ES2777207T3 - Partículas cargadas con lisado tumoral - Google Patents
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Abstract
Célula dendrítica aislada que comprende un componente fagocitado que consiste en (i) una partícula de la pared celular de levadura y (ii) un lisado tumoral cargado dentro de la partícula de la pared celular de levadura, en la que la partícula de la pared celular de levadura cargada puede obtenerse liofilizando una combinación del lisado tumoral y la partícula de la pared celular de levadura para atrapar el lisado tumoral.
Description
DESCRIPCIÓN
Partículas cargadas con lisado tumoral
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional estadounidense n.° 61/697.498, presentada el 6 de septiembre de 2012, la solicitud estadounidense n.° 14/019.025, presentada el 5 de septiembre de 2013, y la solicitud estadounidense n.° 14/019.007 presentada el 5 de septiembre de 2013.
Antecedentes de la invención
Una célula tumoral existe en parte porque ha seleccionado una o más mutaciones que le permiten escapar parcial o completamente de la vigilancia inmunitaria in vivo.
En un intento de provocar una respuesta inmunitaria a una célula tumoral, los investigadores anteriores han usado células dendríticas, que son células presentadoras de antígeno profesionales, para presentar antígenos tumorales al sistema inmunitario. Por ejemplo, se han usado células dendríticas pulsadas con péptido o lisado tumoral para vacunar pacientes con melanoma.
Sin embargo, la simple presentación de antígenos tumorales al sistema inmunitario de la manera anterior no ha sido eficaz porque tales antígenos se sometieron a endocitosis simplemente por las células dendríticas y se presentaron generalmente a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II, que sólo provoca a células T cooperadoras y no proporciona una respuesta inmunitaria robusta.
Por el contrario, la presentación de antígenos tumorales por medio de la ruta del MHC clase I contribuye a una inmunidad antitumoral más robusta activando células T CD8+. Los investigadores anteriores han intentado presentar antígenos tumorales a través de la ruta del MHC clase I usando métodos de transferencia de genes. Sin embargo, estos métodos presentan inconvenientes, incluyendo (1) una capacidad limitada para identificar todos los antígenos específicos de tumor importantes, (2) una capacidad limitada para mapear los genes de antígenos tumorales específicos, (3) sólo puede introducirse uno o un pequeño número de genes de antígenos tumorales conocidos en una célula dendrítica y (4) los métodos requieren mucho tiempo y son complicados.
El documento WO 02/39951 se refiere a una vacuna que incluye una célula dendrítica cargada con un antígeno y vehículo de levadura, a métodos de elaboración de la vacuna y al uso de la vacuna para provocar respuestas inmunitarias celulares y humorales en un mamífero.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una célula dendrítica aislada que comprende un componente fagocitado que consiste en (i) una partícula de la pared celular de levadura y (ii) un tumor cargado dentro de la partícula de la pared celular de levadura, en la que la partícula de la pared celular de levadura cargada puede obtenerse liofilizando una combinación del lisado tumoral y la partícula de la pared celular de levadura para atrapar el lisado tumoral.
En realizaciones específicas, el lisado tumoral está presente en una cantidad de desde aproximadamente 200 |ig hasta aproximadamente 500 |ig. En realizaciones específicas, el lisado tumoral está presente en una cantidad de aproximadamente 200 |ig.
En algunas realizaciones, el lisado tumoral es un lisado seleccionado de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores de Wilms, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de próstata y melanoma ocular.
La partícula es una partícula de la pared celular de levadura. En algunas realizaciones, la célula dendrítica es una célula inmadura que se ha aislado durante no más de 8 días.
Otra realización se refiere a una vacuna que comprende la célula dendrítica aislada anterior.
Algunas realizaciones se refieren a un método para producir una célula dendrítica aislada que contiene una partícula cargada con lisado tumoral que comprende: (i) cargar el lisado tumoral en la partícula de la pared celular de levadura para producir la partícula cargada con lisado tumoral; (ii) liofilizar la partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral; y (iii) incubar la partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral con una célula dendrítica, en el que la incubación provoca que la célula dendrítica fagocite la partícula cargada con lisado tumoral.
En realizaciones específicas, el método anterior comprende además (a) resuspender la partícula de la pared celular
de levadura cargada con lisado tumoral en disolución y (b) liofilizar la disolución resuspendida antes de la etapa (iii). En realizaciones específicas, el lisado tumoral se produce mediante congelación y descongelación del tumor. En realizaciones específicas, el método anterior comprende además repetir las etapas de congelación y descongelación. En realizaciones específicas, el método anterior comprende además crioconservar el lisado tumoral a -150°C.
En realizaciones específicas, la etapa (iii) comprende: (a) añadir lisado tumoral en una partícula de la pared celular de levadura, (b) incubar la partícula de la pared celular de levadura, (c) liofilizar la partícula de la pared celular de levadura y (d) lavar la partícula de la pared celular de levadura, en la que las etapas (b)-(c) se repiten al menos una vez con una etapa de adición de agua en la partícula de células de levadura antes de que se repita la etapa (b). En realizaciones específicas, la etapa (iii) comprende: (a) poner en contacto la partícula cargada con lisado tumoral y la célula dendrítica a una razón de aproximadamente 100:1, (b) incubar la partícula cargada con lisado tumoral con la célula dendrítica durante de 1 a 2 horas y (c) recoger la célula dendrítica y lavar la célula.
En una realización preferida, se añade una pequeña cantidad de uno o más adyuvantes de potenciación de la respuesta inmunitaria al tampón de lisis tumoral antes de la incubación con una célula dendrítica. La adición de uno o más adyuvantes aumenta los efectos del lisado tumoral sobre la célula dendrítica mientras disminuye drásticamente cualquier efecto sistémico de tales adyuvantes. Los adyuvantes usados habitualmente incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.
Los adyuvantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, monofosforil lípido A, oligonucleótidos de GpC (tal como ADN de GpC), Poli I:C, Poli ICLc , péptidos de epítopos del MHC II potentes, beta-glucano y citocinas estimuladoras de células dendríticas tales como IL-12. Los adyuvantes adecuados son aquellas moléculas que se sabe que interaccionan con receptores en células dendríticas con el fin de activar células dendríticas y estimular además una generación más robusta de células T, tales como células T CD4+ y CD8+.
En una realización, la cantidad de uno o más adyuvantes de potenciación de la respuesta inmunitaria es de al menos aproximadamente 5 |ig, al menos aproximadamente 10 |ig, al menos aproximadamente 15 |ig, al menos aproximadamente 20 |ig, al menos aproximadamente 25 |ig, al menos aproximadamente 30 |ig, al menos aproximadamente 35 |ig, al menos aproximadamente 40 |ig, al menos aproximadamente 45 |ig, al menos aproximadamente 50 |ig, al menos aproximadamente 60 |ig, al menos aproximadamente 70 |ig, al menos aproximadamente 80 |ig, al menos aproximadamente 80 |ig, al menos aproximadamente 90 |ig, o al menos aproximadamente 100 |ig. En una realización, la cantidad de adyuvante representa entre el 1-10% de la cantidad de lisado total. La cantidad de adyuvante es suficiente para estimular receptores, tales como el receptor de tipo Toll, en la célula dendrítica.
Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a una vacuna para su uso en un método para tratar cáncer, que comprende administrar una vacuna que comprende la célula dendrítica aislada anterior. En aspectos específicos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores de Wilms, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de próstata y melanoma ocular.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa un procedimiento para producir células dendríticas.
La figura 2 representa un procedimiento para producir lisado tumoral.
La figura 3 representa un procedimiento para producir partículas de la pared celular de levadura.
La figura 4 representa un procedimiento para cargar lisado tumoral en partículas de la pared celular de levadura. La figura 5 representa un procedimiento para producir células dendríticas cargadas con partículas de lisado tumoral. La figura 6 es un gráfico que compara el efecto de células dendríticas cargadas con partículas de lisado tumoral frente a la pulsación con antígenos de células dendríticas en células B3Z.
La figura 7A muestra los pulmones de ratones de control afectados con melanoma murino B16F0.
La figura 7B muestra los pulmones de ratones afectados con melanoma murino B16F0 pero tratados con células dendríticas cargadas con partículas de lisado tumoral.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
En el presente documento se hace referencia a diversas metodologías conocidas por los expertos habituales en la técnica.
El término “aproximadamente” en relación con valores e intervalos numéricos significa que el número comprendido no se limita al número exacto expuesto en el presente documento, y pretende referirse a intervalos sustancialmente dentro del intervalo acotado mientras no se aparte del alcance de la invención. Tal como se usa en el presente documento, “aproximadamente” se entenderá por los expertos habituales en la técnica y variará hasta cierto punto en el contexto en el que se usa.
Tal como se usa en el presente documento, “sujeto” o “paciente” indica cualquier animal que necesita tratamiento con una vacuna. Por ejemplo, un sujeto puede estar padeciendo o en riesgo de desarrollar un estado que puede tratarse o prevenirse con una vacuna. Tal como se usa en el presente documento, “sujeto” o “paciente” incluye humanos.
Tal como se usa en el presente documento, las frases “cantidad terapéuticamente eficaz” y “nivel terapéutico” significan la dosificación de vacuna o concentración en plasma en un sujeto, respectivamente, que proporciona la respuesta específica para la que se administra la vacuna en un sujeto que necesita tal tratamiento. Sólo por comodidad, dosificaciones, cantidades de administración de vacuna, cantidades terapéuticamente eficaces y niveles terapéuticos a modo de ejemplo se proporcionan a continuación con referencia a un sujeto humano adulto. Los expertos en la técnica pueden ajustar tales cantidades según prácticas convencionales según sea necesario para tratar un sujeto y/o estado/enfermedad específicos.
Lisado tumoral
Tal como se describe en el presente documento, “lisado tumoral” se refiere a un tumor que se ha lisado. La lisis tumoral puede producirse en varias condiciones, incluyendo congelación y descongelación repetida del tumor, rotura física del tumor por homogeneización, contacto con una disolución hiper o hipotónica y contacto con uno o más detergentes no iónicos. El lisado tumoral no se reticula durante el procedimiento de lisado. En otra realización, el lisado tumoral se produce picando, triturando o machacando el tumor, o pulverizando de otro modo el tumor usando cualquier técnica conocida en la técnica. En otra realización, el lisado tumoral se produce picando, triturando, machacando o pulverizando el tumor en presencia de disolución de tampón fosfato (PBS), tal como 1X PBS.
En realizaciones específicas, el lisado tumoral se produce a partir de un tumor sólido que pesa un mínimo de 200 a 500 |ig.
En otra realización, el lisado tumoral se produce picando, triturando, machacando o pulverizando el tumor seguido por congelación y descongelación repetida. En realizaciones específicas, el tumor picado se congela y descongela múltiples veces. En realizaciones específicas, el tumor picado se congela y descongela al menos 1, 2, 3 ó 4 veces. En algunas realizaciones, la congelación se realiza en nitrógeno líquido, y puede realizarse durante 20 minutos. En realizaciones específicas, la descongelación se realiza a temperatura ambiente. En otra realización, el lisado tumoral se almacena a una temperatura de aproximadamente -135°C o inferior después del procedimiento de congelación y descongelación. En realizaciones específicas, el lisado tumoral se almacena a una temperatura de -150°C o inferior después del procedimiento de congelación y descongelación.
El lisado tumoral puede prepararse a partir de cualquier tumor sólido incluyendo, pero no limitado a, carcinomas y sarcomas. En algunas realizaciones, los tumores sólidos son de tumores relacionados con cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores de Wilms, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de próstata y melanoma ocular.
Pueden añadirse varios agentes de potenciación de la respuesta inmunitaria al tampón de lisis tumoral como adyuvantes para mejorar la respuesta inmunitaria de manera que cuando el lisado tumoral se incuba con una célula dendrítica, los adyuvantes muestran un efecto aumentado sobre la célula dendrítica mientras disminuye drásticamente cualquier efecto sistémico de tales adyuvantes.
Está dentro del ámbito de un experto habitual en la técnica seleccionar uno o más adyuvantes adecuados para esta invención. Por ejemplo, monofosforil lípido A, oligonucleótidos de GpC, Poli I:C, Poli ICLC, péptidos de epítopos del MHC II potentes y citocinas estimuladoras de células dendríticas tales como IL-12, IL-2 y GM-CSF son buenos adyuvantes candidatos de esta invención.
Partícula
Tal como se describe en el presente documento, “partícula” se refiere a cualquier estructura hueca y porosa que puede contener lisado tumoral en la misma y también permite que el lisado salga de la estructura. En algunas realizaciones, el tamaño de la partícula es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 |im, que se aproxima al
tamaño de una bacteria para permitir que los monocitos ingieran la partícula, tales como células dendríticas. En realizaciones específicas, el tamaño de la partícula es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 |im. En realizaciones específicas, el tamaño de la partícula es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5 |im. En algunas realizaciones, la partícula puede ser cualquier partícula con una red de glicanos, siempre que la partícula tenga un tamaño de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 |im.
En algunas realizaciones, la partícula es un vector en perla. El vector en perla no está limitado por la forma o el material, pero puede ser de cualquier forma, tamaño o material que permita que los monocitos fagociten el vector en perla, incluyendo células dendríticas.
La partícula es una partícula de la pared celular de levadura (“YCWP”). La YCWP se prepara a partir de la pared celular de levadura de manera que la partícula es porosa y puede contener lisado en la misma. En una realización, la YCWP se prepara a partir de Saccharomyces cerevisiae. En otra realización, la YCWP es una partícula de cimosano. En otra realización, la YCWP se aproxima en tamaño a las estructuras microbianas que las células del sistema fagocítico mononuclear y otras células fagocíticas ingieren normalmente. En realizaciones específicas, la YCWP es de aproximadamente 1-5 |im.
En una realización, la YCWP se prepara (a) suspendiendo levadura para producir una suspensión, (b) incubando la suspensión, (c) centrifugando la suspensión y retirando el sobrenadante y (d) recuperando la YCWP resultante. En otra realización, las etapas (a)-(d) se repiten al menos 1, 2, 3 ó 4 veces.
En otra realización, la YCWP se prepara (a) suspendiendo levadura en una disolución para producir una primera suspensión, (b) incubando la primera suspensión, (c) centrifugando la primera suspensión y retirando el sobrenadante, (d) suspendiendo el sedimento resultante para producir una segunda suspensión, (e) incubando la segunda suspensión, (f) centrifugando la segunda suspensión y retirando el sobrenadante y (g) lavando el sedimento resultante para recuperar la YCWP. En otra realización, la YCWP se esteriliza.
En realizaciones específicas, la levadura se suspende en NaOH, incluyendo NaOH 1 M. En realizaciones específicas, la primera suspensión se incuba a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 1 hora o durante 1 hora. En realizaciones específicas, la centrifugación se realiza a aproximadamente 2000 veces la gravedad durante aproximadamente 1o minutos, o a 2000 veces la gravedad durante 10 minutos. En realizaciones específicas, el sedimento se suspende en agua, incluyendo agua a aproximadamente pH 4,5 o a pH 4,5. En realizaciones específicas, la segunda suspensión se incuba a aproximadamente 55°C durante aproximadamente 1 hora o a 55°C durante 1 hora. En realizaciones específicas, el sedimento se lava en agua al menos 1, 2, 3 ó 4 veces. En realizaciones específicas, el sedimento se lava una vez.
En otra realización, la YCWP se esteriliza usando isopropanol y/o acetona seguido por el lavado del sedimento. En realizaciones específicas, son apropiados otros alcoholes conocidos. En realizaciones específicas, se permite que se seque completamente la YCWP después de la esterilización. En otra realización, la YCWP se resuspende después de dejar que se seque. En realizaciones específicas, la YCWP se resuspende en PBS, tal como 1X PBS. En otra realización, se permite que se seque la YCWP y luego se congele antes de que se cargue el lisado tumoral en la YCWP, con el fin de colocarla en almacenamiento antes de su uso. En realizaciones específicas, la YCWP se liofiliza y se almacena a aproximadamente 4°C o menos. En realizaciones específicas, la YCWP se liofiliza y se almacena a 4°C.
Partícula cargada con lisado tumoral
La partícula se carga con lisado tumoral. En un aspecto de la divulgación, el lisado tumoral se carga en la partícula incubando el lisado y una suspensión de partículas juntos y permitiendo que penetre el lisado en los interiores huecos de las partículas.
En otro aspecto de la divulgación, después de que se cargue la partícula con lisado tumoral, la combinación se liofiliza para crear un lisado tumoral anhidro dentro de la partícula. Liofilizando la partícula cargada con lisado tumoral, el lisado se atrapa dentro de la partícula y queda listo para que un monocito lo fagocite, tal como una célula dendrítica. En realizaciones específicas, la liofilización es el único mecanismo usado para atrapar el lisado dentro de la partícula. En realizaciones específicas, el atrapamiento no se provoca por un componente separado que bloquea que el lisado salga de la partícula, por ejemplo, mediante atrapamiento físico, unión hidrófoba, cualquier otra unión. En realizaciones específicas, el atrapamiento no está provocado por reticulación o unión de otro tipo del lisado con la partícula fuera de cualquier unión que pueda producirse tras la liofilización.
En otra realización, la partícula se resuspende en disolución después de la liofilización. En realizaciones específicas, la disolución es agua. En realizaciones específicas, la partícula se resuspende para permitir que penetre lisado tumoral adicional en la partícula y luego se liofiliza de nuevo la combinación. En otras realizaciones, la combinación se somete a resuspensiones y liofilización múltiple. En otras realizaciones, la partícula cargada con lisado tumoral se esteriliza en etanol después de la liofilización y antes de su uso.
En realizaciones específicas, el lisado tumoral se carga en la partícula (a) incubando el lisado y una suspensión de las partículas, permitiendo que penetre el lisado en los interiores huecos de las partículas y liofilizando la suspensión de partículas cargadas con lisado y (b) opcionalmente resuspendiendo las partículas, incubando las partículas resuspendidas y liofilizando las partículas resuspendidas y cualquier lisado tumoral que aún no esté en la partícula. En realizaciones específicas que usan YCWP, el número de YCWP es de aproximadamente 1 x 109 y el volumen de lisado tumoral es de aproximadamente 50 |il (generado a partir de aproximadamente 200 |ig de tejido tumoral). En realizaciones específicas, el número de YCWP es de 1 x 109 y el volumen de lisado tumoral es de 50 |il (a partir de aproximadamente 200 |ig de tejido tumoral). En realizaciones específicas, la incubación en la etapa (a) es durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4°C. En realizaciones específicas, la incubación en la etapa (a) es durante 2 horas a 4°C. En algunas realizaciones, la suspensión anterior se liofiliza en la etapa (b) a lo largo de un periodo de aproximadamente 2 horas o a lo largo de un periodo de 2 horas. En algunas realizaciones, las YCWP en la etapa (c) se resuspenden en agua, incluyendo aproximadamente 50 |il de agua o 50 |il de agua. En algunas realizaciones, las YCWP resuspendidas se incuban en la etapa (d) durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4°C o durante 2 horas a 4°C.
Célula dendrítica
Tal como se describe en el presente documento, “célula dendrítica” se refiere a una célula generada a partir de una célula mononuclear de sangre periférica (“PBMC”). En una realización, una célula dendrítica se prepara (a) recogiendo sangre, (b) diluyendo la sangre, (c) realizando una separación por gradiente de densidad de PBMC, (d) lisando glóbulos rojos y lavando las PBMC, (e) incubando las PBMC, (f) retirando células no adherentes y (g) cultivando células adherentes en medios.
En algunas realizaciones, la célula dendrítica es una célula dendrítica inmadura que se ha cultivado durante no más de 5 días. En otras realizaciones, la célula dendrítica se ha cultivado durante 6-8 días.
En realizaciones específicas, la sangre se hepariniza. En realizaciones específicas, la separación por gradiente de densidad en la etapa (c) comprende colocar la sangre en un medio de separación de linfocitos y luego centrifugar la sangre. En realizaciones específicas, la centrifugación se realiza a aproximadamente 1000 veces la gravedad durante aproximadamente 20 minutos o a 1000 veces la gravedad durante 20 minutos. En realizaciones específicas, se realiza una segunda centrifugación antes de la etapa (d) y se realiza a aproximadamente 500 g durante aproximadamente 5 minutos o se realiza a 500 g durante 5 minutos. En realizaciones específicas, se realiza una tercera centrifugación antes de la etapa (d) y se realiza a aproximadamente 500 g durante aproximadamente 10 minutos o se realiza a 500 g durante 10 minutos. En realizaciones específicas, el lisado se realiza usando una disolución de lisado ACK, seguido por incubación, preferiblemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, y seguido por una centrifugación posterior. En realizaciones específicas, las PBMC se lavan en medio RPMI-1640. En realizaciones específicas, las PBMC se incuban en la etapa (e) en matraces a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 1-2 horas o a 37°C durante 1-2 horas. En realizaciones específicas, se añaden medios de DC libres de suero al matraz.
En algunas realizaciones, están presentes una o más citocinas en los medios de cultivo, incluyendo, pero no limitado a, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (800 unidades/ml) e IL-4 (500 unidades/ml).
Partículas cargadas con lisado tumoral fagocitadas en células dendríticas
La partícula cargada con lisado tumoral se fagocita dentro de un monocito, preferiblemente una célula de dendrita. En una realización, la partícula cargada con lisado tumoral se incuba con una célula dendrítica de manera que la célula fagocita la partícula cargada con lisado tumoral.
En realizaciones específicas, la partícula se incuba con la célula dendrítica a una razón de aproximadamente 100:1 o a una razón de 100:1. La incubación puede realizarse durante en aproximadamente 1 hora, 1 hora o preferiblemente menos de 1 hora.
En realizaciones específicas, la célula dendrítica incubada que contiene la partícula de lisado tumoral se recoge y se lava, por ejemplo, al menos 1, 2, 3 ó 4 veces. En otras realizaciones, las células dendríticas se incuban después del lavado y se resuspenden en medio de congelación. En realizaciones específicas, la resuspensión produce una concentración de aproximadamente 10 x 106 células por ml o 10 x 106 células por ml. En realizaciones específicas, la resuspension se congela para almacenamiento antes de su uso.
Vacuna
En un aspecto de la divulgación, la célula dendrítica que contiene una partícula cargada con lisado tumoral es para su uso como vacuna para prevenir y/o tratar una enfermedad, incluyendo cáncer. La enfermedad que va a tratarse no está particularmente limitada, pero depende del lisado tumoral particular cargado en la partícula. Por ejemplo, se usa una vacuna que usa lisado tumoral de un tumor de cáncer de mama para tratar cáncer de mama. En otra
realización, se usan las propias células tumorales del paciente para crear la vacuna. Por ejemplo, la vacuna puede producirse usando lisado tumoral de un tumor asociado con cáncer de mama y luego administrarse al paciente con cáncer de mama del que se ha extraído el tumor. En otra realización, aproximadamente 200 |il de una concentración de 10 x 106 de células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral forma una dosis de la vacuna.
En otra realización, la dosis se administra diluyendo la alícuota de 200 |il hasta un volumen final de 1 ml antes de que se administre la dosis a un paciente. En realizaciones específicas, la alícuota se diluye con solución salina estéril que contiene albúmina sérica humana al 5%. En realizaciones específicas, se necesitará que se descongele la alícuota de 200 |il antes de la dilución. En una situación de este tipo, el periodo de tiempo entre la descongelación y la administración de la dosis a un paciente será de no más de 2 horas. En algunas realizaciones, la alícuota diluida se administra en una jeringa de 3 cc. En algunas realizaciones, se usa una aguja de jeringa de no menos de calibre 23.
En otra realización, a un paciente se le administra al menos 1, 2, 3 ó 4 dosis. En realizaciones específicas, un paciente vuelve a vacunarse una vez cada 4 semanas. En realizaciones específicas, se administrarán aproximadamente 1-2 millones de células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral en cada vacunación. En otra realización, las células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral se administran a un paciente mediante inyección. En realizaciones específicas, las partículas cargadas con lisado tumoral se inyectan en un paciente en o cerca de (1) un tumor o (2) un ganglio linfático.
En algunas realizaciones, la vacuna no se administra con cualquier otro tratamiento inmunodepresor, tal como esteroides o quimioterapia. La vacuna puede administrarse usando cualquier técnica, incluyendo inyección intravenosa e inhalación.
La vacuna también puede contener adyuvantes biológicos, incluyendo, pero no limitado a, ácidos nucleicos tales como oligonucleótidos de GpC, proteínas o epítopos de péptido tales como el péptido p30 de unión a MHC clase II de la vacuna antitetánica.
Ejemplo 1: Preparación de células dendríticas
Se generaron células dendríticas a partir de las PBMC de un paciente. Se recogieron las PBMC del paciente mediante una extracción de sangre de 200 ml siguiendo procedimientos de trabajo convencionales. Luego se transfirió la sangre a tubos de centrífuga de 250 ml y se diluyó 1:1 con 1X PBS. A continuación, se colocaron en capas 35 ml de la sangre diluida sobre 15 ml de medio de separación de linfocitos a temperatura ambiente (LSM; Mediatech) en tubos de 50 ml y se centrifugaron 1000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se retiraron las capas de PBMC por pipeteo a partir de los gradientes de LSM y se colocaron en tubos de centrífuga de 50 ml limpios. Se añadieron cuatro volúmenes de 1X PBS y se invirtieron los tubos para mezclar el contenido. Luego se centrifugaron las PBMC a 500 g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron diez ml de 1X PBS en cada tubo y se resuspendieron y agruparon las células en 1 tubo. Se centrifugaron de nuevo las PBMC a 500 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se resuspendieron en de 20 a 40 ml de disolución de lisado ACK (Cambrex) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se centrifugaron de nuevo las células a 1500 rpm durante 5 minutos. Se resuspendieron las PBMC en 30 ml de medio RPMI-1640 (Mediatech). Luego se transfirieron las células a 2-4 matraces T75. Se incubaron los matraces a 37° C durante de 1 a 2 horas. Luego se retiraron las células no adherentes mediante enjuagado. Después de eso, se añadieron 10 ml de 1X PBS en cada matraz, se agitó el matraz y se retiró el PBS. Después de eso, se añadieron 10 ml de medios de DC completos (medio de DC libre de suero GM-CSF 800 U/ml IL-41000 U/ml) a cada matraz. Luego se incubaron los matraces a 37°C, el 5% de CO2 durante 2 días. En el día 3, se añadieron 10 ml de medio de DC completo a cada matraz. Luego se incubaron las células durante otros 2 días. En el día 6 ó 7, las DC inmaduras resultantes estaban listas para su uso.
La figura 1 proporciona una visión general de la generación de células dendríticas.
Ejemplo 2: Preparación de lisado tumoral
Se obtuvo una muestra tumoral de un paciente. Después de retirar por separación el tejido adiposo y necrótico del tejido tumoral, se pesó el tejido y se añadió 1X PBS (50 |il de PBS por 200 |ig de tejido) y se picó bien el tumor con bisturíes en 1X PBS. Luego se sometieron las células tumorales a 4 ciclos de congelación y descongelación. La congelación se realizó en nitrógeno líquido durante 20 minutos y la descongelación se realizó a temperatura ambiente. Se cuantificó el lisado tumoral preparado mediante un espectrofotómetro. Se tomó una alícuota para pruebas de control de calidad. Se almacenó el resto a < -135°C en preparación para la preparación de vacunas. Pueden añadirse opcionalmente pequeñas cantidades de adyuvante después de los ciclos de congelacióndescongelación.
La figura 2 proporciona una visión general del procesamiento de lisado de células tumorales.
Ejemplo 3: Preparación de YCWP
Se prepararon YCWP a partir de levadura de panadero Fleischmann's o equivalente. En resumen, se suspendieron 10 g de levadura de panadero Fleischmann's en 100 ml de NaOH 1 M y se calentaron hasta 80°C durante una hora. Se recuperaron las paredes celulares de levadura no disuelta mediante centrifugación a 2000 x g durante 10 minutos. Luego se resuspendieron las paredes celulares de levadura recuperadas en 100 ml de agua con el pH ajustado a 4,5 con HCl y se incubaron a 55°C durante una hora adicional, y posteriormente se recuperaron mediante centrifugación. Luego se lavaron las YCWP recuperadas con agua una vez, isopropanol 4 veces y finalmente acetona 2 veces. Una vez que se secaron completamente las YCWP, se resuspendieron en PBS, se contaron, se dividieron en alícuotas en grupos de 1 x 109 partículas y se liofilizaron para su uso en la elaboración de la vacuna. La figura 3 proporciona una visión general del procesamiento de las partículas de la pared celular de levadura. Ejemplo 4: Preparación de YCWP
Se lavaron tres gramos de levadura seca activa (Fleischmann's o equivalente) tres veces en agua suspendiendo la levadura en 30 ml de agua estéril, agitando con vórtex y centrifugando a 800-1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de que decantara el sobrenadante, se resuspendió el sedimento de levadura en 50 ml de NaOH 1 M y se calentó en un baño de agua a 90°C durante 1 hora.
Posteriormente, se centrifugó la suspensión de levadura a 800-1000 x g durante 5 minutos, y se resuspendió el sedimento en 25-30 ml de agua ácida (pH ajustado a 4,5 con HCl). Se repitió la etapa de lavado con agua ácida hasta que el pH de la suspensión era < 7,0. Luego se resuspendió el sedimento en 30 ml de agua ácida y se incubó en un baño de agua a 75°C durante 1 hora. Se recuperó el sedimento de levadura mediante centrifugación a 1000 x g durante 5 minutos, y luego se lavó con 10 ml de agua estéril 3 veces, 10 ml de isopropanol 4 veces y finalmente 10 ml de acetona 2 veces. Se retiró con cuidado la acetona, y se extendió de manera uniforme el sedimento sobre la superficie de vidrio de un vaso de precipitados, se dejó secar al aire durante la noche.
Se recogieron las YWCP secas y se almacenaron en un frasco de vacío a 4°C y luego se lavaron en 10-15 ml de etanol filtrado al 70% 3 veces. Se sonicaron brevemente las YWCP en el lavado final, y se repitió la sonicación si era necesario para dispersar los grupos. Una vez que se retiró el etanol, se lavaron las YWCP en agua estéril. Se dispensaron alícuotas de 100 |il de YWCP en tubos de centrífuga con tapa a presión de fondo redondo de 2,0 ml, se colocaron en un congelador durante 1 hora, se liofilizaron y se almacenaron en un frasco de vacío a 4°C para su uso futuro.
Ejemplo 5: Carga de lisado tumoral en YCWP
Se colocó una suspensión de YCWP completamente anhidras (1 x 109) en contacto con 50 |il de lisado tumoral en PBS (a partir de 200 |ig de tejido tumoral) a lo largo de un periodo de 2 horas a 4°C, permitiendo que penetre el lisado en los interiores huecos de las YCWP para producir YCWP cargadas. Luego se liofilizó la suspensión durante 2 horas. Después de la liofilización, se añadieron 50 |il de agua a las YCWP cargadas, se incubaron durante otras 2 horas a 4°C y se liofilizaron de nuevo para proporcionar YCWP con lisado tumoral seco dentro de sus interiores huecos. Luego se esterilizaron las YCWP cargadas mediante lavado en etanol y se mantuvieron en etanol.
La figura 4 proporciona una visión general del procedimiento de carga de las YCWP.
Ejemplo 6: Carga de YCWP con lisado tumoral
Se mezcló con cuidado una muestra de biopsia de tumor de un paciente con 50-100 |il de tampón de lisis (PBS) (en función de la cantidad de muestra de tumor), evitando burbujas durante el mezclado, y luego se incubó a 4°C durante 30 minutos. Se sometió la mezcla a congelación-descongelación 3 veces en un baño de acetona-hielo seco y un baño de agua a 37°C, y se centrifugó a 4°C durante 10 minutos a velocidad máxima. Se añadieron 50 |il del lisado tumoral preparado en un tubo de centrífuga de 2 ml estéril que contenía 10 mg de YCWP secas de manera que el lisado tumoral líquido cubrió las YCWP. Se incubó la mezcla a 4°C durante 2 horas hasta que el lisado tumoral líquido se absorbió en las YCWP.
Luego se colocó el tubo en un congelador a -85°C durante 30 minutos para una congelación rápida del sedimento. Se colocó el tubo en un liofilizador durante la noche. Se añadieron 50 |il de agua estéril sobre el sedimento de levadura seco y se incubó a 4°C durante 2 horas para permitir que se absorbiera el líquido en los sedimentos.
Se colocó el tubo en un congelador a -85°C durante 30 minutos para una congelación rápida del sedimento. Luego se colocó el tubo en un liofilizador durante la noche. Luego se resuspendieron las partículas secadas en 1 ml de etanol al 70% y se almacenaron a 4°C para su uso futuro.
Ejemplo 8: Preparación de células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral
Se centrifugaron las YCWP cargadas con lisado tumoral en una suspensión de etanol al 70%. Se retiró con cuidado el etanol y se reemplazó con 1 ml de PBS. Se sonicaron las YCWP cargadas. Se lavaron las YCWP cargadas con 1X PBS estéril. Después del lavado final, se resuspendieron las YCWP cargadas en PBS hasta aproximadamente 1 x 108 partículas/100 |il de PBS.
Se añadieron las YCWP cargadas a un cultivo de células dendríticas a una razón de 1:100, y se devolvió el cultivo a la incubadora a 37°C. Posteriormente, se añadieron los siguientes factores al cultivo: se añadieron 50 |ig/ml de TNF-a en agua estéril al cultivo a una razón de 1:5000 en volumen (2 |il por 10 ml de cultivo); se añadieron 10 |ig/ml de IL-1 p en agua estéril al cultivo a una razón de 1:1000 en volumen; se añadieron 10 |ig/ml de IL-6 en agua estéril al cultivo a una razón de 1:1000 en volumen; y se añadió 1 mg/ml de PGE2 en el 100% de etanol al cultivo a una razón de 1:1000 en volumen. Después de añadirse y mezclarse todos los factores en el cultivo, se incubó el cultivo durante la noche.
Ejemplo 9: Recogida de células dendríticas, preparación y crioconservación de la vacuna
Se retiró el cultivo de células dendríticas preparado según el ejemplo 9 de la incubadora. Se realizó el siguiente procedimiento en una campana en condiciones estériles. Se retiraron 10 ml de medios del matraz de cultivo. Se enjuagó el matraz de cultivo con 4,0-4,5 ml de 1X PBS y se añadió también a los medios.
Se añadieron 1,5-2,0 ml de CellStripper™ al matraz de cultivo. Se colocó el matraz de cultivo en una incubadora a 37°C durante 10-20 minutos. Se devolvieron aproximadamente 4 ml de los medios de cultivo al matraz desde el tubo para lavar y retirar las células. Se lavó el matraz para recoger tantas células como fuera posible. Se contaron las células en un hematocitómetro o un dispositivo Cellometer™. Se retiró el sobrenadante después de la centrifugación.
Posteriormente, se resuspendieron las células en CryoStor™ 10 a 5 x 106 células/ml, se tomaron alícuotas en crioviales etiquetados de manera apropiada con el número de ID del paciente, la fecha y la concentración de células a 1,25 x 106 células/ml por vial (aproximadamente 250 |il). Se guardó una porción de 250-500 |il en un criovial para las pruebas de esterilidad, y se almacenaron los viales restantes en recipientes de Styrofoam y se colocaron a -86°C para disminuir la congelación.
Ejemplo 10: Preparación de la vacuna de tumor sólido para la administración a un paciente
Se retiró un criovial de células de un paciente del crioalmacenamiento y se descongeló con cuidado a 37°C en un baño de agua. En condiciones estériles, se añadió suavemente 1 ml de solución salina estéril para inyección con albúmina sérica humana al 5% (o 1 ml de 1X PBS estéril) al criovial que contenía las células. Después de que se resuspendieran con cuidado las células, se extrajo todo el volumen del criovial y se usó la jeringa que contenía las células tumorales para la administración de la vacuna a un paciente.
Ejemplo 11: Células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral frente a células dendríticas (DC) pulsadas con antígeno
Las células B3Z son un hibridoma de células T que expresan un receptor de células T que reconoce específicamente el epítopo OVA(257-264) (SIINFEKL) en el contexto de H-2Kb y que porta un constructo de betagalactosidasa (lacZ) impulsado por un factor nuclear de elementos de células T activados del promotor de interleucina 2 (X). Se usaron estas células B3Z para evaluar la eficacia de las células dendríticas pulsadas con ovoalbúmina frente a aquellas cargadas con ovoalbúmina por medio de YCWP cargadas con ovoalbúmina para la presentación de antígenos, dando como resultado una respuesta de células T CD8+.
Tras la activación mediante la interacción con moléculas del MHC clase I en células dendríticas que presentaban epítopos de ovoalbúmina, se diseñaron por ingeniería genética células B3Z para responder expresando pgalactosidasa. La p-galactosidasa cataliza una rotura de X-gal (5-bromo-4-cloro-indolil-p-D-galactopiranósido) para proporcionar 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol, un producto coloreado en azul. La medición espectroscópica de este color azul proporciona una medición de la presentación eficaz del MHC clase I del epítopo de ovoalbúmina. Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 6, demuestran que la carga de células dendríticas mediante YCWP cargadas con ovoalbúmina proporcionó un aumento de más de 100 veces en la respuesta de células T CD8+ con respecto a células dendríticas pulsadas con ovoalbúmina.
Ejemplo 12: Datos in vitro
Se prepararon células dendríticas a partir de células obtenidas de la médula ósea de fémur y tibia de ambas patas traseras de un ratón C57BL/6J hembra. Se obtuvieron células de melanoma murino B16F0 (ATCC (CRL-6322)) y se cultivaron usando técnicas de cultivo tisular convencionales. Se cargaron las células dendríticas con YCWP que contenían lisado tumoral B16F0 (alrededor de 2x10'15 g/YCWP) a una razón partículas:DC de 100:1 añadiendo las
partículas en el día 7 de un cultivo de células dendríticas durante un periodo de 2 horas. Tres días antes de la preparación de las células dendríticas que contenían partículas cargadas con lisado tumoral, se expusieron ratones C57BL/6J hembra a 0,75 x 106 células de melanoma B16F0 en 0,4 ml de 1X PBS mediante inyección intravenosa. Una vez que se prepararon las células dendríticas que contenían partículas cargadas con lisado tumoral, se inyectó por vía intravenosa a cada ratón en el grupo de tratamiento con 2x106 células dendríticas que contenían partículas cargadas con lisado tumoral y se repitió esta vacunación durante tres dosis semanales. Se monitorizaron los ratones hasta cuatro semanas para determinar la metástasis pulmonar.
Al final de cuatro semanas (cuando murió uno de los ratones de control), se sacrificaron los ratones y se contó cualquier incidencia de metástasis. Los cuatro animales de control que no se trataron con células dendríticas que contenían partículas cargadas con lisado tumoral tenían más de 50 tumores. Sin embargo, ninguno de los animales tratados tenía metástasis medibles. Estos datos indican que las células dendríticas que contenían partículas cargadas con lisado tumoral son eficaces en el tratamiento de cáncer en un sistema de modelo animal probado. Los datos se compilan en la tabla 1.
Tabla 1. Número de metástasis en ratones de control y tratados
Además, la figura 7A muestra los pulmones de tres de los ratones de control (un ratón murió antes del final del experimento y los pulmones no pudieron fotografiarse) en este experimento y la figura 7B muestra los pulmones de los cuatro ratones tratados.
Ejemplo 13: Procedimiento in vivo
Para vacunar a un sujeto, puede crioconservarse una dosis de 1,25 millones de células dendríticas que contienen partículas cargadas con lisado tumoral en 0,2 ml de un medio de congelación libre de suero, con dimetilsulfóxido al 10% (CryoStor™ CS-10, BioLife Solutions, Inc.). Antes de la inyección, pueden descongelarse las células dendríticas y diluirse hasta 1 ml con solución salina estéril para inyección que contiene albúmina sérica humana al 5% (Albuminar-25, Aventis Behring). Luego puede transferirse la dilución a una jeringa de 3,0 cc para inyección y usando una aguja de calibre no menor de 23, que debe administrarse en un plazo de 2 horas desde la descongelación. Puede administrarse la inyección por vía subcutánea en un área de los ganglios linfáticos.
Ejemplo 14: Aislamiento de células mononucleares a partir de sangre periférica completa usando el sistema SepMate-50
Procedimiento:
Ejemplo 15: Generación de células dendríticas combinadas con YCWP cargadas Siguiendo el procedimiento en el ejemplo 14, se realizaron los siguientes métodos: I. Adición de YCWP
II. Preparación y adición de citocinas
Ejemplo 16: Recogida de células, preparación y crioconservación de la vacuna Siguiendo el procedimiento en el ejemplo 15, se realizan los siguientes métodos: Recogida de células:
II. Preparación de la vacuna y crioconservación:
Claims (14)
- REIVINDICACIONESi. Célula dendrítica aislada que comprende un componente fagocitado que consiste en (i) una partícula de la pared celular de levadura y (ii) un lisado tumoral cargado dentro de la partícula de la pared celular de levadura, en la que la partícula de la pared celular de levadura cargada puede obtenerse liofilizando una combinación del lisado tumoral y la partícula de la pared celular de levadura para atrapar el lisado tumoral.
- 2. Célula dendrítica según la reivindicación 1, en la que el lisado tumoral está presente en una cantidad de desde aproximadamente 200 |ig hasta aproximadamente 500 |ig.
- 3. Célula dendrítica según la reivindicación 1, en la que el lisado tumoral está presente en una cantidad de aproximadamente 200 |ig.
- 4. Célula dendrítica según la reivindicación 1, en la que el lisado tumoral es un lisado seleccionado de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores de Wilms, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de próstata y melanoma ocular.
- 5. Célula dendrítica según la reivindicación 1, en la que la célula dendrítica es una célula inmadura que se ha aislado durante no más de 8 días.
- 6. Vacuna que comprende la célula dendrítica aislada según la reivindicación 1.
- 7. Método para producir una célula dendrítica aislada que contiene una partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral que comprende:(i) cargar el lisado tumoral en la partícula de la pared celular de levadura para producir la partícula cargada con lisado tumoral;(ii) liofilizar la partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral; y(iii) incubar la partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral con una célula dendrítica.
- 8. Método según la reivindicación 7, que comprende además (a) resuspender la partícula de la pared celular de levadura cargada con lisado tumoral en disolución y (b) liofilizar la disolución resuspendida antes de la etapa (iii) y después de la etapa (ii).
- 9. Método según la reivindicación 7, en el que el lisado tumoral se produce mediante congelación y descongelación del tumor.
- 10. Método según la reivindicación 9, que comprende además repetir las etapas de congelación y descongelación, opcionalmente que comprende además crioconservar el lisado tumoral a -150°C.
- 11. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa (i) comprende: (a) añadir lisado tumoral en una partícula de la pared celular de levadura, (b) incubar la partícula de la pared celular de levadura, (c) liofilizar la partícula de la pared celular de levadura y (d) lavar la partícula de la pared celular de levadura, en el que las etapas (b)-(c) se repiten al menos una vez con una etapa de adición de agua en la partícula de células de levadura antes de que se repita la etapa (b).
- 12. Método según la reivindicación 7, en el que etapa (iii) comprende: (a) poner en contacto la partícula cargada con lisado tumoral y la célula dendrítica a una razón de aproximadamente 100:1, (b) incubar la partícula cargada con lisado tumoral con la célula dendrítica durante de 1 a 2 horas y (c) recoger la célula dendrítica y lavar la célula.
- 13. Vacuna que comprende la célula dendrítica aislada según la reivindicación 1, para su uso en un método para tratar cáncer, que comprende administrar la vacuna a un paciente que lo necesita.
- 14. Vacuna para su uso según la reivindicación 13, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores de Wilms, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de próstata y melanoma ocular.
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