CN105073989A - 免疫原性多肽表层表达双歧杆菌 - Google Patents
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Abstract
一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达基因，该基因含有编码该免疫原性多肽的基因，该免疫原性多肽含有规定的基础结构域和至少一个抗原肽，该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。本发明的双歧杆菌表层表达基因还能够含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因。
Description
技术领域
本发明涉及免疫原性多肽表层表达双歧杆菌，更详细而言，例如，涉及能够制造丙型肝炎疫苗组合物的免疫原性多肽表层表达双歧杆菌。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)的携带者在世界中有1亿7000万人以上，约70％暴露于转变为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的风险中。在日本也存在约200万人的携带者，其中约80％为1b型感染。
作为丙型肝炎的治疗，主要进行干扰素治疗。但是，采用组合了聚乙二醇干扰素α与抗病毒药利巴韦林的并用疗法，1型病毒排除率为50％以下，并且治疗期间长，副作用大，因此，需要更有效的治疗药的开发和治疗法的建立。
HCV是属于黄病毒科的正链RNA病毒，包括4种结构蛋白区域(C-E1-E2-P7)和6种非结构蛋白区域(NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)。其中，NS3蛋白在N末端侧的三分之一具有丝氨酸蛋白酶活性，C末端侧的三分之二具有RNA解旋酶活性。对于这样的具有蛋白酶-解旋酶的2种活性的NS3蛋白，为了解明立体结构，通过X射线结晶解析研究了其立体结构(非专利文献1)。
HCV感染被治愈的患者中，可见NS3特异性强免疫应答(非专利文献2)。另外，NS3蛋白在遗传学上的保守性高，鉴定出大量细胞毒性T细胞(CTL)表位(非专利文献3)。
报告了用于丙型肝炎的预防或治疗的源自NS3蛋白的多肽的利用。例如，在专利文献1中，记载了含有源自HCV的NS3区域的氨基酸1188～1463位的至少8个氨基酸连续的氨基酸或由其构成并含有T细胞刺激性表位的多肽。在专利文献2中，记载了将表达含有与HCV核序列的至少一部分连结的HCVNS3蛋白酶的至少一部分的HCV融合蛋白的酵母细胞作为疫苗的基础。在专利文献3，记载了将表达NS3等的全长蛋白质或免疫原性蛋白质、分泌的弱毒化单核细胞增多性李司忒菌(Listeriamonocytogenes)等细菌作为疫苗平台。
另一方面，着眼于将通过基因重组得到的转化微生物作为口服疫苗使用的方法。报告了对小鼠口服给药转化长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，该转化长双歧杆菌使用存在于双歧杆菌属微生物(本说明书中，也称为“双歧杆菌”)的细胞膜的GNB/LNB基质结合膜蛋白(本说明书中，也称为“GLBP”)在表层表达源自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的鞭毛蛋白(flagellin)，由此，在血中产生鞭毛蛋白特异性抗体，通过肠道粘膜免疫而诱导全身性免疫，从而有效抑制鼠伤寒沙门氏菌的经口感染引起的小鼠的致死作用(非专利文献4和专利文献4)。另外，还报道了由含有转化长双歧杆菌的耐酸性胶囊制剂构成的口服疫苗，该转化长双歧杆菌在细胞内或分泌表达源自鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)或痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)的鞭毛蛋白(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平9-504534号公报
专利文献2：日本特表2008-516610号公报
专利文献3：日本特表2011-529077号公报
专利文献4：国际公开第2011/034181号
专利文献5：国际公开第2008/114889号
非专利文献
非专利文献1：Structure，7卷，1353-1363页，1999年
非专利文献2：J.Gene.Med.，10卷，177-186页，2008年
非专利文献3：J.Clin.Invest.，95卷，521-530页，1995年
非专利文献4：Vaccine，28卷，6684-6691页，2010年
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种用于HCV感染的治疗的更有效的治疗药。本发明的目的还在与提供一种通过口服给药对HCV感染引起的疾患的治疗有效的治疗药。本发明的目的还在于提供一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的方法。
用于解决课题的方法
本发明的发明人着眼于作为HCV复制相关区域的非结构蛋白3(non-structuralprotein3：NS3)的免疫原性，设计含有源自NS3蛋白的CD4表位和CD8表位的合成多肽，由此，成功地制作了在表层表达和提呈HCV抗原多肽的双歧杆菌，并且在将该HCV抗原多肽表层表达双歧杆菌口服给药的动物中成功地诱导了NS3特异性免疫应答(即，NS3特异性肠道粘膜免疫与全身性体液免疫、以及细胞免疫的诱导)。并且发现，通过应用这样的合成多肽的设计，能够提供对于免疫原性多肽可广泛利用的双歧杆菌表层表达基因。
本发明提供一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达基因，其中，
该基因含有编码该免疫原性多肽的基因，
该免疫原性多肽为含有基础结构域(basedomain)和至少一个抗原肽的丙型肝炎病毒抗原多肽，
该基础结构域含有选自下述(1)～(4)的多肽中的一个以上，
(1)含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(2)含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(3)含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；和
(4)含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
该抗原肽为选自含有序列号4～15的氨基酸序列的肽以及含有与序列号4～15的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的至少一种，
该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。
在一个实施方式中：
(1)上述基础结构域为含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含EIPFYGKAI(序列号7)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域、或者连接包含EIPFYGKAI(序列号7)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、KLSALGVNA(序列号9)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；
(2)上述基础结构域为含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有EIPFYGKAI(序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；
(3)上述基础结构域为含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有TPAETSVRLRAYLNTPG(序列号15)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；或
(4)上述基础结构域包含含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在C末端侧连接包含含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽、含有EIPFYGKAI(序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域。
在一个实施方式中，上述双歧杆菌表层表达基因还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因，编码上述免疫原性多肽的基因位于该源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的3’末端侧。
本发明还提供一种基因表达用质粒，其以能够表达上述双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因。
本发明还提供一种转化双歧杆菌，其保持上述的质粒，在细胞表层提呈上述免疫原性多肽。
本发明还提供一种转化双歧杆菌，其在基因组中以能够表达上述双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因，在细胞表层提呈上述免疫原性多肽。
本发明还提供一种丙型肝炎疫苗组合物，其含有在细胞表层提呈上述丙型肝炎病毒抗原多肽的转化双歧杆菌。
在一个实施方式中，上述疫苗组合物为口服疫苗。
本发明还提供一种设计用于在双歧杆菌的表层表达的免疫原性多肽的方法，该方法包括：
选择保持立体结构并且具有细胞分泌能力的基础结构域和至少一个抗原肽的工序；以及
设计将该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结的合成多肽的工序。
在一个实施方式中，上述基础结构域含有至少一个CD4表位或CD8表位或者含有其双方。
本发明还提供一种转化双歧杆菌，其在细胞表层表达在癌细胞的表层特异性表达的多肽。
在一个实施方式中，上述转化双歧杆菌还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因。
本发明还提供含有上述转化双歧杆菌的癌疫苗。
发明的效果
根据本发明，能够在双歧杆菌的细胞表层表达和提呈免疫原性多肽。另外，根据本发明，例如，在将在双歧杆菌的表层提呈免疫原性的丙型肝炎病毒抗原多肽的双歧杆菌口服给药的动物中，能够诱导对丙型肝炎病毒抗原特异性的免疫，因此，能够作为疫苗组合物(例如，口服疫苗)利用。
附图说明
图1表示含有HCV-1b型的多肽(GenBank：BAA08120.1)的NS3蛋白全长区域的氨基酸序列。
图2表示作为合成NS3多肽的例子的氨基酸序列1和2，该合成NS3多肽中，基于HCV-1b型多肽的NS3的接头部位和N末端侧的β-α-β结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
图3是对野生型长双歧杆菌245、长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165中的合成NS3蛋白的表达的蛋白质印记(蛋白质印记)的结果的照片。
图4表示长双歧杆菌245(1、4)、长双歧杆菌2164(2、5)和长双歧杆菌2165(3、6)的亮视野显微镜照片(1～3)和荧光显微镜照片(4～6)。
图5是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组的小鼠粪便中所含的NS3抗原特异性IgA抗体的经日变化的图表。
图6是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组的小鼠血清中所含的NS3抗原特异性IgG抗体的经日变化的图表。
图7是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组的小鼠脾脏细胞中根据有无NS3抗原刺激而进行的IFN-γ量的比较的图表。
图8表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于HCV-1b型多肽的NS3的α-螺旋结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
图9表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于HCV-1b型多肽的NS3的C末端侧β-α-β-结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
图10表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于在N末端连结了HCV-1b型多肽的NS4A区域的一部分的NS3的β折叠桶(β-barrel)结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
图11表示质粒pBApo-CMVNeo/NS3/4A的构建。
图12表示通过RT-PCR检测NS3/4A片段。
图13表示通过蛋白质印记检测NS3/4A。
图14表示NS3表达双歧杆菌疫苗对表达NS3/4A的EL4细胞的增殖抑制的效果。
具体实施方式
(双歧杆菌)
本发明中，“双歧杆菌”是指属于双歧杆菌属的微生物。作为双歧杆菌，例如，可以列举青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、角双歧杆菌(B.angulatum)、动物双歧杆菌动物亚种(B.animalissubsp.animalis)、动物双歧杆菌乳亚种(B.animalissubsp.lactis)、星状双歧杆菌(B.asteroides)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、牛双歧杆菌(B.boum)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、家兔双歧杆菌(B.cuniculi)、龋齿双歧杆菌(B.denticolens)、齿双歧杆菌(B.dentium)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、鸡胚双歧杆菌(B.gallinarum)、球状双歧杆菌(B.globosum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、奇异双歧杆菌(B.inopinatum)、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、大双歧杆菌magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、短小双歧杆菌(B.parvulorum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌球形亚种(B.pseudolongumsubsp.globosum)、假长双歧杆菌假长亚种(B.pseudolongumsubsp.pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、瘤胃双歧杆菌(B.ruminale)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、世纪双歧杆菌(B.saeculare)、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(B.scardovii)、细长双歧杆菌(B.subtile)、猪双歧杆菌(B.suis)、热嗜酸性双岐杆菌(B.thermacidophilum)、和嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。另外，也可以使用这些双歧杆菌的耐性株或突变株。
这些菌株均有市售或者能够从保藏机构容易地得到。例如，可以列举长双歧杆菌(B.longum)JCM1217(ATCC15707)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)ATCC11863、长双歧杆菌105-A株(Biosci.Biotechnol.Biochem.，61卷，1211-1212页，1997年)等。
(GNB/LNB基质结合膜蛋白)
GNB/LNB基质结合膜蛋白(GLBP)是属于输送双歧杆菌所具有的lacto-N-biose(即，N-乙酰-3-O-(β-D-半乳吡喃糖基)-D-葡糖胺)和galacto-N-biose(即，N-乙酰-3-O-(β-D-半乳吡喃糖基)-D-半乳糖胺)的ABC蛋白质(ATPBindingCassetteprotein)家族的膜蛋白。ABC蛋白质是使用ATP(三磷酸腺苷)这样的能源在所有生物的细胞膜上能动地进行特异性物质输送的重要膜蛋白，在细胞膜上存在多种ABC蛋白质。因此，作为ABC蛋白质的GLBP，在具备用于GLBP表层表达的细胞机能的双歧杆菌属细菌(双歧杆菌)中，如果利用适当的启动子，就能够在双歧杆菌中普遍地表达。例如，源自长双歧杆菌JCM1217(ATCC15707)株的GLBP具有序列表的序列号2所述的氨基酸序列(对应的碱基序列在序列号1中表示)。
GLBP的构造不限于天然存在的GLBP，只要具有在双歧杆菌的细胞表层表达的能力即可，也可以在构成该GLBP的氨基酸中具有1个以上(例如，1个或数个)的取代、插入或缺失。
(免疫原性多肽)
在本发明中，用于在双歧杆菌的表层表达的免疫原性多肽以保持立体结构并且具有细胞分泌能力的基础结构域和至少一个抗原肽构成。该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。
“免疫原性”是指抗原能够诱导抗原特有的T细胞应答(CD4+和/或CD8+)的意思。
作为基础结构域(basedomain)，能够使用保持立体结构(例如，在结晶结构上形成二级结构(例如，β-片层或α-螺旋))并且具有细胞分泌能力的(例如，不含有连续的碱性氨基酸残基，或改变为不含连续的碱性氨基酸残基)区域。作为保持立体结构的结构域，可以列举α-β-α结构域、β-折叠桶结构域、α-螺旋结构域等。蛋白质的立体结构例如能够通过本领域技术人员通常使用的X射线结晶构造解析来确定，基础结构域能够根据公知或推定的X射线构造解析信息来选择(例如，ProteinDataBank(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；Bioinformatics，22卷，195-201页，2006年；和ProteinScience，2卷，305-314页，1993年)。基础结构域优选在结构域内含有至少一个CD4表位和/或CD8表位。
“细胞分泌能力”是指多肽(蛋白质)能够具有通过双歧杆菌的细胞膜上的输送装置分泌到细胞外的能力的意思。为了具有细胞分泌能力，期望区域不含连续2个氨基酸以上的碱性氨基酸(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)(即，区域中的碱性氨基酸之前和之后的氨基酸为碱性氨基酸以外的氨基酸)。在区域中含有2个氨基酸以上连续的碱性氨基酸时，如以下所说明的那样，也能够通过取代为其它的氨基酸改变该区域。
“抗原肽”是指发挥抗原性的任意的肽。发挥抗原性的肽含有CD4表位(辅助性T细胞识别表位)和CD8表位(细胞毒性T细胞识别表位)。这样的肽例如能够通过本领域技术人员通常使用的表位定位(epitopemapping)来确定并得到。
抗原肽只要具有发挥所期望的特性(特别是抗原性)的能力，则也可以在构成表位的氨基酸中具有1个以上(例如，1个或数个)的取代、插入和/或缺失。例如，抗原肽可以包含：进一步添加表位所来源(即，本来存在)的蛋白质内的该表位的N末端和/或C末端延伸的区域所来源的1个以上的氨基酸(优选为1～5个氨基酸)所构成的氨基酸序列、从该表位的氨基酸序列的N末端或C末端的任一个末端缺失1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或取代该表位的氨基酸序列中的1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或这些的组合。
在基础结构域所来源的本来的蛋白质的对应的立体结构区域的氨基酸序列内，同种或不同种的碱性氨基酸(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)连续2个氨基酸以上时，可以取代为其它的氨基酸，以实现所期望的作用(基础结构域的立体结构和分泌能力)。连续2个氨基酸以上的碱性氨基酸不需要被全部取代，取代除了其中的1个碱性氨基酸以外的氨基酸即可。取代后的氨基酸为碱性氨基酸以外即可，例如，为丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸，优选为谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸，更优选为以谷氨酰胺和亮氨酸的顺序形成序列取代。基础结构域只要能够保持其结构域的立体结构且具有细胞分泌能力，则也可以在氨基酸中具有1个以上(例如，1个或数个)的取代、插入和/或缺失。另外，可以使用多种基础结构域。可以包含进一步添加基础结构域所来源(即，本来存在)的蛋白质内的基础结构域的N末端和/或C末端的区域所来源的1个以上的氨基酸(优选为1～5个氨基酸)所构成的氨基酸序列、从该基础结构域的氨基酸序列的N末端或C末端的任一个末端缺失1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或取代该基础结构域的氨基酸序列中的1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或这些的组合。
上述具有1个以上的氨基酸的取代、插入和/或缺失的突变体优选为保守性改变的突变体。“保守性改变的突变体”适用于氨基酸和核酸序列双方。关于特定的核酸序列，保守性改变的突变体包含编码同一氨基酸序列的核酸、和具有1个以上的同类取代的氨基酸序列。同类取代的例子为以下的组中的一个氨基酸与同组的其它氨基酸的交换：
(1)疏水性：异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、色氨酸、甘氨酸；
(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸；
(3)酸性：天冬胺酸、谷氨酸；
(4)碱性：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
(5)对链取向有影响的残基：甘氨酸、脯氨酸；
(6)芳香族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸；和
(7)小的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸。
这样的突变体的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％。“序列同一性百分比”和“序列同一性％”这样的词语是指由2个以上的氨基酸或核酸序列的比较或比对所得到的序列同一性的比例。同一性百分比可以通过将序列并列、计算2个整列序列间一致的准确的数，除以短序列的长度，将该结果乘以100，从而直接比较2个分子间的序列信息来确定。用于同一性百分比的计算的算法为Smith-Waterman序列同源性搜索算法(例如，Proteins，48卷，367-376页，2002年；Bioinformatics，17卷，327-337页，2001年)。
抗原肽通过与基础结构域组合并在双歧杆菌细胞表层表达和提呈，能够发挥免疫原性。至少一个抗原肽可以添加在基础结构域的N末端侧和C末端侧的一侧或两侧。例如，添加的抗原肽多于1个时，可以将各抗原肽添加在基础结构域的一侧或两侧。基础结构域具有表位区域时，例如，可以选择所连结的抗原肽，以使得能够通过该抗原肽的表位和该基础结构域内的表位能够发挥免疫原性。
以下，列举丙型肝炎病毒(HCV)免疫原性多肽的例子进行说明。
图1表示包含HCV-1b型的多肽(GenBank：BAA08120.1)的NS3蛋白全长区域的氨基酸序列(序列号3)。图1中的1027位～1657位的氨基酸序列是NS3的全长(本说明书中，只要对氨基酸的位置序号没有特别记载，则为基于HCV-1b型多肽全长中的位置)。NS3蛋白由β-折叠桶结构域(1027位～1195位)、接头部位(1196位～1215位)、2个β-α-β-结构域(N末端侧结构域1216位～1350位和C末端侧结构域1351位～1509位)和α-螺旋结构域(1510位～1657位)形成(非专利文献1)。
图1也表示NS3蛋白区域中的CD8表位(图1中以下划线表示)和CD4表位(图1中以双下划线表示)的分布。图1中，CD8表位为：
1067位～1086位：QSFLATCINGVCWTVYHGAG(CD8表位1：序列号4)、
1169位～1177位：LLCPSGHVV(CD8表位2：序列号5)、
1291位～1298位：ITYSTYGK(CD8表位3：序列号6)、
1372位～1380位：EIPFYGKAI(CD8表位4：序列号7)、
1391位～1399位：LIFCHSKKK(CD8表位5：序列号8)、
1406位～1414位：KLSALGVNA(CD8表位6：序列号9)、
1435位～1454位：VATDALMTGYTGDFDSVIDC(CD8表位7：序列号10)、和
1629位～1637位：GAVQNEVTL(CD8表位8：序列号11)，
CD4表位为：
1130位～1149位：LYLVTRHADVIPVRRRGDSR(CD4表位1：序列号12)、
1202位～1220位：ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(CD4表位2：序列号13)、
1303位～1330位：GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(CD4表位3：序列号14)、和
1531位～1547位：TPAETSVRLRAYLNTPG(CD4表位4：序列号15)。
作为丙型肝炎病毒(HCV)免疫原性多肽的基础结构域，例如，以下列举：
(1)基于HCV-1b型抗原多肽的NS3蛋白的接头部位(1196位～1215位)和N末端侧β-α-β结构域(1216位～1350位)的基础结构域(图2)
VPVESMETTMRSPVFTDNSTPPAVPQSFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATAT(序列号16)；
(2)基于HCV-1b型抗原多肽的NS3蛋白的α-螺旋结构域(1510位～1657位)的基础结构域(图8)
GMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAYLNTPGLPVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAKAPPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKFIMACMSADLEVVT(序列号17)；
(3)基于HCV-1b型多肽的NS3蛋白的C末端侧β-α-β-结构域(1510位～1657位)的基础结构域(其中，1351位～1353位的3个氨基酸缺失，并且将NS3的下游侧β-α-β-结构域的1398～1399位的2个K(赖氨酸)取代为Q(谷氨酰胺：1398位)、L(亮氨酸：1399位))(图9)
SVTVPHPNIEEVALSNTGEIPFYGKAIPLEAIKGGRHLIFCHSKQLCDELAAKLSALGVNAVAYYRGLDVSIIPTSGDVVVVATDALMTGYTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQMQGRTGRGRGGIYRFVTPGERPS(序列号18)；和
(4)基于将NS4A区域的一部(例如，1677位～1690位)与N末端连结的NS3蛋白的β-折叠桶结构域(1027位～1195位)的基础结构域(其中，1027～1028位的2个氨基酸和1195位的氨基酸缺失，并且1144～1145位的2个R(精氨酸)取代为Q(谷氨酰胺：1144位)、L(亮氨酸：1145位))(图10)
TGSVVIVGRIILSGITAYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRQLGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVD(序列号19：图10中的TGSVVIVGRIILSG(序列号20)源自NS4A区域)。
双歧杆菌表层表达的丙型肝炎病毒(HCV)免疫原性多肽能够将上述基础结构域(1)～(4)中的1个以上作为基础结构域含有。例如，基础结构域(1)～(4)可以单独使用或与其它1个以上的基础结构域组合使用。
基础结构域(1)，例如，含有ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(1202位～1220位，CD4表位2：序列号13)、ITYSTYGK(1291位～1298位，CD8表位3：序列号6)和GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(1303位～1330位，CD4表位3：序列号14)。
基础结构域(2)，例如，含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位～1547位，CD4表位4：序列号15)和GAVQNEVTL(1629位～1637位，CD8表位8：序列号11)。
基础结构域(3)，例如，含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、LIFCHSKQL(1391位～1399位，将CD8表位5的KK取代为QL：序列号21)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)。
基础结构域(4)，例如，含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)、LYLVTRHADVIPVRQLGDSR(1130位～1149位，将CD4表位1中的RR取代为QL：序列号22)和LLCPSGHVV(1169位～1177位，CD8表位2：序列号5)。
在基础结构域的N末端侧和/或C末端侧连结HCV抗原肽的至少一个。该抗原肽包含例如含有选自以下的氨基酸序列的肽：
QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)、
LYLVTRHADVIPVRRRGDSR(序列号12)、
LLCPSGHVV(序列号5)、
ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(序列号13)、
ITYSTYGK(序列号6)、
GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(序列号14)、
EIPFYGKAI(序列号7)、
LIFCHSKKK(序列号8)、
KLSALGVNA(序列号9)、
VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)、
TPAETSVRLRAYLNTPG(序列号15)、和
GAVQNEVTL(序列号11)。
上述肽是源自HCV-1b型抗原多肽的NS3蛋白的CD4表位或CD8表位。CD4表位和CD8表位如图1所示配置，但与基础结构域连结的抗原肽的表位的种类和个数、相对于基础结构域的连结位置(N末端侧还是C末端侧)和在末端连结多个时的连结顺序无关。作为抗原肽，也能够使用上述基础结构域(1)～(4)这样的含有表位的区域。抗原肽也可以与配置于基础结构域的表位重复。例如，可以选择所连结的抗原肽，以使得能够通过该抗原肽的表位与基础结构域内的表位发挥免疫原性。
抗原肽内的上述CD4表位或CD8表位只要具有发挥抗原性的能力，则也可以在氨基酸中具有1个以上(例如，1个或数个)的取代、插入和/或缺失。例如，抗原肽可以包含：进一步添加上述表位所来源(即，本来存在)的蛋白质内的该表位的N末端和/或C末端延伸的区域所来源的1个以上的氨基酸(优选为1～5个氨基酸)所构成的氨基酸序列、从该表位的氨基酸序列的N末端或C末端的任一个末端缺失1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或取代该表位的氨基酸序列中的1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或这些的组合。双歧杆菌表层表达用HCV抗原多肽中所使用的抗原肽只要具有发挥抗原性的能力，则也可以具有相对于上述CD4表位或CD8表位的肽的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列。
在作为基础结构域选择的本来的NS3蛋白所对应的区域的氨基酸序列内，同种或不同种的碱性氨基酸(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)连续2个氨基酸以上时，可以取代为其它的氨基酸，以实现所期望的作用(基础结构域的立体结构和分泌能力)。取代后的氨基酸为碱性氨基酸以外即可，例如，为丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸，优选为谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸，更优选为以谷氨酰胺和亮氨酸的顺序形成序列取代。
基础结构域只要能保持其结构域的立体结构且具有细胞分泌能力，则也可以在氨基酸中具有1个以上(例如，1个或数个)的取代、插入和/或缺失。基础结构域可以包含：进一步添加基础结构域所来源(即，本来存在)的NS3蛋白内的该基础结构域所对应的区域的N末端和/或C末端延伸的区域所来源的1个以上的氨基酸(优选为1～5个氨基酸)所构成的氨基酸序列、从该基础结构域的氨基酸序列的N末端或C末端的任一个末端缺失1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或取代该基础结构域的氨基酸序列中的1个以上的氨基酸(优选为3个氨基酸以内)、或这些的组合。双歧杆菌表层表达用HCV抗原多肽中所使用的基础结构域只要能够保持结构域的立体结构且具有用于表层表达的细胞分泌能力，则也可以具有相对于上述基础结构域(1)～(4)的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列。
在基础结构域(1)的情况下，优选在基础结构域的N末端侧可连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域，并且在C末端侧可连结以不同顺序含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的至少一个的区域；更优选可连结含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)的区域、或(优选以该顺序)含有(EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域(这些只要具有发挥抗原性的能力，则也可以含有具有相对于明示的序列号所记载的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列的肽)。基础结构域(1)时的合成蛋白质的例子，例如，如图2的氨基酸序列1和2所示(图2中，用大文字表示基础结构域的序列，用小文字表示抗原肽区域的序列，并且，分别用下划线、双下划线表示CD8表位和CD4表位)。
在基础结构域(2)的情况下，优选在基础结构域的N末端侧可连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域。在C末端侧可连结以不同顺序含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的至少一个的区域；更优选可连结(优选以该顺序)含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域(这些只要具有发挥抗原性的能力，则也可以含有具有相对于明示的序列号所记载的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列的肽)。基础结构域(2)时的合成蛋白质的例子，例如，如图8的氨基酸序列所示(图8中，用大文字表示基础结构域的序列，用小文字表示抗原肽区域的序列，并且，分别用下划线、双下划线表示CD8表位和CD4表位)。
在基础结构域(3)的情况下，优选在基础结构域的N末端侧可连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域。在C末端侧可连结含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位～1547位，CD4表位4：序列号15)的区域(这些只要具有发挥抗原性的能力，则也可以含有具有相对于明示的序列号所记载的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列的肽)。基础结构域(3)时的合成蛋白质的例子，例如，如图9的氨基酸序列所示(图9中，用大文字表示基础结构域的序列，用小文字表示抗原肽区域的序列，并且，分别用下划线、双下划线表示CD8表位和CD4表位，粗体字的“QL”表示取代后氨基酸)。
在基础结构域(4)的情况下，优选在基础结构域的N末端侧不连结抗原肽，在C末端侧可连结含有ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(1202位～1220位，CD4表位2：序列号13)、ITYSTYGK(1291位～1298位，CD8表位3：序列号6)和GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(1303位～1330位，CD4表位3：序列号14)的基础结构域(1)(或者只要能够保持该结构域的立体结构且具有用于表层表达的细胞分泌能力，具有相对于上述基础结构域(1)的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列)的区域，进一步可连结以不同顺序含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的至少一个的区域；优选可连接(优选以该顺序)含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域(这些只要具有发挥抗原性的能力，则也可以含有具有相对于明示的序列号所记载的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、更加优选至少99％的序列同一性％的氨基酸序列的肽)。基础结构域(4)时的合成蛋白质的例子，例如，如图10的氨基酸序列所示(图10中，用大文字表示基础结构域的序列，用小文字表示抗原肽区域的序列，并且，分别用下划线、双下划线表示CD8表位和CD4表位；粗体字的“QL”表示取代后氨基酸)。
(双歧杆菌表层提呈融合蛋白)
本发明中，在双歧杆菌的表层所表达·提呈的免疫原性多肽作为与GLBP的融合蛋白表达。该融合蛋白从N末端以GLBP和目的免疫原性多肽的顺序连结。
用于表达该融合蛋白的基因含有编码目的免疫原性多肽的基因和编码GLBP的基因(也称为免疫原性多肽表层表达框基因)。
编码目的免疫原性多肽的基因位于编码GLBP的基因的3’末端侧。免疫原性多肽表层表达框基因可以是将编码目的免疫原性多肽的基因与编码GLBP的基因的3’末端侧连结的融合基因，或者也可以在编码GLBP的基因与编码目的免疫原性多肽的基因之间配置编码适当长度的接头的基因。
(转化双歧杆菌的制备)
以下，对将目的免疫原性多肽在双歧杆菌表层作为融合蛋白而表达·提呈的转化双歧杆菌的制备步骤的一例进行说明。
1.基因的获得
编码GLBP的基因和编码目的免疫原性多肽的基因能够分别基于公知的基因序列或氨基酸序列信息得到。例如，以从任意的双歧杆菌制备的基因组DNA或cDNA为模板，使用基于该双歧杆菌的GLBP的结构基因的序列信息制作的引物对，以聚合酶链式反应(PCR)进行扩增得到。通常而言，由于对于1个氨基酸存在多种密码子，因此，也可以是具有与公知碱基序列或基于公知氨基酸序列的碱基序列不同的碱基序列的基因。
例如，编码长双歧杆菌(B.longum)的GLBP的基因能够从ActaCrystallographicaSectionF.，F63卷，751页，2007年中记载的长双歧杆菌的GLBP的结构基因序列得到。例如，能够以长双歧杆菌的染色体DNA或cDNA为模板，使用基于序列信息制作的引物对，以PCR进行扩增来得到。
编码目的免疫原性多肽的基因能够从设计的氨基酸序列基于公知的或推定的基因序列信息确定编码目的免疫原性多肽的基因序列，进一步根据需要考虑宿主的密码子频率而得到优化的基因序列。
例如，分别编码作为基于基础结构域(1)的合成蛋白质的例子的图2的氨基酸序列1和2的基因序列1和2由基于双歧杆菌的密码子频率优化的碱基序列构成。基因序列1和2的碱基序列分别如序列号25和27所示(将其对应的氨基酸序列分别以序列号26和28表示)。
编码作为基于基础结构域(2)的合成蛋白质的例子的图8的氨基酸序列、且基于双歧杆菌的密码子频率优化的基因的碱基序列如序列号33所示(将对应的氨基酸序列以序列号34表示)。
编码作为基于基础结构域(3)的合成蛋白质的例子的图9的氨基酸序列、且基于双歧杆菌的密码子频率优化的基因的碱基序列如序列号35所示(将对应的氨基酸序列以序列号36表示)。
编码作为基于基础结构域(4)的合成蛋白质的例子的图10的氨基酸序列、且基于双歧杆菌的密码子频率优化的基因的碱基序列如序列号39所示(将对应的氨基酸序列以序列号40表示)。
基于这样获得的基因序列而编码的基因，例如，能够通过公知的化学合成得到。作为化学合成法，例如，可以列举通过利用亚磷酰胺法的DNA合成机进行化学合成的方法。另外，基于所要获得的碱基序列的5’末端和3’末端的碱基序列制备引物，以从各种所来源生物的组织或细胞中所含的mRNA合成的cDNA或选自cDNA文库的cDNA为模板，使用PCR法进行DNA的扩增，由此，也能够获得上述的基因。另外，基于公知碱基序列信息，以将其全长或一部分进行化学合成得到的DNA或多聚核苷酸为探针，对从各种所来源生物的组织或细胞所含的mRNA合成的cDNA或cDNA文库进行集落杂交、嗜菌斑杂交，由此，也能够获得上述的基因。
另外，编码上述各蛋白质的基因也能够从公知的氨基酸序列信息容易地得到。作为从公知的氨基酸序列信息得到编码上述各蛋白质的基因的方法，例如，可以列举使用具有编码公知的氨基酸序列的基因的部分碱基序列的合成DNA引物，通过PCR法从上述cDNA文库等扩增目标基因的方法；或通过将重组入适当的载体的基因与标记编码上述各蛋白质的基因的一部分或全长的DNA片段或合成DNA的片段(探针)杂交来筛选的方法等。
编码上述的各蛋白质的基因也可以是与如上所述获得的基因在严格条件下杂交的DNA。能够在严格条件下杂交的DNA是指以上述DNA为探针，通过集落杂交法、嗜菌斑杂交法或DNA印迹杂交法(southernblothybridization)等得到的DNA。具体而言，可以列举：使用将集落或嗜菌斑所来源的DNA固定化的过滤器，在约0.7～1.0M的氯化钠存在下，在约65℃进行杂交之后，使用约0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为含有150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在约65℃的条件下洗净过滤器，由此而鉴定的DNA。作为上述能够杂交的DNA，具体而言，可以列举具有与基于上述公知碱基序列信息或氨基酸序列信息得到的编码各蛋白质的基因的碱基序列具有至少80％的序列同一性的DNA、优选具有至少90％的序列同一性的DNA、更加优选具有至少95％的相同性的DNA。
2.免疫原性多肽表层表达框基因和双歧杆菌转化用载体的制备
从如上所述制备的编码各蛋白质的基因制备含有免疫原性多肽表层表达框基因或该免疫原性多肽表层表达框基因的重组体DNA。免疫原性多肽表层表达框基因可以如上所述制备为编码目的免疫原性多肽的基因位于编码GLBP的基因的3’末端侧。本发明中，重组体DNA可以为表达载体或染色体插入型载体(例如，同源重组型载体)。作为这样的载体的制备中使用的质粒，只要是能够在双歧杆菌表达的质粒即可，没有特别限制。作为源自双歧杆菌的质粒，可以使用pTB6、pBL67、pBL78、pNAL8H、pNAL8M、pNAC1、pBC1、pMB1、pGBL8b等。也可以使用这些质粒与大肠杆菌的质粒的复合质粒，例如，可以列举pBLES100、pKKT427、pRM2等。
从表达的稳定性和用于转化株的制备的DNA的制备的容易度的观点出发，上述质粒之中，优选从长双歧杆菌的质粒和大肠杆菌的质粒合成的复合质粒。
表达载体从选择转化株的观点出发，优选具有抗生素耐性、氨基酸要求性等选择标记。
表达载体为了表达GLBP与目的免疫原性多肽的融合蛋白或有利于表达，优选添加调节序列。作为调节序列，例如，可以列举启动子序列、前导序列、前肽序列、增强子序列、信号序列、终止子序列等。这些调节序列只要能在双歧杆菌表达即可，其来源没有特别限制。
作为启动子序列，只要能够在双歧杆菌表达即可，没有特别限制。从表达效率的观点出发，优选使用长双歧杆菌的组蛋白样蛋白(HU)的启动子序列、LDH启动子等。
另外，从提高表达效率的观点出发，优选具有终止子序列。作为终止子序列，优选使用上述HU基因的终止子序列。
此外，根据需要，能够配置前导序列、前肽序列、增强子序列、信号序列等。另外，也可以在编码GLBP的基因和编码目的免疫原性多肽的基因之间配置编码适当长度的接头的基因。
如上所述，在上述的质粒中，根据需要，导入启动子序列、终止子序列等调节序列和选择标记基因，制备克隆载体。作为选择标记，可以列举壮观霉素(SPr)、氨苄青霉素(Ampr)、四环素(TETr)、卡那霉素(KMr)、链霉素(STr)、新霉素(NEOr)等抗生素耐性标记；绿色荧光蛋白质(GFP)、红色荧光蛋白质(REP)等荧光标记；LacZ等酶等。
在克隆载体的启动子的下游，优选具备具有多克隆位点的接头等。通过使用这样的接头，编码上述融合蛋白的基因(DNA)能够插入启动子的下游且在框内(in-frame)表达融合蛋白。作为克隆载体用的质粒，例如，可以列举pBLES100、pBLEM100等(专利第3642755号公报)。
例如，通过在该质粒pBLES100中在框内(in-frame)插入上述获得的HU启动子序列、编码GLBP的基因和编码目的免疫原性多肽的基因，得到在双歧杆菌的表层表达融合蛋白的载体。以这样的方法得到的表达载体可以用于双歧杆菌的转化。
作为双歧杆菌表层表达用载体，例如，也可以列举质粒pJT101(专利文献4和非专利文献4)、和大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pJW241(专利文献4和非专利文献4)。质粒pJT101含有长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)JCM1217(ATCC15707)所来源GLBP基因(序列号1和2：专利文献4和非专利文献4)，能够在该GLBP基因的下游在框内(in-frame)重组入编码目的免疫原性多肽的基因。另外，也能够将重组入pJT101的GLBP基因和编码目的免疫原性多肽的基因的连结物(免疫原性多肽表层表达框基因)切出，重组入大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pJW241中。
3.表达融合蛋白的转化双歧杆菌的制备
能够将重组体DNA，例如如上所述制备的表达载体导入作为宿主的双歧杆菌，制备转化双歧杆菌。
在转化双歧杆菌的制备中，能够使用利用能够在双歧杆菌内复制的质粒的基因同源重组法。根据基因同源重组法，能够将免疫原性多肽表层表达框基因(例如，在编码GLBP的基因的3’末端侧连结有编码目的免疫原性多肽的基因的融合基因)插入双歧杆菌染色体中。例如，可以使用具有与双歧杆菌染色体基因相同部位的温度感受性质粒(在高温(例如，42℃以上)不复制的质粒)(例如，Appl.Microbiol.Biotechnol.，95卷，499-509页，2012年)。更具体而言，在具有与双歧杆菌染色体基因相同部位的温度感受性质粒的相同部位间插入免疫原性多肽表层表达框基因，将该质粒导入双歧杆菌，在高温培养，由此，能够选择性地培养通过基因同源重组在染色体中重组入了该目标基因的双歧杆菌。
在用于转化的表达载体或双歧杆菌内导入能够复制的质粒，只要是公知的方法即可，能够使用任一种方法。具体而言，例如，可以列举电穿孔法(electroporation法)、磷酸钙法、脂质体转染法、钙离子法、原生质体法、微注射法、基因枪法等。在本发明中，优选使用电穿孔法。利用电穿孔法时，能够以0.5～20kV/cm、0.5μsec～10msec的条件进行。例如，以2～10kV/cm、50μsec～5msec进行。
转化株利用融合蛋白表达载体所具有的选择标记、能够在双歧杆菌内复制的质粒的性质(例如，温度感受性)等来选择。作为培养转化株的培养基，可以列举分别适于宿主微生物的培养基，例如，葡萄糖血液肝脏(BL)琼脂培养基、DeMan-Rogosa-Sharp(MRS)琼脂培养基、岐阜大学厌氧性(GAM)琼脂培养基、改良GAM(TGAM)琼脂培养基、布氏(Briggs)琼脂培养基、和酵母提取物葡萄糖蛋白胨(YGP)琼脂培养基。在这些培养基中根据选择标记添加抗生素，或者缺失或添加氨基酸，作为选择压力。
此外，培养条件优选以能够培养双歧杆菌的厌氧培养进行。通过在厌氧性条件下培养，能够防止好氧性菌的增殖。厌氧性条件下是指在保持双歧杆菌能够增殖的程度的厌氧度的密闭容器中，例如，可以例举在厌氧腔室或厌氧盒等中可能的条件。培养温度只要是能够培养双歧杆菌的温度即可，通常为4℃～45℃，优选为15℃～40℃，更优选为24℃～37℃。
此外，也可以制备不仅仅导入了使GLBP和目的蛋白质或肽的融合蛋白在表层提呈的载体、还同时导入了使GLBP和具有佐剂功能的蛋白质的融合蛋白在表层提呈的载体的转化双歧杆菌。
可以从转化双歧杆菌提取质粒，在限制酶处理后以电泳确认编码融合蛋白的基因的导入，也可以将限制酶处理片段的序列进行直接测序。
所得到的转化双歧杆菌的融合蛋白的表达的确认，例如，能够通过蛋白质印记法进行。首先，例如，使用非离子性表面活性剂对转化双歧杆菌进行溶菌。作为非离子性表面活性剂，可以列举聚氧乙烯脱水山梨醇酯(Tween(注册商标)20、40、60、65、80、85)、脱水山梨醇酯(Span(注册商标)20、40、60、65、80、85)等。接着，使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液等进行稀释，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)、三-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶等进行电泳。接着，转印到硝基纤维素、聚偏氟乙烯(PVF)膜等，使针对目的蛋白质或肽的抗体(免疫球蛋白G(IgG))反应，接着使具有荧光标记的2次抗体反应，由此，能够确认融合蛋白的表达。
特别是，目的免疫原性多肽在双歧杆菌表层提呈能够通过对转化双歧杆菌使用对于目的蛋白质或肽的抗体和FITC标记抗IgG抗体的免疫抗体法来容易地确认。表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌的免疫原性能够通过粪便所含的抗原特异性IgA抗体(局部粘膜免疫的诱导)、血清所含的抗原特异性IgG抗体(全身性免疫的诱导)、以及由抗原刺激得到的细胞内细胞因子(例如，干扰素γ(IFN-γ))产生的诱导等来确定。
确认了目的免疫原性多肽的表层提呈的转化双歧杆菌，通过本领域技术人员常用的方法进行培养、回收，可以直接用于制剂的制造。或者，也可以干燥使用。干燥通过进行冻干、低温干燥等低温处理，以暴露于肠内环境或培养基等培育条件下时能够培育的处理方法进行。
转化双歧杆菌可以用公知的方法进行后处理。例如，可以通过离心分离等进行粗精制。另外，根据期望，进行粗精制后可以使其溶解或悬浮于生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)或乳酸配合林格氏液等的本领域一直使用的溶剂中。另外，也可以根据期望进行冻干或喷雾干燥，形成为粉状物或粒状物。
(含转化双歧杆菌的疫苗组合物)
本发明的疫苗组合物中含有上述转化双歧杆菌作为有效成分。例如，在为表层表达HCV免疫原性多肽的转化双歧杆菌的情况下，本发明的疫苗组合物能够以对HCV感染充分诱导适当的免疫应答的量对患者给药。
为了形成疫苗，转化双歧杆菌作为其活菌的冷冻、冻干、悬浮液或细胞糊、或者与固体介质或凝胶或液状介质组合保存。作为给药制剂的剂型，没有限定，优选粉末、使该冻干粉末悬浮的液剂、或封入该冻干粉末的胶囊剂等。作为胶囊剂，例如，可以适当使用专利文献5所记载的耐酸性胶囊。给药通路没有特别限定，可以列举口服给药或非口服给药。优选口服给药或者经鼻给药，更优选口服给药。
作为适于口服给药的制剂的例子，例如，可以列举颗粒剂、细粒剂、散剂、糖浆剂、溶液剂、胶囊剂或悬浊剂等。作为适于非口服给药的制剂的例子，例如，可以列举注射剂、点滴剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。
口服给药用的液体制剂的制造中，例如，能够使用水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖类；聚乙二醇、聚丙二醇等二醇类；芝麻油、橄榄油、大豆油等油类；对羟基苯甲酸酯类等防腐剂等制剂用添加物。另外，在胶囊剂、散剂或颗粒剂等固态制剂的制造中，例如，能够使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；淀粉、海藻酸钠等崩解剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙纤维素、明胶等结合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂。
非口服给药用的制剂中，注射剂、点滴剂等血管内给药用制剂能够优选使用与人血液等渗的水性介质进行制备。例如，注射剂能够使用选自盐溶液、葡萄糖溶液、或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物的水性介质，根据常规方法与适当的助剂一起形成溶液、悬浊液或分散液来制备。用于肠内给药的栓剂，例如，能够使用可可脂、氢化油脂或氢化脂肪酸等载体来制备。
非口服给药用的制剂中，喷雾剂能够使用不刺激人的口腔和气管粘膜、且能够将作为有效成分的转化双歧杆菌作为微细的颗粒分散而促进吸收的载体来制备。作为这样的载体，例如，能够使用乳糖或甘油等。根据转化双歧杆菌和所使用的载体的性质，能够作为空气溶胶、干粉等的形态的制剂来制备。非口服给药用的制剂的制造中，例如，能够使用选自稀释剂、香料、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、表面活性剂、增塑剂等的中1种或2种以上的制剂用添加物。
本发明的疫苗组合物内的转化双歧杆菌的含量可以根据制剂的种类或剂形、给药对象的年龄、性別、体重或患病状态、给药或摄取的方法、时期或时间等适当设定。
本发明的转化双歧杆菌，例如，免疫原性多肽为HCV抗原多肽(例如，NS3所来源的抗原多肽)时，成为对HCV的感染有效的口服疫苗。含有本发明的免疫原性HCV抗原多肽表层表达转化双歧杆菌的疫苗组合物可以用于HCV感染症的预防或治疗的任一种。另外，本疫苗组合物也能够与现有的干扰素疗法等并用。
本发明的转化双歧杆菌抑制表达NS3/4A的肿瘤细胞的增殖(实施例9、图14)。这可以认为是意味着本发明的转化双歧杆菌作为疫苗发挥作用，活化了对于NS3的细胞性免疫。即，可以认为：通过将本发明的双歧杆菌口服给药，诱导NS3蛋白特异性细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocyte；CTL)，该CTL攻击表达NS3/4A的肿瘤细胞EL4，抑制了肿瘤的增殖。由此，确认了通过含有本发明的双歧杆菌的口服疫苗，诱导抗原肽特异性细胞性免疫。
本发明的转化双歧杆菌也能够用于抑制肿瘤细胞的增殖的用途。如实施例9所示，通过将表达NS3蛋白的B.longum2165给药，能够抑制表达NS3蛋白的肿瘤的增殖。这可以认为是在B.longum2165的表层表达的NS3作为抗原发挥作用，引起NS3特异性CTL的诱导，该CTL抑制表达NS3的肿瘤的增殖的缘故。
由此，可以认为，通过在双歧杆菌的表层表达在细胞表层肿瘤特异性表达而在正常细胞完全不表达的多肽并进行给药，能够引起肿瘤特异性细胞性免疫，抑制肿瘤细胞的增殖。
在细胞表层肿瘤特异性表达而在正常细胞完全不表达的抗原(癌抗原)，至今报道了多种，例如，已知有恶性黑色素瘤(melanoma)中的MAGE、MART-1、乳腺癌等中的HER2/neu、大肠癌中的CEA、各种白血病、各种癌中的WT1、NY-ESO-1、PSMA等，但不限于这些。另外，上述癌抗原能够以insilico(模拟)、湿式实验来鉴定。通过insilico来鉴定推定为在细胞表层表达的基因，制作微阵列来研究表达图谱，由此，能够进行是否为癌抗原的一次筛选。癌抗原的基因表达的有无能够通过制备mRNA、进行RT-PCR来确认，另外，也能够通过制作抗体、用蛋白质印记、ELISA等本领域技术人员公知的方法来确认蛋白质的表达。或者，使用微阵列对癌特异性表达的基因进行网罗式筛选，也能够从其中鉴定出在细胞表层表达的抗原。
可以认为，通过使该癌抗原蛋白质(或多肽)在双歧杆菌的细胞表层表达并将该菌口服给药，能够作为癌疫苗用于癌的预防、治疗。
癌抗原只要知道氨基酸序列，通过鉴定人基因组中的对应基因、设计引物以PCR法进行扩增，克隆编码该癌抗原多肽的基因片段的技术，是本领域技术人员公知的技术。将克隆的扩增片段插入双歧杆菌的细胞表层表达载体使其表达，在技术上也是容易的。由此，能够根据各种癌抗原制造癌疫苗。可以认为通过将这样的癌疫苗给药，能够进行癌的预防、治疗。本发明的癌疫苗所含的转化双歧杆菌可以为活菌，也可以杀死的死菌。
实施例
以下列举实施例说明本发明，但是，本发明不受这些实施例的限定。
(实施例1：双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计)
设计图2所示的2个氨基酸序列，使得基于HCV-1b型多肽的NS3接头部位(1196位～1215位)和上游侧的β-α-β结构域(1216位～1350位)，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
氨基酸序列1(图2的>1：序列号23)在基础结构域的N末端侧连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域，并在C末端侧连结依次含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域。
氨基酸序列2(图2的>2：序列号24)在基础结构域的N末端侧连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域，并在C末端侧连结含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)的区域。
上述基础结构域为对应于HCV-1b型抗原多肽的1196位～1350位的区域，基础结构域自身含有ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(1202位～1220位，CD4表位2：序列号13)、ITYSTYGK(1291位～1298位，CD8表位3：序列号6)和GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(1303位～1330位，CD4表位3：序列号14)。
(实施例2：NS3蛋白表层表达转化双歧杆菌的制备)
基于实施例1中设计的氨基酸序列1和2(各自序列号23和24)，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率(http://www.kazusa.or.jp/codon/)的基因序列1和2(各自序列号25和27；分别对应的氨基酸序列以序列号26和28表示)，基于这些基因序列信息，全长合成各自的基因片段(也将前者称为“长型”，将后者称为“短型”)。基因片段的全长合成委托给GenScript公司。将所得到的基因片段用XhoI和SalI处理，插入同样用XhoI和SalI处理过的重组质粒pJT101(专利文献4和非专利文献4)。质粒pJT101含有长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)JCM1217(ATCC15707)所来源GLBP基因(序列号1和2：专利文献4和非专利文献4)。通过上述插入，在GLBP基因的下游连结了“长型”或“短型”的基因片段。
以在GLBP基因的下游含有“长型”基因的融合基因的质粒为模板，使用正向引物(5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：序列号29)和反向引物(5’-TTTCATCTGTGCATAGTCGACTTCAGGTGTTGCAGTCGA-3’：序列号30)的引物对进行PCR。另一方面，以在GLBP基因的下游含有“短型”基因的融合基因的质粒为模板，使用正向引物(5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：序列号29)和反向引物(5’-TTTCATCTGTGCATATTCACAGCGGGATGGCCTTGCCGTAGA-3’：序列号31)的引物对进行PCR。将大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体的pJW241(专利文献4和非专利文献4)用NdeI切断，在该部位用In-fusion法(ClontechLaboratories,Inc.)连结所得到的PCR扩增片段。将含有“长型”的融合基因的表层表达载体命名为pJW2165，并且将含有“短型”的融合基因的表层表达载体命名为pJW2164。
用电穿孔法将所得到的作为表层表达载体的pJW2165或pJW2164导入长双歧杆菌105-A株(Biosci.Biotechnol.Biochem.，61卷，1211-1212页，1997年)，得到转化长双歧杆菌。这里，将导入了pJW2165的转化长双歧杆菌命名为长双歧杆菌2165，将导入了pJW2164的转化长双歧杆菌命名为长双歧杆菌2164。还制作了仅表达GLBP的长双歧杆菌(长双歧杆菌2012)。
(实施例3：转化长双歧杆菌的NS3蛋白表层表达)
通过蛋白质印记法确认用上述的方法制作的长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165是否以正确的分子量表达GLBP-NS3融合蛋白。将用GAM培养基(“NISSUI”：日水制药株式会社)厌氧培养过夜的长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165洗净后，用1％TritonX/PBS稀释，将菌液用聚丙烯酰胺电泳分离。转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，使用3％牛血清白蛋白(BSA)/0.1％Tween20/生理盐水(PBS)在4℃封闭过夜。以1000倍稀释rabbitanti-NS3IgG(operon公司)、1000倍稀释goatanti-rabbitIgGHRPConjugated(SantaCruz公司)的顺序分别在室温震荡反应1小时，通过化学发光法进行GLBP-NS3融合蛋白的检测。
在图3表示蛋白质印记法的结果。图3中各列如下所述：M.分子量标记；1.野生型长双歧杆菌245；2.长双歧杆菌2164；和3.长双歧杆菌2165。GLBP-NS3融合蛋白的分子量，长双歧杆菌2164为66kDa、长双歧杆菌2165为69kDa，用箭头表示图3中的各自的条带的位置。长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165能够在各自目标位置确认条带(分别在列2和3)，可知表达了所设计的分子量的蛋白质。
接了，为了确认NS3蛋白是否在长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165的表层表达，进行菌体的免疫染色。将用GAM培养基厌氧培养过夜的长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165洗净后，用PBS稀释，使用1％-BSA/PBS在37℃封闭30分钟。以50倍稀释rabbitanti-NS3IgG(operon)、1000倍稀释AlexaFluor594goatanti-rabbitIgG(H+L)(invitrogen公司)的顺序分别在37℃反应1小时，用荧光显微镜观察菌体的荧光显色。
在图4表示免疫染色法的结果。各照片如下所示：1、4：长双歧杆菌245；2、5：长双歧杆菌2164；3、6：长双歧杆菌2165；1～3：亮视野(400倍)；4～6：荧光显微镜下(400倍)。与野生型长双歧杆菌245进行比较，能够确认长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165的荧光强，可知在双歧杆菌表层表达目标NS3蛋白。
(实施例4：转化长双歧杆菌向小鼠的口服给药)
将转化长双歧杆菌用GAM培养基厌氧培养过夜，用PBS稀释为5×108CFU/ml。将该菌液每次100μl对8周龄的雌性BALB/C小鼠进行胃内口服给药。给药每周3次，进行4周。作为对照，使用PBS给药组、野生型长双歧杆菌245给药组、和仅表达GLBP的长双歧杆菌2012给药组，以相同条件进行给药。以给药开始日作为第1天，在第0、14、28天进行尾静脉采血并回收粪便。在第29天对小鼠进行麻醉处置后，通过颈椎脱臼使其安乐死，解剖取出脾脏。
(4-1：利用ELISA法检测HCV-NS3抗原特异性抗体)
通过酶联免疫吸附(ELISA)法检测粪便所含的NS3抗原特异性IgA抗体。将粪便溶解于5％脱脂牛奶/0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂/2mM苯甲磺酰氟/PBS，制作粪便溶解液。在96孔微孔板(NUNC)包被GST-NS3抗原肽，使用5％脱脂牛奶/PBS在37℃封闭1小时。以稀释为适当浓度的粪便溶解液、1000倍稀释goatanti-mouseIgAHRP(SantaCruz)的顺序分别在37℃反应1.5小时。在最后添加TMB显色试剂(BectonDickinson公司：BD)显色20分钟，以波长450nm测定吸光度(OD450)。另外，同样地，对通过尾静脉采血得到的血液的血清中所含的NS3抗原特异性IgG抗体，使用1000倍稀释goatanti-mouseIgGHRP(R&DSystems公司：R&D)通过ELISA法检测。
在图5中表示研究粪便所含的NS3抗原特异性IgA抗体的ELISA法结果。图5中的记号如下所述：黑方形：PBS给药组；黑三角：长双歧杆菌245给药组；黑圆点：长双歧杆菌2012给药组；白三角：长双歧杆菌2164给药组；和白圆点：长双歧杆菌2165给药组。*表示在p<0.05具有显著性差异。对于在第28天收集的粪便，长双歧杆菌2165给药组与PBS、长双歧杆菌245、长双歧杆菌2012给药组进行比较，显示了显著提高的吸光度(OD450)(p<0.05)。另一方面，虽然没有确认到显著性差异，在长双歧杆菌2164也显示高的值。
在图6表示研究血清所含的NS3抗原特异性IgG抗体的ELISA法结果。图6中的记号与图5同样。**表示在p<0.01具有显著性差异。长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165的IgG抗体量均经日上升，在第14、28天，与PBS、长双歧杆菌245、长双歧杆菌2012给药组进行比较，显示了显著提高的值(p<0.01)。
长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165均能够确认通过口服给药得到的局部粘膜免疫的诱导和全身性免疫应答的诱导。
(4-2：由抗原刺激引起脾脏细胞的细胞因子产生)
使用70μl细胞筛(BD)将脾脏细化，用0.83％NH4Cl/PBS使其溶血之后，洗净。以10％FBS/RPMI培养基将细胞悬浮为4×105细胞/孔，在用GST-NS3抗原肽2μg刺激的同时在96孔微孔板中培养3天。使用MouseIFN-γQuantikineELISAKit(R&D)测定了脾脏细胞的培养上清中的干扰素γ(IFN-γ)量。
在图7中表示结果。图7的横轴为脾脏细胞的培养上清中的IFN-γ量(pg/ml)。从左侧开始，为长双歧杆菌245给药组、长双歧杆菌2012给药组、长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组，黑棒图表示无NS3抗原刺激(对照组)，白棒图表示有NS3抗原刺激。长双歧杆菌2165给药组由于抗原刺激引起IFN-γ产生量增加，与在相同条件培养的非刺激孔相比确认到显著性差异(p<0.01)。长双歧杆菌2164给药组中，没有看到显著性差异，但是由于抗原刺激，IFN-γ产生量增加。
(实施例5：双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计2)
设计图8所示的氨基酸序列，使得基于HCV-1b型多肽的NS3α-螺旋结构域(1510位～1657位)，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
图8的氨基酸序列(序列号32)在基础结构域的N末端侧连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域，并且在C末端侧连结依次含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域。基础结构域为对应于HCV-1b型抗原多肽的1510位～1657位的区域，基础结构域自身含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位～1547位，CD4表位4：序列号15)和GAVQNEVTL(1629位～1637位，CD8表位8：序列号11)。
基于图8的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率(http://www.kazusa.or.jp/codon/)的基因序列(序列号33；对应的氨基酸序列以序列号34表示)。
(实施例6：双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计3)
设计图9所示的氨基酸序列，使得基于HCV-1b型多肽的NS3下游侧β-α-β-结构域(1351位～1509位)，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。在基础结构域中，缺失1351位～1353位的3个氨基酸，将1398～1399位的2个K(赖氨酸)取代为Q(谷氨酰胺：1398位)和L(亮氨酸：1399位)。
图9的氨基酸序列(序列号35)在基础结构域的N末端侧连结含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)的区域，并且在C末端侧连接含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位～1547位，CD4表位4：序列号15)的区域。基础结构域自身含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、LIFCHSKQL(1391位～1399位，将CD8表位5的KK取代为QL：序列号21)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)。
基于图9的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率(http://www.kazusa.or.jp/codon/)的基因序列(序列号36；对应的氨基酸序列以序列号37表示)。
(实施例7：双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计4)
设计图10所示的氨基酸序列，使得基于将HCV-1b型多肽的NS4A区域的一部分(1677位～1690位)与N末端连结的NS3的β-折叠桶结构域(1027位～1195位)，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的C末端连结。在基础结构域中，缺失1027～1028位的2个氨基酸和1195位的氨基酸，并且将1144～1145位的2个R(精氨酸)取代为Q(谷氨酰胺：1144位)和L(亮氨酸：1145位)。
图10的氨基酸序列(序列号38)在上述基础结构域的C末端侧连结含有ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(1202位～1220位，CD4表位2：序列号13)、ITYSTYGK(1291位～1298位，CD8表位3：序列号6)和GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(1303位～1330位，CD4表位3：序列号14)的基础结构域(1)的区域、以及依次含有EIPFYGKAI(1372位～1380位，CD8表位4：序列号7)、KLSALGVNA(1406位～1414位，CD8表位6：序列号9)和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(1435位～1454位，CD8表位7：序列号10)的区域。基于上述NS4A区域和NS3的β-折叠桶结构域的基础结构域自身含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(1067位～1086位，CD8表位1：序列号4)、LYLVTRHADVIPVRQLGDSR(1130位～1149位，将CD4表位1中的RR取代为QL：序列号22)和LLCPSGHVV(1169位～1177位，CD8表位2：序列号5)。
基于图10的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率(http://www.kazusa.or.jp/codon/)的基因序列(序列号39；对应的氨基酸序列以序列号40表示)。
(实施例8：皮下肿瘤用转化EL4细胞的制作)
由于小鼠不感染HCV，为了在小鼠中制作皮下肿瘤，通过其增殖抑制效果评价本发明的疫苗的效果，进行了以下的实验。
从质粒pSG5/NS3/4A用BamHI切出编码NS3/4A的片段，插入质粒pBApo-CMVNeo(TAKARA)的BamHI位点，由此得到质粒pBApo-CMVNeo/NS3/4A(图11)。制备该质粒pBApo-CMVNeo/NS3/4A，使用TransIT-293TransfectionReagent(TAKARABIO株式会社制)导入EL4细胞(小鼠淋巴瘤细胞)。用含有G418800μg/ml的培养基选择转化EL4细胞，通过有限稀释法得到了转化EL4细胞(NS3/4A-EL4细胞)的克隆株。
为了确认其为转化细胞，进行了RT-PCR和蛋白质印记。RT-PCR根据通常方法，从总RNA制备cDNA，使用引物(序列号41：CGGCCCTCAGGCATGTTCGATTCTTC、序列号42：CCGGACAAGATGATCCTGCCCACAATG)在94℃保温120秒后，以98℃、10秒、64℃、30秒、68℃、40秒为1个循环进行30个循环，扩增编码NS3/4A的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭染色，在UV下确认扩增的DNA片段(图12)。在图12中，1为质粒pSG5/NS3/4A，2为转化EL4细胞，3为Mock感染EL4细胞，在1和2中确认了目的条带。
蛋白质印记通过将细胞提取液进行SDS-PAGE分离、转印到尼龙膜并进行封闭后用抗体检测NS3/4A蛋白质来进行(图13)。在图13中，在转化EL4细胞检测到73kDa的NS3/4A蛋白质的条带(列2)。另外，在对照的列3中没有检测到NS3/4A蛋白质的条带。由此，确认其为NS3/4A-EL4细胞的克隆株。
(实施例9：由B.longum2165口服给药获得的抗肿瘤效果的研究)
在皮下接种的前一日测定体重(Day0)，将确认为转化体的NS3/4A-EL4细胞移植到C57BL/6N小鼠的皮下。移植是将1×106个的细胞包埋于200μl的RPMI1640&Matrigel进行皮下接种。将皮下接种日作为Day1，开始表层表达NS3/4A蛋白质的双歧杆菌的口服给药实验。
口服给药组在各实验区每个区使用个体数6只，将PBS、B.longum2012(GLBP基因表达株)、B.longum2165(GLBP-NS3基因表达株)、非活化B.longum2165(将5×108CFU/ml菌液250μl在65℃加热5分钟)分别在各个实验区每周3次将5×107CFU溶解于100μl的PBS进行给药(计13回)。此后，每2天测量肿瘤长径和短径。在图14表示其结果。如图14所示，在PBS、GLBP给药区，肿瘤体积显著增大，但是在给药2165(GLBP-NS3)和非活化2165(GLBP-NS3)的区中，肿瘤体积的增加被显著抑制。这表示GLBP-NS3基因表达双歧杆菌具有在细胞表层表达NS3/4A蛋白质的肿瘤细胞的增殖抑制效果。另外，该效果不仅在活菌能够观察到，在非活化的菌也能观察到。因此，可以认为与双歧杆菌的生死无关而具有作为抗原的效果。
工业上的可利用性
根据本发明，能够在双歧杆菌的细胞表层表达和提呈免疫原性多肽。另外，根据本发明，在将在双歧杆菌的表层提呈例如丙型肝炎病毒抗原多肽的双歧杆菌口服给药的动物中，能够诱导NS3特异性免疫，因此，能够作为疫苗组合物(例如，口服疫苗)利用。这样的疫苗组合物能够期待与现有的干扰素疗法等并用，提高HCV慢性感染的治愈率。
Claims (13)
1.一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达基因，其特征在于：
该基因含有编码该免疫原性多肽的基因，
该免疫原性多肽为含有基础结构域和至少一个抗原肽的丙型肝炎病毒抗原多肽，
该基础结构域含有选自下述(1)～(4)的多肽中的一个以上，
(1)含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(2)含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(3)含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；和
(4)含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
该抗原肽为选自含有序列号4～15的氨基酸序列的肽以及含有与序列号4～15的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的至少一种，
该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。
2.如权利要求1所述的的双歧杆菌表层表达基因，其特征在于：
(1)所述基础结构域为含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)或与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含EIPFYGKAI(序列号7)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，或者连接包含EIPFYGKAI(序列号7)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、KLSALGVNA(序列号9)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；
(2)所述基础结构域为含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有EIPFYGKAI(序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；
(3)所述基础结构域为含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有TPAETSVRLRAYLNTPG(序列号15)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；或
(4)所述基础结构域包含含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在C末端侧连接包含含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽、含有EIPFYGKAI(序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTGDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域。
3.如权利要求1或2所述的双歧杆菌表层表达基因，其特征在于：
还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因，编码所述免疫原性多肽的基因位于该源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的3’末端侧。
4.一种基因表达用载体，其特征在于：
以能够表达权利要求3所述的双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因。
5.一种转化双歧杆菌，其特征在于：
保持权利要求4所述的载体，在细胞表层提呈所述免疫原性多肽。
6.一种转化双歧杆菌，其特征在于：
在基因组中以能够表达权利要求3所述的双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因，在细胞表层提呈所述免疫原性多肽。
7.一种丙型肝炎疫苗组合物，其特征在于：
含有权利要求5或6所述的转化双歧杆菌。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于：
其为口服疫苗。
9.一种设计用于在双歧杆菌的表层表达的免疫原性多肽的方法，其特征在于，包括：
选择保持立体结构并且具有细胞分泌能力的基础结构域和至少一个抗原肽的工序；以及
设计将该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结的合成多肽的工序。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述基础结构域含有至少一个CD4表位或CD8表位或者含有其双方。
11.一种转化双歧杆菌，其特征在于：
在细胞表层表达在癌细胞的表层特异性表达的多肽。
12.如权利要求11所述的转化双歧杆菌，其特征在于：
还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因。
13.一种癌疫苗，其特征在于：
含有权利要求11或12所述的转化双歧杆菌。
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