所述抗体作为检测所述分子的试剂来使用。所述抗体还可以是中和所述分子调节或抑制DC分化和成熟的活性的抗体，因此如下所述其可用于治疗目的。本发明的此方面中所包括的抗体可与本发明范围所囊括的上述任何功能等价物、同源物和蛋白片段结合。
本发明还包括与本发明的蛋白的碳水化合物部分结合的抗体。特别的是，本发明包括与一种或多于一种天然附着至Japanin的碳水化合物部分结合的抗体。
本发明的范围还包括“Anticalin”，其经改造脂质运载蛋白而得，用来识别并结合特定的蛋白表位。在某些实施方式中，anticalin可以采取肽、糖肽或糖脂的形式。本文中将anticalin包含在术语“抗体”的范围内。Anticalin不是源自免疫球蛋白的分子，但是其以与抗体类似的方式识别蛋白表位。
如果需要多克隆抗体，可以用本发明的分子(例如Japanin蛋白、片段、同源物或其功能等价物)使选定的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊或马)免疫。如果需要，可以使所述分子与运载蛋白偶联。常用的运载体包括牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin)。随后使用所述偶联分子来使动物免疫。从经免疫的动物收集血清，并按照已知程序(例如通过免疫亲和色谱)对其进行处理。
本领域的技术人员还能够容易地制造针对本发明分子的单克隆抗体。使用杂交瘤技术制造单克隆抗体是公知的一般方法(参见例如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中第77-96页，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
本文所用的术语“抗体”包括抗体的片段，例如Fab、F(ab’)2和Fv片段，其也特异性地结合DC调节分子。术语“抗体”还包括对本发明的分子特别是对Japanin蛋白、同源物及其片段有特异性的嵌合抗体分子和人源化抗体分子。嵌合抗体是将非人类可变区连接或融合至人类恒定区的抗体(参见例如Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,3439(1987))。本文所用的术语“人源化抗体”指其中用非人类供体抗体重链和/或轻链的可变区中的CDR氨基酸及选定的其他氨基酸来替换人类抗体中的对等氨基酸而获得的抗体分子。人源化抗体因此与人类抗体非常相似，但具有供体抗体的结合能力(参见Jones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88,34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。
在一些情况下，例如为了便于检测，可能需要将标记基团连接到抗体上。所述标记可以是酶、放射性标记、诸如生物素等化合物或荧光染料。
融合蛋白
本发明还包括融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明的分子特别是Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物，且所述分子与一种或多于一种的肽、多肽或其他分子遗传学融合或化学连接。所述额外的肽或多肽或分子的目的可以是对蛋白的检测、表达、分离或纯化进行辅助，或者其可以带给该蛋白所需的额外性质。潜在的融合伴侣的实例包括β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、萤光素酶、多聚组氨酸标签、T7聚合酶片段和分泌信号肽。融合伴侣还可以延长所述分子(例如Fc片段)在体内的寿命。在实施例15～实施例18中提供了融合蛋白的实例。
其他的潜在的融合伴侣包括潜在的生物药物，例如开发用作治疗特定疾病的药物的蛋白或其他分子。另外的潜在融合伴侣包括将本发明的分子靶向免疫系统中的细胞(如DC)的抗原。举例而言，融合伴侣可以包括可以与所述分子融合的自身抗原或外来抗原或者过敏原，从而在体内将所述分子递送至DC。另外的融合伴侣可以包括与不同的DC细胞表面成分结合从而便于向DC进行递送的分子。在一些情况下，可以包含多种融合伴侣。这类抗原的实例将在下文进行更详细的讨论。
核酸
本发明还包括核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明的分子的核酸序列。术语“核酸分子”旨在包括DNA分子、RNA分子和混合的DNA-RNA分子。该定义还包括基因组DNA、cDNA分子、mRNA分子以及含有经修饰的碱基的DNA和RNA。对本领域的技术人员而言显而易见的是，遗传密码的简并性决定了会存在多种不同的能够编码所定义的蛋白序列的核酸序列，所述蛋白序列是本发明范围所囊括的所分离的蛋白、蛋白片段或其功能等价物。本发明还包括编码融合蛋白(例如上述融合蛋白)的核酸分子。
在本发明的一个方面中，包含编码本发明分子的核酸序列的核酸分子可以包含或仅包含SEQ ID NO：1或其简并序列。在本发明的其他方面，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：3、5、7、9或11中的任何一个序列或其简并序列。简并序列的一个实例是核酸分子SEQ ID NO：32，其与核酸分子SEQ ID NO：3编码相同的安氏革蜱蛋白SEQ IDNO：4。
本发明还提供反义核酸分子，其在高度严格杂交条件下与包含编码本发明的分子(特别是上述分离出的节肢动物蛋白、同源物、片段或其功能等价物)的核酸序列的核酸分子杂交。高度严格杂交条件包括：在含有50％甲酰胺、5×SSC (150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经剪切的变性鲑精DNA的溶液中于42℃过夜温育，随后在0.1×SSC中于约65℃清洗过滤器。反义核酸分子包括反义DNA寡聚核苷酸和包括siRNA在内的RNA寡聚核苷酸。
本发明还包括包含核酸分子或反义核酸分子的载体，所述核酸分子包含编码分离出的节肢动物蛋白、同源物、片段或其功能等价物的核酸序列，所述反义核酸分子在高度严格杂交条件下与所述核酸分子杂交。所述载体包括克隆载体和表达载体。所述表达载体可以整合有在结构上与本发明的核酸分子连接的适合的转录控制序列和翻译控制序列，例如增强子元件、启动子-操纵子区、终止序列、mRNA稳定性序列、起始密码子及终止密码子或者核糖体结合位点。这些控制序列仅通过实例给出，而并非试图对其进行限制。
此外，便利的是，重组蛋白从某种宿主分泌。因此，此类载体的其他成分可以包括编码分泌、信号传导和加工序列的核酸序列。
本发明的载体可以包括质粒和病毒(包括细菌噬菌体和真核生物病毒)，以及其他直链或环状DNA运载体，例如采用转座因子或同源重组技术的载体。特别适合的病毒载体包括杆状病毒类、慢病毒类、腺病毒类和牛痘病毒类载体。
本发明还包括宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明的分子的载体、核酸分子或反义核酸分子；所述本发明的分子、特别是节肢动物蛋白、同源物、片段或功能等价物调节并优选抑制DC的分化和成熟。在本发明范围内，可以使用任何类型的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞可以是原核生物宿主细胞。在该实施方式中，所述原核生物宿主细胞可以是大肠杆菌宿主细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞可以是真核生物宿主细胞。在该实施方式中，所述宿主细胞可以是真核酵母菌细胞。在又一个实施方式中，宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞。在再一个实施方式中，宿主细胞可以是昆虫细胞，且在该实施方式中表达系统可以是杆状病毒表达系统。
可以使用多种技术来将本发明的载体或核酸导入宿主细胞。在文献中充分描述了适合的转化和转染技术(Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman和Leinwald，1998)。在真核细胞中，根据系统的要求，表达系统可以是短暂的(例如附加体)或永久的(染色体整合)。
在本发明另一个实施方式中，提供了本发明的分子、特别是分离出的节肢动物蛋白、同源物、片段或功能等价物的制备方法，所述分子调节并优选抑制DC分化和成熟，所述制备方法包括：
i)在表达本发明蛋白的条件下培养包含载体的宿主细胞，所述载体含有编码本发明的分子、特别是分离出的节肢动物蛋白、同源物、片段或功能等价物的核酸序列，根据本发明，所述分子调节并优选抑制DC分化和成熟；和
ii)回收由此制得的所述蛋白。
在本发明的此方面中，取决于宿主细胞系统、载体和随后的蛋白回收方法，蛋白表达所需的条件会有所不同。实施例公开了制造和回收本发明所分离的蛋白的特定过程。这些条件的变化对本领域的技术人员而言是显而易见的。
药物组合物
因鉴定出本发明的分子在调节并优选抑制DC分化和成熟中具有活性，故计划将本发明的分子、蛋白、核酸、反义核酸、载体、宿主细胞和抗体作为治疗剂来使用。
本发明提供如下的药物组合物：所述组合物包含分离出的DC调节分子(例如调节并优选抑制DC分化和成熟的节肢动物蛋白或其功能等价物)、编码此类分子的核酸、含有所述核酸的载体、包含所述载体的宿主或结合所述分子的抗体和药物可接受载剂。
只要赋形剂本身并不引发毒性效果或导致产生对接受药物组合物的个体有害的抗体，本文所用的术语“药物可接受载剂”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和无活性的病毒颗粒或者实际上任何其他试剂。药物可接受载剂还可以包括诸如水、生理盐水、甘油、乙醇等液体，或者包括诸如润湿剂或乳化剂和pH缓冲物质等辅助性物质。赋形剂可以使药物组合物能被制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂，从而帮助患者进行服用。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中全面讨论了药物可接受载剂。
在一个实施方式中，药物组合物可以包括一种或多于一种的与蛋白相互作用的脂质分子。在一个具体实施方式中，所述脂质分子可以是胆固醇或胆固醇的代谢产物(如维他命D3)。在另一实施方式中，药物组合物可以包括复合物，所述复合物包含或仅包含Japanin和脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)。在又一实施方式中，药物组合物可以包括复合物，所述复合物包含或仅包含Japanin、脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)和受体(例如诸如C型凝集素受体等二价阳离子依赖型受体)。
在本发明的一个方面中，药物组合物还可以包括一种或多于一种的额外治疗剂。本发明此方面包括技术人员认为有利于与本发明的分子共同施用的任何额外治疗剂。具体而言，所述额外治疗剂可以包括抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白。在特定的实施方式中，所述一种或多于一种的额外治疗剂可以包括抗炎剂。
治疗方法
本发明提供分离出的分子，例如调节并优选抑制DC分化和成熟的蛋白、编码所述蛋白的核酸、反义核酸、含有所述核酸或反义核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、与所述蛋白或分子结合的抗体、或者包含所述分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的治疗用的药物组合物。
本文所用的术语“治疗”包括出于人类或动物患者的利益而使用本文所述的蛋白、分子、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。具体而言该术语包括治疗性治疗、预防性治疗、诊断和疫苗接种。此列表仅通过说明性的方式给出，并不试图进行限制。
本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来治疗任何动物。在一些实施方式中，所述动物可以是哺乳动物。在另外一些实施方式中，所述动物可以是牛、猪、羊、猫、狗或兔。在其他实施方式中，所述动物可以是人。
在另一个实施方式中，提供了分离出的分子在制造用于治疗DC活性相关疾病的药物中的应用，所述分离出的分子调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和成熟，例如调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和成熟的分离出的节肢动物蛋白、编码所述蛋白的核酸、与编码所述蛋白的核酸结合的反义核酸、含有所述核酸或反义核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、与所述蛋白或分子结合的抗体、或者用于制造治疗DC活性相关疾病的药物的包含所述分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的药物组合物。
本发明还提供了对患有DC相关疾病的动物的治疗方法，所述治疗方法包括对所述动物施用调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和成熟的分离出的分子，例如调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和成熟的分离出的节肢动物蛋白、编码所述蛋白的核酸、与编码所述蛋白的核酸结合的反义核酸、含有所述核酸或反义核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、与所述蛋白或分子结合的抗体、或者包含所述分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的药物组合物。
在本发明范围内，可以使用多种施用模式中的任何一种或多种来对患者施用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。此类施用方式为本领域所公知，其可以包括胃肠外注射(例如静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射或注射至组织间隙)，或者通过直肠施用、口服、阴道施用、局部施用、经皮施用、皮内施用、鞘内施用、鼻内施用、眼部施用、耳部施用、肺部施用或其他粘膜施用。可以使用纳米贴片(nanopatch)来经皮施用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。还可以使用基因枪来施用本发明的核酸、载体或药物组合物。确切的施用方式将取决于待治疗的疾病或病症。
在一个实施方式中，可以在治疗或预防自身免疫性疾病、过敏症及其他超敏性病症、移植排斥及移植物抗宿主疾病和极性及慢性炎症性疾病中使用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。
自身免疫性疾病包括但不限于：胃酸缺乏性自身免疫性慢性活动性肝炎、艾迪生氏病(Addison′s disease)、斑秃、肌萎缩性侧索硬化(ALS，Lou Gehrig氏病)、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜肾炎或抗肾小管基底膜肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、关节炎、哮喘、特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、巴洛病(Balo disease)、白塞氏病(Behcet′s disease)、Berger氏病(IgA肾病)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、口炎性腹泻皮炎、慢性疲劳免疫缺陷综合征(CFIDS)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施综合征(Churg Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、大肠炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、库欣综合征(Cushing′s syndrome)、Dego氏病、皮炎、皮肌炎、幼年型皮肌炎、Devic氏病、I型糖尿病、盘状红斑狼疮、Dowling-Dego氏病、心肌梗塞后综合征(Dressler′s syndrome)、嗜酸性筋膜炎、获得性大疱性表皮松解症、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、伊文综合征(Evan′s syndrome)、纤维肌痛、纤维肌炎、纤维化肺泡炎、胃炎、巨细胞动脉炎、肾小球性肾炎、Goodpasture氏病、Grave氏病、Guillian-Barre综合征、乔本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、肝炎、Hughes综合征、特发性肾上腺萎缩、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、炎性脱髓鞘性多发性神经病、胰岛素依赖性糖尿病(I型)、肠易激综合征、幼年型关节炎、Kawasaki氏病、扁平苔藓、Lou Gehrig氏病、狼疮状肝炎、莱姆病、梅尼埃尔氏病(Meniere′s disease)、混合性结缔组织病、多发性骨髓瘤、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、眼瘢痕性类天疱疮(ocular cicatricial pemphigoid)、骨质疏松症、扁平部睫状体炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、多腺性自身免疫性综合征、风湿性多肌痛(PMR)、多肌炎、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、雷诺氏现象、莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)、风湿性关节炎、结节病、巩膜炎、硬皮病、Sjogren综合征、粘血综合征(sticky blood syndrome)、全身肌强直综合征、斯提耳病(Still′s disease)、Sydenham舞蹈症(Sydenham’s chorea)、系统性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎(Takayasu′s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、血管炎、白癫风、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)和Wilson氏综合征。
过敏或超敏反应病症可以是任何已知的过敏或超敏反应病症(根据Gell-Coombs分类包括I型、II型、III型或IV型)以及较少定义的V型超敏反应病症。此类病症包括但不限于：特应性、哮喘、胎儿成红细胞增多症、Goodpasture综合征、自身免疫性溶血性贫血、血清病、阿瑟斯反应(Arthus reaction)、系统性红斑狼疮、接触性皮炎、结核菌素皮肤试验、慢性移植排斥、格雷夫斯病(Graves disease)、重症肌无力、全身过敏反应、局部过敏反应、过敏性鼻炎、结膜炎、胃肠炎、湿疹、输血反应、新生儿溶血性疾患、风湿性关节炎、肾小球性肾炎、接触性皮炎、特应性皮炎、结核性损伤、药物引发的溶血性贫血、狼疮肾炎、曲霉病、多动脉炎、多肌炎、硬皮病、超敏性肺炎、韦格纳肉芽肿病、I型糖尿病、荨麻疹/血管性水肿或甲状腺发炎。过敏或超敏反应病症可能与传染病有关，所述传染病包括但不限于：肺结核、麻风、芽生菌病、组织胞浆菌病、弓形体病、利什曼病或其他感染。可以治疗的过敏症包括但不限于：对花粉(例如桦树、豚草、油菜籽)、食物(例如坚果、蛋类或海产食物)、药物(例如青霉素或水杨酸盐)、昆虫产物(例如蜜蜂或胡蜂毒液，或者房尘螨)或动物毛发以及诸如胶乳等人造产品的过敏反应。其他可以治疗的炎性疾病包括动脉硬化症或其他心血管疾病、阿尔茨海默病、血管炎、肌炎、脑炎、再灌注损伤、II型糖尿病、脂肪肝和伤口愈合，所述伤口愈合包括炎症期、血管生成过程、纤维组织形成及外皮形成、和重建期(remodeling phase)。
在一个实施方式中，对于在治疗或诊断程序中由体液或组织与人造或非哺乳动物材料的接触引起的有害病症，可以在对其进行的治疗和预防中使用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。此类程序可以是临时性或永久性的，包括但不限于：对包括肾血液渗析或肝血液渗析、腹膜透析、心肺转流术和血液滤过在内的体外循环回路的使用，对置于血管、膀胱、鞘内空间或任何其他中空内脏的留置导管的使用，对包括人工关节、心脏瓣膜、血管内支架、脑脊液分流器、人造血管和冠状动脉血管成形术导管在内的植入型假体的使用。
本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可能具有免疫抑制效果，该效果可用于防止移植排斥。移植物可以是同一个体中的同系移植物、在同一物种不同成员之间的同种异体移植物或者在不同物种间的异种移植物。本发明的分子可用于防止对多种移植物的排斥，所述移植物包括但不限于心脏、肺、心脏及肺、肾脏、肝脏、胰腺、小肠、手、角膜、皮肤移植物(包括脸部再植和脸部移植)、胰岛(islets of Langerhans)、骨髓移植物、输血、血管、心脏瓣膜、骨和皮肤。所述分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来预防骨髓移植后的移植物抗宿主疾病。
虽然本发明人不希望受理论束缚，但仍假定Japanin蛋白可能参与抑制癌症所涉及的信号传导途径。在本发明的另外一个实施方式中，可以用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物来治疗癌症。本发明还提供对患有癌症的动物的治疗方法，该治疗方法包括对所述动物施用上述本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。这种治疗可能涉及再极化(repolarisation)和对癌症中免疫响应的调节。
特别的是，癌症可以是血液病癌症，例如淋巴瘤或白血病或多发性骨髓瘤。可以依照本发明来治疗的白血病包括极性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴母细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。可以依照本发明来治疗的淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。还可以治疗的相关病症包括能够最终发展为ALL的脊髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症或骨髓纤维化症)以及由轻链疾病引发的淀粉样物。
在另外的实施方式中，癌症可以是恶性肿瘤、肉瘤或胚细胞瘤。本发明考虑了对任何器官的癌的治疗，所述癌包括但不限于：乳腺、肺、卵巢、胰腺、精巢、皮肤、结肠、脑、肝或子宫颈的癌以及黑色素瘤。可以治疗或预防的癌症是组织细胞瘤且特别是犬皮肤组织细胞瘤。
在本发明另一个实施方式中，可以用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物来治疗传染病。特别的是，这种治疗可能涉及再极化和对免疫响应的调节，所述免疫响应由诸如病毒、细菌和原生动物(例如HIV致病体、TB和疟疾)以及其他寄生物等病原体所造成的感染引起。
诸如蜱等吸血节肢动物是诸如蜱传播脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、Nairobi羊病毒、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi，Lyme病的媒介物)和泰勒原虫(Theileria parva，海岸热的媒介物)等传染病因子的来源。据推测Japanin可以起到促进蜱传疾病传播的作用。因此Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物可用于对动物进行疫苗接种来引发免疫响应，从而治疗或预防蜱传疾病。在本发明的另一个实施方式中，由此提供了预防节肢动物携带的传染病传播的方法或治疗节肢动物携带的传染病的方法，所述方法包括对动物施用本发明的分子，例如本发明的蛋白或核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。本发明还提供本发明的分子(例如本发明的蛋白或核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物)用来预防节肢动物携带的传染病的传播和治疗节肢动物携带的传染病。所述节肢动物可以是吸血节肢动物。节肢动物携带的疾病可以是Lyme病、蜱传播脑炎、克里米亚-刚果出血热、Nairobi羊病毒或海岸热。
还可以将Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物用作疫苗来抵抗吸血节肢动物本身及其携带的疾病。因此，本发明还提供对动物接种疫苗来抵抗吸血节肢动物(可以是蜱)的方法，所述方法包括对动物施用本发明的分子，例如本发明的蛋白或核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。本发明还提供用来对动物进行疫苗接种来抵抗吸血节肢动物(可以是蜱)的本发明的分子(例如本发明的蛋白或核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物)。
如上所讨论，可能有益的是，将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与一种或多于一种的额外治疗剂(例如抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白，或者为治疗上述任何病症而开发的其他生物药物)组合施用。
还可能有益的是，将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与将其在体内靶向DC的抗体一起施用，从而调节或抑制与不利的免疫响应有关的DC分化和成熟。在此实施方式中，可以将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与疾病相关要素组合施用，从而帮助将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物靶向适当的DC。在其中本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、或抗体已经通过与DC特异性结合而靶向DC的实施方式中，可以不需要疾病相关要素。
术语“疾病相关要素”旨在涵盖与患者的疾病相关的任何成分。所述疾病可以包括上述的自身免疫性疾病、过敏及其他超敏反应、移植排斥及移植物抗宿主疾病、传染病(包括由蜱传播的传染病)、癌症(包括血液系统恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病。“疾病相关要素”因此可以包括：i)与诸如病毒、微生物、寄生物和微生物毒素等传染原相关的成分；ii)与过敏相关的非自身分子过敏原；iii)与除过敏外的超敏反应相关的非自身成分；iv)与自身免疫性疾病相关的自身成分；v)来自同一物种的遗传差异性成员的移植抗原(同种抗原)或来自不同物种的移植抗原(异种抗原)；和vi)肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。
术语“疾病相关要素”还涵盖这些疾病相关要素的片段和衍生物。此类衍生物可以包括解毒剂、合成模拟表位(mimotope)和抗原，所述抗原在其结构中存在取代、插入或缺失但仍能够将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物引导至适合的DC。
向动物提供疾病相关要素将改善调节和抑制与所述疾病相关的DC分化和成熟的特异性。以此方式靶向特定的DC是有利的，因为其避免了对整体免疫响应进行抑制的需求，而且因此可以使副作用程度减少。
在本发明的一方面中，可以将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与疾病相关要素分开施用。在此方面中，可以依次施用本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物和疾病相关要素。在另一实施方式中，本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以在疾病相关要素之前施用。在又一实施方式中，本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以在疾病相关要素之后施用。
在另一实施方式中，可以将本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与疾病相关要素同时施用。在本发明的此方面中，本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以与疾病相关要素结合，例如以融合蛋白的方式结合。
因此本发明还提供具有疾病相关要素和本发明的抑制或调节DC分化和成熟的分子的融合蛋白。还提供了编码此融合蛋白的核酸。
本发明还提供包含本发明的分子、蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物及疾病相关要素和药物可接受载剂的药物组合物。
上述方法涉及对动物施用本发明的分子，从而在动物体内调节并优选抑制DC的成熟及分化。所述分子可以单独施用，或与包括疾病引发元素在内的额外试剂组合施用，所述额外试剂会将所述分子靶向DC。
上述疾病的替代性治疗方法是将本发明的分子用于离体靶向疗法。该方法涉及到将本发明的分子在体外递送至DC来调节所述DC并且将经调节的DC递送至需要治疗的动物。
在另一方面，本发明提供DC的调节方法，所述方法包括使DC接触本发明的分子，例如上述Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物。还提供了使用此方法产生的经调节的DC。
本发明还提供在有需要的动物中治疗或预防的DC相关病症的方法，其中所述方法包括对动物施用由此方法产生的经调节的DC。
调节DC分化的分子可以是上述任何调节并优选抑制DC分化和成熟的分子，包括Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等价物。还可以使用编码这些分子的核酸分子以及含有所述核酸分子的载体。
可以直接从需要治疗的动物中分离出DC。作为另一选择，可以从动物中分离出DC前体，例如骨髓祖细胞的单核细胞，并用来产生DC。在本发明的此方面中，对于在用本发明的分子进行治疗后要将经调节的DC导入其中的动物，DC或DC前体可以是与所述动物自体同源的或同种异基因的。
DC相关病症可以是上文讨论的任何疾病，包括自身免疫性疾病、过敏及其他超敏反应、移植排斥及移植物抗宿主疾病、传染病(包括由蜱传播的传染病)、癌症(包括血液系统恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病。所考虑的是，该方法可以用来在进行移植前从移植供体产生经调节的DC来向期望移植受体进行施用，其目的在于诱发对移植物的不应性(unresponsiveness)并因此减少给予免疫抑制剂的需要。
在本发明的此方面中，DC还可以与上述疾病相关要素接触，从而将调节并优选抑制DC分化和成熟的分子靶定至适合的DC。作为另一选择，可以将经调节的DC和诸如上文所述的哪些疾病相关要素向动物进行组合施用。
筛选方法
对Japanin的同源受体的鉴定使得在筛选方法中能够用该受体来鉴定Japanin的潜在激动剂和拮抗剂，从而对任何具有潜在治疗用途或其他用途的化合物进行鉴定。
可以从例如细胞、无细胞制剂、化学物质库或天然产物混合物中分离出潜在的激动剂或拮抗剂化合物。对于此类筛选方法的恰当综述，参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)。
最适合作为优秀拮抗剂的化合物是下述分子：所述分子与Japanin的同源受体结合，且并不引发由Japanin所引发的生物效应，并因此竞争性地抑制Japanin的功能。如上所述，认为Japanin的同源受体是二价阳离子依赖型受体，所述受体是C型凝集素受体且在结合Japanin时引发细胞内信号传导途径从而抑制树突状细胞的分化和成熟。潜在的拮抗剂包括与所述受体结合且不激活信号传导途径、或通过激活负信号传导途径而与所述受体结合的有机小分子、肽、多肽和抗体。特别的是，适合的潜在拮抗剂包括碳水化合物部分和工程化的Japanin分子所述Japanin分子已经过工程化以在保留其受体亲和力的同时减弱了其功能。其他适合的化合物包括：Japanin的抗体、Japanin所联结的碳水化合物部分的抗体、以及能够经工程化而具有靶标特异性的anticalin。
最适合作为优秀激动剂来发挥功能的化合物是下述化合物：所述化合物与Japanin的同源受体结合并引发细胞内信号传导途径，所述信号传导途径与Japanin所引发的一样，因此所述化合物以与Janapin相似的方式发挥调节并优选抑制DC分化和成熟的功能。适合的潜在激动剂的实例包括经工程化以提高其受体活化能力和/或受体结合亲和力的Japanin分子。
用于此筛选技术中的同源受体(二价阳离子依赖型受体，可能为C型凝集素)可以游离于溶液中、附接于固体支持体、携带于细胞表面或位于细胞内。一般而言，这些筛选程序可以涉及使用合适的表达所述受体并且与测试化合物接触的细胞或细胞膜，从而对结合进行观察或观察对功能性响应的刺激或抑制。随后将与测试化合物接触的细胞的功能性响应与对照细胞比较，所述对照细胞未与测试化合物接触。这种测试可以使用适当的检测系统来评估测试化合物是否会产生与经Japanin活化的受体所产生的信号相似的信号。由于确信Japanin通过结合细胞表面二价阳离子依赖型受体(例如C型凝集素受体)并引发细胞内信号传导途径来发挥作用，所以如果筛选方法涉及使用细胞表面受体且涉及监视化合物与受体的结合对细胞内信号的诱导，则该筛选方法可能会最有效地发挥功能。
在一个实施方式中，Japanin的激动剂化合物和拮抗剂化合物的鉴定方法包括：
(a)在允许与受体结合的条件下，使待筛选的化合物与细胞接触，所述细胞在其表面表达有二价阳离子依赖型受体(例如C型凝集素受体)，其中所述受体在响应于与所述化合物的结合时能够提供可检测信号；和
(b)通过测量由所述化合物与所述受体的相互作用产生的信号的水平，来确定所述化合物是否与所述受体结合并活化或抑制所述受体。
在某些实施方式中，待筛选的化合物可以在配体存在时与受体接触。此类配体可以是脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物(例如维他命D3)。
在另一实施方式中，Japanin的拮抗剂化合物的鉴定方法包括：
(a)在使Japanin结合其同源受体的条件下使Japanin与细胞接触，所述细胞在其表面表达有二价阳离子依赖型受体(例如C型凝集素受体)，其中所述受体在响应于与所述化合物的结合时能够提供可检测信号；
(b)测量由Japanin与所述受体的相互作用产生的信号的水平；
(c)在允许与受体结合的条件下，添加待筛选的化合物；和
(d)通过测量由所述化合物与所述受体的相互作用产生的信号水平变化，来确定所述化合物对Japanin的结合所产生的效果。
在某些实施方式中，可以在上述筛选方法中使用任何如上讨论的Japanin同源物或功能等价物。
在另外一些实施方式中，待筛选化合物和/或Janapin可以在存在配体的情况下与受体接触。此类配体可以是脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物。
上文指出的条件可以包括培养基的存在、含生理浓度Ca2+的溶液的存在和/或pH值为7～8。
上述可检测的信号可以包括细胞内磷酸化、核定位、基因表达和/或细胞因子释放。
在上述方法的某些实施方式中，可以使用简单的结合检验，其中利用与测试化合物直接或间接联结的标记、或者利用涉及到与经标记的竞争剂竞争的测试，来检测所述测试化合物对携带C型凝集素受体的表面的粘附。在另一实施方式中，可以使用竞争性药物筛选测试，其中中和性抗体能够结合二价阳离子依赖型受体(例如C型凝集素受体)，且在结合中特异性地与测试化合物进行竞争。这样，这些抗体可以用来检测具有对受体的特异性亲和力的任何测试化合物的存在。
对于，本领域的技术人员可以设计对作用于Japanin同源受体的化合物进行鉴定的测试。对于具有适合的受体亲和力的化合物，其高通量筛选可以使用一种技术来提供(参见国际专利申请WO84/03564)。在该方法中，在固体基体上合成了大量不同的测试小分子，随后可以使其与受体反应并进行清洗。一种固定肽段的方法是使用非中和性抗体。随后使用本领域公知的方法可以检测到已结合的受体。还可以将纯化的受体分子直接涂布到平板上，以供前述的药物筛选技术使用。
本发明还包括用上述方法鉴定出的激动剂、拮抗剂和其他化合物。这些激动剂、拮抗剂和其他化合物可以构成上述药物组合物的一部分，而且可以在上述治疗方法中使用。
现将通过实施例来详细描述本发明的各个方面及实施方式。应了解的是，可以在不脱离本发明范围的情况下对细节做出修改。
附图说明
图1显示了来自经饲养和未经饲养的雄性和雌性具尾扇头蜱的SGE对人类DC中的CD86表达上调的影响。F＝雌性，M＝雄性，0/3/6＝饲养天数。
图2显示了来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的SGE对CD1a+细胞中的成熟标记物表达的影响。黑色直方图显示用SGE和LPS处理过的CD1a+细胞中的成熟标记物表达，灰色直方图显示用LPS处理过且未经SGE处理的CD1a+细胞中的成熟标记物表达。
图3显示了经Q柱分离的SGE对用LPS处理过的CD1a+细胞中的成熟标记物表达以及对未经SGE处理的CD1a+细胞中的成熟标记物表达的影响。QFT＝在pH值为7时流经Q柱的材料。QFR＝在pH值为7时保留在Q柱上的材料。
图4显示了在A)LPS+IFNγ和B)聚(I:C)+TNFα存在的情况下SGE或QFT对CD86上调的影响。
图5显示了蛋白酶K处理对QFT的DC调节效果的影响。
图6显示了关于DC调节活性的尺寸分级(size fractionation)结果。根据在LPS存在的情况下对CD86上调的抑制来评估活性。
图7显示了对使用尺寸排阻色谱获得的活性最高的片段所进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图8显示了HPLC纯化结果：A)HPLC柱的洗脱图，和B)从HPLC洗脱出的各级分(fraction)的活性图。
图9显示了通过Edman降解而测序得到的N端16个氨基酸。
图10和图11显示了克隆JapaninDNA 3’区域的PCR的结果。
图12显示了Japanin 3’区域的共有序列。
图13a显示了用于扩增Japanin 5’区域的引物设计。
图13b显示了Japanin 5’区域的PCR扩增结果。泳道“PCR”是未经处理的PCR产物。标记为“清洁的PCR”的两个500bp泳道是对柱进行清洁后所得的不同体积。
图14显示Japanin 5’cDNA序列。
图15显示全长Japanin cDNA，以及其编码的具有176个氨基酸的蛋白。
图16显示位于Japanin全长序列内部的潜在断裂位点。
图17显示从含有Japanin表达载体的细胞获得的昆虫细胞上清液的DC调节活性。
图18显示了存在于各硫酸铵沉淀级分中的活性，所述硫酸铵沉淀级分来自从含Japanin的昆虫细胞收集的上清液。
图19显示银染色的SDS-PAGE凝胶，该凝胶显示Japanin的存在。
图20显示证实用来分离Japanin的多聚组氨酸标签的存在的蛋白质印迹。
图21显示Japanin-TEV-his上清液的DC调节效果。
图22显示了纯化的带His标签的Japanin的DC调节效果。
图23显示Japanin对DC的CD1a和CD14表达的影响。
图24显示了在MLR测试中由Japanin诱发的T细胞增殖的减少。
图25显示了对Japanin和在安氏革蜱(安氏革蜱E1244)中鉴定出的Japanin同源物的逐对比对结果。
图26显示了对Japanin和在微小牛蜱(微小牛蜱RM-CK185494)中鉴定出的Japanin同源物的逐对比对结果。
图27显示了对Japanin和在美洲钝眼蜱(美洲钝眼蜱CX766068)中鉴定出的Japanin同源物的逐对比对结果。
图28显示了对Japanin和在具尾扇头蜱(具尾扇头蜱CD796501)中鉴定出的Japanin同源物的逐对比对结果。
图29显示了对Japanin和在微小牛蜱(微小牛蜱CV443471)中鉴定出的Japanin同源物的逐对比对。
图30显示了从GC-MS分析获得的质谱数据。
图31显示了3H-胆固醇与Japanin的结合。
图32显示了对带荧光标记的Japanin与下述细胞结合的FACS分析，所述细胞为第5天的源自单核细胞的树突状细胞(图32a)、单核细胞(图32b)、源自骨髓的树突状细胞(图32c)、第1天的源自单核细胞的树突状细胞(图32d)、在甘露聚糖(图32e)和在EDTA (图32f)存在的情况下源自单核细胞的树突状细胞。
图33显示Japanin的N-糖基化。
图34显示了在LPS(图34a)、IFNγ(图34b)、TNFα(图34c)、水溶性CD40L(图34d)、IFNα(图34e)和CD097(TLR7/8配体)(图34f)存在的情况下Japanin对源自单核细胞的树突状细胞成熟所受的抑制的影响。
图35显示了Japanin对树突状细胞的TNFα分泌的影响。
实施例
材料和方法
蜱
在牛津生态学和水文学中心(Centre of Ecology and Hydrology，Oxford)饲养具尾扇头蜱。在用纱布覆盖的容纳室中，通过将蜱置于豚鼠剃净的背部上来进行饲养。
唾液腺提取物的制备
饲养1～6天之后，从豚鼠身上小心地取下蜱并且在显微镜下切除其唾液腺。在冷磷酸盐缓冲盐水(PBS，Oxoid Ltd.)中快速冲洗该腺体并将其转移至1.5ml微量离心管中，在需用前储存于-70℃。通过使用Dounce匀浆器使PBS中的腺体匀浆化来制备唾液腺提取物(SGE)。在≥10000g将匀浆物离心3分钟，随后收集上清液并在需用前储存于-20℃。
细胞培养
除非另有说明，细胞培养基和补充剂来自PAA。其中包括胎牛血清(FCS)，且始终使用该FCS的#A04304-0511批次。哺乳动物细胞培养在37℃、5％CO2下进行。昆虫细胞培养在28℃的Sf900II培养基中进行。除了共转染培养物，在以100～130rpm进行轨道振荡的锥形瓶中进行液体培养。
树突状细胞
从分离自健康成年供体的外周血液单核细胞中产生人类树突状细胞(DC)。简言之，将白细胞层(英国国家血液服务中心(National blood service)，Bristol)与不含Ca2+/Mg2+的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)以1∶2(体积/体积)混合，小心铺设至Lymphoprep(Axis Shield)上并在800g下于22℃离心30分钟。在HBSS/白细胞层混合物的分界面形成外周血单核细胞(PBMC)层，小心收集Lymphoprep并用HBSS清洗三次以除去血小板。通过短暂粘着或通过用磁珠进行负选择来从PBMC中分离出单核细胞。
对于通过短暂粘着来进行的单核细胞分离，将PBMC沉淀物重悬于RPMI-5中，所述RPMI-5由补充有5％人类AB+血清(英国国家血液服务中心)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640组成。以1×107个细胞/ml、10ml/平板的方式将PBMC平板接种至100mm的用细胞培养基处理过的Petri碟(BDBiosciences)中，并于37℃在5％CO2下温育45分钟。随后用HBSS冲洗平板三次来除去非粘着性细胞，并且将10ml RPMI-5加回至平板。培养1天后，添加人类GM-CSF(John Radcliffe Hospital pharmacy)至浓度为1000U/ml，添加人类IL-4(Peprotech)至浓度为20ng/ml。在培养3天后和5天后，分别用补充有新鲜制备的GM-CSF+IL-4的RPMI-5对总体积的1/3进行置换。
对于通过负选择来进行的单核细胞分离(换言之，通过除去非单核细胞)，将PBMC沉淀物重悬于不含Ca2+/Mg2+的HBSS中，随后根据制造商的操作说明使用Dynal单核细胞负分离试剂盒(Invitrogen)分离出单核细胞。将纯化的单核细胞以5×105/ml的密度重悬于DC-RPMI(即补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1000U/ml人类GM-CSF和1000U/ml人类IL-4(二者均来自Gentaur)的RPMI1640)中。3天后，取出1/3的培养基进行离心，将沉淀物重悬于相同体积的含3000U/ml每种细胞因子的新鲜培养基中，随后将其加回原培养物中。5天后，用HBSS/2％FCS清洗细胞，并将细胞重悬于含5.5％羟乙基淀粉(“Voluven”，John Radcliffe Hospital pharmacy)/4.8％DMSO(Hybri-max级，Sigma)/3.8％FCS的等渗盐水中，随后置于-80℃的控制型冷冻设备(1度/分钟)中将细胞冷冻。
筛选DC调节活性
使用上述在含FCS的培养基中产生并冷冻的DC来进行DC调节活性的常规筛选。将DC解冻，随后在97孔平底Primaria平板(BD Biosciences)中用补充有待筛选样品的DC-RPMI来培养细胞。培养24小时后，添加poly(I:C)(25μg/ml)或LPS(200ng/ml)来刺激DC，且通过每批DC对不同刺激物的响应性来确定对刺激物的选择。再培养18～24小时后，通过流式细胞计量来评估CD1a+细胞中的CD86表达水平。
流式细胞计量
使用由CellQuest Pro(Becton Dickinson)控制的FACSort流式细胞仪(Becton Dickinson)来进行流式细胞计量。用CellQuest Pro和FloJo(Treestar Software)来进行数据分析。
PCR
使用DNAEngine温度循环器(Biorad)来执行PCR。具HPSF品质的引物由MWG Biosciences制造，dNTP来自Bioline。其他试剂依照本文本中的注释来提供。
E.coli转化
对于化学感受态大肠杆菌的热休克转化，在冰上解冻50μl细菌，随后在冰上与DNA共温育5分钟，于42℃使之热休克40秒，随后置回到冰上。随后添加250μl室温SOC培养基，将细胞以200rpm轨道振荡方式于37℃温育45分钟～1小时30分钟，随后将50μl等分试样铺涂至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
实施例1：SGE对LPS所诱发的CD86上调的抑制作用
如上所述，通过短暂粘着来分离单核细胞并用GM-CSF+IL4进行培养来产生DC。培养5天后，将来自雄性或雌性具尾扇头蜱的SGE添加到培养物中。所述SGE源自未经饲养的蜱或来自已饲养3天或6天的蜱，添加所述SGE直至源自蜱的蛋白的最终浓度为50μg/ml。培养共6天后，用LPS(50ng/ml)处理DC，并且在培养7天后用抗CD1a和抗CD86将其染色，并通过流式细胞计量对其进行分析。图1将CD86+细胞的数量显示为CD1a+细胞的百分比×这些细胞上的CD86染色的几何平均荧光强度(GMFI)。如图1中所示，发现来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的SGE抑制LPS所诱发的人类DC中协同刺激受体CD86的上调，而来自未经饲养的雌性蜱、饲养6天的雌性蜱或者来自雄性蜱(经饲养或未经饲养)的SGE却无此效果。该实验进行了两次，且结果相似。在所添加的SGE在培养物中的最终材料浓度相当于每毫升含有一个腺体时，获得的结果也相似。
实施例2：SGE对LPS所诱发的CD86和II类MHC上调的抑制作用
如上所述，通过短暂粘着来分离单核细胞并用GM-CSF+IL4进行培养来产生DC。培养5天后，将来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的SGE添加到一些培养物中，直至最终材料浓度相当于每毫升培养基含有一个腺体。培养共6天后，用LPS(50ng/ml)处理DC，并且在培养7天后用抗CD1a、抗CD80、抗CD86和抗HLA-DR将其染色，并通过流式细胞计量对其进行分析。图2显示了在SGE存在(黑色)和不存在(灰色)的情况下经LPS处理的CD1a+细胞中成熟标记物的表达。如图2中所示，发现来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的唾液腺提取物不仅抑制对LPS做出响应的CD86上调，而且还抑制CD80和II类MHC的上调。该实验进行了两次。
实施例3：对SGE活性成分的Q柱分级
将从饲养3天的雌性具尾扇头蜱的112个腺体中获得的SGE以1∶10稀释于50mM磷酸钠(pH 7.0)中，随后将其添加到之前已用同样缓冲液进行平衡的Hi-Trap Q琼脂糖离子交换柱(Amersham)上。收集未结合的材料(Q柱流穿部分(flowthrough)＝QFT)，用2个柱体积的50mM磷酸钠(pH 7.0)清洗该柱，随后通过向该柱添加50mM磷酸钠、1M NaCl(pH 7.0)来洗脱已结合的材料(Q柱结合级分＝QFR)。用Vivaspin 65kDaMWCO离心浓缩器(Sartorius)将QFT和QFR浓缩至最终体积为500μl，所述离心浓缩器已经用γ-球蛋白进行了预处理来防止对蛋白的非特异性吸收。
如上所述，通过短暂粘着来分离单核细胞并用GM-CSF+IL4进行培养来产生DC。培养5天后，将来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的SGE或上述产生的QFT或QBF添加到培养物中。每个所提供材料的最终浓度相当于每毫升培养基中含有一个腺体。培养共6天后，用LPS(50ng/ml)处理DC，并且在培养7天后用抗CD1a和抗CD86将其染色，并通过流式细胞计量对其进行分析。图3将CD86+细胞的数量显示为CD1a+细胞的百分比×这些细胞上的CD86染色的几何平均荧光强度(GMFI)。误差条表示成对培养物间的变化范围。
图4显示出DC调节活性并不限于对LPS所诱发的成熟(大概通过TLR4产生作用)，而且还抑制对25μg/ml poly(I:C)(TLR3配体)处理或对50ng/ml IFN-γ处理做出响应的CD86上调(图4a)。然而，QFT对100ng/ml TNF-α所诱发的CD86上调没有或几乎没有影响(图4b)。其原因目前尚不清楚。
实施例4：蛋白酶K对QFT的DC调节活性的影响
将上述制备的冷冻的5天期DC解冻，并且与最终浓度为02个腺体等价物/ml的QFT一起培养。在此实验中，如下所述，一些QFT用蛋白酶K进行了预处理。一天后，用poly(I:C)(25μg/ml)处理DC，再培养一天后用抗CD1a和抗CD86将其染色，并通过流式细胞计量对其进行分析。
对于蛋白酶K处理，在50mMNa2HPO4(pH 7.0)中将QFT与150μg/ml蛋白酶K(Sigma)于50℃共温育2小时。随后通过加热至98℃并保持10分钟来使该酶失活。使用另外进行的不含QFT的相同反应的产物来执行仅含蛋白酶的对照[蛋白酶K+poly(I:C)]，并且以相同的方式处理在无蛋白酶的对照[QFT+poly(I:C)]中使用的QFT，从而说明DC调节活性的消失并不是因为活性成分的热变性。在两个另外执行的对照中，对热失活的蛋白酶K[失活的蛋白酶K+poly(I:C)]进行温育或者将热失活的蛋白酶K与QFT共温育[QFT+失活的蛋白酶K+poly(I:C)]，从而确认DC调节活性的消失需要蛋白酶K的不耐热蛋白裂解能力。对于这些步骤，在于50℃进行温育前，将蛋白酶K于98℃预处理10分钟。图5显示用蛋白酶K进行的处理使QFT的DC调节活性消失，从而确认了其蛋白质性质。结果是成对孔中数据的平均值±2S.E.。
实施例5：QFT的大小分级
从饲养3天的雌性具尾扇头蜱中切除得到350个唾液腺，并如上所述用其来制备QFT。通过用Superdex 75柱在8个单独实验中进行凝胶过滤来对QFT进行大小分级。在每个情况中，从该柱收集到约40个级分，并且如上所述通过与解冻的5天期DC的共培养来筛选其DC调节活性。24小时后通过添加200ng/ml LPS来刺激DC，再过24小时后通过流式细胞计量来评估CD1a+细胞的CD86表达。
图6中显示了8个分级中一个代表性分级的结果，其中初始筛选是在1个腺体等价物/ml下进行，而接下来的对所推测的活性级分的筛选是在0.04个腺体等价物/ml下进行。在所有分级中，经鉴定级分#12或#13的活性最高。
将每个分级中活性最高的级分合并，并在低盐缓冲液[50mM HEPES，pH 8.3]中进行透析，随后在还原条件下在4％～12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上进行电泳。SGE、QFT和两个Q柱结合级分与合并的活性级分一起电泳。其结果示于图7中。SGE和QFT具有DC调节活性，但Q柱结合级分却没有。在QFT和合并的级分中存在位于约20kDa处的条带，但是在两个失活样品中却不存在，这表示该条带是活性蛋白。本发明人将此蛋白命名为“Japanin”。
将从QFT凝胶过滤色谱获得的活性最高的级分(见上)合并，并且在低盐缓冲液中进行透析，随后用C4柱进行HPLC分级。用乙腈上升梯度进行洗脱，从而从该柱获得23个级分，并且如上所述通过与解冻的5天期DC的共培养来筛选其DC调节活性。24小时后通过添加25μg/ml LPS来刺激DC，再过24小时后通过流式细胞计量来评估CDla+细胞的CD86表达。
实施例6：用HPLC对DC调节活性进行分离
以1∶200稀释每个级分后对其进行评估，得到的腺体等价物/ml浓度为2.6～7.9(取决于级分体积)，其中包括作为对照的输入材料(合并的活性凝胶过滤级分)和QFT，其浓度分别为1.8和02个腺体等价物/ml。由于级分#23为约100％的乙腈，在存在或不存在QFT的情况下对其效果进行评估，从而排除了HPLC溶剂对DC的直接调节效果，或相反所述溶剂掩盖所述效果的能力。图8显示了HPLC的结果。图8a显示了洗脱图，图8b显示了根据对DC中DC86上调的抑制而评估的每个级分的活性。
实施例7：Edman降解
在将HPLC的级分#19表征为具有最强DC调节活性之后，将其用于Edman降解测序，从而产生了16个残基的N端序列：(Thr)Pro Ser Met Pro Ala Ile Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala(Arg)，其中对括号内残基的鉴定尚未确定。Edman降解的信息显示如图9中所示。自此将具有该N端序列的蛋白称为“Japanin”。
实施例8：对JapaninDNA 3’区域的PCR扩增
将上述N端序列用来设计外正向引物，将所述正向引物与寡聚dT反向引物的组合一起用于Japanin DNA的PCR扩增。采用一组针对序列“M P A I N T Q”的4个简并引物。这4个引物非常相似，但却分开使用来减少简并度：
外引物1(SEQ ID NO：13)ATG CCN GCNATC AAYACN CAA
外引物2(SEQ ID NO：14)ATG CCN GCN ATC AAY ACN CAG
外引物3(SEQ ID NO：15)ATG CCN GCN ATW AAY ACN CAA
外引物4(SEQ ID NO：16)ATG CCN GCN ATW AAY ACN CAG
从饲养1天的雌性具尾扇头蜱唾液腺中产生cDNA来提供PCR模板。根据制造商的操作说明使用Trizol试剂(Invitrogen)从30个唾液腺中分离出RNA，随后通过添加1/3体积的8M氯化锂来从水相中沉淀出RNA。在用冷75％乙醇清洗后，将所述RNA再溶解于5μl无RNA酶的水中。
根据制造商的操作说明，使用ImPromII逆转录酶(Promega)在40μl反应物中进行逆转录。该反应物含有4μgRNA，且MgCl2浓度为2.5mM，dNTP总浓度为0.5mM。寡聚(dT)15用于启动逆转录，其以0.1μg/ml。该反应在42℃进行1小时，并随后于70℃进行15分钟的热失活。
在补充有62.5μM的各种dNTP、250nM简并引物和3.25μM寡聚(dT)20-V的1X Thermopol缓冲液(New England Biosciences)中，用Taq DNA聚合酶(New England Biosciences)执行使用上述cDNA的PCR。使用以1∶40稀释后的模板cDNA。于94℃进行1分钟起始变性步骤，而后执行5次如下循环：于94℃30秒[变性]/于45℃30秒[退火]/于72℃60秒[延伸]，然后执行30次如下循环：于94℃/于50℃30秒/于72℃60秒，最后再于72℃进行5分钟。在相同条件下使用已知蜱蛋白的正向引物来执行阳性对照[RH1-PE]。在1.8％琼脂糖凝胶上对产物进行电泳。其结果示于图10中。
由正向引物2和4扩增的较大产物为约600bp，这表示其编码约22kDa的蛋白(鉴于氨基酸残基平均质量为110Da)。这与在SDS PAGE凝胶上的活性级分中鉴定出的约20kDa的条带形成良好对应。在克隆该cDNA之前，通过进行巢式PCR确认了所述cDNA与N端序列相对应。
针对序列“Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala”设计了内引物，所述序列在N端序列内部但位于先前所用引物的结合位点下游：
内引物1(SEQ ID NO：17)GCY ACI CAG ACI YTI TAY CTN GC
内引物2(SEQ ID NO：18)GCY ACI CAG ACI YTI TAY TTR GC
非标准码“I”表示作为中性碱基加入的肌苷。
使用正向引物2和4所编码的引物和寡聚(dT)20-V扩增的DNA在以1∶20进行稀释后作为模板。反应条件如上所述，不同之处在于：全部35次循环都采用50℃的退火温度，并且将72℃的延伸步骤从60秒缩短至40秒。在1.8％琼脂糖凝胶上对产物进行电泳。
如在图11中所示，这些PCR产生了预期尺寸(即，约600bp)的条带，从而有力表明编码N端蛋白序列的cDNA得到特异性的扩增。
实施例9：对Japanin cDNA 3’区域的共有序列的鉴定
为了获得Japanin的3’序列，使用外正向引物2和4来扩增DNA，并克隆至pCR2.1中，随后进行测序。
将外正向引物2和4与作为反向引物的寡聚(dT)20-V组合使用，且如上所述在40μl反应物中进行反应。在琼脂糖凝胶上对反应物进行电泳，并且将约600bp的DNA条带切下，随后根据制造商的操作说明使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)来将其纯化，并且用30μl洗脱缓冲液从柱中洗脱所述DNA。
在10μl反应中将50ng pCR2.1-TA(Invitrogen)和T4DNA连接酶(NEBBiosciences)与6μl每个纯化产物于14℃温育过夜，从而将所述纯化产物连接到pCR2.1中。用该连接混合物来转化感受态大肠杆菌TOP10菌株，并通过组合使用正向引物2和4及寡聚(dT)20-V的PCR筛选来鉴定出包含插入序列的菌落。根据制造商的操作说明使用QIAprep离心试剂盒(Qiagen)从5ml阳性菌落的培养物中分离出包含插入序列的pCR2.1DNA。
对四种包含插入序列的质粒的测序使得可以构建示于图12中的Japanin cDNA 3’区域的共有序列。
实施例10：对Japanin 5’区域的测序
采用5’RACE(cDNA末端快速扩增)方案来扩增包含Japanin 5’区域的约500bp的产物。
5’RACE利用已知的3’cDNA序列(在此情况下即最新获得的Japanin 3’序列)来为基因特异性引物的设计提供信息。用这些引物来进行基因特异性逆转录，并且使用巢式PCR来扩增cDNA的5’区域。在后一种情况下，正向引物对以实验手段引入的寡聚核苷酸封端区域有特异性，而反向引物则是基因特异性的反向引物。所用的各种Japanin特异性引物的相对位置示于图13a中。
根据制造商的操作说明使用RNAqueous-4PCR试剂盒(Ambion)从饲养2天的雌性具尾扇头蜱唾液腺中提取出RNA。从柱洗脱液中沉淀出所述RNA并将其再溶解于20μl洗脱缓冲液中。
使用GSP1B引物来进行基因特异性逆转录。根据制造商的操作说明，在含有1μgRNA的20μl反应物采用ImProm II逆转录酶(Promega)。在该反应物中，MgCl2浓度为2.5mM，dNTP总浓度为0.5mM，且引物浓度为125nM。逆转录反应在48℃进行1小时，之后于70℃进行15分钟的热失活。随后通过添加1μl RNA酶混合物(Invitrogen，来自5’RACE系统试剂盒)来除去RNA，并且在室温温育30分钟。
根据制造商的操作说明，使用SNAP柱(Invitrogen，来自5’RACE系统试剂盒)来清洁生成的cDNA以除去酶、引物及核苷酸。在50μl无核酸酶的水中洗脱出cDNA。
根据制造商的操作说明，使用TdT酶和dCTP (Invitrogen，来自5’RACE系统试剂盒)在25μl反应物中将寡聚(dC)连接至15μl cDNA末尾。
在20μl反应物中使用1μl带寡聚(dC)尾部的cDNA作为巢式PCR的模板。组合使用GSP2A引物与AAP引物(Invitrogen，来自5’RACE系统试剂盒)来进行第一轮扩增，凝胶纯化所得产物并将其用作第二轮扩增的模板，组合使用GSP3引物与AUAP引物(Invitrogen，来自5’RACE系统试剂盒)来进行所述第二轮扩增。
在含有2mM Mg2+且补充有62.5μM每种dNTP(Bioline)和250nM每种引物的1×Thermopol缓冲液(New England Biosciences)中，用Taq DNA聚合酶(New England Biosciences)执行全部两个PCR。GSP2A/AAP PCR包括在94℃进行1分钟的起始变性步骤，和随后的35次如下循环：于94℃30秒/于66℃30秒/于72℃40秒，以及最后在72℃再进行5分钟。在琼脂糖凝胶上对20μl反应的产物进行电泳，随后将约650bp的条带切下，并根据制造商的操作说明使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)将其提取出。将纯化的产物以1∶1000稀释后用作第二轮扩增的模板。
GSP3/AUAP PCR与之类似，不同之处在于所采用的退火温度是68℃而不是66℃。为了获得充足的DNA供测序使用，执行150μl的GSP3/AUAP PCR。在琼脂糖凝胶上对75μl产物进行电泳，随后将约500bp的条带切下，并根据制造商的操作说明使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)将其提取出。在30μl的洗脱缓冲液中从柱中洗脱出DNA，并将样品与未经纯化的PCR产物一起在琼脂糖凝胶上电泳，从而对回收进行确认并将浓度估算为约100ng/μl，然后对剩余产物进行测序，如图13b所示。
使用AUAP引物对经凝胶纯化的PCR产物进行测序，得到Japanin cDNA的5’序列，并示于图14中。
GSP1B＝GTT ATG GAT AGC ACC TCT CG(SEQ ID NO：29)
GSP2A＝AGC CTT CAC ACG CAG CAG TGG AGA(SEQ ID NO：30)
GSP3＝GCC TGT GTTACC CAAGGT TCT G(SEQ ID NO：31)
实施例11：设计用于克隆全长Japanin的引物
对5’和3’cDNA序列的成功克隆使得可以对假定Japanin cDNA全长序列进行装配，所述序列编码176个氨基酸的肽，并示于图15中。残基在Japanin序列中的位置和与其他已知分子的序列相似性表示Japanin是脂质运载蛋白。
神经网络分析表示前24个氨基酸是分泌信号序列。之后是序列Thr Pro Ser Met Pro Ala Ile Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala，其与从DC调节性HPLC级分获得的N端序列吻合。这确认了已经对正确的cDNA进行了测序。
使用巢式PCR策略来克隆全长cDNA。两轮PCR均使用高保真DNA聚合酶，从而使引入聚合酶所产生的突变的可能性最小化。基于包括信号序列在内的假定全长cDNA序列来设计引物，其中第二轮的引物分别在正向和反向引物的5’端含有BamHi和NotI限制性位点以促进亚克隆。因为据报导限制性酶在直链核酸最末端进行切割时效率较低，所以在限制性位点前有5个额外的核苷酸。
正向引物5(SEQ ID NO：19)TGGCATTCT TTGAAGCTCTGTCATCA
反向引物3(SEQ ID NO：20)GCTTTTTATTTTCCGTTATGGATAGCACCTC
正向引物6(SEQ ID NO：21)GCTTTTTATTTTCCGTTATGGATAGCACCTC
反向引物4(SEQ ID NO：22)GTTTAGCGGCCGCCGTTATGGATAGCA
两轮PCR均使用Phusion HotStart DNA聚合酶(New England Biosciences)在补充有50μM每种dNTP(Bioline)和250nM每种引物的1×HF缓冲液(New England Biosciences)中来执行。
使用正向引物5和反向引物3来执行第一轮PCR，如上所述，由产生自饲养1天的雌性具尾扇头蜱唾液腺的cDNA来为其提供模板。在98℃进行30秒的起始变性步骤，随后进行35次如下循环：于98℃10秒/于64.6℃30秒/于72℃30秒，随后在72℃再进行1分钟。将该反应的产物在以1∶100000稀释后用作第二轮扩增的模板。
使用正向引物6和反向引物4执行第二轮PCR。在98℃进行30秒的起始变性步骤，随后进行2次如下循环：于98℃10秒/于41℃30秒/于72℃30秒，最后在72℃再进行5分钟。
实施例12：克隆Japanin
如上所述对附加有5’BamHI位点和3’NotI位点的编码全长Japanin的DNA进行PCR扩增，用BamHI和NotI进行切割，并连接至以相似方式处理过的pBacPAK8载体中。使用连接后的DNA来转化TOP10大肠杆菌，之后取孤立的菌落进行培养并进行Miniprep抽提，并且对其质粒DNA进行测序。
如上所述用50μl反应物来扩增编码全长Japanin的DNA(其含有5’BamHI位点和3’NotI位点)。为了除去引物和核苷酸，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来处理35μl产物，随后在30μl洗脱缓冲液中洗脱出所述质粒，所述缓冲液已用水稀释至0.33×以便减弱其缓冲力并减弱对限制性酶缓冲液pH的后续影响。
在补充有BSA的1×BamHI缓冲液中，于37℃用BamHI和NotI通过1小时的温育来酶切经扩增的DNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)用30μl洗脱缓冲液进行洗脱来清洁所述DNA，从而除去酶。所有酶和缓冲液都来自New England Biosciences。
用相似方式酶切pBacPAK8，随后使用QIAquick凝胶提取试剂盒来纯化凝胶，从而确保除去所切下的具多个克隆位点的片段。
在含有约60ng切开的pBacPAK8和约5ng切开的Japanin PCR产物的10μl反应物中，用1μl在1×T4DNA连接酶缓冲液(New England Biosciences)中的T4DNA连接酶(New England Biosciences)将Japanin DNA连接至pBacPAK8中。
使用3μl上述连接反应物来转化50μl化学感受态的TOP10大肠杆菌。在补充有氨苄青霉素的LB琼脂上过夜培养后，将分离出的菌落接种至5ml LB(+氨苄青霉素)过夜培养物中，根据制造商的操作说明使用QIAprep离心试剂盒(Qiagen)从中分离出质粒DNA。
使用Bacl和Bac2引物来进行测序。得到的序列确认了所推测的完整cDNA序列的准确性，并且使得可以对无突变的克隆进行选择并用来产生重组杆状病毒(pBacPAK8-Japanin)。
实施例13：在昆虫细胞培养物中表达Japanin
使用flashBac系统来产生表达Japanin的重组杆状病毒，从而用Japanin转移载体和具有缺陷性必需基因的突变病毒来对Sf9昆虫细胞进行共转染。在将Japanin序列插入所述病毒的同时，在强启动子的控制下，所述载体与所述病毒之间的同源重组恢复了所述必需基因的功能。这确保了所有活病毒都包含Japanin DNA。在扩增后，使用重组病毒来感染新鲜Sf9细胞，收集由此得到的培养物上清液并进行DC调节活性筛选。如在图17中所示，发现所述上清液具有DC调节活性，说明产生了功能性的Japanin并分泌到了培养基中，但为了显示出上述活性，有必要先使所述上清液通过100kDa MWCO过滤器来除去病毒颗粒，这大概是因为病毒颗粒的高度刺激性效果压制或规避了Japanin的抑制效果。
使对数生长期的Sf9细胞以1.1×106细胞/孔的密度粘附于6孔板上，随后使用Cellfection转染试剂(Invitrogen)用flashBac gold杆状病毒DNA(Oxford Expression Technologies)和pBacPAK8-Japanin的混合物对其进行转染。将500ng质粒DNA与0.5μl flashBac gold DNA和5μl Cellfectin在1ml Sf900II培养基中混合，在室温温育25分钟来使复合物形成。将培养基从粘附的Sf9细胞上除去并用DNA/Cellfection复合物对其进行置换，过夜温育细胞，之后再添加1ml Sf900II培养基，再继续温育4天。此时收集含有病毒的上清液并于4℃储存在暗处。
随后使用以此方式获得的小体积的病毒储备物接种更大体积的Sf9细胞培养物来扩增该病毒。将0.5ml包含病毒的上清液添加到250ml对数生长期Sf9细胞的振荡培养物中(其中细胞密度为约1.5×106/ml)。随后将所述培养物温育5天，之后收集上清液并于4℃储存在暗处。
为了促进蛋白表达，使用经扩增的病毒储备物以高感染复数来感染Sf9细胞。将25ml病毒储备物添加到250ml对数生长期Sf9细胞培养物中(细胞密度为8×105/ml)。随后将培养物温育3天，之后通过离心来收集上清液。
为了除去病毒颗粒，使5ml上清液样品通过100kDa MWCO Vivaspin 6离心浓缩器(Sartorius)。用常见方法对所述样品和QFT(作为阳性对照)、未过滤的杆状病毒/Japanin上清液及来自表达无关蛋白的杆状病毒-Sf9细胞培养物的上清液一起进行DC调节活性筛选。该结果清楚显示，在所述上清液中存在DC调节活性，但是在未过滤的上清液中病毒颗粒的存在掩盖了所述活性，或许这是因为所述颗粒本身向DC传递压倒性的刺激。此结果确认了作为“Japanin”克隆的蛋白确实具有所预期的DC调节性质，并且其活性形式由Sf9细胞产生。
实施例14：对分离自含有Japanin的昆虫细胞上清液中的蛋白的沉淀
通过添加聚乙二醇(PEG)或硫酸铵来从杆状病毒/Japanin上清液中沉淀出蛋白。用Superdex 75柱通过凝胶过滤来对硫酸铵所沉淀的蛋白进行进一步分级。如在图18中所示，发现在硫酸铵所沉淀的蛋白中以及合并的Superdex级分#22～#38(其含有大部分蛋白)中保留了DC调节活性，但在PEG所沉淀的蛋白中却没有保留。接下来对级分#22～#38进行的筛选揭示了合并的级分#23+#24活性最高。
在冰上通过持续搅拌将PEG逐渐加到上清液中，直至其最终水平为30％(重量/体积)。以相同方式将硫酸铵加至70％(重量/体积)。
将PEG所沉淀的蛋白重溶解于50mM HEPES(pH 7.2)中并用Q柱进行分级。对A280的实时测绘表明级分#4含有明显的蛋白峰，因此用Superdex 75柱通过凝胶过滤将该级分进一步分级。从该柱洗脱出的大部分蛋白都在级分#22和#23中。
将硫酸铵所沉淀的蛋白重溶解于50mM HEPES(pH 7.2)中并用5kDa MWCOVivaspin 6离心浓缩器(Sartorius)将其浓缩15倍。用Superdex 75柱通过凝胶过滤来对浓缩后的蛋白进行分级。对A280的实时测绘表明级分#22～#28含有大部分蛋白。
用常见方法对各自以1∶100稀释的所述样品进行DC调节活性筛选，揭示了活性保留在硫酸铵所沉淀的蛋白中，但在PEG所沉淀的蛋白中却检测不到。正如据此可预期到的，选定的PEG沉淀蛋白的Q柱结合级分未显示出活性，但是与从该Q结合级分得到的Superdex级分#22+#23共温育后却观察到CD86表达略有下降：该结果并不明确，且未进一步进行探究。相反的是，硫酸铵所沉淀的蛋白在浓缩并进行凝胶过滤色谱后保留了其活性，并且接下来进行的在凝胶过滤级分间的比较揭示出级分#23+#24活性最高，因此推定其含有的Japanin浓度最高。
实施例15：对带组氨酸标签的Japanin的克隆
使用三段巢式PCR来再次克隆在C端附加有六残基寡聚组氨酸融合标签(组氨酸标签)的Japanin，其中用pBacPAK8-Japanin来提供模板。用限制性酶对巢式PCR的产物进行酶切，从而便于将其连接至以相似方式进行限制性切割的pBacPAK8质粒。引物被设计来在组氨酸标签和天然蛋白序列之间引入四个附加残基(谷氨酰胺-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)。其目的在于防止因组氨酸标签邻近天然序列而引起的立体位阻，并且还可引入TEV蛋白酶共有断裂位点，从而潜在地促进对所述标签进行蛋白水解性去除。
正向引物7(SEQ ID NO：23)CGTTAGGATCCGGCATTCTTTGAAGCTC
反向引物5(SEQ ID NO：24)ATGAGAGCCTCCTTGTGGATAGCACCTCTCG
反向引物6(SEQ ID NO：25)TTAGTGATGATGATGATGATGAGAGCCTCCTTG
反向引物7(SEQ ID NO：26)AAGTGCGGCCGCTTAGTGATGATGATG
使用Phusion DNA聚合酶(New England Biosciences)在补充有50μM每种dNTP(Bioline)、500nM每种引物和各10pg/μl模板质粒的1×HF缓冲液(New England Biosciences)中来执行第一阶段PCR。在98℃进行30秒的起始变性步骤，随后进行15次如下循环：于98℃10秒[变性]/于70℃30秒[退火]/于72℃15秒[延伸]，最后在72℃再进行5分钟。所用引物是正向引物7和反向引物5。使用QIAquick PCR纯化试剂盒对以此方法进行的20μl反应的产物进行清洁，从而除去引物和核苷酸，并且在30μl洗脱缓冲液中将其洗脱出。
用完全相同的方法执行第二阶段PCR，不同之处在于：退火温度为69℃，由清洁后的第一阶段PCR产物(在去离子水中以1∶10稀释)提供模板，并且所用反向引物为反向引物6。使用QIAquickPCR纯化试剂盒对以此方法进行的20μl反应物的产物进行清洁，从而除去引物和核苷酸，并且在30μl洗脱缓冲液中将其洗脱出。
用与第二阶段PCR完全相同的方法执行第三阶段PCR，不同之处在于：由清洁后的第二阶段PCR产物(在去离子水中以1∶10稀释)提供模板，并且所用反向引物为反向引物7。使用QIAquickPCR纯化试剂盒对以此方法进行的50μl反应的产物进行清洁，从而除去引物和核苷酸，并且在30μl 0.5×洗脱缓冲液中将其洗脱出。在琼脂糖凝胶上对来自该反应的样品进行电泳，使得PCR产物的浓度经估算为约20ng/μl。
在含有BSA和1×缓冲液BamHI的50μl反应物中，于37℃用BamHI和NotI通过20分钟的温育来酶切清洁后的第三阶段PCR产物。酶和缓冲液来自New England Biosciences。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)来清洁反应物以除去酶和切下的片段，并且在30μl洗脱缓冲液中进行洗脱。
为了达到用于最佳连接的约1∶1的摩尔比，将约4.5ng的限制性切割产物连接至50ng此前经BamHI/NotI限制性切割并经CIP处理的pBacPAK8。在10μl含有T4DNA连接酶缓冲液(New England Biosciences)的反应物中使用T4DNA连接酶(New England Biosciences)在室温进行15分钟的连接。使用连接混合物来转化感受态的大肠杆菌TOP10菌株。将离散的菌落接种至5ml液体LB培养基中，并且根据制造商的操作说明使用QIAprep离心试剂盒(Qiagen)分离出质粒DNA。使用Bac1和Bac2引物进行的测序确认了存在编码Japanin融合蛋白的插入序列。自此将该质粒称为pBacPAK8-Jap-TEV-his。
实施例16：对带组氨酸标签的Japanin的分离
如此前对产生未标记的重组Japanin所述，使用flashBac Gold系统用pBacPAK8-Jap-TEV-his来产生重组杆状病毒。再次如前所述，随后使用这些重组杆状病毒来感染250ml Sf9细胞的表达培养物。使用氢氧化铵从培养物上清液中沉淀出蛋白，并使用结合多聚组氨酸基序的IMAC柱来进行纯化。如在图19中所示，对SDS-PAGE凝胶的银染色揭示了在约20kDa处存在重组物特异性蛋白，而且如图20中所示，通过蛋白质印迹确认了该蛋白确实带组氨酸标签。这些结果说明已成功表达了带组氨酸标签的Japanin。
如此前对产生未标记的重组Japanin所述，通过添加硫酸铵至70％(重量/体积)来从250ml pBacPAK8-Jap-TEV-his的3天期表达培养物的上清液中沉淀出蛋白。将所沉淀的蛋白再溶解于60ml pH8的40mM Na2HPO4/300mM NaCl/10％甘油(结合缓冲液)中，并加载至预先装有1ml Talon树脂(Clontech)的柱上。随后用20ml结合缓冲液将该柱清洗两次，并随后用6ml pH8的40mM Na2HPO4/100mM NaCl/300mM咪唑(洗脱缓冲液)进行洗脱。用5000MWCO Vivaspin 6(Sartorius)将洗脱出的蛋白浓缩10倍。
在4％～12％聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶(NuPage预制凝胶，Invitrogen)上对0.5μl样品进行电泳，之后根据制造商的操作说明使用SilverXpress试剂盒(Invitrogen)进行银染色。在两种重组蛋白上清液中明显存在两条位于约20kDa处的主条带，但是所述条带在使用来自受野生型杆状病毒感染的细胞的上清液而平行进行的阴性对照纯化物中却不存在。
对于蛋白质印迹分析，在4％～12％聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶(NuPage预制凝胶，Invitrogen)上对6.5μl样品进行电泳，随后通过湿法印迹(在补充有10％甲醇的NuPage转移缓冲液中施加1小时的30V恒定电压)将其转移至具有0.45μm小孔的硝化纤维膜(Biorad)上。一旦完成转移，用去离子水漂洗该膜，用Tris缓冲盐水/0.1％Tween 20(TBST)清洗5分钟，随后在封闭剂(#B6429，Sigma)中于室温温育1小时。封闭之后，用TBST快速漂洗该膜，随后在封闭剂中用经1∶1000稀释的抗五聚组氨酸抗体(Qiagen)于4℃温育过夜。接下来在TBST中进行5次5分钟的清洗，在10％脱脂奶粉(Marvel)/TBS中用经1∶20000稀释的驴抗小鼠HRP(Jackson Immunoresearch)在室温温育1小时，并在TBST中再进行7次5分钟的清洗。最后，根据制造商的操作说明，通过用ECL底物(Amersham)处理该膜来使抗体可视化，并随后使之与X射线胶片接触10秒。在从上述柱洗脱出的前四个1ml级分中明显存在约20kDa的条带，从而确认了存在具有预期尺寸的带组氨酸标签的蛋白。
实施例17：源自Japanin-TEV-his上清液的样品的DC调节活性
如前所述对源自Japanin-TEV-his上清液的样品进行DC调节活性筛选，其中在测试所述样品时对其进行1∶100的稀释。将源自未标记的重组Japanin的Superdex级分#23+#24作为DC调节活性的阳性对照来进行筛选，而源自受野生型杆状病毒感染的Sf9细胞培养物的样品则作为阴性对照。如在图21中所示，在使用硫酸铵从Japanin-TEV-his上清液中沉淀出的蛋白中存在活性，从而表明已经生成了活性重组融合蛋白。在来自Japanin-TEV-his上清液的经10倍浓缩的Talon柱结合蛋白中也存在活性，从而确认了该活性蛋白的确可结合Talon树脂。与硫酸铵所沉淀的大量蛋白相比，经10倍浓缩的Talon洗脱液活性较低，这未必说明活性有所下降，而在另一方面可能反映出Talon洗脱缓冲液的刺激性效果。
实施例18：对带组氨酸标签的Japanin的纯化
通过使Talon柱洗脱液通过Superdex 75(凝胶过滤)柱来从该洗脱液中进一步将带多聚组氨酸标签的Japanin纯化。根据在银染色的SDS-PAGE凝胶上约20kDa条带的存在来对含有Japanin的级分进行鉴定，并将所述级分合并。根据280nm处的吸光度和消光系数计算出合并级分中的蛋白浓度，其中所述消光系数用expasy.org的ProtParam工具从成熟Japanin的序列预测出。
如前所述通过在24小时后将聚(I:C)加至细胞来对不同浓度(25ng/ml～1.6μg/ml)的纯化的蛋白进行DC调节活性测试。图22显示了浓度在100ng/ml以上时活性达到最大，且到目前为止所进行的单一实验表示在浓度小于25ng/ml时活性可以达到一半。
实施例19：Japanin对DC分化的影响
如前所述，通过用GM-CSF和IL-4进行培养来从人类单核细胞中产生DC。一些培养物中另外补充有200ng/ml的重组Japanin。从第3天到第6天每天对培养物进行CD14和CD1a表达分析。
可以辩驳Japanin对分化所产生的任何影响都是由于重组Japanin的内毒素污染，而不是由于Japanin本身的影响，因此使用LAL测试对Japanin的内毒素含量进行了评估，并发现该含量为约0.540EU/μg(近似相当于0.054ng大肠杆菌LPS/μg Japanin)。
从图23可见，200ng/ml的Japanin极大地改变了分化培养物的发育，其中约50％的单核细胞未能上调CD1a并下调CD14(分化为DC的标志)。对照实验说明了上述结果并不是Japanin的内毒素污染的副作用，在所述对照实验中添加了9pg/ml或40ng/ml大肠杆菌LPS(分别近似相当于使用200ng/ml重组Japanin时其内毒素含量和大于4000倍该含量的内毒素含量)且这两种浓度没有一种对分化有任何显著影响。
实施例20：T细胞增殖测试——混合白细胞反应(MLR)
对于响应于呈递特定抗原(在此情况下为同种异基因MHC)的moDC的T细胞增殖，利用混合白细胞反应(MLR)来评估Japanin对其产生的效果。在此系统中显示Japanin明显抑制T细胞增殖。
将如上所述制备的冷冻的5天期源自单核细胞的DC解冻，并在存在或不存在200ng/ml重组Japanin的情况下再培养2天。
根据制造商的操作说明使用CD3MACS微珠(Miltenyi Biotech)从白细胞层分离出同种异基因T细胞，其中如前所述用Lymphoprep进行PBMC的起始分级。
将T细胞以1×105细胞/孔的密度平板接种至圆底96孔板(Corning)，同时添加受辐照的DC的梯度稀释物。培养基为补充有10％FCS+2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640，且最终体积为200μl/孔。向含有已与Japanin共温育2天的DC的孔中再补充200ng/ml的Japanin。使用包含T细胞但无DC的对照。
将MLR培养物温育4天，之后用0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶来使之产生放射脉冲。随后再将其温育16～18小时，而后使用自动细胞收集器将其收集至玻璃纤维滤膜上，接下来用闪烁计数器对与滤膜结合的放射性DNA进行定量测定。
进行该实验三次，发现在每次实验中用Japanin对DC进行预处理且在MLR培养物中存在Japanin时，都导致T细胞增殖的下降。图24中显示了一个示例性结果。
实施例21：搜索Japanin同源物(安氏革蜱)
通过对EMBL表达序列标签(EST)数据库进行BLAST搜索，从安氏革蜱中鉴定出一种Japanin同源物。目前将该同源物命名为安氏革蜱E1244(EBIID＝EG363153)。用SignalP来鉴定安氏革蜱E1244可能的信号肽部分(残基1～17)，从而使得可以将成熟Japanin序列与所预测的成熟安氏革蜱E1244(DA-E1244)序列进行比较。如在图25中所示，使用BLOSUM62矩阵执行的EMBOSS逐对比对结果显示出在这两种蛋白间存在30.5％的一致性和50.3％的相似性。存在于该数据库中的核苷酸序列在本文中为Seq ID no：32，而其所编码的假定蛋白为Seq ID no：4。
与Japanin的高度同源性强力表明安氏革蜱E1244具有Japanin样的生物活性，因此继续进行工作来产生重组蛋白。
出于此目的，将编码DA-E1244全氨基酸序列的DNA制成合成基因(Seq ID no：3)，并以克隆载体形式提供，且命名为pCR4TOPO-DA-E1244opt (其由Entelechon GmbH，Regensburg依合同完成)。合成的DNA序列始于ATG起始密码子，因此并不含与Kozak共有序列(Kozak consensus)吻合的上游序列，所述Kozak序列是真核生物系统中进行有效翻译的必需前体。为了补救这一问题，设计了具下述效果的引物：所述引物扩增DA-1244并且在产物5’末端增加BamHI识别位点(“GGATCC”)和Kozak-顺应序列“TCCAAA”，并在3’末端增加NotI识别位点(“GCGGCCGC”)。在5’和3’末端都增加“过量”碱基，从而使得限制性酶的位点不在产物末端，因为已知其会抑制限制性切割。
正向引物8(SEQ ID NO：27)GCAGGCATAGGATCCAAAATGAAACTAAACTTT
反向引物8(SEQ ID NO：28)TATTGCGGCCGCTTATTTCGAACACGT
使用在补充有50μM每种dNTP(Bioline)和250nM每种引物的1×HF缓冲液(New England Biosciences)中的Phusion HotStart DNA聚合酶(New England Biosciences)在20μl反应物中执行PCR。用pCR4TOPO-DA-E1244_opt质粒作为模板，其以1ng/lμl存在于反应物中。在98℃进行30秒的起始变性步骤，随后进行15次如下循环：于98℃10秒/于69℃30秒/于72℃15秒，随后在72℃再进行5分钟。
通过在琼脂糖凝胶上对5μl已完成反应的反应物进行电泳来确认存在具有预期尺寸(600bp)的产物，根据制造商的操作说明用QIAquick柱(Qiagen)来清洁剩余物，在缓冲液BamHI(NEB)中用BamHI和NotI(均来自NEB)进行酶切，随后用QIAquick柱再次进行清洁。
随后将经切割并清洁的DA-1244的PCR产物连接到经BamHI/NotI酶切并经小牛小肠碱性磷酸酶处理的pBacPAK8(杆状病毒转移载体)中，用该连接反应物转化感受态大肠杆菌TOP10菌株。
随后挑取转化后的大肠杆菌的孤立菌落并使之在液体培养基中生长，用QIAprep miniprep试剂盒抽提DNA。使用Bac1和Bac2引物进行测序，从而确认在未引入突变的情况下已成功克隆了DA-E1244。
已鉴定出了适合的克隆体(pBacPAK8-E1244)，并将其用于产生重组杆状病毒。
实施例22：搜索其他Japanin同源物
通过对EMBL表达序列标签(EST)数据库进行BLAST搜索，从微小牛蜱(2种同源物)、美洲钝眼蜱和具尾扇头蜱中鉴定出了Japanin同源物。目前将这些同源物分别命名为微小牛蜱CK185494、美洲钝眼蜱CX766068、具尾扇头蜱CD796501和微小牛蜱CV436349。在图26～图29中显示了这些序列的序列比对结果图和一致性百分比图。
在这些鉴定出的同源序列中，仅有微小牛蜱CV436349具有信号肽。对于在其他三个鉴定出的同源物中信号肽的缺失，存在三种可能的解释：i)其并非分泌蛋白；ii)部分序列丢失，或iii)涉及到非标准分泌。
微小牛蜱CK185494和美洲钝眼蜱CX766068均为与Japanin基本同源的脂质运载蛋白。然而，这两个序列均不含有信号肽，如上所述，这表示其不是分泌蛋白或者部分序列丢失。
虽然这些Japanin同源物与Japanin的序列一致性低于从安氏革蜱中鉴定出的同源物，但是其功能据预期与Japanin相似。
实施例23：胆固醇作为Japanin配体的鉴定
已将Japanin描述为脂质运载蛋白，这表示了其可以结合脂质配体的可能性。根据OmCI(一种结合脂肪酸的蜱脂质运载蛋白)的晶体结构，构建了Japanin的假想结构模型，从而为上述观点提供了额外的支持，因为其表示了在Japanin中存在疏水性的开放结合口袋(未示出)。
为了对此进行进一步的研究，如在实施例13中所述，在昆虫细胞培养物中产生了重组Japanin，并如前所述使用连续金属亲和色谱和凝胶过滤来将其纯化。在如下所述使用Bligh和Dyer法进行脂质提取之后，将400μg纯化的重组蛋白用于气相色谱-质谱(GC-MS)分析。
Bligh和Dyer法脂质提取
将3.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)加至0.5ml蛋白样品(或加至0.5ml缓冲液对照)中。将此混合物振荡10～15分钟，随后添加另一份1.25ml氯仿，并通过涡旋振荡1分钟进行混合。随后添加1.25ml超净水，并再进行1分钟的涡旋振荡。对所得样品进行离心，弃去上部的相，保留下部含脂质的相。在氮气下对其进行干燥，并重悬于500μl二氯甲烷中。
气相色谱/电子冲击-质谱(GC/EI-MS)
将1μl从重组蛋白或从缓冲液空白对照中提取出的样品注射至配备有毛细管气相色谱的Perkin Elmer Turbomass四级杆质谱仪中。使用下述条件：
气相色谱：柱＝DB-5。注射＝柱上(On-column)。注射温度＝40℃。温度梯度＝在40℃保持1分钟，随后8℃/分钟直至325℃(并保持10分钟)。载气＝氦。
质谱：电离电压＝70eV。电离模式＝扫描。质谱分辨＝单位。
从质谱获得的数据显示在Japanin样品中在33.1分钟处存在一个峰，而在缓冲液空白对照中却不存在该峰(图30a)。通过将来自该峰的平均谱(图30b)与NIST库中的谱进行比较，可以将其鉴定为胆固醇。在相同条件下对胆固醇参照标准物进行同样处理，得到与平均谱吻合的33.1分钟处的峰，从而确认了上述结果(图30c)。
实施例24：重组Japanin结合游离胆固醇
在含有Ni-NTA磁珠的500μl缓冲液A(120mM NaCl、0.02％Tween、5％甘油、40mM Na2HPO4)中将0.5μg重组的带寡聚组氨酸标签的Japanin于室温温育2小时，从而将该蛋白固定于所述珠上。对照样品中不加蛋白。用500μl缓冲液A将蛋白涂覆的珠清洗三次，随后添加含有0.2μl 3H-胆固醇的50μl缓冲液B(6M胍、120mM NaCl、0.02％Tween、5％甘油、40mM Na2HPO4)(该变性缓冲液用来促进在带放射性标记的胆固醇和与蛋白结合的源自细胞培养物的冷配体之间可能发生的交换)。5分钟后，除去缓冲液B并添加含有另外0.2μl3H-胆固醇的500μl缓冲液A。随后在室温进行3小时的温育。用500μl冰冷缓冲液A将珠清洗1次，再用50μl冰冷缓冲液A将珠清洗2次，从而除去未结合的胆固醇。随后通过将珠重悬于含有咪唑(0.5M)的100μl缓冲液A中来从珠上洗脱出蛋白。图31中的清洗物1和清洗物2指50μl清洗物，每个样品的右侧柱形显示了与珠/蛋白结合的放射量。
在图31中能够见到，这些结果清楚显示了3H-胆固醇与Japanin结合。还不清楚蛋白结合是否需要变性/再折叠，而且对结合强度和结合特异性还必须进行确定。
实施例25：Japanin与DC上的C型凝集素细胞表面受体结合
Japanin抑制DC成熟的能力意味着其具有结合DC表面受体的能力。这看似最可能通过与Japanin的膜受体特异性相互作用而发生，但是亦可能构想到一种作用机制，通过该机制Japanin以非特异性的方式结合并进入细胞(这可能涉及所结合的胆固醇与质膜的相互作用)并随后以细胞类型特异性的方式作用于细胞内信号传导途径。
为了研究Japanin是否以特异性方式与DC表面结合，并为了可以对任何相互作用的性质进行研究，使用商用试剂盒用荧光染料Alexa 488标记Japanin。用500ng/ml的带荧光标记的Japanin于4℃与细胞共温育30～60分钟，随后进行充分清洗，使Japanin的结合可以通过流式细胞计量来显现。
图32a展示了Japanin特异性地结合源自单核细胞的DC，其显示Japanin-Alexa488(图32a～32f中的填充的直方图)与5天期源自单核细胞的DC(如前所述而产生)结合，然而作为对照脂质运载蛋白使用的moubatin-Alexa 488并不结合DC (图32a～32f中的虚线直方图)。此外，Japanin既不与单核细胞结合(图32b)，也不与源自小鼠骨髓的DC结合(图32c)。
鉴于之前所展示的Japanin阻碍单核细胞分化为DC的能力，Japanin不与单核细胞结合令人惊奇。问题就此产生：Japanin如何能够对其明显不会结合的细胞类型产生作用。为了解决这个问题，将Japanin-Alexa 488(图32a～32f中的填充的直方图)或moubatin-Alexa 488(图32a～32f中的虚线直方图)与1天期源自单核细胞的DC(图32d)共温育。发现Japanin与1天期源自单核细胞的DC结合，尽管其程度与5天期源自单核细胞的DC相比较低。这表示Japanin结合受体的上调始于DC分化极早期，因此Japanin可能在此早期阶段作用于细胞来使其分化停滞。
为了研究Japanin-DC相互作用的性质，对甘露聚糖和EDTA的效果进行了考察。1mg/ml甘露聚糖的存在极大地减弱了Japanin-Alexa 488与源自单核细胞的DC的结合(图32e，填充的直方图显示在无甘露聚糖时Japanin-Alexa 488的结合，未填充的直方图显示在甘露聚糖存在时的结合，而虚线直方图显示对照蛋白的结合)，然而0.5mM EDTA的存在则将此结合完全破坏(图32f，如图32d，不同之处在于未填充的直方图显示在EDTA存在时的结合)。综上考虑，这些发现强烈表示Japanin与源自单核细胞的DC上的C型凝集素细胞表面受体结合。
实施例26：Japanin发生N-糖基化
使用NetNGlyc 1.0(生物序列分析中心，Technical University of Denmark)表明，Japanin含有一个很可能的N-糖基化位点和另一个可能的N-糖基化位点(图33a)。如前所述，Japanin与C型凝集素受体的相互作用也表明存在一定程度的糖基化。
为了确认N-糖基化的存在，用PNGase F(一种除去多数N-糖基化形式的酶)于37℃对纯化的重组Japanin(如前所述制备)进行16小时的处理。在SDS-PAGE凝胶上将经PNGase F处理的Japanin与模拟处理的和未处理的Japanin一起电泳，并通过抗组氨酸标签蛋白质印迹来进行可视化。如在图33b中所示，用PNGase F进行的处理导致在经模拟物处理和未处理的Japanin的两条条带之外还出现了一条额外的较小条带。这表明较大的两条条带中的至少一条、可能有两条代表N-糖基化的Japanin。
实施例27：重组Japanin抑制响应于多种不同的刺激物的树突状细胞成熟
如前所述，重组Japanin抑制响应于聚(I:C)(TLR3刺激物)的树突状细胞成熟，所述树突状细胞源自单核细胞，而来自饲养3天的雌性具尾扇头蜱的包含Japanin的Q柱流穿部分抑制响应于LPS(TLR4刺激物)和IFNγ(其通过γ干扰素受体而发挥作用)而非水溶性TNFα(其通过TNFR1发挥作用)的树突状细胞成熟，所述树突状细胞源自单核细胞。通过重复进行这些使用纯化的重组Japanin(如前所述而产生)和用LPS(图34a)、IFNγ(图34b)、TNFα(图34c)、水溶性CD40L(图34d)、IFNα(图34e)或CL097(TLR7/8配体)(图34f)进行刺激的实验(根据前述同样的方法)，使上述这些发现得到了扩展。由除TNFα外的所有这些刺激物触发的树突状细胞成熟都受到Japanin的抑制，而未观察到对TNFα驱动的成熟有显著影响，尽管可能出现微小的抑制。这些发现确认了Japanin能够抑制对大范围的刺激物做出响应的树突状细胞成熟，其通过多个不同的受体和下游信号传导途径来起作用。
实施例28：重组Japanin抑制响应于刺激物的树突状细胞TNFα分泌
除了上调协同刺激分子和II类MHC以外，树突状细胞还通过产生多种细胞因子来对炎性刺激物做出响应。为了评估Japanin是否能够抑制或改变树突状细胞成熟的这一方面，已经评估了Japanin对树突状细胞在响应于两种刺激物(LPS和IFNγ)的混合物时产生促炎性细胞因子TNFα的影响，所述树突状细胞源自单核细胞。
如前所述产生源自人类单核细胞的树突状细胞。在第5天将其收集并以5×105细胞/ml的密度重悬于含有FCS、GCSF和IL4(如前所述)的新鲜培养基中。随后在经组织培养基处理的24孔板中，在存在或不存在纯化的重组Japanin(500ng/ml)的情况下对所述细胞进行培养，24小时后将含有重组人类IFNγ(Peprotech)和超纯大肠杆菌011：B4LPS(Alexis Biochemicals)的刺激物混合物加到一些孔中，至最终浓度为20ng/ml IFNγ+200ng/ml LPS。再过48小时，收集培养物上清液并将其离心以除去细胞和碎片。随后根据制造商的操作说明使用ELISA试剂盒(Insight Biotechnology)来确定TNFα的浓度。
如图35中所示，发现Japanin使响应于刺激物混合物的树突状细胞TNFα分泌下降。
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WO84/03564
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Claims (42)

1.一种树突状细胞(DC)调节分子，其中所述分子调节哺乳动物DC的分化和成熟。
2.如权利要求1所述的树突状细胞(DC)调节分子，其中所述分子抑制哺乳动物DC的分化和成熟。
3.如权利要求1或2所述的DC调节分子，其中所述分子调节或抑制人类DC的分化和成熟。
4.如权利要求1～3中任一项所述的DC调节分子，所述分子分离自吸血节肢动物。
5.如权利要求1～4中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子是蛋白质。
6.如权利要求1～5中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子抑制T淋巴细胞的活化。
7.如权利要求1～6中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子调节T淋巴细胞的极化。
8.如权利要求1～7中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子是免疫抑制剂。
9.如权利要求5～8中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子被糖基化。
10.如权利要求4～9中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子分离自蜱。
11.如权利要求10所述的DC调节分子，其中所述蜱选自下述群体：硬蜱属、凹沟蜱亚科、花蜱亚科、血蜱亚科、扇头蜱亚科(包括璃眼蜱亚科)、纳蜱科、软蜱亚科、残喙蜱亚科、匙喙蜱亚科、Nothhoaspinae和钝缘蜱亚科。
12.如上述权利要求中任一项所述的DC调节分子，所述分子是脂质运载蛋白。
13.如权利要求12所述的DC调节分子，其中所述分子与脂质复合。
14.如权利要求13所述的DC调节分子，其中所述脂质是类固醇或甾醇。
15.如权利要求14所述的DC调节分子，其中所述脂质是胆固醇或胆固醇的代谢产物，例如维他命D3。
16.如上述权利要求中任一项所述的DC调节分子，所述分子与存在于DC外膜上的受体结合。
17.如权利要求16所述的DC调节分子，所述分子与C型凝集素受体结合。
18.如上述权利要求中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子包括：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白；
ii)i)中所定义蛋白的同源物，所述同源物与所述蛋白的一致性至少为60％；
iii)上文i)中所定义蛋白的活性片段，或上文ii)中所定义同源物的活性片段；或
iv)i)、ii)或iii)的功能等价物。
19.如上述权利要求中任一项所述的DC调节分子，其中所述分子包括：
i)包含SEQ ID NO：4、6、8、10或12中任何一个氨基酸序列的蛋白；
ii)i)中所定义蛋白的同源物，所述同源物与所述蛋白的一致性至少为60％；
iii)上文i)中所定义蛋白的活性片段，或上文ii)中所定义同源物的活性片段；或
iv)i)、ii)或iii)的功能等价物。
20.一种核酸分子，所述核酸分子含有编码上述权利要求中任一项所述的DC调节分子的核酸序列。
21.如权利要求20所述的核酸分子，所述核酸分子含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11中的任何一个。
22.一种核酸分子，所述核酸分子在高度严格杂交条件下与权利要求20或21所述的核酸分子杂交。
23.一种载体，所述载体包含权利要求20～22中任一项所述的核酸序列。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求23所述的载体或权利要求20～22中任一项所述的核酸分子。
25.制备权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子的方法，所述方法包括在表达所述蛋白的条件下培养权利要求24所述的宿主细胞并回收由此制得的所述蛋白。
26.一种抗体，所述抗体与权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子结合。
27.一种调节DC的方法，所述方法包括使所述DC与下述物质接触：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞或权利要求26所述的抗体。
28.一种经调节的DC，所述DC通过权利要求27所述的方法制得。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体或权利要求28所述的DC，以及药物可接受载剂。
30.如权利要求29所述的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多于一种的附加治疗剂。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述一种或多于一种的附加治疗剂包括抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白。
32.如权利要求29或30所述的药物组合物，其中所述一种或多于一种的治疗剂包括疾病相关要素。
33.用于治疗用途的以下物质：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～32中任一项所述的药物组合物。
34.用于治疗或预防自身免疫性疾病、移植排斥、急性及慢性炎症性疾病、过敏或超敏反应的用途的以下物质：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～32中任一项所述的药物组合物。
35.用于治疗或预防包括节肢动物传播的疾病在内的传染病的用途的以下物质：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～32中任一项所述的药物组合物。
36.用于治疗和预防癌症的用途的以下物质：权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～30中任一项所述的药物组合物。
37.一种对患有自身免疫性疾病、移植排斥、急性及慢性炎症性疾病、过敏或超敏反应的动物进行治疗的方法，所述方法包括：对所述动物施用权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～32中任一项所述的药物组合物。
38.一种对患有包括节肢动物传播的疾病在内的传染病的动物进行治疗的方法，所述方法包括：对所述动物施用权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～32中任一项所述的药物组合物。
39.一种对患有癌症的动物进行治疗的方法，所述方法包括：对所述动物施用权利要求1～19中任一项所述的DC调节分子、权利要求20～22中任一项所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的宿主细胞、权利要求26所述的抗体、权利要求28所述的DC或权利要求29～30中任一项所述的药物组合物。
40.如权利要求37～39中任一项所述的方法或如权利要求31～34中任一项所述的DC调节分子、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物，其中将所述DC调节分子、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物与疾病相关要素组合施用。
41.如权利要求38所述的方法或如权利要求38所述的DC调节分子、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物，其中所述疾病相关要素选自：与传染原相关的成分；过敏原；与除过敏外的超敏反应相关的非自身成分；与自身免疫性疾病相关的自身成分；移植抗原；和肿瘤抗原。
42.一种如权利要求1～19中任一项所述的调节分子的激动剂或拮抗剂的鉴定方法，所述鉴定方法包括：
(a)在允许与受体结合的条件下，使待筛选的化合物与细胞接触，所述细胞在其表面表达有所述受体，其中所述受体在响应于与所述化合物的结合时能够提供可检测的信号；和
(b)通过测量由所述化合物与所述受体的相互作用产生的信号的水平，来确定所述化合物是否与所述受体结合并活化或抑制所述受体。
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