CN102614510A - 基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗。本文公开了用于接种动物以抗丙型肝炎病毒(HCV)和治疗或预防动物中丙型肝炎病毒感染的组合物，包括疫苗，以及方法。本发明包括多种新HCV融合蛋白，其可直接用作疫苗或者与基于酵母的疫苗媒介物联合使用，来引起动物中针对HCV的免疫应答。本发明还包括本文所述的HCV融合基因和蛋白用于任何诊断或治疗程序以供检测和/或治疗或预防HCV感染的用途。

Description

基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗
本申请是申请日为2005年10月18日、中国申请号为200580043462.0、发明名称为“基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明一般地涉及用于对动物进行抗丙型肝炎病毒(HCV)免疫接种以及治疗或预防动物中丙型肝炎病毒感染的组合物和方法。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)是全世界范围内急慢性肝炎的一种主要致病因素。据估计全世界有二亿慢性HCV感染个体，其中有四百万居住在美国。最重要的感染源是通过胃肠外途径，包括输血和静脉吸毒(IV drug use)。虽然当前血库操作步骤的安全性很高，但感染率仍继续增长，这可能是静脉吸毒或其它形式的暴露所导致的。
根据来自第三次国家健康和营养普查(Third National Health andNutrition Examination Survey，NHANES III)的数据，美国HCV感染患者中有约70％将成为慢性感染者。慢性感染个体中有相当一部分将遭受慢性HCV感染的严重后果，包括发展为肝硬化，肝代偿失调，肝移植，肝细胞癌，及死亡。对HCV慢性感染患者进行的回顾性长期随访研究估计，发展为肝硬化的比例约20％到50％，其中随访时间为10到29年(1-4)。对经过输血后暴露(post-transfusion exposure)的HCV慢性感染患者进行的回顾性长期随访研究估计，发展为肝硬化的比例约10％到15％，其中随访时间相对较短，为8到16年(5-8)。对于病毒感染继发肝硬化的患者，预计每年有约1％到3％会发生肝细胞癌，每年的死亡率约为2％到6％(9-10)。一种使用NHANES III血清流行病学数据和年龄特异性发病率流行病学模型估计，最迟到2015年，美国人群中发展为肝硬化和相关并发症的风险将出现峰值，这预示着不久的将来将出现更加严重的未得到满足的医疗需求(11)。已经在数个大系列中显示，使用基于抗生素的治疗方案阻断慢性病毒感染可有益地改变向肝硬化、肝细胞癌和死亡发展的速率(12-14)。使用包含利巴韦林(ribavirin)的聚乙二醇化干扰素-α方案治疗慢性丙型肝炎基因型I(在美国出现的主要基因型)，持续病毒应答率只有约50％。另外，基于干扰素加利巴韦林的方案还有显著的安全问题，包括抑郁，自杀观念，类似流行性感冒的症状，以及中性粒细胞减少。对于基于干扰素的疗法的部分反应者(partial responder)，复发者(relapsers)和无反应者(non-responders)而言，目前治疗选项是有限的。
HCV是带包膜的正链RNA病毒黄病毒(Flaviviridae)科的成员。其基因组具有约9600个核苷酸，在进入细胞时翻译为约3000个氨基酸的多聚蛋白。由来源于细胞和HCV的蛋白酶共翻译地和翻译后产生3个结构蛋白和7个非结构蛋白(表1)。虽然某些病毒蛋白的作用还没有清楚地确定，已经知道其中的一些，例如HCV结构Core蛋白，E1和E2表面糖蛋白，非结构性的NS2和NS3蛋白酶及NS5B RNA依赖的RNA聚合酶在HCV的生命周期中起关键作用。根据已分离的病毒基因组的遗传异质性，HCV具有6种主要的基因型和多于100种亚型。
基因型1a，1b和2主要在北美和欧洲发现，而在南美，普遍的HCV基因型是1a，1b和3。基因型4，5和6在世界其它所有地区都有发现(19)。虽然某些HCV基因型具有地域性优势，但由于人群迁移的增加，大多数基因型已经在全世界范围内被确认。对于目前被推荐的干扰素/利巴韦林疗法，这些不同的基因型的反应有差异。特别地，当前的治疗方案对～50％的被HCV基因型1感染的患者无效(19)。具非洲血统的美国人(African-American)对干扰素α的反应率低于高加索人种后裔。这些数据提示需要作为选择的治疗手段，其理想地增强个体已有的细胞免疫应答。
表1.HCV基因和基因产物
  基因   功能   HCV基因型1a和1b之间的同源性
  Core   核壳体Core蛋白   98.4
  E1   包膜糖蛋白   81.8
  E2   包膜糖蛋白   79.9
  P7   离子通道   81.0
  NS2   金属蛋白酶   80.1
  NS3   蛋白酶/解旋酶   92.1
  NS4a   NS3蛋白酶辅因子   91.1
  NS4b   未知   82.4
  NS5a   未知   77.7
  NS5b   RNA依赖性RNA聚合酶   87.5
HCV蛋白序列获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，登录号为AF011753(gi：2327074)。使用Genstream生物信息学站点(Insitut de Génétique Humaine，141rue de laCardonille，Montpellíer France)的Align程序比较来自1a和1b株的HCV蛋白的氨基酸序列。
许多研究提示，在HCV感染的个体中，病毒复制、病毒血(viremia)水平和向慢性状态的发展，直接和间接地受CD4+T辅助淋巴细胞(TH)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)所介导的、针对结构性和非结构性病毒蛋白，包括Core和NS3的HCV特异性细胞免疫的影响(15)。慢性HCV感染的人中其它HCV基因型的超感染的出现进一步暗示了这些人缺乏有效的免疫。已有人提出细胞免疫应答的强健性(robustness)和广泛性(breadth)影响HCV感染的自然病程，因此，开发在暴露于病毒的个体中刺激T细胞免疫应答的免疫治疗产品具有十分重要的意义。
对人类和黑猩猩进行的研究显示，HCV可以在血液和肝脏中发生CD4+和CD8+T细胞应答之前繁殖数周。另外，CD8+细胞(可能还有CD4+细胞)功能的获得可能存在延迟，即使在它们在血液中扩增之后(15)。功能性CD8+细胞的出现在动力学上与病毒血相关联，在某些情况下，还与血清转氨酶的上升相关联，提示急性丙型肝炎中的肝脏损害是免疫性的。血液、肝脏或两者中均没有产生可检测的病毒特异性T淋巴细胞应答的个体遭受持续性HCV感染的风险最高。可能最重要的是，细胞免疫应答的产生并不一定保证感染会被永久性地控制。CD4+和CD8+T细胞应答必须在病毒复制的表观控制时点之后持续数周或数月，以防止复发和持续性感染的确立。
CD4+T细胞为CD8+T细胞应答的活化和持续提供辅助，从而在抗-HCV免疫中扮演重要角色。保护性CD4+T细胞似乎主要识别Core、NS3、NS4和NS5蛋白中的表位，虽然针对其它HCV基因产物的应答也有报道(20-21)。除了CD4+T细胞对CD8+T细胞提供的辅助以外，看起来关键的是它们产生γ干扰素以及其它促炎性TH-1而非TH2型细胞因子。对于控制慢性感染而言，HCV特异性记忆CD4+T细胞的建立是同等重要的(20及22)。
CD4+T和CD8+T细胞应答对自限性HCV感染而言是普遍的，这一发现暗示它们协同作用以实现对病毒血的控制。在黑猩猩，可能还有人类中，急性resolving丙型肝炎感染过程中初次接触抗原的(primed)记忆CD4+和CD8+T细胞提供针对病毒持续感染的长期保护。通过抗体介导的各种记忆T细胞亚群的排除(depletion)，黑猩猩模型为CD8+T细胞在急性丙型肝炎的控制中的重要性以及它们对CD4+T细胞辅助的依赖性提供了直接证据(24)。与CD4+T细胞相反，急性和记忆CD8+T细胞似乎同等地识别所有的HCV细胞，并且，象CD4+T那样，可能关键的是它们能产生促炎细胞因子，包括γ干扰素(15)。
急性到慢性HCV感染的转变伴随着HCV特异性CD4+T细胞的显著丧失，这些细胞在宿主的生命过程中似乎不会恢复。CD8+T细胞活性也被损害，因为其不足以消减感染。
人们已经对多种免疫治疗的实验途径进行了研究，包括基于DNA、重组病毒和自身树突状细胞的策略。DNA疫苗可以很好地初次激发人体中的免疫应答，但加强免疫的效果差。相对地，重组病毒加强免疫的效果较好，但受到载体中和(vector neutralization)的限制。最后，基于树突状细胞的疫苗具有患者特异性，而且劳动量大。因此，本领域中对于有效的抗HCV免疫治疗方法的仍然存在需求。
发明概述
本发明的一个实施方式涉及一种疫苗，其包含：a)酵母媒介物；和b)HCV融合蛋白，其中该酵母媒介物重组表达该融合蛋白。所述HCV融合蛋白可以选自任何下述的HCV融合蛋白，其中特别优选包含相互连接的至少一部分HCV NS3蛋白酶和至少一部分HCV Core序列的HCV融合蛋白。
因此，在一个方面中，所述HCV融合蛋白包含相互连接的至少一部分HCV NS3蛋白酶和至少一部分HCV Core序列。优选地，该HCV NS3蛋白酶缺少天然HCV NS3蛋白酶的催化域。在一个方面中，该HCV NS3蛋白酶基本上由全长NS3蛋白中最先的N端88个氨基酸之后的262个HCV NS3氨基酸(对于SEQ ID NO：20为1115到1376位)组成。在一个方面中，HCVCore的疏水C端序列被截短。在一个方面中，HCV Core序列基本上由全长HCV Core序列第2到140位氨基酸(对于SEQ ID NO：20为2到140位)构成。在另一个方面中，HCV Core序列添加并包含了两个氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸。在另一个方面中，HCV Core序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO：10)。在一个方面中，HCV NS3蛋白酶在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：2组成。
在另一个方面中，所述融合蛋白包含全长的、失活的HCV NS3蛋白。在一个方面中，HCV NS3蛋白包含突变，该突变对于SEQ ID NO：20而言在HCV多聚蛋白序列1165位残基处，造成该蛋白质的蛋白水解活性的失活。在另一个方面，所述HCV NS3蛋白酶在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ IDNO：4组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含相互融合的截短的HCV E1蛋白和截短的HCV E2蛋白。在一个方面中，截短的HCV E1蛋白基本上由HCV E1的氨基酸1到156(对于SEQ ID NO：20为192到347位)组成。在一个方面中，截短的HCV E2蛋白基本上由HCV E2的氨基酸1到334(对于SEQ ID NO：20为384到717位)组成。在一个方面中，所述截短的HCV E1蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：6组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白。在一个方面中，所述缺失跨膜域的HCV NS4b蛋白基本上由相互连接的HCVNS4b氨基酸1到69(对SEQ ID NO：20而言为1712到1780位)和HCVNS4b氨基酸177到261(对SEQ ID NO：20而言为1888到1972位)组成。在另一个方面中，所述缺失跨膜域的HCV NS4b蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：8组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含全长HCV Core蛋白、全长HCV E1蛋白和全长HCV E2蛋白，其中全长HCV Core蛋白与全长HCV E1蛋白融合，全长HCV E1蛋白与全长HCV E2蛋白融合。在一个方面中，所述全长HCV Core蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：12组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含截短的HCV Core蛋白，其与缺失跨膜域的HCV E1蛋白及缺失跨膜域的HCV E2蛋白融合。在一个方面中，截短的HCV Core蛋白基本上由HCV Core蛋白2到140位(对于SEQ ID NO：20而言为2到140位)组成。在另一方面中，缺失跨膜域的HCV E1蛋白基本上由HCV E1蛋白1到156位(对于SEQ ID NO：20而言为192到347位)组成。在另一方面中，缺失跨膜域的HCV E2蛋白基本上由HCV E2蛋白1到334位(对于SEQ ID NO：20而言为384到717位)组成。在另一方面中，截短的HCV Core蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：14组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含HCV NS3、HCV NS4a和HCV NS4b，其中HCV NS3与HCV NS4a融合，HCV NS4a与HCV NS4b融合，其中HCVNS3蛋白酶失活，且HCV N24b缺少跨膜域。在一个方面中，HCV NS3蛋白基本上由HCV HS3的1到631位(对SEQ ID NO：20而言为1027到1657位)组成，其中对SEQ ID NO：20而言的1165位上的丝氨酸被丙氨酸取代以使该蛋白酶失活。在一个方面中，HCV NS4a蛋白基本上由HCV NS4a蛋白的1到54位(对SEQ ID NO：20而言为635到691位)组成。在另一个方面中，HCV NS4b蛋白基本上由相互融合的HCV NS4b的1到69位(对SEQ IDNO：20而言为1712到1780位)及HCV NS4b的177到261位(对SEQ ID NO：20而言为1888到1972位)组成。在另一个方面中，HCV NS3蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：16组成。
在另一方面中，所述融合蛋白包含相互融合的HCV NS5a蛋白和HCVNS5b蛋白，其中NS5b蛋白包含NS5b C端的失活性缺失。在一个方面中，HCV NS5a蛋白基本上由HCV NS5a的1到448(对SEQ ID NO：20而言为1973到2420位)组成。在一个方面中，HCV NS5b蛋白基本上由HCV NS5b的1到539(对SEQ ID NO：20而言为2421到2959位)组成。在另一个方面中，HCV NS5a蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。在另一个方面中，融合蛋白基本上由SEQ ID NO：18组成。
在一个实施方式中，所述融合蛋白的表达受诱导型启动子，例如CUP1的控制。
本发明的另一个实施方式涉及分离的HCV融合蛋白，其中该HCV蛋白是任何上述的蛋白，尤其是选自下列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16和SEQID NO：18。
本发明的另一个实施方式涉及分离的核酸分子，其包含编码上述任意融合蛋白的核酸序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白的表达受诱导性启动子，例如CUP1的控制。
本发明的另一个实施方式涉及包含任何这样的分离核酸分子的重组核酸分子。在一个实施方式中，所述重组核酸分子是病毒载体。
本发明的另一个实施方式涉及被任何本文所述的重组核酸分子转染的重组细胞，这样的细胞可包括，但不限于肿瘤细胞或酵母细胞。
本发明的另一个实施方式涉及一种疫苗，其包含(a)如上所述的HCV融合蛋白；(b)药学可接受的载体(carrier)。
本发明的另一个实施方式涉及一种疫苗，其包含(a)树突状细胞；及(b)如上所述的HCV融合蛋白。这样的疫苗还可包含酵母媒介物(vehicle)，其中所述树突状细胞也包含该酵母媒介物。
本发明的另一个实施方式涉及一种疫苗，其包含编码如上所述的HCV融合蛋白的分离的核酸分子。
包括本发明的分离的HCV融合蛋白的上述任何本发明的疫苗可以包含至少一种生物反应调节剂。这样的生物反应调节剂可以包括，但不限于，细胞因子、激素、脂质衍生物、及小分子药物。这样的生物反应调节剂可包括，但不限于：抗-CTLA-4、抗-CD137、抗-CD28、抗-CD40、alemtuzumab、denileukin diftitox、抗-CD4、抗-CD25、抗-PD 1、抗-PD-L 1、抗-PD-L2、FOXP3组滞剂、Flt-3配体、咪喹莫特(imiquimod)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、沙格斯廷(sargramostim)、Toll样受体(TLR)-7激动剂和TLR-9激动剂。
本发明的另一个实施方式涉及保护动物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括对已感染HCV或有感染HCV风险的动物施用本文所述的任何本发明的疫苗，其中对该动物施用所述疫苗减少或防止该动物中的HCV感染或HCV感染导致的至少一种症状。
本发明的另一个实施方式涉及引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对动物施用本文所述的任何本发明的疫苗。
本发明的另一个实施方式涉及在已感染HCV的一群个体中引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对该群体的个体施用任何上述的疫苗。
本发明的另一个实施方式涉及对有感染HCV风险的一群个体进行抗HCV免疫的方法，包括对该群体的个体施用上述的任何疫苗。
在上述任何方法中，所述疫苗可作为包含编码HCV抗原的病毒载体的疫苗的加强剂来施用。在上述任何方法中，可以施用所述疫苗对免疫系统进行初次免疫，然后用不同的HCV疫苗加强免疫。
本发明另一个实施方式涉及上述任何疫苗在保护动物抗HCV感染的制剂中的用途。
本发明的另一个实施方式涉及上述任何疫苗在引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的制剂中的用途。
本发明的另一个实施方式涉及上述任何疫苗在治疗或预防疾病或症候的制剂中的用途。
本发明的另一个实施方式涉及上述任何疫苗在用于免疫有感染HCV风险的一群个体的制剂中的用途。
本发明的另一个实施方式涉及上述任何疫苗在用于治疗感染了HCV的一群个体的制剂中的用途。
本发明涉及下述各项。
1.一种疫苗，包括
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含相互连接的至少一部分HCV NS3蛋白酶和至少一部分HCV Core序列。
2.项1的疫苗，其中所述HCV NS3蛋白酶缺少天然HCV NS3蛋白酶的催化域。
3.项1的疫苗，其中所述HCV NS3蛋白酶基本上由全长NS3蛋白中最先的N端88个氨基酸之后的262个HCV S3氨基酸(对于SEQ ID NO：20为1115到1376位)构成。
4.项1的疫苗，其中HCV Core的疏水C端序列被截短。
5.项5的疫苗，其中HCV Core基本上由全长HCV Core序列第2到140位氨基酸(对于SEQ ID NO：20为2到140位)构成。
6.项1的疫苗，其中HCV Core序列添加并包含了两个氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸。
7.项1的疫苗，其中HCV Core序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H(SEQ ID NO：10)。
8.项1的疫苗，其中所述HCV NS3蛋白酶在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
9.项1的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：2组成。
10.一种疫苗，其包含：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含全长且失活的HCVNS3蛋白。
11.项10的疫苗，其中所述HCV NS3蛋白包含突变，该突变对于SEQID NO：20而言在HCV多聚蛋白序列1165位残基处，该突变造成该蛋白质的蛋白水解活性的失活。
12.项10的疫苗，其中所述HCV NS3蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
13.项10的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：4组成。
14.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含相互融合的截短的HCV E1蛋白和截短的HCV E2蛋白。
15.项14的疫苗，其中截短的HCV E1蛋白基本上由HCV E1的氨基酸1到156(对于SEQ ID NO：20为192到347位)组成。
16.项14的疫苗，其中截短的HCV E2蛋白基本上由HCV E2的氨基酸1到334(对于SEQ ID NO：20为384到717位)组成。
17.项14的疫苗，其中所述HCV E1蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
18.项14的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：6组成。
19.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白。
20.项19的疫苗，其中所述缺失跨膜域的HCV NS4b蛋白基本上由相互连接的HCVNS4b氨基酸1到69(对SEQ ID NO：20而言为1712到1780位)和HCVNS4b氨基酸177到261(对SEQ ID NO：20而言为1888到1972位)组成。
21.项19的疫苗，其中所述缺失跨膜域的HCV NS4b蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
22.项19的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：8组成。
23.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含全长HCV Core蛋白、全长HCV E1蛋白和全长HCV E2蛋白，其中全长HCVCore蛋白与全长HCV E1蛋白融合，全长HCV E1蛋白与全长HCV E2蛋白融合。
24.项23的疫苗，其中全长HCV Core蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
25.项23的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：12组成。
26.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含截短的HCV Core蛋白，该截短的HCV Core蛋白与缺失跨膜域的HCV E1蛋白及缺失跨膜域的HCV E2蛋白融合。
27.项26的疫苗，其中截短的HCV Core蛋白基本上由HCV Core蛋白2到140位(对于SEQ ID NO：20而言为2到140位)组成。
28.项26的疫苗，其中缺失跨膜域的HCV E1蛋白基本上由HCV E1蛋白1到156位(对于SEQ ID NO：20而言为192到347位)组成。
29.项26的疫苗，其中缺失跨膜域的HCV E2蛋白基本上由HCV E2蛋白1到334位(对于SEQ ID NO：20而言为384到717位)组成。
30.项26的疫苗，其中截短的HCV Core蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
31.项26的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：14组成。
32.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含HCVNS3、HCVNS4a和HCVNS4b，且HCVNS3与HCVNS4a融合，HCVNS4a与HCV NS4b融合，其中HCV NS3失活，且HCV N24b缺少跨膜域。
33.项32的疫苗，其中HCV NS3蛋白基本上由HCV HS3的1到631位(对SEQ ID NO：20而言为1027到1657位)组成，其中对SEQ ID NO：20而言的1165位上的丝氨酸被丙氨酸取代以使该蛋白酶失活。
34.项32的疫苗，其中HCVNS4a蛋白基本上由HCVNS4a蛋白的1到54位(对SEQ ID NO：20而言为635到691位)组成。
35.项32的疫苗，其中HCVNS4b蛋白基本上由相互融合的HCVNS4b的1到69位(对SEQ ID NO：20而言为1712到1780位)及HCV NS4b的177到261位(对SEQ ID NO：20而言为1888到1972位)组成。
36.项32的疫苗，其中HCV NS3蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
37.项32的疫苗，其中融合蛋白基本上由SEQ ID NO：16组成。
38.一种疫苗，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含相互融合的HCV NS5a蛋白和HCV NS5b蛋白，其中NS5b蛋白包含NS5b C端的失活性缺失。
39.项38的疫苗，其中HCVNS5a蛋白基本上由HCVNS5a的1到448(对SEQ ID NO：20而言为1973到2420位)组成。
40.项38的疫苗，其中HCVNS5b蛋白基本上由HCVNS5b的1到539(对SEQ ID NO：20而言为2421到2959位)组成。
41.项38的疫苗，其中HCV NS5a蛋白在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
42.项38的疫苗，其中融合蛋白基本上由SEQ ID NO：18组成。
43.项1到42任一项的疫苗，其中所述融合蛋白的表达受诱导型启动子的控制。
44.项43的疫苗，其中所述诱导型启动子是CUP1。
45.项1到42任一项的疫苗，其中所述疫苗还包括树突状细胞，其中该树突状细胞在细胞内装载了重组表达HCV融合蛋白的所述酵母媒介物。
46.项1到45任一项的疫苗，还包括至少一种生物反应调节剂。
47.项46的疫苗，其中所述生物反应调节剂选自下组：细胞因子、激素、脂质衍生物和小分子药物。
48.项46的疫苗，其中所述生物反应调节剂选自下组：抗-CTLA-4、抗-CD137、抗-CD28、抗-CD40、alemtuzumab、denileukin diftitox、抗-CD4、抗-CD25、抗-PD1、抗-PD-L1、抗-PD-L2、FOXP3组滞剂、Flt-3配体、咪喹莫特、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、沙格斯廷、Toll样受体(TLR)-7激动剂和TLR-9激动剂。
49.项1到48任一项的疫苗在保护动物抗HCV感染的制剂中的用途。
50.项1到48任一项的疫苗在引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的制剂中的用途。
51.项1到48任一项的疫苗在治疗或预防疾病或症候的制剂中的用途。
52.项1到48任一项的疫苗在用于免疫有感染HCV风险的一群个体的制剂中的用途。
53.项1到48任一项的疫苗在用于治疗感染了HCV的一群个体的制剂中的用途。
54.保护动物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括对已感染HCV或有感染HCV风险的动物施用项1到48任一项的疫苗，其中对该动物施用所述疫苗减少或防止该动物中的HCV感染或HCV感染导致的至少一种症状。
55.引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对动物使用项1到48任一项的疫苗。
56.在已感染HCV的一群个体中引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对该群体的个体施用项1到48任一项的疫苗。
57.对有感染HCV风险的一群个体进行抗HCV免疫的方法，包括对所述群体的个体施用项1到48任一项的疫苗。
58.项53到57任一项的方法，其中所述疫苗作为对包含编码HCV抗原的病毒载体的疫苗的加强剂来施用。
59.项53到57任一项的方法，其中施用所述疫苗来对免疫系统进行初次免疫，然后用不同的HCV抗原加强免疫。
60.一种分离的HCV融合蛋白，包括相互连接的至少一部分HCVNS3蛋白酶和至少一部分HCV Core序列，其中该HCV NS3蛋白酶缺少天然HCVNS3蛋白酶的催化域。
61.项60的分离的融合蛋白，其中所述HCV NS3蛋白酶基本上由全长NS3蛋白中最先的N端88个氨基酸之后的262个HCV NS3氨基酸(对于SEQ ID NO：20为1115到1376位)构成。
62.项60的分离的融合蛋白，其中HCV Core的疏水C端序列被截短。
63.项62的分离的融合蛋白，其中HCV Core基本上由全长HCV Core序列第2到140位氨基酸(对于SEQ ID NO：20为2到140位)构成。
64.项60的分离的融合蛋白，其中HCV Core序列添加并包含了两个氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸。
65.项60的分离的融合蛋白，其中HCV Core序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO：10)。
66.项60的分离的融合蛋白，其中所述HCV NS3蛋白酶在其N端与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列(MADEAP)连接。
67.项60的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：2组成。
68.一种分离的融合蛋白，该蛋白被基本上由选自下组的核酸序列组成的核酸序列所编码：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18。
69.一种分离的核酸分子，其包含编码项60到68任一项的融合蛋白的核酸序列。
70.一种重组核酸分子，其包含项69的分离的核酸分子。
71.项70的重组核酸分子，其是病毒载体。
72.被项71的重组核酸分子转染的重组细胞。
73.项72的重组细胞，其中该细胞是肿瘤细胞。
74.项72的重组细胞，其中该细胞是酵母细胞。
75.一种疫苗，其包括：
a)项60到68任一项的HCV融合蛋白；和
b)药学可接受的载体。
76.一种疫苗，其包含编码项60到68任一项的HCV融合蛋白的分离的核酸分子。
77.项60到68任一项的疫苗在保护动物抗HCV感染的制剂中的用途。
78.项60到68任一项的疫苗在引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的制剂中的用途。
79.项60到68任一项的疫苗在用于免疫有感染HCV风险的一群个体的制剂中的用途。
80.项60到68任一项的疫苗在用于治疗感染了HCV的一群个体的制剂中的用途。
81.保护动物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括对已感染HCV或有感染HCV风险的动物施用项60到68任一项的疫苗，其中对该动物施用所述疫苗减少或防止该动物中的HCV感染或HCV感染导致的至少一种症状。
82.引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对动物施用项60到68任一项的疫苗。
83.在已感染HCV的一群个体中引起针对HCV抗原的抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法，包括对该群体的个体施用项60到68任一项的疫苗。
84.对有感染HCV风险的一群个体进行抗HCV免疫的方法，包括对所述群体的个体施用项60到68任一项的疫苗。
附图说明
图1A和1B是Western印迹(图1A)和Coomassie染色(图1B)的数字图像，显示截短的NS3-Core融合蛋白和失活的HCV NS3融合蛋白在本发明酵母媒介物中的表达。
图1C是Western印迹的数字图像，显示截短的HCV E1-E2融合蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达。
图1D是Western印迹的数字图像，显示跨膜(TM)域缺失的HCV NS4b融合蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达。
图2说明表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导NS3-和Core-特异性淋巴细胞增殖。
图3A-3C说明表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导NS3-特异性细胞毒效应细胞。
图4显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导细胞毒效应细胞，该细胞毒效应细胞杀灭感染了编码HCV NS3或Core的重组痘苗病毒的肿瘤细胞。
图5是显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导小鼠脾细胞分泌促炎性细胞因子。
图6是显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗按每周一次进行一次，两次，或三次免疫所诱导的增殖的淋巴细胞。
图7A-7D显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗按每周一次进行一次，两次，或三次免疫所诱导的细胞毒效应细胞活性。
图8A和8B显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗按每周一次进行一次，两次，或三次免疫所诱导的酵母特异性促炎细胞因子分泌细胞。
图9显示从根据不同的免疫程序用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗免疫并加强免疫的BALB/c小鼠获得的脾细胞中淋巴细胞增殖。
图10是显示从根据不同的免疫程序用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗免疫并加强免疫的BALB/c小鼠获得的脾效应细胞中细胞毒效应细胞活性的图。
图11A和11B显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导的淋巴细胞增殖应答的持续性。
图12A和12B显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导的细胞毒效应细胞应答的持续时间。
图13A-13D显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导的酵母和NS3特异性细胞因子分泌细胞持续时间。
图14A-14I显示用表达不同量的截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导的细胞毒效应细胞活性。
图15A-15C显示用表达不同量的截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导的促炎性细胞因子分泌细胞。
图16显示用表达截短的NS3-Core融合蛋白或失活的HCV NS3蛋白酶融合蛋白的本发明的疫苗诱导BALB/c小鼠中针对表达HCV NS3的同基因肿瘤细胞攻击的保护性免疫。
图17显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗诱导C57BL/6小鼠中针对表达HCV NS3的同基因肿瘤细胞攻击的保护性免疫。
图18显示来自“被保护的”小鼠的脾细胞中淋巴细胞增殖活性。
图19显示来自“被保护的”小鼠的脾细胞中细胞毒效应细胞活性。
图20显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗在从幼稚荷瘤小鼠分离的脾细胞中刺激细胞毒效应细胞活性。
图21显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗在携带表达HCV NS3的同基因B细胞淋巴瘤的BALB/c小鼠中诱导治疗性免疫。
图22A和22B显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗在携带表达HCV NS3的同基因B细胞淋巴瘤的BALB/c小鼠中诱导治疗性免疫。
图23A和23B显示表达截短的NS3-Core融合蛋白的本发明的疫苗在雄性和雌性新西兰大白兔中诱导酵母特异性淋巴细胞增殖。
发明详述
本发明一般性地涉及用于接种动物以抗丙型肝炎病毒(HCV)和用于治疗或预防动物中丙型肝炎病毒感染的组合物和方法。本发明包括使用具体的基于酵母的疫苗，该疫苗包含酵母媒介物和HCV抗原融合蛋白，该蛋白被选出用于引起动物中针对HCV感染的免疫应答。本发明还包括本文所描述的HCV融合基因和蛋白在任何HCV疫苗和疫苗程序中的应用。
临床证据提示，细胞介导免疫(cell-mediated immunity)促进丙型肝炎病毒(HCV)的清除和感染的控制，而且增强慢性感染个体中的免疫可能在治疗上是有益的。本发明人和其他人报道的先前研究显示，完整的重组酿酒酵母(S.cerevisiae)具有作为疫苗和免疫疗法的载体的潜力(例如，参见1998年11月3日授权的美国专利5,830,463，及2001年11月15日提交的美国专利申请序列号09/991,363，分别将其所有内容通过引用并入本文)。本发明人的基于酵母的免疫治疗产品已被证明在多种动物物种中引起能在体内杀灭表达多种病毒和癌症抗原的靶细胞的免疫应答，并且以抗原特异性的、由CD8+CTL介导的方式实现该作用(16-17)。
本发明涉及对于1998年11月3日授权的美国专利5,830,463和2001年11月15日提交的美国专利申请序列号09/991,363所述基于酵母的免疫治疗产品的相关平台技术的改进。本发明人先前已证实酿酒酵母被树突状细胞高亲和力地吞噬并直接活化树突状细胞，随后树突状细胞将酵母相关蛋白高效地呈递给CD4和CD8T细胞(Stubbs等.Nature Med.5：625-629，2001；及美国专利申请序列号09/991,363，同上)。在自发性肺癌小鼠模型中已证实，表达突变Ras癌蛋白的酿酒酵母特异性地清除携带同源突变的肿瘤(Lu等，Cancer Research 64：5084-5088，2004)，该方法目前正在胰腺癌、肺癌和结肠直肠癌患者中进行一期临床试验检验。基于该平台技术的免疫治疗产品可简单直接地生产，不被宿主免疫应答所中和，可以重复施用来加强抗原特异性免疫应答，且不需要针对具体患者采用特异性的生产方法。
更具体地说，举例而言，本发明人开发了一种基于酵母的疫苗，其包含重组的热灭活的酿酒酵母，该酵母表达新的HCV融合蛋白，该蛋白在一个实施方式中包含至少一部分NS3和Core蛋白序列。其它实施方式包括新的全长失活NS3HCV蛋白，新的截短的E1-E2融合蛋白，及新的TM域缺失的HCV NS4b融合蛋白。参考本文的公开，本发明的其它实施方式将是显而易见的。
HCV Core蛋白和NS3蛋白酶在HCV感染的细胞中丰富地表达，并且为病毒复制所必需；这些特性，加上高度的序列保守性，使得它们成为免疫疗法的良好目标。已经证明本发明的疫苗在动物中针对表达NS3和Core抗原的病毒感染细胞产生抗原特异的增殖性T细胞应答以及细胞毒性T(CTL)细胞应答，并保护动物抵抗表达HCV抗原的肿瘤(见实施例和18)。施用该疫苗可望提高针对HCV NS3和Core蛋白的HCV特异性CD4+T和CD8+T细胞应答，导致病毒载量的减少，并最终导致HCV感染个体中病毒的清除。
用作本发明的基于酵母的疫苗的组分的新HCV融合蛋白是使用在酵母中表达异源抗原的新型构建体产生的，在该构建体中所需抗原性蛋白或肽在其氨基末端与：(a)本文描述的具体合成肽；或(b)内源酵母蛋白的至少一部分相融合；其中任一融合配偶体(fusion partner)均显著地提高该蛋白在酵母中表达的稳定性和/或防止酵母细胞对该蛋白进行翻译后修饰。而且，所述融合肽提供了可被设计为选择剂例如抗体所识别的表位，并且不表现针对构建体中接种抗原的免疫反应的负面影响。这样的制剂可用于鉴定、选择和纯化本发明中有用的蛋白。
另外，本发明考虑使用融合到所述抗原构建体C末端的肽，尤其是用于选择和鉴定该蛋白质。这样的肽包括，但不限于，任何合成或天然的肽，例如肽标签(如6X His)或任何其它短的表位标签。附加于本发明的抗原的C末端的肽可以在有或没有添加上面讨论的N末端肽的条件下使用。
最后，本发明人在本文中描述了供基于酵母的疫苗中使用的数种不同的新型融合蛋白HCV抗原，它们提供来自同一构建体中的一个或多个抗原的多个(两个或更多)免疫原性域。包含多个免疫原性域的融合蛋白的一个例子是包含HCV NS3和Core蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白，其在本文中有描述。其它的例子也在下文描述。
如上所述，NS3和Core在被感染的细胞中丰富地表达，为病毒复制所必需，并含有在急性和慢性感染中被CD4+和CD8+T细胞识别的表位。以这些蛋白为靶位，尤其是在单个疫苗中以上述两种蛋白为靶位的另一个优点在于氨基酸水平的高度保守性。Core和NS3蛋白在美国最普遍的两种HCV株，即HCV基因型1a和1b中都是高度保守的(表1)。Core蛋白在1a和1b株中显示98％的氨基酸同一性，发现其它5种基因型与HCV 1a蛋白序列相比的同一性为86-95％。NS3蛋白在不同的HCV株中也是高度保守的——1a和1b株之间存在92％的氨基酸同一性，且其它HCV基因型与HCV 1a蛋白序列相比的同一性为81-86％。各种HCV基因型之间Core和NS3蛋白的高度保守性，提示有特定的蛋白域对病毒功能而言是必需的。本发明的一种疫苗，虽然是单个产品，但被设计来靶向两种病毒抗原，NS3蛋白酶和Core蛋白。可以容易地扩展该方法，来包括其它必需和保守的HCV病毒蛋白的蛋白质序列，产生更广泛的细胞免疫应答。本文例举了这样的其它融合蛋白和疫苗。
HCV多聚蛋白基因的核酸和氨基酸序列和其编码的多聚蛋白是本领域已知的。例如，丙型肝炎病毒H77株多聚蛋白基因的核酸序列被记载在数据库登录号AF011753(gi：2327074)中，在本文中由SEQ ID NO：19表示。SEQ IDNO：19编码HCV H77株多聚蛋白，其具有本文中SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列。在SEQ ID NO：20中，HCV蛋白包含下列位置：HCV Core(SEQ IDNO：20的1到191位)；HCV E1包膜糖蛋白(SEQ ID NO：20的192到383位)；HCV E2包膜糖蛋白(SEQ ID NO：20的384到746位)；HCV P7离子通道(SEQID NO：20的747到809位)；HCV NS2金属蛋白酶(SEQ ID NO：20的810到1026位)；HCV NS3蛋白酶/解旋酶(SEQ ID NO：20的1027到1657位)；HCVNS4a NS3蛋白酶辅因子(SEQ ID NO：20的1658到1711位)；HCV NS4b(SEQID NO：20的1712到1972位)；HCV NS5a(SEQ ID NO：20的1973到2420位)；和HCV NS5b RNA依赖性RNA聚合酶(SEQ ID NO：20的2421到3011位)。如上所述，HCV的各株显示高度的氨基酸同一性(例如，见表1)。因此，使用本文提供的指导并参考示例HCV株，本领域技术人员将能容易地于本发明的组合物和疫苗中使用源自任何HCV株的多种基于HCV的融合蛋白。
显然，HCV的控制和清除需要CD4+和CD8+T细胞二者，且缺少足够的细胞免疫与慢性感染的发生相关联。因此，一种有吸引力的观点是，刺激慢性HCV感染的个体中已有但不充分的HCV特异性CD4+T和CD8+T细胞将带来治疗上的益处。不受限于理论，本发明人相信，理想的HCV免疫疗法由这样的非病原性载体构成，该载体可将抗原输送进入第I类和第II类MHC抗原呈递途径，以刺激强的CD4+和CD8+T细胞应答。与其它治疗性产品相似，该载体也应该能重复施用。本发明的疫苗和组合物理想地符合这些目标的要求。
本发明之前已知的一些免疫治疗性疫苗制剂由纯化的病毒蛋白组成，这些蛋白被树突状细胞和巨噬细胞(本文中一般又称为抗原呈递细胞或APC)内吞。被吞入的物质中的蛋白质被消化成多肽(10-20个氨基酸)，这些多肽在APC中特化的内体中与第II类MHC结合。然后该肽-第II类MHC分子复合物被表达在APC的表面上。抗原特异性CD4+T辅助细胞(TH)与第II类MHC+肽的联合体结合，变为活化状态并产生淋巴因子。
在没有佐剂条件下细胞外施用的可溶性抗原倾向于刺激2型T辅助细胞(TH2)，该细胞产生淋巴因子，所述淋巴因子作用于B细胞，导致体液免疫应答。TH2应答倾向于抑制对于诱导细胞介导免疫而言重要的1型T辅助细胞(TH1)应答。如果被靶定的病毒抗原在受感染细胞的膜上，那么产生抗体的方法可具有治疗效果。但是，如果被靶定的病毒抗原出现在受感染细胞内部，则抗体通常几乎没有效果。另外，由于对TH2应答的倾向性，CD8+CTL一般不会响应于外源引入的蛋白抗原而被活化。如果针对慢性病毒感染的保护需要CD8+CTL，似乎可以合理地推测，使用重组蛋白的手段可能不成功。
与胞外抗原相反，CD8+CTL响应于任何被靶细胞合成的抗原而被诱导。这些抗原称作内源抗原。受感染细胞合成的病毒蛋白被胞浆蛋白酶体消化成肽(8-10个氨基酸)，随后肽被输送到内质网。在转运到受感染的细胞或肿瘤细胞的表面之前，第I类MHC分子在内质网中的正确折叠依赖于蛋白酶体产生的肽的结合。CD8+T细胞对MHC I受体-肽结合形成复合物起响应，产生淋巴因子，包括IFN-γ，这些淋巴因子通常导致细胞介导型免疫应答，包括杀灭所述受感染细胞。
CTL的有效活化表现为需要IL-2和IL-12。虽然CD8+CTL可产生一些IL-2，但一般承认CD4+TH1细胞是CTL介导型应答的主要IL-2来源。IL-12由树突状细胞和巨噬细胞产生。另外还清楚，为最大程度活化CTL，需要树突状细胞呈递抗原。因此，如同CD4+TH1细胞那样，CTL也需要与抗原呈递细胞(APC)相互作用，以最大程度地活化并对病毒感染的细胞起反应。
最初并不清楚，除了树突状细胞自身被感染以外，病毒感染的细胞合成的抗原如何得以进入树突状细胞中的第I类MHC途径。但是，新近的数据说明，树突状细胞可识别由于感染而发生凋亡的受感染细胞，而且可发生交叉致敏(cross-priming)(外源抗原输送到内源抗原呈递途径中)，使得被树突状细胞和巨噬细胞吞入的细胞/颗粒所结合的一些蛋白得以进入第I类MHC途径(23)。另外，一些“危险”信号(下述)可增强该过程(25)。
免疫应答主要由从细胞外液(extracellular fluids)摄取外来(foreign)物质的树突状细胞和巨噬细胞所引发。增加这些细胞充分呈递抗原的能力应该会导致T细胞介导的细胞免疫应答的增强。就此而言，重组酿酒酵母显示免疫刺激复合物(immunostimulatory complexes，ISCOM)的独特特征(26)，还具有这样的优点，即高度糖基化的酵母具有类似天然佐剂的性质，且可以很容易地接受工程改造以表达多个抗原(16，27-29)。酿酒酵母被专职抗原呈递细胞(professional antigen-presenting cells)，包括巨噬细胞和树突状细胞高亲和力地摄取。酵母相关蛋白通过第I类和第II类MHC被有效地呈递，导致针对肿瘤细胞的保护性、抗原特异性CTL介导型免疫(16-17)。
树突状细胞和巨噬细胞在其表面上具有多种受体，它们充当微生物模式识别分子，即它们根据糖基化模式、脂蛋白和核酸组成的不同来识别病原体。因此，这样的抗原呈递细胞(APC)具有针对以下分子的受体：微生物甘露糖蛋白(mannoproteins)、肽聚糖、葡聚糖、脂蛋白、双链RNA和含CpG岛的DNA(30-32)。这些受体被结合(engagement)则产生所谓“危险”信号，导致树突状细胞成熟，活化，吞噬作用增强，以及与结合物质相关联的抗原的高效呈递(33)。
事实上，树突状细胞和巨噬细胞具有的识别酵母的受体可能多于任何其它的微生物。这些受体包括TLR-2、TLR-4、TLR-6、CD14、Dectin-1、Dectin-2、DEC-205及甘露糖受体家族(30，40)。摄取酵母聚糖(一种酿酒酵母细胞壁粗制备物)导致多种促炎性基因的上调(35)。本发明人的数据显示，小鼠和人树突状细胞和巨噬细胞摄取整个酵母导致多种细胞表面分子的上调，包括黏附分子(ICAM-1，CD54)、共刺激分子(B7-1，B7-2，CD80，CD86)以及第I类和第II类MHC分子，并促进诸如TNF-α、GM-CSF、干扰素-γ、IL-2和IL-12等促炎性TH1型细胞因子的分泌。
除了能直接与树突状细胞相互作用以外，酵母还具有使其成为理想的免疫疗法平台的多种其它性质。首先，可以对多种抗原进行工程改造以在单株酵母中表达(29)，这样的制剂与DNA疫苗具有许多共同的优点，包括容易构建以及靶向多种抗原的能力。和DNA疫苗不同，基于酵母的免疫治疗制剂不需要进行大量纯化来去除可能有毒的污染物。如下面将进一步详述的，重组酵母中表达的异源蛋白充当体外和体内强CD8+CTL介导型免疫应答的抗原(16-17)。在作为预防性及治疗性处理的动物试验中，酵母制剂成功地保护了被免疫动物免于肿瘤生长，并治疗了被免疫动物的肿瘤生长(16-17)。这些结果提示本发明的疫苗作为HCV免疫治疗剂可引发广谱的免疫应答。
在本发明中，发明人创制了一种新的重组酵母免疫治疗剂，本文中又称为GI-5005，其表达诱导型启动子的控制下的HCVNS3-Core融合蛋白。使用NS3-或Core-特异性抗体对GI-5005细胞裂解物进行免疫印迹分析，显示了一种47kD的蛋白质。GI-5005酵母每1000万个细胞表达多于5μg的所述HCV融合蛋白。淋巴细胞增殖、细胞毒作用和细胞因子释放测定显示，用GI-5005酵母注射C57BL/6和BALB/c小鼠诱发了强的NS3和Core抗原特异性T辅助细胞和细胞毒T细胞免疫应答。接种GI-5000系列酵母的小鼠针对用表达HCV抗原的同基因肿瘤细胞进行的攻击受到了保护。本文还给出了免疫原性和肿瘤保护的结果，以及疗法的替代模型中的结果。最后，将描述慢性HCV感染患者中的1期试验。
本发明的疫苗和组合物
本发明的一个实施方式涉及一种组合物(疫苗)，其可在保护动物免于HCV感染或HCV感染导致的疾病，或减轻HCV感染导致的至少一种症状的方法中使用。所述组合物或疫苗。所述疫苗包括(a)酵母媒介物；和(b)该酵母媒介物表达的异源融合蛋白。如上面讨论的，本发明包括数种改进的HCV融合蛋白，用作本发明的疫苗中的抗原，其中这样的疫苗可包括酵母媒介物，但其它不包括酵母媒介物的疫苗也在本发明的考虑之内(见下述)。具体地，本发明提供新的融合蛋白构建体，其稳定所述异源蛋白在酵母媒介物中的表达，防止表达的异源蛋白被翻译后修饰，并且/或者可如本文所述地在没有酵母媒介物的条件下(即，在常规的或其它非基于酵母的疫苗组合物中)用作接种抗原。这些新融合蛋白在一些实施方式中还通过在单个疫苗中使用多种经过选择的抗原而提供广泛的细胞免疫应答。这些融合蛋白在和酵母媒介物一起时，最典型地作为重组蛋白被酵母媒介物表达(例如，被完整的酵母或酵母球芽表达，其中球芽任选地可被进一步加工成酵母细胞形成核(cytoblast)，酵母空胞(ghost)，或酵母膜提取物或其级分)，但作为本发明的一个实施方式，可以如上所述将一种或多种这样的融合蛋白装载到酵母媒介物中或与酵母媒介物复合或混合，来形成本发明的疫苗。
可用于本发明的一种这样的融合构建体是包括下列成分的融合蛋白：(a)至少一种HCV抗原(包括全长抗原的免疫原性域和表位，以及本文中他处所述的多种融合蛋白和多种抗原构建体)；和(b)合成肽。
在一个实施方式中，合成肽与HCV抗原的N末端连接，该肽由至少两个对该HCV抗原而言异源的氨基酸组成，其中该肽稳定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表达，或者防止表达的融合蛋白被翻译后修饰。合成肽和抗原的N末端部分一起形成融合蛋白，其有如下的要求：(1)该融合蛋白第1位的氨基酸残基是甲硫氨酸(即，合成肽的第一个氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白的第二位的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸(即，合成肽的第二个氨基酸不是甘氨酸或脯氨酸)；(3)融合蛋白第2-6位的任何氨基酸残基都不是甲硫氨酸(即，第2-6位的氨基酸都不包含甲硫氨酸，不管它们是所述合成肽的部分，还是所述蛋白的部分-当合成肽短于六个氨基酸时)；及(4)融合蛋白第2-6位的任何氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸(即，第2-6位的氨基酸都不包含赖氨酸或精氨酸，不管它们是所述合成肽的部分，还是所述蛋白的部分-当合成肽短于五个氨基酸时)；合成肽可以短达2个氨基酸，但更优选为至少2-6个氨基酸(包括3、4、5个氨基酸)，且可长于6个氨基酸，以整数计，可长达约200个氨基酸。
在一个实施方式中，所述肽包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中M是甲硫氨酸，其中X2是除了甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X3是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X4是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X5是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；且其中X6是除了甲硫酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸。在一个实施方式中，X6残基是脯氨酸。一种增强HCV抗原在酵母细胞中表达的稳定性和/或防止该蛋白在酵母细胞中被翻译后修饰的示例性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO：9)。除了表达产物的稳定性增强之外，本发明人相信该融合配偶体不会负面影响针对构建体中的接种抗原的免疫应答。此外，可以在合成融合肽中设计出可为选择剂例如抗体所识别的表位。
在本发明的另一个实施方式中，编码本发明中使用的合成肽的翻译起始位点的核酸是A-C-C-A-T-G-G(SEQ ID NO：21)，其遵循Kozak翻译序列规则，该序列中的ATG是初始翻译起始位点，并编码M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO：9)的甲硫氨酸。
应当理解，本文中描述的本发明的多个实施方式也可以组合。例如，在本发明的一个方面中，当合成肽是M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO：9)时，编码该肽的起始位点的核酸可以是如上所述的A-C-C-A-T-G-G(SEQ ID NO：10)。本发明的多种实施方式的组合对本领域的技术人员而言将是显而易见的。
本文的另一个具体实施方式与上面的实施方式相似，并可包含上述实施方式的限制(虽然这不是必须的)，其包括一种疫苗，该疫苗包含：(iii)与HCV抗原的C末端连接的肽，该肽由至少2个对该HCV抗原而言异源的氨基酸残基组成，其中该肽稳定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表达或防止表达的融合蛋白被翻译后修饰。在本发明的一个示例性的方面中，所述肽包含氨基酸序列E-D(Glu-Asp)。这样的序列起到抵消疏水性的作用。
根据本发明，“异源氨基酸”是下述的氨基酸的序列：所述氨基酸天然地不存在于(即，不存在于天然状态下，体内)指定氨基酸序列侧翼；或者所述氨基酸与指定的氨基酸序列的功能不相关；或者当编码指定氨基酸序列的天然核酸序列存在于基因中时，所述氨基酸不被该核酸序列侧翼的核苷酸所编码，如果所述核苷酸的天然序列是按照给定氨基酸序列的来源生物的标准密码子用法翻译的话。因此，对HCV抗原而言异源的至少2个氨基酸残基，是天然地不存在于HCV抗原两侧的任何氨基酸残基。
本发明另一实施方式涉及可用于保护动物免受HCV感染或该感染导致的症状的组合物(疫苗)，其包含：(a)酵母媒介物；及(b)酵母媒介物表达的异源蛋白。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含(i)至少一种HCV抗原(包括全长抗原的免疫原性域和表位，以及本文中他处所述的多种融合蛋白和多种抗原构建体)，其与(ii)连接于所述HCV抗原的N末端的酵母蛋白相融合，其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约2个到约200个氨基酸构成，其中所述酵母蛋白显著地提高该融合蛋白在酵母媒介物中表达的稳定性或者防止该融合蛋白被酵母细胞翻译后修饰。另外，所述内源酵母抗原，如所述合成肽一样，该融合配偶体似乎不负面影响针对该构建物中的接种抗原的免疫应答。本发明的这个方面可以结合上述的本发明的其它实施方式使用。
所述内源酵母蛋白由内源酵母蛋白的约2-200个氨基酸(或最多22kDa)构成，其中所述酵母蛋白稳定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表达或防止表达的融合蛋白被翻译后修饰。在该实施方式中可使用任何合适的内源酵母蛋白，特别优选的蛋白包括但不限于SUC2(酵母转化酶；其在同一启动子驱动下既能将蛋白表达在胞质溶胶中又能将其导入分泌途径，因此是良好的候选，但其依赖于培养基中的碳源)，α因子信号前导序列；SEC7；CPY；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PCK1，磷酸甘油激酶PGK和丙糖磷酸异构酶TPI基因产物，以利用其在葡萄糖中可被阻遏的表达及胞质溶胶定位；Cwp2p，以利用其在细胞壁中的定位及滞留；热休克蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1和KAR2，当细胞被暴露于热处理时它们被诱导表达，且它们的蛋白更加热稳定；线粒体蛋白CYC1，用于向线粒体的输入；BUD基因，用于在形成子细胞的初始阶段定位于酵母细胞芽；ACT1，用于锚定到肌动蛋白束上。
在一个实施方式中，此处的融合蛋白中使用的内源酵母蛋白/肽或合成肽包含用于鉴定和纯化所述融合蛋白的抗体表位。选择性结合内源抗原的抗体可以是现成可得的，或者可以容易地产生。最后，如果希望将蛋白导向特定的细胞位置(例如，进入分泌途径，进入线粒体，进入细胞核)，则构建体可使用所述酵母蛋白的内源信号，以确保对该输送系统而言细胞机制是最优化的。优选地，可以获得或者生产了选择性结合所述融合配偶体的抗体。根据本发明，短语“选择性结合”指本发明的抗体、抗原结合片段或结合配偶体(binding partner)优先结合指定蛋白质的能力。更具体地，短语“选择性结合”指一种蛋白对另一蛋白的选择性结合(例如，抗体、其片段或结合配偶体对抗原)，其中以任何标准测定(例如免疫测定)所测得的结合水平统计学显著地高于所述测定的背景对照。例如，当进行免疫测定时，对照通常包括只含有抗体或抗原结合片段(即没有抗原)的反应孔/管，其中将所述抗体或其抗原结合片段在没有抗原条件下的反应性(例如对孔的非特异性结合)的量看作背景。可以使用本领域标准的多种方法，包括酶免疫测定(例如ELISA)、免疫印迹测定等，来测量结合。
在一个实施方式中，本发明的疫苗可包含连接于HCV抗原C末端的肽，其中所述肽使得该融合蛋白可被针对该肽的抗体识别。在一个方面中，所述肽包含氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO：10)。该实施方式可以单独使用或者与上述的融合蛋白的其它方面联合使用。
如上面所讨论的，本发明的疫苗和组合物中使用的融合蛋白包含用于接种动物的至少一种HCV抗原。所述组合物或疫苗可包括一种，两种，少数种，数种或多种HCV抗原，包括一种或多种HCV抗原的一种或多种免疫原性域，视需要而定。例如，本文所述的任何融合蛋白可包括选自下列的一种或多种HCV蛋白的至少一部分：HCV E1包膜糖蛋白，HCV E2包膜糖蛋白，HCV P7离子通道，HCV NS2金属蛋白酶，HCV NS3蛋白酶/解旋酶，HCVNS4a NS3蛋白酶辅因子，HCV NS4b，NCV NS5a，HCV NS5b RNA依赖性RNA聚合酶，及HCV Core序列。在优选的实施方式中，至少一部分HCV Core序列与至少一部分不同于HCV Core序列的HCV蛋白连接。在另一个方面中，所述融合蛋白包含一种或多种HCV抗原的至少一种或多种免疫原性域。
根据本发明，本文中术语“抗原”一般用于指：蛋白质(肽、部分蛋白质、全长蛋白质)的任何部分，其中所述蛋白质是天然的或合成而来的；细胞组合物(整个细胞，细胞裂解物或破碎的细胞)；生物体(整个生物体、裂解物或破碎的细胞)或糖或其它分子，或者其部分，其中所述抗原引起抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，或为耐受原针对被施用该抗原的动物的细胞和组织中遇到的相同或相似的抗原。
在本发明的一个实施方式中，如果刺激免疫应答是有利的，术语“抗原”可以与术语“免疫原”互换使用，且在本文中用来描述这样的蛋白、肽、细胞组合物、生物体或其它分子，其引发体液和/或细胞免疫应答(即为抗原性)，以致于对动物施用该免疫原(例如通过本发明的疫苗)后，针对该动物的组织中遇到的相同或相似抗原产生抗原特异性免疫应答。因此，针对特定抗原免疫动物，在一个实施方式中意味着作为施用该抗原的结果，引发了针对该抗原或其免疫原性或耐受原性部分的免疫应答。接种优选地导致保护性或治疗性效应，其中接种之后暴露于抗原(或抗原源)将引发针对该抗原(或抗原源)的免疫应答，减轻或预防该动物体内的疾病或病症。接种的概念在本领域是公知的。施用本发明的治疗性组合物所引发的免疫应答，可以是免疫应答的任何方面(例如细胞免疫，体液免疫，细胞因子产生)相比于没有施用该疫苗时发生的任何可检测的改变。
“接种抗原”(vaccinating antigen)可以是免疫原或耐受原，但其是疫苗中使用的抗原，针对该接种抗原引发生物应答(免疫应答的引发，耐受)。
给定抗原的免疫原性域(部分，片段，表位)可以是抗原的任何下述的部分(即，肽片段或亚单位或抗体表位或其它构象表位)：其含有至少一个施用于动物时充当免疫原的表位。例如，单个蛋白可含有多个不同的免疫原性域。在体液免疫的情况下，免疫原性域并非必需是蛋白质内的线性序列。
本文中表位定义为给定抗原内足以引发免疫应答的单个免疫原性位点，或者给定抗原内足以抑制、缺失或失活免疫应答的单个耐受原性位点。本领域技术人员将认识到，T细胞表位的大小和组成与B细胞表位不同，且通过第I类MHC途径呈递的表位与通过第II类途径呈递的表位不同。表位可以是线性序列或构象表位(保守结合区)，取决于免疫应答的类型。抗原可以小到单个表位，或者更大，可以包含多个表位。就其本身而言，抗原的大小可以小到约5-12个氨基酸(例如，肽)，可以大到：全长蛋白，包括多聚体和融合蛋白，嵌合蛋白，整个细胞，整个微生物，或其部分(例如，整个细胞的裂解物或微生物提取物)。另外，抗原可包括糖类，其可加载到酵母媒介物中或本发明的组合物中。应当理解，在一些实施方式中(即当酵母媒介物从重组核酸分子表达该抗原时)，抗原是蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白，或其片段，而不是整个细胞或微生物。本文中描述了本发明优选的HCV融合蛋白。
在本文的另一个实施方式中，所述疫苗的HCV抗原部分作为包含两个或多个抗原的融合蛋白产生。在一个方面中，所述融合蛋白可包括一种或多种抗原(例如本文所述的HCV NS3序列和HCV Core序列)的两个或更多免疫原性域或两个或多个表位。这样的疫苗可在广范围的患者中提供抗原特异性免疫。例如，可用于本发明的多域融合蛋白可具有多个域，其中每个域由来自特定蛋白的肽组成，所述肽由至少4个氨基酸残基组成，所述氨基酸残基位于所述蛋白的任一侧翼并包含该蛋白中的突变氨基酸，其中所述突变与特定的疾病或病症(例如HCV感染)相关联。
在本发明的一个实施方式中，产生的本文描述的任何氨基酸序列可带有至少1个，多达约20个附加的异源氨基酸，这些氨基酸位于指定的氨基酸序列的C和/或N末端之一的侧翼。所得的蛋白或多肽可称为“基本上由”所指定的氨基酸序列构成。如上面讨论的，根据本发明，异源氨基酸是下述的氨基酸的序列：所述氨基酸天然地不存在于(即，不存在于天然状态下，体内)指定氨基酸序列的侧翼；或者所述氨基酸与指定的氨基酸序列的功能不相关；或者当编码指定氨基酸序列的天然核酸序列存在于基因中时，所述氨基酸不被该核酸序列侧翼的核苷酸所编码，如果所述核苷酸的天然序列是按照给定氨基酸序列的来源生物的标准密码子用法翻译的话。类似地，短语“基本上由......组成”当对本文中的核酸序列使用时，是指下述的编码指定氨基酸序列的核酸序列，在该编码指定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端之任一的侧翼可具有至少一个，多达约60个附加异源核苷酸。异源核苷酸是这样的核苷酸：当编码指定的氨基酸序列的核酸序列存在于天然基因中时，它们天然不存在于(即不存在于天然状态下，体内)该序列的侧翼；或者它们不编码赋予具有指定的氨基酸序列的蛋白质以任何其它功能，或改变其功能的蛋白质。
在本发明的一个优选的方面中，HCV抗原是由HCV NS3蛋白酶和Core序列组成的HCV蛋白。在另一个方面中，HCV抗原由相互连接的HCV NS3蛋白和HCV Core序列构成，其中HCV NS3蛋白缺少天然NS3蛋白的催化域。在另一个方面中，HCV抗原由天然NS3蛋白中最先的N端88个氨基酸之后的262个HCV NS3氨基酸(即HCV NS3的89-350位；SEQ ID NO：20)构成。在一个方面中，所述HCV Core序列缺少疏水性C末端序列。在另一个方面中，HCV Core序列缺少C末端的两个氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸。在一个优选的方面中，HCV Core序列由天然HCV Core序列的2到140位氨基酸构成。
实施例1描述了这样的疫苗的一个例子。在这个实施方式中，酵母(例如酿酒酵母)经过工程改造，在铜诱导型启动子CUP1的控制下表达HCVNS3-Core融合蛋白。该融合蛋白是单个多肽，其中下列序列元件从N末端到C末端共阅读框地融合(括号中为HCV多蛋白(SEQ ID NO：20)的编号，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：2)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：2的1到6位)；(2)HCV NS3蛋白酶蛋白的氨基酸89到350(SEQ ID NO：20的1115到1376)(SEQ ID NO：2的6到268位)；(3)克隆过程中导入的单个苏氨酸残基(SEQ ID NO：2的269位)；(4)HCV Core蛋白的氨基酸2到140(SEQ ID NO：20的2到140)(SEQ ID NO：2的270到408位)；和(5)增加Core变体亲水性的E-D序列(SEQ ID NO：2的409到410位)。本文中SEQ ID NO：1表示编码SEQID NO：2的融合蛋白的核酸序列。
在本发明另一个优选的方面中，HCV抗原是失活的全长HCV NS3，其构成本发明的融合蛋白的一部分。实施例2描述了这样的疫苗的一个例子。在这个实施方式中，酵母(例如酿酒酵母)经过工程改造，在铜诱导型启动子CUP1的控制下表达失活的全长HCV NS3融合蛋白。包含该全长HCV NS3的融合蛋白是单个多肽，其中下列序列元件从N末端到C末端共阅读框地融合(括号中为HCV多蛋白的编号，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：4)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：4的1到6位)；和(2)HCV NS3蛋白酶蛋白的氨基酸1到631(SEQ ID NO：20的1027到1657)(SEQ ID NO：4的7到637位)(注意，为了使蛋白水解活性失活，HCV多肽1165位残基的氨基酸已经从丝氨酸改变为丙氨酸)。本文中SEQ ID NO：3表示编码SEQ ID NO：4的融合蛋白的核酸序列。
在本发明的另一个方面中，酵母疫苗包含截短的HCV E1-E2融合蛋白。实施例3描述了这样的疫苗的一个例子。在这个实施方式中，经过工程改造的酵母(例如酿酒酵母)表达E1-E2融合蛋白，该蛋白是单个多肽，具有从N末端到C末端共阅读框融合的下列序列元件(括号中为HCV多蛋白的编号，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：6)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：6的1到6位)；(2)HCV蛋白E1的氨基酸1到156(SEQ ID NO：20的192到347)(SEQID NO：6的7到162位)；和(3)HCV蛋白E2的氨基酸1到334(SEQ ID NO：20的384到717)(SEQ ID NO：6的163到446位)。应注意，在该融合蛋白中省去了E1的36个C末端疏水性氨基酸和E2的29个疏水性氨基酸，以促进在酵母细胞质中的积累。本文中SEQ ID NO：5表示编码SEQ ID NO：6的融合蛋白的核酸序列。
在本发明的另一个方面中，所述酵母疫苗包含缺失跨膜(TM)域的HCVNS4b融合蛋白。实施例4描述了这样的疫苗的一个例子。该融合蛋白是单个多肽，其中以下序列元件从N末端到C末端共阅读框地串联排列(括号中为多蛋白的编号，该融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：8)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：8的1到6位)；(2)HCV蛋白NS4b的氨基酸1到69(SEQ ID NO：20的1712到1780)(SEQ ID NO：8的7到75位)；和(3)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(SEQ ID NO：20的1888到1972)(SEQ ID NO：8的76到160位)。省去了对应于NS4b氨基酸70到176(SEQ ID NO：20的1781到1887)、含多个跨膜域的107个氨基酸的区域，以促进在酵母细胞质中的积累。本文中SEQ IDNO：7表示编码SEQ ID NO：8的融合蛋白的核酸序列。
在本发明的另一个优选的方面中，酵母疫苗包含Core-E1-E2融合蛋白。该融合蛋白为单个多肽，其中以下序列元件从N末端到C末端共阅读框地串联排列(括号中为多蛋白的编号，该融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：12)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：12的1到6位)；及(2)编码全长Core、E1和E2蛋白的未修饰HCV多蛋白(SEQ ID NO：12的7到751位：从7到196位为Core，197位到387位为E1，388到751位为E2)的氨基酸1到746(SEQ ID NO：20的2到746)。本文中SEQ ID NO：11表示编码SEQ ID NO：12的融合蛋白的核酸序列。
本发明另一优选方面中，酵母疫苗包含缺失跨膜域的Core-E1-E2融合蛋白。该融合蛋白是单个多肽，其中下列序列元件从C末端到N末端共阅读框地融合(括号中为多蛋白的编号，该融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：14)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性；(2)氨基酸2到140(SEQ ID NO：20的2到140)HCV Core蛋白(SEQID NO：14的7到145位)；(3)氨基酸1到156(SEQ ID NO：20的192到347)HCV蛋白E1(SEQ ID NO：14的146到301位)；及(4)氨基酸1到334(SEQ ID NO：20的384到717)HCV蛋白E2(SEQ ID NO：14的302到635位)。省去了Core蛋白的51个C末端疏水性氨基酸、E1的36个C末端疏水性氨基酸和E2的29个C末端疏水性氨基酸，以促进在酵母细胞质中的积累。本文中SEQID NO：13表示编码SEQ ID NO：14的融合蛋白的核酸序列。
在本发明的另一个优选的方面中，酵母疫苗包含NS3-NS4a-NS4b融合蛋白，其中NS3蛋白酶失活且NS4b缺少跨膜域。所述NS3-NS4a-NS4b融合蛋白是单个多肽，其中以下序列元件从N末端到C末端共阅读框地融合(括号中为多蛋白的编号，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中用SEQ IDNO：16表示)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：16的1到6位)；(2)对应于全长HCV NS3蛋白的氨基酸1到631(SEQ ID NO：20的1027到1657)(注意，丝氨酸139(对SEQ ID NO：20而言为1165位)被改变为丙氨酸，以使NS3蛋白水解潜力失活)(SEQ ID NO：16的7到634位)；(3)NS4a蛋白的氨基酸1到54(SEQ ID NO：20的1658到1711)(SEQ ID NO：16的635到691位)；(4)HCV蛋白NS4b的氨基酸1到69(SEQ ID NO：20的1712到1780)(SEQ ID NO：16的692到776位)；和(5)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(SEQ ID NO：20的1888到1972)(SEQ ID NO：16的777到845位)。省去了对应于NS4b氨基酸70到176(SEQ ID NO：20的1781到1887)的、含多个跨膜域的107个氨基酸的区域，以促进在酵母细胞质中的积累。本文中SEQ ID NO：15表示编码SEQ ID NO：16的融合蛋白的核酸序列。
在本发明的另一个优选的方面中，酵母疫苗包含NS5a-NS5b融合蛋白，其中NS5b的C末端带有失活性缺失。该NS5a-NS5b融合蛋白是单个多肽，其中以下序列元件从N末端到C末端共阅读框地融合(括号中为多蛋白的编号，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO：18表示)：(1)序列MADEAP(SEQ ID NO：9)，赋予对蛋白酶体降解的抗性(SEQ ID NO：18的1到6位)；(2)整个NS5a蛋白，对应于氨基酸1到488(SEQ ID NO：20的1973到2420)(SEQ ID NO：18的7到454位)；和(3)氨基酸1到539(SEQ ID NO：20的2421到2959)NS5b的(SEQ ID NO：18的455到993位)。缺失了NS5b在HCV复制中的活性所需要的52个C末端氨基酸残基，以使该蛋白失活。本文中SEQ ID NO：17表示编码SEQ ID NO：18的融合蛋白的核酸序列。
根据本发明，任何本文所述的融合蛋白可包含与该融合蛋白N末端连接的肽，该肽由至少2-6个对所述HCV抗原而言异源的氨基酸残基组成。在一个方面中，所述肽包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中是X2除了甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X3是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X4是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X5是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X6是除了甲硫氨酸以外的任何氨基酸。在一个方面中，X6是脯氨酸。在另一个方面中，所述肽包含氨基酸序列M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO：9)。
在本文的一个具体方面中，上述融合蛋白在两个HCV蛋白(例如HCVNS3序列和HCV Core序列)之间含有异源接头序列。在一个优选的实施方式中，所述异源接头序列由单个异源氨基酸残基组成。在一个更优选的实施方式中，异源接头序列由单个苏氨酸残基组成。
在任何上述的本发明的组合物(例如疫苗)中，下面与酵母媒介物有关的方面包括在本发明中。在一个实施方式中，酵母媒介物选自完整酵母、酵母原生质球、酵母胞质体、酵母空胞，以及亚细胞酵母膜提取物或其级分。在一个方面中，用编码抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母媒介物的酵母细胞或酵母原生质球，使得该抗原被该酵母细胞或酵母原生质球重组表达。在这个方面中，重组表达所述抗原的酵母细胞或酵母原生质球被用来产生包含酵母胞质体、酵母空胞或亚细胞酵母膜提取物或其级分的酵母媒介物。在一个方面中，所述酵母媒介物来自非病原性酵母。在另一个方面中，所述酵母媒介物来自从以下组选择的酵母：酵母属酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母属酵母(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属酵母(Kluveromyces)、汉逊酵母属酵母(Hansenula)、假丝酵母属酵母(Candida)和毕赤酵母属酵母(Pichia)。在一个方面中，所述酵母属酵母是酿酒酵母。
一般而言，可以用本文描述的任何技术将酵母媒介物和抗原结合起来。在一个方面中，HCV抗原加载到酵母媒介物细胞内。在另一个方面中，HCV抗原共价或非共价地附着于酵母媒介物。在另一个方面中，通过混合将酵母媒介物和HCV抗原结合起来。在另一个方面中，抗原被酵母媒介物，或者被酵母媒介物所来源的酵母细胞或酵母原生质球重组表达。
更具体地，根据本发明，酵母媒介物是可以与抗原共同用于本发明的疫苗或治疗组合物中，或者用作佐剂的任何酵母细胞(例如整个或完整的细胞)或其衍生物(见下述)。因此，酵母媒介物可包括，但不限于，活的完整酵母类微生物(即，具备其所有组分，包括细胞壁的酵母细胞)、死的(死亡的)完整酵母类微生物，或其衍生物，包括：酵母原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母空胞(即缺少细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)，或亚细胞酵母膜提取物或其级分(以前又称亚细胞酵母颗粒(subcelluar yeast particle))。
酵母原生质球通常通过酶消化酵母细胞壁而产生。这样的方法在例如Franzusoff等，1991，Meth.Enzymol.194，662-674中有描述，在此将其全部内容引用并入本文。酵母胞质体通常通过将酵母细胞去核而产生。这样的方法在例如Coon，1978，Natl.Cancer Inst.Monogr.48，45-55中有描述，在此将其全部内容引用并入本文。酵母空胞通常通过将透化处理或裂解后的细胞重接(reseal)而产生，并可能，但不一定含有该细胞的至少一些细胞器。这样的方法在例如Franzusoff等，1983，J.Biol.Chem.258，3608-3614和Bussey等，1979，Biochim.Biophys.Acta 553，185-196中有描述，在此分别将其全部内容引用并入本文。亚细胞酵母膜提取物或其级分是指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。该颗粒可以为任何大小，包括从天然的酵母膜的大小，到本领域技术人员已知的超声处理或其它膜破碎方法处理后重接而产生的微颗粒的大小的范围。产生亚细胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff等，1991，Meth.Enzymol.194，662-674中有描述。还可以使用酵母膜提取物的级分，它们含有酵母膜部分，而且，当制备所述酵母膜提取物之前酵母重组表达所述抗原时，它们还含有目标抗原。
可以使用任何酵母菌株来产生本发明的酵母媒介物。酵母是属于下述三类之一的单细胞微生物：子囊菌(Ascomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)和半知菌(Fungi Imperfecti)。虽然根据本发明可以使用病原性酵母菌株或其非病原性突变体，非病原性酵母菌株是优选的。优选的酵母菌株的属包括酵母属、假丝酵母属(其可能是病原性的)、隐球酵母属(Cryptococcus)、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属和西洋蓍霉属(Yarrowia)，其中更优选酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属，尤其优选酵母属。优选的酵母菌株的物种包括酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、罗仑氏隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马科斯克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowia lipolytica。应当理解，这些物种中有多数包含多种亚种、类型、亚型、等等，都包括在上述的物种中。更优选的酵母物种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。酿酒酵母是尤其优选的，因为它们相对易于操作，并且用作食品添加剂是“通常认为安全的”(“Generally Recognized As Safe”，或“GRAS”)(GRAS，FDA proposed Rule 62FR18938，April 17，1997)。本发明的一个实施方式是能复制质粒到特别高的拷贝数的酵母菌株，例如酿酒酵母cir°株。
在一个实施方式中，本发明的优选的酵母媒介物能与该酵母媒介物和抗原被投送到的细胞类型，例如树突状细胞或巨噬细胞相融合，从而得以特别高效地将所述酵母媒介物(在许多实施方式中还有抗原)投送给该细胞类型。如本文中使用的，酵母媒介物与靶标细胞类型的融合，是借助酵母细胞膜或其颗粒与靶标细胞类型(例如树突状细胞或巨噬细胞)的膜融合，导致合胞体形成的能力。如本文中使用的，合胞体是细胞合并而产生的多核的原生质体团。已证明多种病毒表面蛋白(包括免疫缺陷病毒例如HIV、流感病毒、脊髓灰质炎病毒和腺病毒的那些)和其它融合剂(包括卵子和精子融合中涉及的那些)能导致两种膜之间(例如病毒膜和哺乳动物细胞膜之间，或哺乳动物细胞膜之间)发生融合。例如，在其表面上产生HIV gp120/gp41异源抗原的酵母媒介物能与CD4+T淋巴细胞融合。但是应该注意，虽然某些情况下将靶标部分并入酵母媒介物中是理想的，但并不必须这样做。本发明人先前已证明，本发明的酵母媒介物被树突状细胞(以及其它细胞，例如巨噬细胞)容易地摄取。
可以使用多种本领域技术人员已知的技术将酵母媒介物配制为本发明的组合物，包括直接施用于患者的制备物或首先装载于载体例如树突状细胞中的制备物。例如，可以通过冷冻干燥来干燥酵母媒介物。还可以通过将酵母包装在块(cake)或片(tablet)中来制备包含酵母媒介物的制剂，例如焙烤或酿造工作中所做的那样。另外，在将带有抗原的酵母媒介物装载到树突状细胞中或以其它方式施用以前，还可以将酵母媒介物与药学可接受的赋形剂，例如宿主细胞可容忍的等渗缓冲剂混合。这样的赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank′s溶液、及其它生理平衡盐水溶液。还可以使用非水性媒介物物，例如非挥发油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的制剂包括含有粘度加强剂(viscosity-enhancing agents)，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、甘油或葡聚糖的悬液。赋形剂还可含有次要量的添加剂，例如增加等渗性和化学稳定性的物质。缓冲剂的例子包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲剂，而防腐剂的例子包括硫柳汞、间-或邻-苯甲酚，福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是注射液(liquid injectables)，或者是可在合适的液体中作为注射悬液或溶液被摄取的固体。因此，在非液体制剂中，所述赋形剂可包含，例如，葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐剂，施用前可以向其加入无菌水或盐水。
根据本发明，术语“酵母媒介物-抗原复合物”或“酵母-抗原复合物”用来一般性地描述酵母媒介物和抗原的任何结合(association)。这样的结合包括酵母表达抗原(重组酵母)；抗原导入酵母；抗原物理地附着于酵母，以及将酵母和抗原混合到一起，例如在缓冲液或其它溶液或制剂中。下面详细描述了这些类型的复合物。
在一个实施方式中，用编码抗原的异源核酸分子转化用于制备酵母媒介物的酵母细胞，从而使该酵母细胞表达该抗原。这样的酵母在本文中又称为重组酵母或重组酵母媒介物。然后可以将该酵母细胞作为完整细胞装载到树突状细胞中，或者可以杀灭该酵母细胞，或者将其衍生化(derivatize)，例如通过形成酵母原生质球、胞质球、空胞或亚细胞颗粒，然后将上述任一衍生物装载到树突状细胞中。也可以用重组核酸分子直接转染酵母原生质球(例如，从整个酵母产生原生质球，然后将其转染)，以产生表达抗原的重组原生质球。
根据本发明，分离的核酸分子或核酸序列，是已经从其自然环境分离的核酸分子或序列。就其本身而言，“分离”并不一定反映该核酸分子被纯化的程度。可用于转染酵母媒介物的分离的核酸分子包括DNA、RNA，或DNA或RNA中任一种的衍生物。分离的核酸分子可以是双链或单链的。可用于本发明的分离的核酸分子包括编码蛋白质或其片段的核酸分子，只要该片段含有至少一个在本发明的组合物中有用的表位。
转化到本发明的酵母媒介物中的核酸分子可包括编码一种或多种蛋白质或其部分(片段、域、构象表位)的核酸序列。这样的核酸分子可包含部分或整个编码区、调控区、或其组合。酵母菌株的优点之一在于它们能携带多个核酸分子并且能产生多种异源蛋白。本发明的酵母媒介物产生的抗原的优选数目是酵母媒介物可合理地产生的抗原的任何数目，通常为至少1个到至少5个或更多，其中更优选约2个到约5个异源抗原。
酵母媒介物中的核酸分子编码的肽或蛋白质可以是全长蛋白质，或者可以是功能上等同的蛋白质，其中氨基酸已被缺失(例如该蛋白质截短的形式)、插入、倒位(invert)、取代和/或衍生化(例如乙酰化、糖基化、磷酸化、被磷脂酰肌醇(GPI)锚钩牵着(tether))，使得被修饰的蛋白质的生物功能基本与天然蛋白质相似(或者，如果需要，其生物功能与天然蛋白相比增强或被抑制)。修饰可以用本领域已知的技术实现，这些技术包括但不限于使用例如经典技术或重组DNA技术实现随机或靶向的诱变，来直接修饰蛋白或修饰编码该蛋白的核酸。功能上等同的蛋白质可以使用测量蛋白质生物活性的测定来选择。优选的HCV抗原如上所述。
使用本领域技术人员已知的技术实现抗原在本发明的酵母媒介物中的表达。简单地说，将编码至少一种目标抗原的核酸分子以这样的方式插入表达载体，使得该核酸分子与转录控制序列可操作性连接，以使其在被转化入宿主酵母细胞后，能实现该核酸分子的组成性或受调控表达。编码一种或多种抗原的核酸分子可以在一个或多个载体上，与一个或多个转录控制序列可操作性连接。
在本发明的重组分子中，核酸分子可操作性连接于含有调控序列的表达载体，所述调控序列有例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点，以及与酵母细胞相容且控制核酸分子表达的其它调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一种或多种转录控制序列可操作性连接的核酸分子。短语“可操作性连接”指核酸分子和转录控制序列以这样的方式连接，使得该分子转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后能被表达。
转录控制序列可控制所产生的蛋白质的量，它们包括控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录起始的转录控制序列，例如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子均可用于本发明，且本领域已经知道了多种这样的启动子。用于在酿酒酵母中表达的优选启动子包括但不限于编码下列酵母蛋白的基因的启动子：醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)，CUP1，磷酸甘油酸激酶(PGK)，丙糖磷酸异构酶(TPI)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，又称TDH3，代表丙糖磷酸脱氢酶)，半乳糖激酶(GAL1)，半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7)，UDP-半乳糖差向异构酶(GAL10)，细胞色素c1(CYC1)，Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，更优选杂合启动子例如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子，尤其更优选ADH2/GAPDH启动子，其在细胞中葡萄糖浓度低(例如，约百分之0.1到0.2)时被诱导。类似地，还知道多种上游激活序列(UASs)，又称增强子。酿酒酵母中表达优选的上游活化序列包括，但不限于，编码下列蛋白质的基因的UASs：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及其它被GAL4基因产物激活的UASs，其中特别优选ADH2UAS。由于ADH2UAS被ADR1基因产物激活，当异源基因与ADH2UAS可操作性连接时，优选过表达ADR1基因。酿酒酵母中表达优选的转录终止序列包括α-因子、GAPDH和CYC1基因的终止序列。
甲基营养(methyltrophic)酵母中表达基因的优选转录控制序列包括编码醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录控制区。
根据本发明，转染核酸分子到酵母细胞中可利用任何将核酸分子投入到细胞内的方法来实现，包括，但不限于，扩散、主动运输、浴超声处理(bathsonication)、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。使用本领域技术人员已知的技术，转染的核酸分子可以整合到酵母染色体中，或维持在染色体外载体上。携带这样的核酸分子的酵母媒介物的例子在本文中有详细的公开。如上面讨论的，酵母胞质体、酵母空胞和亚细胞酵母膜提取物或其级分也可以通过下述方法重组产生：用所需的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球，在其中产生所述抗原，然后使用本领域技术人员已知的技术进一步处理该微生物或原生质球以产生含有所需抗原的胞质体、空胞或亚细胞酵母膜提取物或其级分。
生产重组酵母媒介物和酵母媒介物表达抗原的有效条件包括可在其中培养酵母菌株的有效的培养基。有效的培养基通常是包含下列成分的水性培养基：可同化的糖、氮和磷酸源，以及合适的盐、矿物质、金属和其它营养物，例如维生素和生长因子。所述培养基可包含复合营养物，或者可以是确定成分的基本培养基。本发明的酵母菌株可以在多种容器中培养，包括，但不限于，生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定盘和培养平皿。在适合于所述酵母菌株的温度、pH和含氧量条件下进行培养。这样的培养条件完全在本领域普通技术人员的专业知识范围内(见例如Guthrie等(eds.)，1991，Methods in Enzymology，vol.194，Academic Press，San Diego)。
在本发明的一个实施方式中，作为在酵母媒介物中重组表达抗原之外的选择，将蛋白质和蛋白质抗原，或充当抗原的糖或其它分子装载到酵母媒介物细胞内。然后，可以将在细胞内含有抗原的酵母媒介物施用于患者，或装载到载体例如树突状细胞(下述)中。如本文所用的，肽包含少于或等于约30-50个氨基酸的氨基酸序列，而蛋白质包含多于约30-50个氨基酸的氨基酸序列；蛋白质可以是多聚体。作为抗原有用的蛋白质或肽可以小到如一个T细胞表位(即，长度大于5个氨基酸)，并且可以是该大于此大小的任何合适的大小，包括多个表位、蛋白片段、全长蛋白、嵌合蛋白或融合蛋白。肽和蛋白可以天然地或合成地衍生化，这样的修饰可包括，但不限于，糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或甘油磷脂酰肌醇的添加。可以利用本领域技术人员已知的技术将肽和蛋白质直接插入本发明的酵母媒介物，例如通过扩散、主动运输、脂质体融合、电穿孔、吞噬、冻融循环(freeze-thaw cycles)和浴超声处理。可以直接装载肽、蛋白质、糖或其它分子的酵母媒介物包括：完整酵母，以及原生质球、空胞或胞质体，可以在这些酵母媒介物产生后，装载到树突状细胞中之前，将抗原装载到其中。或者，可以将抗原装载到完整酵母中，然后从其制备出原生质球、空胞、胞质体或亚细胞颗粒。在本实施方式中，酵母媒介物中可以装入任何数目的抗原，从至少1，2，3，4个或高达数千或数万的任何整数个抗原，例如，通过装载微生物，装载哺乳动物细胞，或其部分，可能提供这样的数目。
在本发明的另一个实施方式中，抗原物理地附着于酵母媒介物。抗原对酵母媒介物的物理附着可以用本领域中适合地任何方法来实现，包括共价和非共价的结合方法，这些方法包括，但不限于，将抗原化学交联到酵母媒介物的外表面，或抗原生物地连接到酵母媒介物的外表面，例如通过使用抗体或其它结合配偶体。化学交联可以通过包括下列的方法实现：戊二醛连接、光亲和标记、用碳二亚胺(carbodiimides)处理、用能连接二硫键的化学品处理、及用本领域中标准的其它交联化学品处理。或者，可以使酵母媒介物接触这样的化学品，其改变酵母膜脂双层的电荷或细胞壁组成，使得酵母的外表面更易于融合或结合具有特定电荷特性的抗原。靶向剂(targeting agents)，例如抗体、结合肽(binding peptides)、也可以将可溶性受体以及其它配体并入抗原中作为融合蛋白，或以其它方式与抗原结合，以供抗原结合酵母媒介物。
在另一实施方式中，酵母媒介物和抗原通过一种更为被动的非特异性或非共价结合机制相互结合，例如通过在缓冲液或其它合适的制剂中将酵母媒介物和抗原轻柔地混合。在本发明的一个实施方式中，将酵母媒介物和抗原都装载到载体，例如树突状细胞或巨噬细胞的细胞内，以形成本发明的治疗组合物或疫苗。或者，可以在没有酵母媒介物的存在下将本发明的抗原(即本发明的新HCV融合蛋白)装载到树突状细胞中。下面详细讨论了可实现两种组分的装载的多种形式。如本文所用的，术语“装载”(loaded)及其衍生语是指组分(例如所述酵母媒介物和/或抗原)插入(insertion)、导入(introduction)或进入(entry)细胞(例如树突状细胞)。“将组分装载到细胞内”涉及将组分插入或导入细胞的胞内区室(intracellular compartment)(例如，通过质膜并至少进入细胞质、吞噬体、溶酶体或细胞的某些胞内空间)。“装载组分到细胞中”借助任何下述的技术：通过该技术，组分或者被迫使进入细胞(例如通过电穿孔)，或者被置于该组分相当有可能通过某种过程(例如吞噬作用)进入细胞的环境中。装载技术包括，但不限于：扩散，主动运输，脂质体融合，电穿孔，吞噬和浴超声处理。在一个优选的实施方式中，使用将酵母媒介物和/或抗原装载到树突状细胞中的被动机制，这样的被动机制包括该酵母媒介物和/或抗原被树突状细胞所吞噬。
应当理解，疫苗中提供的上述任何HCV融合蛋白可以不具有一种或多种对该蛋白在酵母中的表达特别有利的N末端和/或C末端修饰。这样的HCV融合蛋白可用于其它非基于酵母的疫苗中，例如通过将所述融合蛋白与常规的佐剂组合，用该融合蛋白冲击(pulse)树突状细胞，提供包含编码该融合蛋白的核酸分子的DNA或核酸或病毒载体，或构建由本发明的特定HCV融合蛋白构成的假病毒体(例如，本发明的E1-E2融合蛋白)。
由此，本发明的另一个实施方式涉及保护动物免于HCV感染或该感染导致的症状的组合物，该组合物(其可以是疫苗)包括：(a)任意一种或多种如上所述的HCV融合蛋白(有或没有本文所述的多种N-和C-末端修饰)；和(b)药学可接受的递送媒介物(其可包括药学可接受的赋形剂或佐剂)。
本发明的另一个实施方式涉及一种基于核酸的疫苗，例如DNA疫苗或病毒载体疫苗，其包含编码如本文所述的HCV融合蛋白(有或没有本文所述的多种N-和C-末端修饰)的核酸构建体(例如病毒载体或其它重组核酸分子)。所述疫苗还可包括任何药学可接受的递送媒介物(其可包括药学可接受的赋形剂或佐剂)。
本发明的另一个实施方式涉及一种假病毒体，其由多种本发明的HCV融合蛋白，特别是如本文所述的E1-E2融合蛋白构成。同样，可包含或不包含对于本发明的基于酵母的疫苗特别有用的N末端和/或C末端修饰。
本发明一个实施方式中，组合物或疫苗还可以包括生物反应调节剂化合物(biological response modifier compounds)，或产生这些调节剂的能力(例如通过用编码这些调节剂的核酸分子转染)，尽管根据本发明这些调节剂对于实现强的免疫应答不是必须的。例如，可以用至少一种抗原和至少一种生物反应调节剂化合物转染或装载酵母媒介物，或者可以将本发明的疫苗或组合物与至少一种生物反应调节剂一起施用。生物反应调节剂包括能调节免疫应答的化合物，它们可称为免疫调节性化合物(immunomodulatory compounds)。某些生物反应调节剂能刺激保护性免疫应答，而其它的能抑制有害的免疫应答。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫应答，而其它的优先增强体液免疫应答(即，能激发细胞免疫水平较之体液免疫升高的免疫应答，或反之)。本领域技术人员知道多种测量免疫应答的激发或抑制的方法，以及区分细胞免疫和体液免疫的方法。
合适的生物反应调节剂包括细胞因子、激素、脂类衍生物(lipidicderivatives)、小分子药物和其它生长调节剂(growth modulators)，包括，但不限于，白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、干扰素γ(IFNγ)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、转化生长因子β(TGF-β)、类固醇、前列腺素和白三烯。酵母媒介物表达(即产生)以及可能分泌IL-2、L-12和/或IFN-γ的能力优先增强细胞介导免疫，而酵母媒介物表达并可能分泌IL-4、IL-5和/或IL-10的能力优先增强体液免疫。其它合适的生物反应调节剂包括，但不限于，抗-CTLA-4抗体(例如，用以释放无反应性(anergic)T细胞)；T细胞共刺激物(例如抗-CD137，抗-CD28，抗-CD40)；alemtuzumab(例如
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)；地尼白介素2(denileukin diftitox)(例如
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)、抗-CD4、抗-CD25、抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-PD-L2或阻滞FOXP3(例如，以杀灭/消除CD4+/CD25+T调节细胞的活性)的剂、Flt3配体、咪喹莫特(imiquimod)(AldaraTM)，GM-CSF，沙格司亭(sargramostim)Toll样受体(TLR)-7激动剂，或TLR-9激动剂(例如，增加树突状细胞或其它专职抗原呈递细胞的数目或其活化状态的剂)。这样的生物反应调节剂是本领域公知并可公开获得的。
本发明的组合物和治疗性疫苗可进一步包括可用于保护受试者免于HCV感染，或治疗或减轻该感染的任何症状的任何其他化合物。
如上所述，本发明还包括本文所述的任何HCV融合蛋白或编码这些HCV融合蛋白的核酸分子在没有本发明的酵母媒介物存在的组合物或疫苗中的用途，例如在任何常规的或非基于酵母的组合物或疫苗中的用途。除了所述HCV融合蛋白外，这样的组合物可包括药学可接受的载体，例如佐剂。另外，本发明的基于酵母的疫苗可以与药学可接受的载体一起提供。
本文中，“药学可接受的载体”指适合递送本发明的方法中有用的HCV融合蛋白到合适的体内或体外位点的任何物质或媒介物。这样的载体可包括，但不限于，佐剂、赋形剂或其它任何类型的递送媒介物或载体。
本文在，“佐剂”通常是一般性地增强动物对特定抗原的免疫应答的物质。合适的佐剂包括，但不限于，弗氏佐剂；其他细菌细胞壁组分；铝基盐(aluminum-based salts)；钙基盐(calcium-based salts)；二氧化硅；多核苷酸；类毒素；血清蛋白；病毒外壳蛋白；其他细菌来源的制备物；γ干扰素；嵌段共聚物佐剂，例如Hunter′s Titermax佐剂(CytRxTM，Inc.Norcross，GA)；Ribi佐剂(可从Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT获得)；以及皂苷及其衍生物，例如Quil A(可从Superfos Biosector A/S，Denmark获得)。
“载体”(carriers)通常是增加治疗性组合物在接受治疗的动物中的半衰期的化合物。合适的载体包括，但不限于，聚合控释制剂(polymeric controlledrelease formulations)、生物可降解植入物、脂质体、油、酯和二醇。
本发明的治疗性组合物还可以含有一种或多种药学可接受的赋形剂。如本文中使用的，“药学可接受的赋形剂”是指适于递送本发明的方法中有用的治疗性组合物到合适的体内或体外位点的任何物质。优选的药学可接受的赋形剂能使组合物(或酵母媒介物，或包含所述酵母媒介物的树突状细胞)维持这样的形式，使得该组合物到达体内的目标细胞、组织或位点时，该组合物能在所述目标位点引发免疫应答(注意，目标位点可以是全身性的)。本发明的合适的赋形剂包括将疫苗运送到某位点，但并不特异性地使疫苗靶向该位点的赋形剂或制剂(formularies)(本文中又称为非靶向性载体)。药学可接受的赋形剂的例子包括，但不限于，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank’s溶液、其他生理平衡的水溶液、油、酯和二醇。水性载体可含有合适的辅助物质(auxiliary substances)，这些物质是模拟接受者的生理条件(例如通过增强化学稳定性和等渗性)所需要的。合适的辅助物质包括，例如，乙酸钠，氯化钠，乳酸钠，氯化钾，氯化钙，和其它用于制备磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂，及碳酸氢盐缓冲剂的物质。辅助物质还可包括防腐剂，例如硫柳汞，间-或邻-苯甲酚，福尔马林和苯甲醇。
本发明的方法
本发明的另一个实施方式涉及保护动物免于HCV感染或由其导致的疾病的方法。该方法包括下述步骤：对具有HCV感染或者有发生HCV感染的危险性的动物施用本文所述的本发明的疫苗或组合物，以减轻或防止该动物中的HCV感染或HCV感染导致的至少一种症状。
本发明的另一个实施方式涉及在动物中引发抗原特异性体液免疫应答和/或抗原特异性细胞介导型免疫应答的方法。该方法包括对动物施用如本文所述的本发明的疫苗或组合物。本发明的方法优先引发动物中抗原特异性的细胞介导型免疫应答。
在上述的实施方式中，所述疫苗或组合物可包括：[1]组合物，其包含(a)酵母媒介物和(b)任意一种或多种上述的HCV融合蛋白；和/或[2](a)任意一种或多种上述的HCV融合蛋白及(b)药学可接受的媒介物(可包含药学可接受的赋形剂或佐剂，或由其构成)；和/或[3](a)编码任意一种或多种上述的HCV融合蛋白的分离的核酸分子(例如，DNA构建体，载体，病毒载体)；和/或[4]分离的树突状细胞(例如自体树突状细胞)，其含有(a)酵母载体和/或(b)任意一种或多种上述的HCV融合蛋白(被(a)和/或(b)冲击)；和/或[5]HCV假病毒体，其由本文所述的任何含E1-E2的HCV融合蛋白构成。
在本发明的一个实施方式中，如本文所述的本发明的疫苗或组合物可以在这样的规程中施用，该规程包括使用一种或多种其它的疫苗或免疫疗法组合物，包括任何常规的疫苗或组合物。例如，所述其它疫苗或免疫疗法组合物可包括任何其它含有抗原，编码抗原，或表达抗原的组合物，例如编码HCV抗原的DNA疫苗或包含HCV抗原的其它病毒载体。用于疫苗的病毒载体是本领域已知的，包括，但不限于，痘病毒(牛痘(vaccinia)，金丝雀禽痘(canary)，禽痘(avipox))，腺病毒，腺相关病毒，α病毒(辛德毕斯病毒，VEE)。其它类型的疫苗，包括基于蛋白的疫苗，也被本发明涵盖。在一个方面中，可以首先对受试者施用这样的常规疫苗，或者不是本发明的一部分的疫苗，或者不包括酵母媒介物的本发明的疫苗(例如包含与药学可接受的载体组合的本发明的新HCV融合蛋白的疫苗，或编码本发明的新HCV融合蛋白的DNA疫苗)以致敏受试者针对HCV抗原的免疫应答。然后，可对受试者施用本发明的疫苗或组合物，尤其是本发明的基于酵母的疫苗，以加强免疫应答。或者，可以对受试者施用本发明的疫苗或组合物以致敏免疫应答，特别地包括本发明的基于酵母的疫苗，并可以使用常规的或其它疫苗或组合物(例如包含本发明的新HCV融合蛋白的、非基于酵母的疫苗，或编码本发明的新融合蛋白的DNA疫苗)来加强免疫应答。
本发明的治疗性组合物或疫苗的使用方法优选地引发动物中的免疫应答，使得该动物被保护免于HCV感染或HCV感染导致的疾病状况或症状。如本文中使用的，短语“被保护免于疾病”涉及减少疾病的症状，减少疾病的发生，和/或减轻疾病的严重性。“保护动物”可借助本发明的治疗性组合物被施用于动物时防止疾病发生和/或治愈或减轻疾病症状、征候或原因的能力。就其本身而言，“保护动物免于疾病”包括防止疾病发生(预防性处理或预防性疫苗)及处理患有疾病或正在经历疾病的初始症状的动物(治疗性处理或治疗性疫苗)。特别地，保护动物免于疾病是通过诱导有益的或保护性的免疫应答，从而在动物中引发免疫应答而实现的，其中所述有益的或保护性的免疫应答在某些情况下还抑制(例如，降低，抑制或阻滞)过度反应性或有害的免疫应答。术语“疾病”指相对动物正常健康状态的任何偏离，包括存在疾病症状的状态，和已经发生了偏离(例如感染，基因突变，遗传缺陷，等等)但尚未表现出症状的情形。
在一个实施方式中，将本发明的任何疫苗施用于被HCV感染的个体或个体群。在另一个实施方式中，将本发明的任何疫苗施用于有感染HCV风险的个体或个体群。这些个体可包括被确认为感染HCV的风险高于，例如，正常个体群或全体个体群的群体。这样的群体可用任何合适的参数来定义。在另一个实施方式中，将本发明的任何疫苗施用于任何个体或任何个体群，不考虑他们已知或预测的感染状态或感染HCV的易感性。
更具体地，如本文所述的疫苗，当通过本发明的方法施用于动物时，优选产生可包括下列的效果：减轻疾病(例如减少所述疾病的至少一种症状或临床表现)，消除疾病，防止或减轻原发疾病的发生所导致的继发疾病，预防疾病，和激发针对该疾病的效应细胞免疫。
本发明包括本发明的组合物或疫苗对动物的递送。施用过程可以在体外或体内进行。体外施用涉及在患者之外进行部分调节步骤，例如在一定条件下将本发明的组合物施用于从患者分离的细胞(树突状细胞)群体，使得酵母媒介物和抗原被装载到细胞中，并将这些细胞返回给患者。本发明的治疗性组合物可以用任何合适的施用模式返回给患者，或施用于患者。
根据本发明，疫苗或组合物，包括装载有酵母媒介物和抗原的树突状细胞、单独的酵母媒介物、或包含单独或与载体组合的新HCV融合蛋白的组合物的施用，可以施用于全身、粘膜和/或目标位点的位置附近(例如，肿瘤附近)。优选的施用途径对本领域技术人员而言将是显然的，取决于要预防或治疗的病症，所用的抗原，和/或目标细胞群体或组织。优选的施用方法包括，但不限于，静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、结内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用(例如到颈动脉中)、皮下施用、经皮递送、气管内施用、皮下施用、关节内施用、脑室内(intraventricular)施用、吸入(例如气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺施用、导管浸渍(impregnation)及直接注射入组织。特别优选的施用途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。胃肠外递送可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管途径。耳递送可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂(nose drops)或鼻内注射，眼内递送可包括滴眼剂(eye drops)。气溶胶(吸入)递送也可以施用本领域的标准方法(参见例如Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992，将其全部内容引用并入本文)进行。例如，在一个实施方式中，可将本发明的组合物或疫苗配制成适于用合适的吸入装置或喷雾器进行雾化递送的组合物。口服递送可包括能通过口摄取的固体和液体，并可用于产生粘膜免疫；而且因为包含酵母媒介物的组合物可容易地制备以供口服递送，例如制成片或胶囊，及配制成食品和饮料产品。其它调节粘膜免疫的递送途径在病毒感染的治疗中是有用的。这样的途径包括支气管、皮内、肌肉内、鼻内、其它吸入、直肠、皮下、表面、经皮、阴道和尿道途径。
在上述任意方法的一个实施方式中，疫苗施用于呼吸道。在另一个实施方式中，通过胃肠外施用途径施用疫苗。在另一个实施方式中，疫苗还包含树突状细胞或巨噬细胞，其中将表达所述融合蛋白的酵母媒介物体外递送给树突状细胞或巨噬细胞，并将所述含有表达HCV抗原的酵母媒介物的树突状细胞或巨噬细胞递送给动物。在该实施方案的一个方面中，所述树突状细胞或酵母载体还装载了游离的抗原。在一个方面中，所述疫苗作为治疗性疫苗施用。在另一方面中，所述疫苗作为预防性疫苗施用。
根据本发明，有效的施用规程(即，以有效的方式施用疫苗或治疗性组合物)包括这样的合适剂量参数和施用模式，导致患有疾病或病症的，或有感染疾病或病症风险的动物中的免疫应答被引发，优选地，使得该动物被保护免于疾病。有效的剂量参数可以用针对特定疾病的本领域已知的标准方法来测定。这样的方法包括，例如，测定存活率、副作用(即毒性)和疾病的进展或消退。
根据本发明，合适的单个剂量是在一个合适的时间段内施用一次或多次时，能引发动物中抗原特异性免疫应答的剂量。剂量可随所治疾病或病症变化。例如，在一个实施方式中，本发明的酵母媒介物的单个剂量是约1x105到约5x107个酵母细胞当量每千克施用该组合物的生物的体重。在优选的实施方式中，每个剂量的酵母细胞不相对生物体重调整。在该实施方式中，本发明的酵母媒介物的单个剂量是约1x104到约1x109个酵母细胞每个剂量。更优选地，本发明的酵母媒介物的单个剂量是约0.1Y.U.(1x106个细胞)到约100Y.U.(1x109个细胞)每个剂量(即每个生物)，并包括任何中间的剂量，按0.1x106个细胞的增量递增(即，1.1x106，1.2x106，1.3x106...)。该剂量范围可有效地用于任何大小的生物中，包括小鼠、猴、人等。
当通过将酵母媒介物和抗体装载到树突状细胞中来施用疫苗时，本发明的疫苗的优选的单个剂量为约0.5x106到约40x106个树突状细胞每个体每次施用。优选地，单个剂量是约1x106到约20x106个树突状细胞每个体，更优选约1x106到约10x106个树突状细胞每个体。
当疫苗包含本发明的融合蛋白和载体时，优选的单个剂量为约0.01微克x千克-1动物体重到约10毫克x千克-1动物体重。更优选的药物的单个剂量包括约1微克x千克-1动物体重到约10毫克x千克-1动物体重。更优选的药物的单个剂量包括约5微克x千克-1动物体重到约7毫克x千克-1动物体重。更优选的药物的单个剂量包括约10微克x千克-1动物体重到约5毫克x千克-1动物体重。尤其优选的药物的单个剂量包括约0.1毫克x千克-1动物体重到约5毫克x千克-1动物体重，如果该药物是通过气溶胶递送的。另一个优选的药物的单个剂量包括约0.1毫克x千克-1动物体重到约10毫克x千克-1动物体重，如果该药物是胃肠外递送的。
治疗性组合物的“加强剂”(booster或boost)优选地在针对抗原的免疫应答已减弱时施用或按需要施用，以提供免疫应答或诱发针对特定的一种或多种抗原的记忆应答。加强剂可以在初始施用后约2周到数年后施用。在一个实施方式中，施用计划包括在约1个月到约6个月的时间段内，施用约1x105到约5x107个酵母细胞当量每千克生物体重的组合物1到4次。
在本发明的方法中，疫苗和治疗性组合物可施用于动物，包括任何脊椎动物，特别是脊椎动物类哺乳纲(Mammalia)的任何成员，包括而不限于，灵长类(primates)、啮齿类(rodents)、家畜(livestock)和家养宠物(domestic pets)。家畜包括供食用的或产生有用产品的哺乳动物(例如产羊毛的绵羊)。优选要保护的哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪，尤其优选人。根据本发明，术语“患者”或“受试者”可用来描述作为本文所述的诊断性、预防性或治疗性处理的对象的任何动物。
分离的融合蛋白、核酸分子和细胞
本发明的另一个实施方式包括分离的蛋白，其包括任何包含本文所描述的HCV抗原的分离的融合蛋白。本发明还包括编码任何这样的蛋白的分离的核酸分子，包含编码这样的蛋白的核酸序列的重组核酸分子，以及含有这样的核酸分子或重组核酸分子，或被其转染/转化的细胞和载体，包括病毒载体。
如本文所用的，本发明中提到分离的蛋白或多肽时，包括了全长蛋白，融合蛋白，或这样的蛋白的任何片段、域、构象表位或同源物。更具体地，分离的蛋白，根据本发明，是已经从其天然环境中分离(即已经经过人类的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，其可包括例如纯化的蛋白，部分纯化的蛋白，重组产生的蛋白，和合成产生的蛋白。就其本身而言，“分离的“并不反映该蛋白被纯化的程度。优选地，本发明的分离的蛋白质是重组产生的。根据本发明，术语“修饰”和“突变”可互换使用，特别是就针对本文所述的蛋白质或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修饰/突变而言。
如本文中使用的，术语“同源物”用来指这样的蛋白或肽，其由于对天然的蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修饰而不同于天然的蛋白或肽，但维持天然形式的基本蛋白质和侧链结构。这样的变化包括，但不限于，一个或数个氨基酸侧链的变化，一个或数个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)插入和/或取代；一个或数个原子的立体化学的变化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物与天然的蛋白或肽相比可具有增加的、减少的，或基本相似的性质。同源物可包含蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物可以用本领域已知的制备蛋白的方法来制备，包括，但不限于，直接对分离的天然蛋白进行修饰，直接合成蛋白，或对编码该蛋白质的核酸序列进行修饰，使用例如经典技术或重组DNA技术以产生随机或定向诱变。
本发明的蛋白和/或其同源物或片段或其它部分的最小大小，在一个方面中，是足以具有所需的生物活性的大小，例如足以充当本发明的融合蛋白或其它组合物中的抗原或免疫原，或作为体外测定的靶标。在一个实施方式中，本发明的蛋白至少约8个氨基酸长，或至少约25个氨基酸长，或至少约30个氨基酸长，或至少约40个氨基酸长，或至少约50个氨基酸长，或至少约75个氨基酸长，或至少约100个氨基酸长，或至少约125个氨基酸长，或至少约150个氨基酸长，或至少约175个氨基酸长，或至少约200个氨基酸长，或至少约250个氨基酸长，或至少约300个氨基酸长，或至少约350个氨基酸长，或至少约400个氨基酸长，或至少约450个氨基酸长，或至少约500个氨基酸长，或至少约550个氨基酸长，或至少约600个氨基酸长，诸如此类，从8个氨基酸直到本发明的蛋白的全长，蛋白或其部分的组合的全长之间的任何长度，或更长的长度，以整数计(例如，8，9，10，...25，26，...102，103，...)。除了实际条件的限制外，这样的蛋白的最大大小没有限制，因为该蛋白可包括蛋白质的一部分、功能域、或其生物活性的或有用的片段，或者全长的蛋白，加上附加的序列(例如融合蛋白序列)，如果需要的话。
根据本发明的优选的融合蛋白包括本文所述的任何融合蛋白。本发明所涵盖的示例性的融合蛋白包括那些包含选自下组的氨基酸序列，基本上由选自下组的氨基酸序列构成，或由选自下组的氨基酸序列构成的融合蛋白：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18。本领域技术人员考虑了本文提供的知道后将清楚其它融合蛋白序列，因为多种HCV蛋白序列是本领域公知的。
本发明还包括任何包含编码本文所述的任何融合蛋白的核酸序列，基本由编码本文所述的任何融合蛋白的核酸序列构成，或由编码本文所述的任何融合蛋白的核酸序列构成的核酸分子。根据本发明，“分离的核酸分子”是已经与其天然环境分离(即，已经经过人的操作)的核酸分子，其“天然环境”是该核酸分子天然处于其中的基因组或染色体。就其本身而言，“分离的”并不反映该核酸分子被纯化的程度，而是表明所述分子不包含该核酸分子天然处于其中的整个基因组或整个基因组。分离的核酸分子可包括基因。包含某基因的分离的核酸分子并不是包含该基因的染色体的片段，而是包含该基因相关的编码区和调控区，但不包含天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含指定的核酸序列，该序列的侧翼(即该序列的5’和/或3’端)存在其它核酸，这些其它核酸在天然条件下通常不位于该指定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子可包含DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上核苷酸的序列，但这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白质或蛋白质的域的核酸分子或核酸序列而言。
优选地，本发明的分离的核酸分子用重组DNA技术(例如聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成产生。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然等位变体以及修饰的核酸分子，所述修饰噬插入、缺失、取代核苷酸和/或进行核苷酸倒位致使产生所需的效果。蛋白同源物(例如核酸同源物编码的蛋白)已在上文详细描述过。
可使用本领域技术人员已知的多种方法生产核酸分子同源物(见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLabs Press(1989))。例如，可以用多种技术修饰核酸分子，包括，但不限于，经典诱变技术和重组DNA技术，例如定点诱变、化学处理核酸分子以诱发突变、限制酶切割核酸片段、连接核酸片段、PCR扩增和/或核酸序列的选择区域的诱变、合成寡核苷酸混合物并连接混合物组以“构建”核酸分子的混合物，及其组合。通过筛选核酸所编码的蛋白的功能和/或与野生型基因杂交，可以从经修饰的核酸的混合物中选择出核酸分子同源物。
表达本发明的融合蛋白的重组核酸分子是这样的分子，其可包括可操作性连接的至少任意一个核酸序列和至少任意一个转录控制序列，其中所述核酸序列编码任意一个或多个本文所述的融合蛋白，所述转录控制序列能有效地调控该核酸序列在要转染的细胞中的表达。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上核苷酸的序列，但这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白质或蛋白质的域的核酸分子或核酸序列而言。另外，短语“重组分子”主要指可操作性地与转录控制序列连接的核酸分子，但其可以与施用于动物的短语“核酸分子”互换使用。
重组核酸分子包括重组载体，重组载体是与编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子可操作性地连接的任何核酸序列，通常是异源序列，其能使所述融合蛋白得以重组产生，并能将所述核酸分子递送到根据本发明的宿主细胞中。这样的载体可含有在天然状态下不出现在要插入该载体的分离的核酸分子附近的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选为病毒或质粒。重组载体可用在克隆，测序，和/或其它核酸分子操作中，并可以用于递送这样的分子(例如，象DNA疫苗或基于病毒的疫苗中那样)。重组载体优选在核酸分子的表达中使用，并还可称为表达载体。优选的重组载体能在被转染的宿主细胞中表达。
在本发明的重组分子中，核酸分子可操作性地与重组载体连接，其中重组载体含有调控序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和其它与宿主细胞相容并控制本发明的核酸分子表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一种或多种转录控制序列可操作性连接的核酸分子。短语“可操作性连接”指核酸分子和转录控制序列以这样的方式连接，使得该分子转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后被表达。
转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，例如启动子、增强子、操纵基因和阻抑蛋白序列。合适的转录控制序列包括能在根据本发明的宿主细胞中起作用的任何转录控制序列。本领域技术人员知道多种合适的转录控制序列。
根据本发明，术语“转染”用来指可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。术语“转化”当用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母，或植物细胞中时，可与术语“转染”互换使用。在微生物系统和植物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物获取了外源核酸而承袭(inherit)的变化，并且基本上与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、细胞化学处理、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
一类在本发明的重组核酸分子中有用的重组载体是重组病毒载体。该载体包括包装在病毒外壳中的编码本发明的融合蛋白的重组核酸序列，其在施用后可在动物体内或体外的宿主细胞中表达。可以使用多种重组病毒载体，包括但不限于基于α病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺相关病毒和逆转录病毒的那些重组病毒载体。特别优选的是那些基于腺病毒和腺相关病毒的病毒载体。适于基因递送的病毒载体在本领域是公知的，可由本领域技术人员选择用于本发明。《Molecular Biotechnology》，第二版，Glick和Pasternak著，ASM Press，Washington D.C.，1998，pp.555-590提供了现有病毒载体的详细讨论，在此将其全部内容引用并入本文。
适于用根据本发明的重组核酸分子转染的宿主细胞包括任何可以被转染或转化的细胞，包括任何动物、昆虫、细菌、真菌(包括酵母)细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是已被转染并表达本发明的融合蛋白的动物细胞，包括肿瘤细胞。在“实施例”部分例举了这样的细胞，它们可用于，例如，评估由本发明的疫苗或组合物诱发的抗原特异性T细胞应答。用这些转染的肿瘤细胞还可以测试其它针对HCV抗原的疫苗或组合物。
以下实验结果是为说明目的而提供的，并不意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1
以下实施例描述对本发明截短的NS3-Core融合蛋白酵母疫苗GI-5005的改造。
GI-5005酿酒酵母被工程改造以在铜诱导型启动子CUP1控制下表达HCV NS3-Core融合蛋白。用PCR扩增HCV基因组(基因型1a，H77株，cDNA由NIH提供)的两个区域以生成所述产物。NS3-Core融合蛋白是单个多肽(本文中用SEQ ID NO：2表示)，其中下列序列元件按照从N末端到C末端的顺序融合在同一读框内(括号中为HCV多蛋白中的编号)：(1)序列MADEAP，赋予对蛋白酶体降解的抗性；(2)HCV NS3蛋白酶蛋白的氨基酸89到350(1115到1376)；(3)克隆过程中导入的单个苏氨酸氨基酸残基；(4)HCVCore蛋白的氨基酸2到140(2到140)；和(5)增加Core变体亲水性的ED序列。
通过对铜诱导、热灭活的GI-5005酵母的裂解产物进行Western印迹分析，确认HCV NS3-Core融合蛋白的表达。蛋白检测使用HCV NS3特异性的单克隆抗体(Virostat)或HCV Core蛋白特异性的单克隆抗体(Anogen)(见图1A和图1B)。
实施例2
以下实施例描述对本发明失活的HCV NS3酵母疫苗GI-5003的工程改造。
GI-5003酿酒酵母被工程改造以在铜诱导型启动子CUP1控制下表达失活的全长HCV NS3蛋白。用PCR扩增HCV基因组(基因型1a，H77株，cDNA由NIH提供)的单个区域以生成产物。失活的NS3蛋白是单个多肽(本文中用SEQ ID NO：4表示)，其中下列序列元件按从N末端到C末端的顺序融合在同一读框内(括号中为HCV多蛋白中的编号)：(1)序列MADEAP，赋予对蛋白酶体降解的抗性；和(2)HCV NS3蛋白酶蛋白的氨基酸1到631(1027到1657)(注意，为了使蛋白水解活性失活，HCV多肽1165位的氨基酸已经从丝氨酸改变为丙氨酸)。
通过对铜诱导、热灭活的GI-5003酵母的裂解产物进行Western印迹分析确认了HCV NS3蛋白的表达。蛋白检测使用HCV NS3特异性的单克隆抗体(Virostat)(见图1A和图1B)。
实施例3
以下实施例描述本发明GI-5000系列的截短的HCV E1-E2融合蛋白酵母疫苗的工程改造。
E1-E2融合蛋白是单个多肽(本文中用SEQ ID NO：6表示)，其中下列序列元件按从N末端到C末端的顺序融合在同一读框内(括号中为HCV多蛋白中的编号)：(1)序列MADEAP，赋予对蛋白酶体降解的抗性；(2)HCV蛋白E1的氨基酸1到156(192到347)；(3)HCV蛋白E2的氨基酸1到334(384到717)。该融合蛋白省去了E1的36个C末端疏水氨基酸和E2的29个C末端疏水氨基酸，以促进在酵母细胞质中的积累。
通过对铜诱导、热灭活的酵母的裂解产物进行Western印迹分析确认了HCV E1/E2融合蛋白的表达(见图1C)。
实施例4
以下实施例描述本发明GI-5000系列的TM域缺失的HCV NS4b融合蛋白酵母媒介物的工程改造。
NS4b融合蛋白是单个多肽(在本文中由SEQ ID NO：8表示)，其中以下序列元件按从N末端到C末端的顺序串联排列在同一阅读框内(括号中为多蛋白的编号)：(1)序列MADEAP，赋予对蛋白酶体降解的抗性；(2)HCV蛋白NS4b的氨基酸1到69(1712到1780)；(3)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(1888到1972)。省去了对应于NS4b氨基酸70到176(1781到1887)的、含多个跨膜域的107个氨基酸的区域，以促进在酵母细胞质中的积累。
通过对铜诱导、热灭活的酵母的裂解产物进行Western印迹分析确认了HCV NS4b融合蛋白的表达(见图1D)。
实施例5
以下实施例描述使用表达HCV抗原的GI-5005酵母媒介物(本文中又称为TarmogenTMTM)在小鼠中进行的非临床药理学研究：免疫原性研究。
GI-5005由稳定转导了酵母表达质粒的酿酒酵母(获自ATCC的W303株)组成，其中所述质粒编码在酵母铜诱导型(CUP1)启动子控制下的HCV基因型1a来源的截短NS3与core基因产物的融合蛋白(SEQ ID NO：2)，如实施例1中所述。在以下研究中，对C57BL/6(H-2b)和BALB/cBy(H-2d)小鼠皮下注射GI-5005酵母。使用检测GI-5005对抗原特异性淋巴细胞的诱导的体外和体内测定，包括淋巴细胞增殖、细胞介导的细胞毒作用、细胞因子分泌和针对肿瘤攻击(challenge)的保护。为了支持上述研究，生成并维持下述酵母菌株、细胞系和重组病毒：
GI-5003：表达HCV-NS3蛋白的酵母菌株。GI-5003表达全长NS3，其中催化域已通过单个点突变而失活。
GI-5005-L：GI-5005酵母菌株，HCV-NS3-Core融合蛋白表达量少于50ng/YU。
GI-5005-M：GI-5005酵母菌株，HCV-NS3-Core融合蛋白表达量约500ng/YU
GI-5005-H：GI-5005酵母菌株，HCV-NS3-Core融合蛋白表达量约1400ng/YU。
EL4-NS3：C57BL/6来源的EL4淋巴瘤细胞(H-2b)，稳定转染了编码HCVNS3的DNA。
A20-NS3：BALB/c来源的A20淋巴瘤细胞(H-2d)，稳定转染了编码HCVNS3的DNA。
P815-NS3：DBA/2来源的P815白血病细胞(H-2d)，稳定转染了编码HCVNS3的DNA。
编码下述蛋白的重组痘苗病毒(rVV)：β-半乳糖苷酶(rVV-lac)、HIV-1Gag(rVV-Gag)、HCV NS3(rVV-NS3)和HCV Core(rVV-Core)。
在下述的研究中，而且如果在具体的实验中没有另外说明，每周一次对雌性BALB/c和/或C57BL/6小鼠(每组5只，6-10周龄)皮下注射5YU(5千万个)GI-5005或GI-5003，最后一次注射的7天后处死小鼠。用添加了10％的热灭活胎牛血清、L-谷胺酰胺、HEPES和2-巯基乙醇的RPMI-1640组织培养基制备脾细胞悬液，将每个组的脾细胞悬液合并，并将其置于使用指定的HCV抗原特异性(通常为rVV-NS3和/或rVV-Core)和酵母抗原特异性(通常为GI-5005)刺激物的体外刺激(IVS)条件下。利用标准试验来评估通过施用GI-5005诱导的免疫应答，所述试验包括通过3H-胸苷掺入进行评定的淋巴细胞增殖，使用51Cr标记的目标细胞进行的细胞介导的细胞毒性试验，细胞因子分泌的定量，和针对肿瘤攻击的保护。
(a)GI-5005诱导抗原特异性淋巴细胞增殖
在评估GI-5005的免疫原性的预实验中，每周一次共三周给C57BL/6小鼠注射5YU(5千万个)的热灭活GI-5005酵母细胞。小鼠未显示由于免疫所致的明显不良反应。最后一次免疫的7天后获得脾细胞，在不用任何刺激物，或分别用EL4淋巴瘤细胞、EL4-NS3(急定表达HCV NS3的EL4)、rVV-NS3(编码HCV NS3的重组痘苗病毒)或rVV-Core的情况下对单细胞悬液进行体外刺激。培养5天后用标准的胸苷掺入试验评估淋巴细胞增殖。更具体地说，C57BL/6小鼠注射5YU GI-5005，取其脾细胞置于96孔U形底组织培养板的单独的孔中(400,000细胞/孔)，进行体外刺激：不用任何刺激物，或用丝裂霉素C处理过的EL4(10,000细胞/孔)、丝裂霉素C处理过的EL4-NS3(10,000细胞/孔)、rVV-NS3(400,000pfu/孔)或rVV-Core(400,000pfu/孔)。第5天加入3HTdR，再18小时后收获培养板。结果表示为一式三份样品的平均CPM+/-S.D.。图2中所示的结果显示GI-5005诱导NS3-和Core-特异性淋巴细胞增殖。
(b)GI-5005诱导抗原特异性细胞毒效应细胞应答：
GI-5005诱导能杀灭稳定表达HCV NS3的肿瘤细胞的细胞毒效应细胞
图3A-3C显示，用GI-5005免疫可诱导能杀灭表达HCV NS3的肿瘤细胞的细胞毒效应细胞。具体地，C57BL/6小鼠每周一次注射5YU的GI-5005共三周，取其脾细胞以30x106细胞/瓶置入25cm2组织培养瓶(图3A-3B)、或以6x 106/孔置入24孔平底组织培养板(图3C)的单独的孔中。分别用：1YU(107个酵母细胞)的GI-5005/瓶(图3A)；1YU/瓶的GI-1001或1YU/瓶的GI-5005(图3B)；或6x106pfu/孔的rVV-lac或rVV-NS3(图3C)，或不用任何刺激物，体外刺激(IVS)脾细胞6天。将与rVV-lac或rVV-NS3一起培养的脾细胞在作为T细胞生长因子源的10％T-stim存在下再扩增3天。在6天(图3A，3B)或9天(图3C)的IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物(doubling dilutions)与10000个51Cr标记的EL4或EL4-NS3细胞混合，如标明的那样。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶比(effector：target ratio)。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。自发铬释放值百分比EL-4为19％(图3A)，EL4-NS3的值为40％(图3A，3B)，EL4-NS3的值为29％(图3C)。
在图3A所示的结果中，用GI-5005酵母对来源于GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞进行体外刺激，其中酵母对脾细胞的比值为1∶3，刺激6天，然后在51Cr标记的未转染的EL4淋巴瘤细胞或稳定表达HCV-NS3的EL4细胞(EL4-NS3)上进行测试。经过刺激的脾细胞以剂量依赖的方式杀灭EL4-NS3靶细胞。与之对照的是，对未转染的EL4细胞，观察到的杀灭显著较少。除了提供证据表明用GI-5005免疫诱导了NS3特异性细胞毒效应细胞外，这些数据还表明GI-5005酵母可用来在体外重刺激(re-stimulate)NS3特异性细胞毒效应细胞。图3B所示的结果为该发现提供了进一步的确证，并且显示，用GI-5005体外刺激(IVS)来自GI-5005免疫的小鼠的脾细胞，与不用任何刺激物(nil)或用载体对照酵母(GI-1001)进行IVS相比，可使细胞毒效应细胞增强对EL4-NS3的细胞毒活性。对于在所述IVS期间需要暴露于一种形式的HCV NS3抗原以激活细胞毒效应细胞活性这一点，通过使用编码NS3的重组痘苗病毒(rVV-NS3)刺激作了进一步研究(图3C)。这些数据显示，与用编码无关抗原β-半乳糖苷酶的重组病毒rVV-lac进行IVS相比，用rVV-NS3进行IVS刺激了存在于被免疫小鼠的脾脏中的NS3特异性细胞毒效应细胞。
GI-5005诱导能杀灭感染了编码HCV NS3或Core的重组痘苗病毒的肿 瘤细胞的细胞毒效应细胞
上面所示的结果显示，用GI-5005免疫可导致对能杀灭表达NS3的同基因肿瘤细胞的细胞毒效应细胞的诱导。但是，GI-5005还表达HCV Core抗原。获得表达HCV Core蛋白的稳定转染肿瘤细胞系的尝试没有成功。为了克服缺乏表达Core的靶细胞的问题，进行了如图4所示的研究。简单地说，用编码HCV NS3或HCV Core的重组痘苗病毒过夜感染带有H-2d的P815白血病细胞，然后将它们用于标准的铬释放测定；铬释放测定使用的脾细胞来自用GI-5005或GI-5003(一种表达全长HCV-NS3而非Core的TarmogenTMTM)免疫的BALB/c小鼠，该小鼠还在GI-5005存在下体外刺激了5天。更具体地，BALB/c小鼠每周一次注射5YU的GI-5005(GI-5005)或5YU的GI-5003(GI-5003)共三周，取其脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(8x 106/孔)，并用GI-5005(1x106/孔)体外刺激5天。在IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的P815白血病细胞混合，其中所述P815白血病细胞已用编码HCV NS3(图4左边小图)或HCV Core(图4右边小图)的重组痘苗病毒感染过夜。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。P815-rVV-NS3的百分比自发铬释放值为21％，而P815-rVV-Core的值为40％。
图4显示，GI-5005可诱导能杀灭感染了rVV-NS3(图4左边小图)或rVV-Core(图4右边小图)的肿瘤细胞的细胞毒细胞，而GI-5003诱导的杀灭仅限于NS3。总之，图3A-3C和图4所示的结果表明，用GI-5005免疫可诱导NS-3和Core-特异性的细胞毒效应细胞活性。
(c)GI-5005诱导能分泌促炎细胞因子的细胞
图5显示，将来自幼稚的或用GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞与GI-5005酵母一起进行组织培养时，细胞因子被分泌。培养开始48小时后收集无细胞上清，并用基于流式细胞仪的LuminexTM测定法(Biosource)测定细胞因子浓度。更具体地，将来自幼稚C57BL/6小鼠或来自接受了每周1次5YU GI-5005注射共3次的小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独孔中(10x106/孔)。用GI-5005(1x106酵母细胞/孔)或PMA(15ng/mL)加离子霉素(750ng/mL)刺激脾细胞。培养开始48小时后收集无细胞上清，由科罗拉多大学癌症中心流式细胞仪室(University of Colorado Cancer Center FlowCytometer Facility)用流式细胞仪LuminexTM测定法(Biosource)对细胞因子进行定量。IFN-g＝IFN-γ；TNF-a＝TNF-α。
这些结果显示，施用GI-5005可激发分泌IL-2和IL-5，以及促炎细胞因子IL-6、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的T细胞。重要地，应当指出，来自免疫小鼠的脾细胞体外暴露于酵母时的细胞因子应答，与来自幼稚C57BL/6小鼠的T细胞被PMA加离子霉素多克隆刺激时观察到的细胞因子应答程度相当。另外，图5还显示了幼稚C57BL/6脾细胞对酵母的细胞因子应答，并说明针对酵母的天然应答包括IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，它们可能来源于群体中的单核细胞和树突状细胞。用幼稚的和免疫的BALB/c小鼠的脾细胞获得了类似的结果(见图8A和8B和图11A和11B)。
(d)重复施用对由GI-5005诱发的免疫应答的影响
图6、图7A-7D和图8A和8B显示的是对C57BL/6和BALB/c小鼠进行1次，2次或3次每周1次的GI-5005免疫的比较实验结果。图6考察了NS3和Core特异性淋巴细胞增殖，图7A-7D显示了NS3和Core特异性细胞毒细胞活性的诱导，图8A和8B显示了细胞因子分泌谱。总的来说，这些结果表明，单次GI-5005注射可诱发弱的免疫应答，通过增加施用显著地增强了该免疫应答。
图6显示对来自接受了1次、2次或3次每周1次的GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞进行淋巴细胞增殖测定的结果。具体地，将来自接受了1次、2次或3次每周1次的5YU GI-5005注射的C57BL/6小鼠的脾细胞置于96孔U形底组织培养板的单独孔中(400,000细胞/孔)，并不用任何刺激物，或用rVV-NS3、rVV-Core或rVV-rastafar(100,000pfu/孔)体外刺激。第5天加入3HTdR，再18小时后收获培养板。结果表示为一式三份样品的平均CPM+/-S.D.。HCV NS3应答和Core特异性淋巴细胞相对于免疫次数成正比地增加，而且3次免疫相对于1次免疫而言计算得到的针对rVV-NS3的刺激指数(stimulation index)从1.8提高到2.8，针对rVV-Core的刺激指数从6.5提高到8.6。没有发现针对rVV-rastafar(编码人Ras)的刺激，这证实了GI-5005诱导的应答的抗原特异性。
图7A-7D显示用来源于接受了1次、2次或3次GI-5005免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾效应细胞进行的铬释放测定的结果。具体地，将来自接受了1次、2次或3次每周一次的5YU GI-5005注射的C57BL/6小鼠(图7A和7B)或BALB/c小鼠(图7C和7D)的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独孔中(10x106/孔)，并用GI-5005(1x106/孔)体外刺激5天。在IVS培养期结束时，将脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的EL4淋巴瘤细胞(图7A和7B)或P815白血病细胞(图7C和7D)混合，其中所述EL4细胞或P815细胞已用表达HCV NS3(图7A和7C)或HCV Core(图7B和7D)的重组痘苗病毒感染过夜。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。EL-4-rVV-NS3的百分比自发51Cr释放值为10％，EL4-rVV-Core为10％，P815-rVV-NS3为12％，P815-rVV-Core为11％。图7A-7D所示的结果证实了图4的发现，并对感染了rVV-NS3或rVV-Core的同基因肿瘤细胞目标显示剂量依赖性的杀灭作用，且该杀灭作用相对于免疫次数成正比增加。
图8A和8B的结果显示来源于接受了1次、2次或3次GI-5005免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾细胞对GI-5005体外刺激应答的细胞因子分泌谱。具体地，来自接受了1次、2次或3次每周一次的5YU GI-5005注射的C57BL/6小鼠(图8A)或BALB/c小鼠(图8B)的脾细胞置于24孔平底组织培养平板的单独的孔中(10X106/孔)，用GI-5005(1x106/孔)体外刺激。培养开始48小时后收集无细胞上清液，由科罗拉多大学癌症中心流式细胞仪室用流式细胞仪LuminexTM测定法(Biosource)对细胞因子进行定量。IFN-g＝IFN-γ；TNF-a＝TNF-α。这些结果显示，来自被免疫小鼠的细胞针对酵母抗原的细胞因子应答主要是TH-1类促炎型的，要出现所有类型的应答需要多于1次的免疫。需要指出的重要一点是，总体上没有检测到TH2细胞因子IL-4和IL-10，这提示本发明的酵母媒介物主要诱导细胞免疫而非体液免疫。
上面所示的数据说明，通过重复每周一次的施用增强了GI-5005诱导的免疫应答。为了探讨用GI-5005加强免疫应答，进行了如表2概述的实验。简单地说，雌性BALB/c小鼠接受了5次每周一次的GI-5005注射，然后不进行加强，或按每1周一次，2周一次，1月一次或2月一次的间隔进行加强。最后一次加强的16天后处死小鼠。结果显示了重要的一点，即重复每周1次的注射不会导致诱导出中和作用和/或耐受，因为即使在经过12次每周1次的注射后，再次施用时仍然产生了加强作用，如淋巴细胞增殖和细胞介导的细胞毒测定所测得的。
表2GI-5005免疫和加强方案
Figure BDA0000152103260000571
I＝用GI-5005加强
图9显示用来自按表2所示的免疫方案接受了GI-5005的BALB/c小鼠的脾细胞进行淋巴细胞增殖测定的结果。简单地说，将来自于用5YU的GI-5005按表2所述的方案免疫的BALB/c小鼠的脾细胞置于96孔U形底组织培养板的单独的孔中(400,000细胞/孔)，不用任何刺激物(Bkgd)、或用GI-5005(320,000或20,000酵母细胞/孔)、伴刀豆球蛋白A(ConA；2.5μg/mL)或脂多糖+硫酸葡聚糖(LPS+DS；25μg/ml及20μg/mL)体外刺激。第3天加入3HTdR，再18小时后收获培养板。结果表示为一式三份样品的平均CPM+/-S.D.。图9显示，针对酵母相关抗原的可加强应答(boostable response)相当明显，且没有明显诱导耐受。
图10显示用来自于如表2所述免疫和加强的BALB/c小鼠的脾效应细胞进行铬释放测定的结果。简单地说，将来自用5YU GI-5005按表2所述方案免疫的BALB/c小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(10x106/孔)，并用GI-5005(1x106/孔)体外刺激5天。在该IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的P815-NS3白血病细胞混合。E∶T比值是指效∶靶细胞比。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。P815-NS3的百分比自发51Cr释放为12％。图10所示的结果确证了图9中报道的发现，显示对稳定表达HCV NS3的同基因肿瘤细胞的剂量依赖性杀灭作用，并进一步显示GI-5005诱导的CTL应答的持续性和可加强性。
(e)GI-5005诱导的免疫应答的持续性
为了评价用GI-5005免疫时诱导的细胞免疫应答的强健性(robustness)，C57BL/6和BALB/c小鼠接受了3次每周一次的GI-5005，并于给药的1个月和2个月后处死。图11A和11B考察酵母特异性淋巴细胞增殖的持续性，而图12A和12B考察NS3特异性和Core特异性细胞毒细胞活性的持续性，图13A-13D显示酵母特异性及NS3特异性细胞因子的分泌谱。总的来说，这些结果提示施用GI-5005可诱导持久和强健的记忆T细胞应答。
GI-5005诱导的淋巴细胞增殖应答的持续性
图11A和11B所示的结果显示，在3次每周一次的免疫后，针对酵母抗原的增殖应答持续至少2个月。简单地说，C57BL/6(图11A)或BALB/c(图11B)小鼠不接受任何免疫(幼稚)或接受3次每周1次的5YU GI-5005免疫，休息5周(持续1个月)或9周(持续2个月)后处死，将来自上述小鼠的脾细胞置于96孔U形底组织培养板的单独的孔中(400,000细胞/孔)，并不用任何刺激物(Bkgd)或用GI-5005(400,000酵母细胞/孔)体外刺激。第5天加入3HTdR，18小时后收获培养板。结果表示为一式三份样品的平均CPM+/-S.D.。重要地，应当指出，这些结果考察的是酵母特异性增殖应答，而不是图2和图6所述的HCV NS3特异性或Core特异性增殖应答。在这些具体实验中，针对酵母抗原的刺激指数的范围在约11到77。
GI-5005诱导的细胞毒效应细胞应答的持续性
如图12A和12B所示，与有关淋巴细胞增殖应答的结果相似，GI-5005诱导的细胞毒效应细胞活性的持续至少2个月。简单地说，C57BL/6(图12A)或BALB/c(图12B)小鼠不接受任何免疫(幼稚)或接受3次每周1次的5YUGI-5005免疫，休息5周(持续1个月)或9周(持续2个月)后处死，将来自上述小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(10x106/孔)，然后用GI-5005(1x106/孔)体外刺激5天。在该IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的EL4-NS3淋巴瘤细胞(图12A)或P815-NS3白血病细胞(图12B)混合。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比值。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。百分比自发51Cr释放对EL-4-NS3为11％，对P815-NS3为11％。
GI-5005诱导的细胞因子分泌应答的持续性
图13A-13D显示来自接受3次每周一次的GI-5005免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾细胞对GI-5005和rVV-NS3体外刺激应答的细胞因子分泌谱的持续性。简单地说，C57BL/6(图13A和13B)或BALB/c(图13D和13D)小鼠不接受任何免疫(幼稚)或接受3次每周1次的5YU GI-5005免疫，休息5周(持续1个月)或9周(持续2个月)后处死，将来自上述小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(10x106/孔)，用GI-5005(1x107/孔)或rVV-NS3(1x107pfu/孔)体外刺激。培养开始48小时(用GI-5005进行IVS)或120小时(用rVV-NS3进行IVS)后收集无细胞培养上清。细胞因子用LuminexTM测定法(Biosource)定量。IFN-g＝IFN-γ；TNF-a＝TNF-α。这些结果显示GI-5005免疫所诱导的细胞因子分泌细胞的持续性至少为2个月。与酵母特异性的细胞因子谱形成对照的是，这些结果还显示，使用rVV-NS3作为刺激物的抗原特异性(即NS3特异性)细胞因子谱主要限于GM-CSF和IFN-γ。
(f)施用不同剂量的GI-5005的比较
图14A-14I和图15A-15C中总结的结果对分别被表达不同量抗原的GI-5005TarmogenTM诱导的细胞毒效应细胞和细胞因子分泌细胞进行了比较。这项研究是作为一种潜能(potency)测定法的开发工作的一部分进行的。
简单地说，制备了表达大约1400、500、以及＜500ng/YU的HCVNS3-Core融合蛋白的GI-5005TarmogenTM。这是通过改变诱导期中存在的铜的量而实现的。将这三种TarmogenTM称为GI-5005-H(1400ng/YU；0.02ng蛋白/ng总蛋白)，GI-5005-M(500ng/YU；0.008ng融合蛋白/总蛋白)和GI-5005-L(＜50ng/YU；＜0.001ng蛋白/ng总蛋白)。用这三种不同的GI-5005TarmogenTM以0.1、1及10YU三种剂量每周一次免疫5只一组的雌性BALB/c小鼠(H-2d)。第三次每周一次的注射的7天后处死小鼠，对它们的脾细胞进行如下面所述的体外刺激(IVS)。
图14A-14I中，将来自被免疫小鼠的脾细胞按组合并，分别用三种不同GI-5005TarmogenTM进行IVS。评估这些IVS培养物对于稳定表达HCVNS3的携带H-2d的P815细胞的细胞介导型细胞毒作用。简单地说，BALB/c小鼠每周接受1次0.1、1或10YU的GI-5005-H(图14A-14C)、GI-5005-M(图14D-14F)或GI-5000-L(图14G-14I)注射，共注射3次；将来自上述小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(10x106脾细胞/孔)，并用所示的GI-5005TarmogenTM(2x106酵母细胞/孔)体外刺激(IVS)5天。在该IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的P815-NS3白血病细胞混合。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比值。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养6小时后分离的。P815-NS3的百分比自发51Cr释放为12％。每张图的图例中的10YU、1YU和0.1YU是指免疫所用的GI-5005的量。结果清楚地显示基于单个参数的剂量应答，所述单个参数是指免疫或体外刺激所用的TarmogenTM中表达的HCV抗原的量。从图15A-15C所示的数据可得出相似的结论。
图15A-15C显示针对酵母特异性抗原应答而分泌的IL-6的水平和针对HCV NS3特异性抗原应答而分泌的GM-CSF的水平的比较。具体地，BALB/c小鼠每周接受1次0.1、1或10YU(X轴)的GI-5005-H(图15A)、GI-5005-M(图15B)或GI-5000-L(图15C)注射，共注射3次；将来自上述小鼠的脾细胞置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(10x106脾细胞/孔)，并用GI-5005-H(2x106酵母细胞/孔)或rVV-NS3(100x106pfu/孔)体外刺激。培养开始72小时后(用GI-5005进行IVS)或120小时后(用rVV-NS3进行IVS)收集无细胞培养上清。使用LuminexTM测定法(Biosource)定量细胞因子。简单地说，这些数据显示，IL-6分泌细胞的诱导依赖于免疫所用的TarmogenTM的数目，但不依赖于TarmogenTM中表达的HCV抗原的量。与之相对的，GM-CSF分泌细胞的诱导依赖于上述两方面。根据图14A-14I和图15A-15C中所示的数据，诱导抗原特异性应答需要最少500ng融合蛋白/YU或0.008ng蛋白/ng总蛋白。
实施例6
以下实施例显示小鼠中使用表达HCV抗原的GI-5005TarmogenTM的非临床药理学研究：肿瘤保护和治疗研究。
由于无法获得抗HCV保护或治疗的体内动物模型，本发明人使用抗携带HCV抗原的肿瘤的体内保护和治疗来显示GI-5005的活性。
(a)GI-5005诱导针对表达NS3的肿瘤细胞的保护性免疫
上面所述的实验显示了GI-5005在C57BL/6和BALB/c小鼠中的免疫原性。为了确定GI-5005酵母的注射是否引发了保护性免疫，每周1次给BALB/c小鼠皮下注射0.1、0.7或5YU的GI-5005或GI-5003(一种只表达HCV NS3蛋白酶的TarmogenTM)，注射3次，用5YU的GI-4014(一种表达突变Ras蛋白的TarmogenTM)作为阴性对照，或不注射任何物质。最后一次免疫的1周后，用稳定转染HCV NS3的同基因A20肿瘤细胞(A20-NS3)皮下注射攻击小鼠。攻击后第21天测量肿瘤的体积。图16所示的数据显示，用表达HCV NS3抗原的TarmogenTM、GI-5005或GI-5003免疫的小鼠针对A20-NS3肿瘤细胞的攻击受到了保护，而不用任何物质免疫或用GI-4014免疫的小鼠没有获得该保护。结果表示为平均肿瘤体积+/-S.D.。这些结果显示，GI-5005可诱导剂量和抗原依赖性免疫应答，该免疫应答为小鼠提供抗表达HCV NS3同基因肿瘤细胞的保护。
在C57BL/6小鼠中重复该实验，该C57BL/6小鼠每周1次注射了3周GI-5005，再经过7天后皮下注射EL4-NS3淋巴瘤细胞而被攻击。简单地说，C57BL/6小鼠(每组5只)不注射任何物质(幼稚)，或每周1次皮下注射5YUGI-5005，注射3次。最后一次免疫7天后用5x104A20-NS3皮下注射攻击小鼠。在攻击后所示的天数测量肿瘤。结果表示为平均肿瘤体积+/-S.D.。数字是指具有可测量的肿瘤的动物数(*从经免疫小鼠切出的肿瘤被发现不再表达NS3)。图17所示结果显示，注射GI-5005的小鼠针对EL4-NS3攻击受到了保护，而幼稚小鼠则没有。注射GI-5005没有为小鼠提供抗单独的EL4的保护，说明该保护性免疫是抗原特异性的(结果未显示)。为了确定在经免疫小鼠中生成的肿瘤是否仍在表达HCV NS3，从两只经过GI-5005免疫的显示肿瘤生长迹象的小鼠中，以及5只幼稚小鼠对照中切出肿瘤，置于含抗生素G4.18的组织培养基中。在EL4-NS3中，编码HCV NS3的哺乳动物表达载体也含有新霉素抗性基因，使转染体得以在新霉素类似物G4.18的存在下生长，从而保持HCV NS3的稳定表达。从幼稚小鼠中切出的EL4-NS3肿瘤细胞在G4.18存在下长出，而来自GI-5005免疫的小鼠的肿瘤则没有。该结果提示存在消除所述转染抗原的表达的免疫压力(immunologicalpressure)。这些结果提示GI-5005可在体内诱导针对表达HCV NS3的同基因肿瘤细胞的攻击的保护性免疫应答。
(b)“被保护”小鼠中的免疫应答
由于可以获得排斥(reject)表达HCV NS3的同基因肿瘤细胞的“被保护”小鼠，从而有机会考察保护性免疫背景下的抗原特异性免疫应答。将来自上述5只排斥EL4-NS3肿瘤细胞的小鼠的脾细胞合并，置于96孔U形底组织培养板的单独的孔中(4x105细胞/孔)，并不用任何刺激物，或用GI-1001(2x105酵母细胞/孔)、GI-5005(2x105酵母细胞/孔)、rVV-Gag(1x105pfu/孔)、rVV-NS3(1x105pfu/孔)、或rVV-Core(1x105pfu/孔)刺激。第5天加入3HTdR，18小时后收获细胞。结果表示为一式四份样品的平均CPM+/-S.D.。图18显示来自被保护小鼠的脾细胞针对酵母特异性刺激物，以及HCV NS3和HCV Core特异性刺激物的增殖应答。图19考察了它们的细胞毒效应细胞活性。在这个实验中，将来自排斥EL4-NS3肿瘤细胞的5只经免疫小鼠的脾细胞或来自幼稚小鼠的脾细胞合并后，置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(8x106脾细胞/孔)，并用GI-5005(1x106酵母细胞/孔)或rVV-NS3(8x105pfu/孔)体外刺激(IVS)5天。在该IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的EL4靶细胞混合，该EL4靶细胞已用rVV-NS3感染过夜。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养5小时后分离的。EL4-rVV-NS3的百分比自发51Cr释放为33％。总的来看，这些结果提示，被保护的小鼠，即排斥表达NS3的肿瘤细胞的经免疫小鼠，与仅如实施例5所述那样免疫的小鼠相比，具有针对HCV NS3的增强的免疫应答。
(c)GI-5005在分离自幼稚荷瘤小鼠的脾细胞中刺激细胞毒效应细胞活性
上面所示的结果提示，GI-5005小鼠被暴露于次级HCV抗原来源，即表达HCV NS3的肿瘤细胞时，可导致加强作用，这一点为增强的增殖应答和细胞毒效应细胞应答所证明。为了确定GI-5005酵母是否还可以刺激来自携带抗原的小鼠的T细胞活性，从而模拟慢性HCV感染患者中的T细胞活化，用EL4-NS3肿瘤细胞皮下注射幼稚C57BL/6小鼠。3周后，当肿瘤体积达到大约2500mm3时，处死小鼠，将脾细胞与载体对照(GI-1001)或GI-5005酵母一起孵育。体外刺激开始6天后，评估针对感染了rVV-NS3的EL4靶细胞的细胞毒效应细胞活性。具体地，将来自21天前注射了EL4-NS3肿瘤细胞的5只幼稚小鼠的脾细胞合并，置于24孔平底组织培养板的单独的孔中(8x106脾细胞/孔)，并用GI-1001或GI-5005(1x106酵母细胞/孔)体外刺激(IVS)6天。在该IVS培养期结束时，将这些脾细胞培养物的二倍稀释物与10000个51Cr标记的EL4靶细胞混合，该EL4靶细胞已用rVV-NS3感染过夜。E∶T比值是指基于IVS培养期开始时脾效应细胞浓度的效∶靶细胞比。结果表示为一式三份样品的平均百分比特异性裂解+/-S.D.，所述样品是在96孔V形底培养板中共培养5小时后分离的。EL4-rVV-NS3的百分比自发51Cr释放为33％。图20所示的结果显示GI-5005能刺激来自携带了表达HCV-NS3的肿瘤的小鼠的细胞毒效应细胞。
(d)GI-5005诱导抗表达NS3的肿瘤细胞的治疗性活性
图20所示的结果显示GI-5005能对携带表达EL4-NS3肿瘤的C57BL/6小鼠的脾细胞重刺激(re-stimulate)NS3特异性细胞毒效应物活性。这提示可能还可获得治疗效应。为了评估这种可能性，对BALB/c小鼠(每组5只)皮下注射1.25x105个A20-NS3同基因B淋巴瘤细胞，这些细胞稳定转染了编码HCV NS3的DNA。从肿瘤植入的7天后开始，每周用PBS或YU GI-5005免疫小鼠1次，经过3周。监测肿瘤的生长，且在肿瘤植入的28天后，PBS组中的肿瘤达到2500mm3时处死小鼠。图21中的结果表示为平均肿瘤体积+/-S.D，数字是指具有可测量的肿瘤的动物数(*发现从所有荷瘤小鼠中切出的肿瘤均仍然表达NS3)。
图21显示，治疗性施用GI-5005造成肿瘤的好转。简单地说，所有5只用PBS处理的荷瘤小鼠都显示肿瘤生长，而用GI-5005处理的5只中只有3只显示肿瘤生长，而且接受了处理的动物中发生的肿瘤似乎生长得慢得多(PBS处理组中荷瘤小鼠的平均肿瘤体积为2488+/-636mm3，而GI-5005处理组中相应为1264+/-548mm3)。但是，与上述的用EL4-NS3得到的结果形成对照的是，HCV NS3蛋白仍然在来自携带A20-NS3肿瘤的小鼠的所有肿瘤中表达(数据未显示)。
图22A和22B所示的另一项研究中证实了GI-5005的免疫治疗性质，该研究中对植入的肿瘤细胞数进行变化。简单地说，对BALB/c小鼠(5只每组)皮下注射2.5x104、5.0x104或1x105个A20-NS3B淋巴瘤细胞。在肿瘤植入的7、14和21天后，通过在皮肤上远离肿瘤的位置皮下注射PBS或10YU GI-5005来对小鼠进行治疗性免疫。在治疗开始后所指明的天数测量肿瘤体积。结果表示为治疗开始后第24天的平均肿瘤体积+/-S.D(图22A)以及荷瘤小鼠的百分比(图22B)。
实施例7
以下实施例描述用本发明的酵母疫苗进行的毒性研究。
如上所述，迄今为止在多项不同的研究中已经给超过300只小鼠施用了GI-5005TarmogenTM，尚没有出现明显可观察到的毒性。使用该基于酵母的疫苗平台的其它相关产品已经被施用于小鼠、大鼠、兔、豚尾猴(pig-tailedmacaque monkeys)和恒河猴(rhesus macaque monkeys)，没有出现严重的可观察到的毒性。其它基于酵母的产品与GI-5005TarmogenTM具有相似性，它们的安全性数据也从而具有关联性，因此，根据GI-5005的毒性数据，详细进行多种所述其它TarmogenTM的非临床安全性评估。
本研究的目的是确定按下述方式施用后，GI-5005在雄性和雌性新西兰兔中的毒性作用：每周一次皮下施用固定剂量体积1mL，连续施用达13周(第1、8、15、29、36、43、50、57、64、71、78、85和92天给药)，然后进行指定间隔的恢复(recovery)/尸检(表3)。根据以前的研究中可获得的数据选择剂量水平。在人体中本测试待测品准备采用的施用途径是皮下途径。中期报告总结如下。三个处理组(第2到第4组)，每组5只雄性、5只雌性新西兰大白兔，分别以1、10和100个酵母单位(YU)的剂量水平施用待测品。对照组(第1组)每种性别各5只动物，接受媒介物，即无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在第1、8、15、22和29天施用一次待测品或媒介物。另外，3个处理组(第6到第8组)，每组每种性别各5只动物(低剂量及中剂量组)及每组每种性别各10只动物(高剂量组)，分别以1、10和100YU的剂量水平施用待测品。对照组(第5组)为每种性别各10只动物，接受PBS媒介物。在第5-8组中，待测品或媒介物于第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85和92天施用。第94天处死第5-8中每种性别各5只动物。使第5和第8组其余的每种性别各5只动物维持约23天的恢复期。
表3兔GLP毒性研究设计
Figure BDA0000152103260000651
每天两次观察所有动物的发病率、死亡率、损伤，以及进食和进水。在该项研究的全程中进行详细的临床检查、注射部位刺激(irritation)评估、检眼镜检查、以及体重和食物消耗的测量。在给药前及每次给药的次日对所有存活的动物进行临床病理评估(血液学，临床化学和尿液分析)，对于第1至4组的动物，在第31天尸检时进行上述临床病理评估。给药前和给药后1小时从所有存活的动物另外采集血液样品用于血清抗体分析；对于第1至4组的动物，在第31天尸检时另外采集血液样品用于血清抗体分析。第31天、97天和120天尸检时，对相应组中所有的动物实施安乐死，并进行全面的宏观和微观检查以及规程所指定的器官重量测量。
没有观察到与处理相关的对存活、临床所见、食物消耗、眼科学或器官重量的效应。微观上，在所有的剂量水平，雌雄两性的注射部位处均观察到与处理相关的改变，包括纤维化、亚急性炎症以及坏死。另外，在某些但不是全部的注射部位中也观察到肉芽肿性炎症的表现。这些表现的发生和严重程度大体上与剂量相关。1YU条件下雌性、以及10YU和100YU条件下雌雄两性的骨髓中的粒细胞增生，和10YU条件下雌性、以及100YU条件下雌雄两性的脾脏中的滤泡淋巴样增生和/或反应性红髓/基质增生，被认为是针对注射部位所见炎症的继发应答。这些表现与注射部位组织增厚的微观表现相互关联。100YU条件下雌雄两性的注射位点均观察到由红斑和水肿组成的、与处理相关的刺激，在10YU条件下雌雄两性中也发现了细微的表现，提示与处理的关联性。在任何注射位点给药后没有任何恢复迹象的指征。在100YU条件下雌雄两性中均发现体重减少，但效果不显著，这提示与GI-5005处理的关联性。
观察到与处理相关的血液学和临床化学效应，并认为这些效应继发于注射部位发现的局部炎症反应。在所有GI-5005处理的组中均观察到与处理相关的白细胞计数的增加，其反映嗜中性粒细胞计数的增加，且其发生和严重程度大体上与剂量相关。在下一次给药之前发现嗜中性粒细胞水平发生了一定恢复。观察到与处理相关的球蛋白值上升，其发生和严重程度大体上与剂量相关。这些增加有随时间增大的趋势，且没有恢复的迹象。
根据这项研究的条件和表现可知，以1、10和100YU的剂量水平对雄兔和雌兔施用GI-5005并未导致任何明显的全身性毒性。主要的处理相关表现仅限于注射部位的纤维化、亚急性炎症和坏死等局部效应，这些效应不常出现，并且是轻微到中等程度，只有在测试的最高剂量条件下除外。注射位点的反应在临床情况下可能是潜在的剂量限制性效应。伴随发生的嗜中性粒细胞计数和球蛋白值的增加被认为继发于局部免疫应答。
为了证实兔毒性研究中GI-5005的免疫原性，并因此证实本研究的免疫-毒理学相关性，进行了淋巴细胞增殖测定。虽然没有测定兔中淋巴细胞增殖的标准化方法，使用从第5次免疫的2天后(第31天)收集的回盲结肠(ileocecocolic)和腋窝淋巴结分离的淋巴细胞进行了响应于酵母蛋白的非最优化淋巴细胞增殖测定。将来自兔个体的淋巴结细胞悬液与指定数目的热灭活GI-5005酵母细胞在96孔U形底板中进行组织培养(4x105每孔)。在培养第3天通过用1μCi/孔的3H-TdR冲击18小时测定淋巴细胞的增殖。图23A和23B显示了用雄性(图23A)和雌性(图23B)的淋巴结细胞获得的平均刺激指数(结果表示为对于可评估的淋巴结细胞样品所得的平均刺激指数+/-S.E.M.，所述淋巴结细胞样品来自每个剂量组中的兔个体)。总地来说，这些数据显示，用媒介物PBS免疫的10只兔中只有1只显示针对GI-5005酵母的大于10的刺激指数，而用1、10或100YU GI-5005免疫的兔中，分别有10只中的9只、10只中的7只和10只中的8只以大于10的刺激指数应答。雄兔与雌兔的淋巴结细胞的应答之间没有可识别的差异，且剂量-应答效应并不明显。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测兔(第1-4组)血清中的抗酿酒酵母抗体(ASCA)并测定其效价，所述兔注射了GI-5005，将其作为MPI研究962-003的一部分。所考察的血清样品是于第1天(第一次注射之前)，和第29天(第五次每周一次的注射之前)获取的。所有的兔在本研究开始时均显示小于1∶100的ASCA效价(表4)。相对照的，所有接受了GI-5005的兔在接受了4次每周一次的注射后均显示升高的ACSA效价。但是该效价较低，小于1∶10,000，并没有发现剂量-应答效应。
表4作为MPI研究962-003的一部分注射了GI-5005的兔(第1-4组)的血清中抗酿酒酵母抗体(ASCA)单位的总结
Figure BDA0000152103260000681
*在进行本次测定时，1∶1000稀释的阳性对照兔抗血清含有311+/-85ASCA单位，这提示在95％的置信度范围内，观测到的小于300的ASCA单位值代表小于1∶1000的效价。平均数据+/-S.D.显示于下表。
每周一次用PBS或1、10或100YU的GI-5005TarmogenTM免疫兔，免疫5周，利用Western印迹分析定量评估该兔中产生的HCV NS3特异性和Core特异性血清抗体的存在，以进一步了解针对该TarmogenTM中所含异源蛋白诱导的体液抗体应答。从任何免疫之前的动物获得的血清中没有发现HCV特异性抗体。与此相对的，来自接受了5个每周一次的100YU GI-5005的剂量之后第31天的9只被测兔中7只的血清样品中，以及来自10YU剂量组3只动物中1只的血清样品中，均检测到了与NS3和Core蛋白特异性反应的抗体。来自PBS或1YU组第31天的血清样品中没有检测到HCV特异性抗体。这项分析显示，作为在兔中皮下施用该TarmogenTM的结果，发生了针对GI-5005中所含异源HCV NS3-Core蛋白的血清抗体的剂量依赖性诱导。
第97日和第120日的初步临床病理学和总体观察数据与第31日的所见一致。每周1次以1、10和100YU的剂量水平对雄兔和雌兔施用GI-5005，施用13次，未导致任何明显的全身性毒性。主要的与处理相关的表现仅限于局部反应，其发生和严重性与剂量相关。但是，在100YU剂量组中，在注射部位反应中观察到更严重的肉芽肿性改变(granu1omatous changes)、纤维化和坏死，其在临床情况下可能是潜在的剂量限制性效应。该97日群组的组织病理学分析结果尚无法得到。还观察到与处理相关的白细胞计数的增加(其反映嗜中性粒细胞计数的增加)以及球蛋白值的增加；这两种效应的发生和严重程度大体上与剂量相关。这些增加有随时间增大的趋势，没有恢复的迹象。
来自331只注射了GI-5000 TarmogenTM系列产品以及原型的C57BL/6和BALB/c小鼠的总体安全性评估结果显示：没有与处理相关的死亡；在大约5％的动物中注射部位出现轻微到中度的脱毛以及发炎，偶尔有与迟发型超敏反应相符的溃疡。注射部位的反应性仅限于通常对皮肤创伤更为敏感的C57BL/6小鼠，且有可能是群居条件导致的理毛行为(grooming behavior)后继发的。未见其它总体上的临床异常或不良反应。
表5对GI-5005TarmogenTM和原型的安全性研究的总结
Figure BDA0000152103260000691
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虽然详细描述了本发明的多个实施方案，但显然本领域技术人员能想到这些实施方案的修改形式和适用形式。然而，应当明确地理解，这些修改形式和适用形式均处于以下权利要求所提出的本发明的范围之内。
Figure IDA0000152103320000011
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Claims (16)

1.一种治疗性组合物，其包括：
a)酵母媒介物；和
b)由该酵母媒介物重组表达的HCV融合蛋白，该HCV融合蛋白包含相互融合的截短的HCV E1蛋白和截短的HCV E2蛋白。
2.权利要求1的治疗性组合物，其中所述HCV E1蛋白由HCV E1蛋白的氨基酸1到156组成。
3.权利要求1或2的治疗性组合物，其中所述HCV E2蛋白由HCV E2蛋白的氨基酸1到334组成。
4.权利要求1至3任一项的治疗性组合物，其中所述HCV融合蛋白是单个多肽，其中下列序列元件从N末端到C末端共阅读框地融合：
(1)SEQ ID NO：9的序列；
(2)HCV E1蛋白的氨基酸1到156；和
(3)HCV E2蛋白的氨基酸1到334。
5.前述权利要求任一项的治疗性组合物，其中所述HCV E1蛋白由SEQID NO：20第192至347位或SEQ ID NO：6第7至162位组成。
6.前述权利要求任一项的治疗性组合物，其中所述HCV E2蛋白由SEQID NO：20第384至717位或SEQ ID NO：6第163至496位组成。
7.前述权利要求任一项的治疗性组合物，其中所述HCV融合蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。
8.前述权利要求任一项的治疗性组合物，其中所述酵母媒介物来自酿酒酵母。
9.前述权利要求任一项的治疗性组合物，其中所述酵母媒介物是死的完整酵母。
10.用于治疗HCV感染的权利要求1至9任一项的治疗性组合物。
11.用于引起针对HCV的抗原特异性细胞介导型免疫应答的权利要求1至9任一项的治疗性组合物。
12.用于治疗已感染HCV的一群个体或用于免疫有感染HCV风险的一群个体的权利要求1至9任一项的治疗性组合物。
13.一种分离的融合蛋白，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
14.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求13的融合蛋白的核酸序列。
15.一种重组核酸分子，其包含权利要求14的分离的核酸分子。
16.一种生成编码由下述各项组成的HCV融合蛋白的核酸分子的方法：
a)全长NS3蛋白中最先的N端88个氨基酸之后的262个HCV NS3氨基酸(对于SEQ ID NO：20为1115到1376位)；和
b)全长HCV Core序列第2到140位氨基酸(对于SEQ ID NO：20为2到140位)。
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