WO2014129412A1 - 免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌 - Google Patents

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acid sequence
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polypeptide
peptide
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利朗 白川
博 堀田
高嶺 片山
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国立大学法人神戸大学
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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an immunogenic polypeptide surface-expressing bifidobacteria, and more specifically, to an immunogenic polypeptide surface-expressing bifidobacteria capable of producing, for example, a hepatitis C vaccine composition.
  • HCV hepatitis C virus
  • Interferon treatment is mainly performed as treatment for hepatitis C.
  • the combination therapy combining pegylated interferon ⁇ and the antiviral drug ribavirin is more effective because the type 1 virus exclusion rate is 50% or less and the treatment period is long and the side effects are heavy. Drug development and treatment need to be established.
  • HCV is a positive-strand RNA virus belonging to the Flaviviridae family, and includes four structural protein regions (C-E1-E2-P7) and six nonstructural protein regions (NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B). ).
  • NS3 protein has serine protease activity in 1/3 of the N-terminal side, and 2/3 of C-terminal side has RNA helicase activity.
  • Non-patent Document 1 the three-dimensional structure of NS3 protein having two protease-helicase activities has been investigated.
  • Non-patent Document 2 NS3 specific strong immune response was observed in patients with cured HCV infection.
  • NS3 protein is genetically highly conserved, and numerous cytotoxic T cell (CTL) epitopes have been identified (Non-patent Document 3).
  • CTL cytotoxic T cell
  • Patent Document 1 describes a polypeptide comprising or consisting of at least 8 consecutive amino acids derived from amino acids 1188 to 1463 of the NS3 region of HCV and comprising a T cell stimulating epitope.
  • Patent Document 2 describes that a yeast cell that expresses an HCV fusion protein containing at least a part of HCV NS3 protease linked to at least a part of an HCV core sequence is used as a vaccine base.
  • Patent Document 3 describes that a vaccine platform is a bacterium such as attenuated Listeria monocytogenes that expresses and secretes a full-length protein such as NS3 or an immunogenic protein.
  • Patent Document 5 An oral vaccine consisting of acid-resistant capsules containing transformed Bifidobacterium longum that expresses or secretes flagellin from Salmonella, Vibrio cholerae, or Shigella dysenteriae.
  • the present inventors pay attention to the immunogenicity of non-structural protein 3 (NS3), which is a region related to HCV replication, and design a synthetic polypeptide containing a CD4 epitope and a CD8 epitope derived from NS3 protein.
  • NS3 non-structural protein 3
  • a bifidobacteria that expresses and displays the HCV antigen polypeptide on the surface, and induces an NS3-specific immune response in an animal orally administered with the HCV antigen polypeptide surface-expressed bifidobacteria (ie, NS3 Induction of specific intestinal mucosal immunity, systemic humoral immunity, and cellular immunity).
  • a bifidobacterial surface expression gene that can be widely used for an immunogenic polypeptide can be provided.
  • the present invention provides a bifidobacteria surface expression gene for expressing an immunogenic polypeptide on the surface of bifidobacteria,
  • the gene comprises a gene encoding the immunogenic polypeptide;
  • the immunogenic polypeptide is a hepatitis C virus antigen polypeptide comprising a base domain and at least one antigenic peptide;
  • the base domain is (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence; (2) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence; (3) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a polypeptide comprising the amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence; and (4) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19
  • the base domain is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence, on the N-terminal side of the base domain, QSFLATCINGVCWTVYHGAG (SEQ ID NO: 4) or a region containing a peptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence is linked, and EIPFYGKAI (SEQ ID NO: 7) or at least 90 with the amino acid sequence is linked to the C-terminal side.
  • the base domain is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence, on the N-terminal side of the base domain, QSFLATCINGVCWTVYHGAG (SEQ ID NO: 4) or a region containing a peptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence
  • the base domain is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence, on the N-terminal side of the base domain, QSFLATCINGVCWTVYHGAG (SEQ ID NO: 4) or a region comprising a peptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence is linked, and at the C-terminal side, TPAETSVRLRAYLNTPG (SEQ ID NO: 15) or the amino acid sequence and at least 90 Or (4) the base
  • the Bifidobacterium surface layer expression gene further comprises a gene encoding a GNB / LNB substrate-binding membrane protein derived from Bifidobacterium, and the gene encoding the immunogenic polypeptide is derived from the Bifidobacterium. It is located on the 3 ′ end side of the GNB / LNB substrate binding membrane protein.
  • the present invention also provides a gene expression plasmid containing the above-mentioned bifidobacteria surface expression gene in a manner capable of expression.
  • the present invention further provides a transformed bifidobacteria that retains the above plasmid and displays the immunogenic polypeptide on the cell surface.
  • the present invention further provides a transformed bifidobacteria that contains the bifidobacteria surface expression gene in the genome in a manner capable of expression, and presents the immunogenic polypeptide on the cell surface.
  • the present invention also provides a hepatitis C vaccine composition comprising a transformed bifidobacteria that presents the hepatitis C virus antigen polypeptide on the cell surface.
  • the vaccine composition is an oral vaccine.
  • the invention further provides a method of designing an immunogenic polypeptide for expression on the surface of Bifidobacteria, the method comprising: A step of selecting a base domain and at least one antigenic peptide having a three-dimensional structure and having a cell secretory ability; and linking the at least one antigenic peptide to either the N-terminal side or the C-terminal side of the basement domain Designing the synthesized polypeptide.
  • the base domain comprises at least one CD4 epitope or CD8 epitope or both.
  • the present invention also provides a transformed bifidobacteria that expresses a polypeptide specifically expressed on the surface of cancer cells on the cell surface.
  • the transformed bifidobacteria further includes a gene encoding a GNB / LNB substrate-binding membrane protein derived from bifidobacteria.
  • the present invention also provides a cancer vaccine containing the transformed bifidobacteria.
  • an immunogenic polypeptide can be expressed and presented on the cell surface of bifidobacteria.
  • immunity specific to hepatitis C virus antigen is induced in an animal orally administered with bifidobacteria presenting an immunogenic hepatitis C virus antigen polypeptide on the surface layer of bifidobacteria And thus can be utilized as a vaccine composition (eg, an oral vaccine).
  • HCV-1b type polypeptide GenBank: BAA08120.1.
  • An amino acid sequence as an example of a synthetic NS3 polypeptide in which an NS3-derived antigen peptide is linked to the N-terminus and C-terminus of the base domain based on the NS3 linker site and the N-terminal ⁇ - ⁇ - ⁇ domain of the HCV-1b type polypeptide 1 and 2 are shown. It is a photograph which shows the result of the Western blot regarding the expression of synthetic NS3 protein in wild type Bifidobacterium longum 245, Bifidobacterium longum 2164, and Bifidobacterium longum 2165.
  • Bright field micrographs (1-3) of Bifidobacterium longum 245 (1, 4), Bifidobacterium longum 2164 (2, 5), and Bifidobacterium longum 2165 (3, 6) and Fluorescence micrographs (4-6) are shown. It is a graph which shows the daily change of NS3 antigen specific IgA antibody contained in the mouse
  • FIG. 2 shows an amino acid sequence which is an example of a synthetic NS3 polypeptide in which an NS3-derived antigen peptide is linked to the N-terminus and C-terminus of the base domain based on the ⁇ -helical domain of NS3 of the HCV-1b polypeptide.
  • the amino acid sequence which is an example of a synthetic NS3 polypeptide in which an NS3-derived antigen peptide is linked to the N-terminus and C-terminus of the base domain based on the ⁇ - ⁇ - ⁇ -domain of NS3 of HCV-1b type polypeptide, is shown.
  • An amino acid sequence which is an example of a synthetic NS3 polypeptide in which an NS3-derived antigen peptide is linked to the C-terminal of the base domain based on the ⁇ -barrel domain of NS3 in which a part of the NS4A region of the HCV-1b polypeptide is linked to the N-terminus Show.
  • the construction of plasmid pBApo-CMVNeo / NS3 / 4A is shown.
  • the detection of NS3 / 4A fragment by RT-PCR is shown.
  • the detection of NS3 / 4A by Western blotting is shown.
  • the effect of NS3 expression bifidobacteria vaccine regarding the growth suppression of EL4 cell which expresses NS3 / 4A is shown.
  • Bifidobacteria refers to a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium.
  • Bifidobacterium for example, Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, Bifidobacterium animalis subsp. Animalis (B. animalis subsp. Animalis), B. animalis subsp. Lactis, B. asteroides, B. bifidum, Bifidobacterium boum ( B. boum), Bifidobacterium breve, B. catenulatum, B.
  • B. choerinum Bifidobacterium coryneform (B coryneforme), B. cuniculi ), B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum ), B. globosum, B. indicum, B. infantis, Bifidobacterium inopinatum (B. inopinatum), B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum , Bifidobacterium minimum (B. minimum), Bifidobacterium pervulorum, Bifidobacte B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum subsp. Globosum, B. pseudolongum subsp.
  • B. pseudocatenulatum B. pseudocatenulatum pseudolongum subsp. pseudolongum
  • B. pullorum B. ruminale
  • B. ruminantium Bifidobacterium sexual (B. saeculare)
  • B. scardovii B. subtile
  • B. suis Bifidobacterium thermacid film
  • B. thermophilum B. thermophilum And the like.
  • strains are either commercially available or can be easily obtained from depository institutions.
  • B. longum JCM1217 ATCC 15707
  • B. bifidum ATCC 11863 Bifidobacterium longum 105-A strain (Biosci. Biotechnol. Biochem., 61) Volume, pages 1211-1212, 1997).
  • GNB / LNB substrate binding membrane protein GNB / LNB substrate binding membrane protein
  • GNB / LNB substrate binding membrane protein is a lacto-N-biose (ie, N-acetyl-3-O- ( ⁇ -D-galactopyranosyl) -D-glucosamine) and galacto- It is a membrane protein belonging to the ABC protein (ATP Binding Cassette protein) family that transports N-biose (ie, N-acetyl-3-O- ( ⁇ -D-galactopyranosyl) -D-galactosamine).
  • ABC protein is an important membrane protein that uses energy called ATP (adenosine triphosphate) and actively transports specific substances on the cell membranes of all living organisms. Is present.
  • GLBP which is an ABC protein
  • Bifidobacteria Bifidobacterium bacterium having a cell function for GLBP surface expression.
  • GLBP derived from Bifidobacterium longum JCM1217 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (the corresponding base sequence is shown in SEQ ID NO: 1).
  • GLBP The structure of GLBP is not limited to the naturally occurring GLBP, and if it has the ability to be expressed on the cell surface of bifidobacteria, one or more substitutions (for example, one or several) in the amino acids constituting the GLBP, It may have an insertion or a deletion.
  • an immunogenic polypeptide for expression on the surface layer of bifidobacteria is composed of a base domain that retains a three-dimensional structure and has the ability to secrete cells, and at least one antigenic peptide.
  • the at least one antigenic peptide is linked to either the N-terminal side or the C-terminal side of the base domain.
  • Immunogenic means that the antigen can induce an antigen-specific T cell response (CD4 + and / or CD8 +).
  • the base domain retains a three-dimensional structure (for example, forms a secondary structure (for example, ⁇ -sheet or ⁇ -helix) on the crystal structure) and has a cell secretory ability (for example, a continuous basic amino acid) Regions that do not contain or have been modified not to contain residues can be used. Examples of domains that retain a three-dimensional structure include ⁇ - ⁇ - ⁇ domain, ⁇ -barrel domain, ⁇ -helix domain and the like.
  • the three-dimensional structure of the protein can be determined, for example, by X-ray crystal structure analysis that is commonly used by those skilled in the art, and the base domain can be selected based on known or estimated X-ray structure analysis information (for example, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do); Bioinformatics, Vol.22, 195-201, 2006; and Protein Science, 2, 305-314, 1993) .
  • the base domain preferably comprises at least one CD4 and / or CD8 epitope within the domain.
  • Cell secretion ability means that the polypeptide (protein) has the ability to be secreted outside the cell by a transport device on the cell membrane of Bifidobacterium.
  • the region does not contain two or more amino acids consecutively in basic amino acids (histidine, lysine, and arginine) (that is, amino acids before and after the basic amino acids in the region Other amino acids) are desirable.
  • the region can be modified by substituting with another amino acid as described below.
  • Antigenic peptide means any peptide that exhibits antigenicity.
  • Peptides that exert antigenicity include CD4 epitope (helper T cell recognition epitope) and CD8 epitope (cytotoxic T cell recognition epitope).
  • CD4 epitope helper T cell recognition epitope
  • CD8 epitope cytotoxic T cell recognition epitope
  • an antigenic peptide has one or more (for example, one or several) substitutions, insertions, and / or deletions in the amino acids constituting the epitope, as long as it has the ability to exert desired properties (particularly antigenicity). May be.
  • an antigenic peptide is composed of one or more amino acids (preferably 1-5 amino acids) derived from a region extending to the N-terminus and / or C-terminus of the epitope within the protein from which the epitope is derived (ie, naturally present).
  • amino acids preferably within 3 amino acids
  • One or more amino acids may be substituted, or a combination thereof may be included.
  • the desired action (three-dimensional structure of the base domain) And may be substituted with another amino acid so as to exhibit a secretory capacity. It is not necessary to replace all basic amino acids that are continuous for two or more amino acids, and the remaining amino acids may be replaced except for one basic amino acid.
  • the amino acid after substitution may be other than basic amino acids, for example, alanine, methionine, glutamic acid, glutamine and leucine, preferably glutamic acid, glutamine and leucine, more preferably in the order of glutamine and leucine. Can be substituted as arranged.
  • the base domain has one or more (for example, one or several) substitutions, insertions, and / or deletions in amino acids as long as it can retain the three-dimensional structure of the domain and has the ability to secrete cells. May be.
  • a plurality of types of infrastructure domains may be used.
  • amino acid sequence consisting of one or more amino acids (preferably 1 to 5 amino acids) derived from the N-terminal and / or C-terminal region of the base domain in the protein from which the base domain is derived (that is, naturally exists) is further added.
  • One or more amino acids preferably within 3 amino acids
  • variants having one or more amino acid substitutions, insertions, and / or deletions are preferably conservatively modified variants. “Conservatively modified variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants for a particular nucleic acid sequence include nucleic acids that encode the same amino acid sequence and amino acid sequences that have one or more conservative substitutions.
  • An example of a conservative substitution is the exchange of an amino acid in one of the following groups with another amino acid in the same group: (1) Hydrophobicity: isoleucine, valine, leucine, phenylalanine, methionine, alanine, tryptophan, glycine; (2) Neutral hydrophilicity: cysteine, serine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine; (3) Acidity: aspartic acid, glutamic acid; (4) Basic: histidine, lysine, arginine; (5) Residues affecting chain orientation: glycine, proline; (6) Aromatic: tryptophan, tyrosine, phenylalanine; and (7) Small amino acids: glycine, alanine, serine.
  • the amino acid sequence of such a variant is at least 90%, more preferably at least 95%. More preferably, it has at least 99% sequence identity.
  • the terms “percent sequence identity” and “% sequence identity” mean the percentage of sequence identity found by comparison or alignment of two or more amino acid or nucleic acid sequences. Percent identity is a direct comparison of sequence information between two molecules by aligning the sequences, calculating the exact number of matches between the two aligned sequences, dividing by the length of the short sequence and multiplying the result by 100. Can be determined by The algorithm for calculating percent identity is the Smith-Waterman homology search algorithm (eg, Proteins, 48, 367-376, 2002; Bioinformatics, 17, 327-337, 2001).
  • the antigenic peptide can exhibit immunogenicity by being expressed and presented on the surface of bifidobacteria cells in combination with the base domain. At least one antigenic peptide can be added to one or both sides of the N-terminal side and the C-terminal side of the base domain. For example, if more than one antigenic peptide is added, the base domain can add each antigenic peptide on one or both sides.
  • the antigen peptide to be linked can be selected so as to exhibit immunogenicity by the epitope by the antigen peptide and the epitope in the base domain.
  • HCV hepatitis C virus
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) including the full-length NS3 protein region of HCV-1b type polypeptide (GenBank: BAA08120.1).
  • the amino acid sequence at positions 1027 to 1657 in FIG. 1 is the entire length of NS3 (in the present specification, unless specifically indicated about the amino acid position number, this is based on the position in the entire length of the HCV-1b polypeptide).
  • NS3 protein consists of a ⁇ -barrel domain (positions 1027 to 1195), a linker site (positions 1196 to 1215), two ⁇ - ⁇ - ⁇ -domains (N-terminal domain 1216 to 1350 and a C-terminal domain). 1351 position to 1509 position) and an ⁇ -helical domain (positions 1510 to 1657) (Non-patent Document 1).
  • FIG. 1 also shows the distribution of CD8 epitope (indicated by underline in FIG. 1) and CD4 epitope (indicated by double underline in FIG. 1) in the NS3 protein region.
  • the CD8 epitope is 1067 to 1086: QSFLATTCINGVCWTVYHGAG (CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4), 1169th to 1177th: LLCPSGHHVV (CD8 epitope 2: SEQ ID NO: 5), 1291 to 1298: ITYSTYGK (CD8 epitope 3: SEQ ID NO: 6), 1372 to 1380: EIPFYGKAI (CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), 1391 to 1399: LIFCHSKKKK (CD8 epitope 5: SEQ ID NO: 8), 1406 to 1414: KLSALGVNA (CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9), 1435 to 1454: VATALLMTGYTGDFDSVIDC (CD8 epitope 7: SEQ
  • HCV hepatitis C virus immunogenic polypeptide
  • the hepatitis C virus (HCV) immunogenic polypeptide expressed on the surface of bifidobacteria can include one or more of the above-mentioned base domains (1) to (4) as a base domain.
  • the base domains (1) to (4) can be used alone or in combination with one or more other base domains.
  • the base domain (1) is, for example, ETTMRSPVFTDNSTPPAVP (positions 1202 to 1220, CD4 epitope 2: SEQ ID NO: 13), ITYSTYKK (positions 1291 to 1298, CD8 epitope 3: SEQ ID NO: 6), and GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG (positions 1303 to 1330) Position, CD4 epitope 3: SEQ ID NO: 14).
  • the base domain (2) includes, for example, TPAETSVRLRAYLNTPG (positions 1531 to 1547, CD4 epitope 4: SEQ ID NO: 15), and GAVQNEVTL (positions 1629 to 1637, CD8 epitope 8: SEQ ID NO: 11).
  • the base domain (3) is, for example, EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), LIFCHSKQL (positions 1391 to 1399, CD8 epitope 5 with KK replaced by QL: SEQ ID NO: 21) , KLSALGVNA (positions 1406-1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9), and VATALLMTGYTGDFDSVIDC (positions 1435-1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10).
  • the base domain (4) is, for example, QSFLATTCINGVCWTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4), LYLVTRHADVPVRRQLGDSR (positions 1130 to 1149, RR in CD4 epitope 1 is replaced by QL: SEQ ID NO: 22 ), And LLCPSGHVV (positions 1169 to 1177, CD8 epitope 2: SEQ ID NO: 5).
  • At least one HCV antigen peptide is linked to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the base domain.
  • the antigenic peptide includes, for example, a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: QSFLATTCINGVCWTVYHGAG (SEQ ID NO: 4), LYLVTRHADVPVRRRRGDSR (SEQ ID NO: 12), LLCPSGHVV (SEQ ID NO: 5), ETTMRSPVFTDNSTPPAVP (SEQ ID NO: 13), ITYSTYGK (SEQ ID NO: 6), GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG (SEQ ID NO: 14), EIPFYGKAI (SEQ ID NO: 7), LIFCHSKKKK (SEQ ID NO: 8), KLSALGVNA (SEQ ID NO: 9), VATALLMTGYTGDFDSVIDC (SEQ ID NO: 10), TPAETSVRLRAYLNTPG (SEQ ID NO: 15), and GAV
  • the peptide is a CD4 epitope or a CD8 epitope derived from the NS3 protein of the HCV-1b type antigen polypeptide.
  • the CD4 epitope and the CD8 epitope are arranged as shown in FIG. 1, but the kind and number of epitopes of the antigen peptide linked to the base domain, the position (N-terminal side or C-terminal side) to be linked to the base domain, and The order of connection in the case where a plurality of terminals are connected is not particularly limited.
  • an antigen peptide a region containing an epitope such as the above-mentioned base domains (1) to (4) can also be used.
  • the antigenic peptide may overlap with an epitope located in the base domain.
  • the antigen peptide to be linked can be selected such that it can exert immunogenicity by an epitope by the antigen peptide and an epitope in the base domain.
  • the CD4 epitope or CD8 epitope within the antigenic peptide has one or more (eg, one or several) substitutions, insertions, and / or deletions in amino acids as long as they have the ability to exert antigenicity. May be.
  • the antigenic peptide is one or more amino acids (preferably 1 to 5 amino acids) derived from a region extending to the N-terminus and / or C-terminus of the epitope within the NS3 protein from which the epitope is derived (ie, naturally present).
  • the antigenic peptide used for the HCV antigen polypeptide for expressing Bifidobacteria surface layer has the ability to exert antigenicity, it is at least 90% with respect to the amino acid sequence of the peptide of the CD4 epitope or CD8 epitope, more preferably At least 95%. More preferably, it may have an amino acid sequence having at least 99% sequence identity.
  • the desired action (the three-dimensional structure of the base domain and the cell secretory ability) is exhibited. May be substituted with another amino acid.
  • the amino acid after substitution may be other than basic amino acids, for example, alanine, methionine, glutamic acid, glutamine and leucine, preferably glutamic acid, glutamine and leucine, more preferably in the order of glutamine and leucine. Can be substituted as arranged.
  • the base domain has one or more (for example, one or several) substitutions, insertions, or deletions in amino acids as long as the three-dimensional structure of the domain can be maintained and the cell secretory ability for surface expression is present. May be.
  • a base domain is one or more amino acids (preferably 1 or more) derived from a region extending from the N-terminal and / or C-terminal of the corresponding region in the NS3 protein from which the base domain is derived (ie, naturally present).
  • the amino acids of the base domains (1) to (4) At least 90% relative to the sequence, more preferably at least 95%. More preferably, it may have an amino acid sequence having at least 99% sequence identity.
  • a region containing QSFLATCINGVCWTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) can be linked to the N-terminal side of the base domain, and to the C-terminal side , EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), KLSALGVNA (positions 1406 to 1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9) and VATALLMTGYTGDFDSVID (positions 1435 to 1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10) ), More preferably a region containing EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), or EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380).
  • CD8 epitope 4 SEQ ID NO: 7
  • KLSALGVNA positions 1406-1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9
  • VATALLMTGYTGDFDSVIDC positions 1435-1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10
  • synthetic protein in the case of the base domain (1) are, for example, as shown in amino acid sequences 1 and 2 of FIG. 2 (in FIG. 2, the base domain sequence is shown in upper case letters and the antigen peptide region sequence is shown in lower case letters)
  • each of the CD8 and CD4 epitopes is underlined and double underlined).
  • a region containing QSFLATCINGVCVCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) can be linked to the N-terminal side of the base domain.
  • EIPFYGKAI positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7
  • KLSALGVNA positions 1406 to 1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9
  • VATALLMTGYTGDFDSVIDC positions 1435 to 1454, CD8 Epitope 7: a region comprising at least one of SEQ ID NO: 10) in any order, more preferably, EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), KLSALGVNA (positions 1406 to 1414, CD8 epitope) 6: SEQ ID NO: 9), and a region containing VATALLMTGYTGDFDSVIDC (positions 1435-1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10) (preferably in this order), which may be antigenic
  • a region containing QSFLATCINGVCVCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) can be preferably linked to the N-terminal side of the base domain.
  • a region containing TPAETSVRLRAYLNTPG (positions 1531 to 1547, CD4 epitope 4: SEQ ID NO: 15) can be linked to the C-terminal side (as long as they have the ability to exert antigenicity, the amino acids described in the specified SEQ ID NO: A peptide having an amino acid sequence with at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 99% sequence identity to the sequence).
  • An example of a synthetic protein in the case of the base domain (3) is, for example, as shown in the amino acid sequence of FIG. 9 (in FIG. 9, the base domain sequence is represented in upper case letters, the antigen peptide region sequence is represented in lower case letters, Each of the CD8 epitope and CD4 epitope is underlined and double underlined; bold “QL” indicates the amino acid after substitution).
  • the base domain (4) preferably, no antigen peptide is linked to the N-terminal side of the base domain, and ETTMRSPVFTDNSTPPAVP (positions 1202 to 1220, CD4 epitope 2: SEQ ID NO: 13), ITYSTYGK ( 1291 to 1298, CD8 epitope 3: SEQ ID NO: 6) and GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG (positions 1303 to 1330, CD4 epitope 3: SEQ ID NO: 14) (1) (or the three-dimensional structure of the domain can be retained, As long as it has the ability to secrete cells for surface expression, it has at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 99% sequence identity with respect to the amino acid sequence of the base domain (1).
  • EIPFYGKAI positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7
  • KLSALGVNA positions 1406 to 1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9
  • VATALMTGGYTGDFDSVIDC 1355.
  • An example of a synthetic protein in the case of the base domain (4) is, for example, as shown in the amino acid sequence of FIG. 10 (in FIG. 10, the base domain sequence is represented in upper case letters, the antigen peptide region sequence is represented in lower case letters, Each of the CD8 epitope and CD4 epitope is underlined and double underlined; bold “QL” indicates the amino acid after substitution).
  • the immunogenic polypeptide expressed / presented on the surface of bifidobacteria is expressed as a fusion protein with GLBP. This fusion protein is linked in the order of GLBP and the immunogenic polypeptide of interest from the N-terminus.
  • the gene for expressing this fusion protein includes a gene encoding the target immunogenic polypeptide and a gene encoding GLBP (also referred to as an immunogenic polypeptide surface expression cassette gene).
  • the gene encoding the target immunogenic polypeptide is located on the 3 'end side of the gene encoding GLBP.
  • the immunogenic polypeptide surface expression cassette gene may be a fusion gene in which the gene encoding the immunogenic polypeptide of interest is linked to the 3 ′ end side of the gene encoding GLBP, or encodes GLBP
  • a gene encoding a linker having an appropriate length may be disposed between the gene to be encoded and the gene encoding the target immunogenic polypeptide.
  • a gene encoding GLBP and a gene encoding a target immunogenic polypeptide can be obtained based on known gene sequence or amino acid sequence information, respectively.
  • a genomic DNA or cDNA prepared from any bifidobacteria is used as a template, and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair prepared based on the sequence information of the structural gene of GLBP of the bifidobacteria. obtain. Since there are generally multiple types of genetic code for one amino acid, it may be a gene having a base sequence different from a known base sequence or a base sequence based on a known amino acid sequence.
  • the gene encoding GLBP of B. longum is the structural gene of GLBP of Bifidobacterium longum described in Acta Crystallographica Section F., Vol. Available from sequence.
  • Bifidobacterium longum chromosomal DNA or cDNA can be used as a template, and amplified by PCR using a primer pair prepared based on sequence information.
  • the gene encoding the target immunogenic polypeptide is determined from the designed amino acid sequence based on known or estimated gene sequence information, and the gene sequence encoding the target immunogenic polypeptide is determined.
  • an optimized gene sequence can be obtained in consideration of the codon frequency of the host.
  • the gene sequences 1 and 2 encoding each of the amino acid sequences 1 and 2 in FIG. 2 which are examples of the synthetic protein based on the base domain (1) are derived from a base sequence optimized based on the codon frequency of bifidobacteria. Become.
  • the nucleotide sequences of gene sequences 1 and 2 are as shown in SEQ ID NOs: 25 and 27, respectively (the corresponding amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 26 and 28, respectively).
  • the base sequence of the gene encoding the amino acid sequence of FIG. 8 which is an example of the synthetic protein based on the base domain (2) and optimized based on the codon frequency of bifidobacteria is as shown in SEQ ID NO: 33 (The corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 34).
  • the base sequence of the gene encoding the amino acid sequence of FIG. 9 which is an example of a synthetic protein based on the base domain (3) and optimized based on the codon frequency of bifidobacteria is as shown in SEQ ID NO: 35 (The corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 36).
  • the base sequence of the gene encoding the amino acid sequence of FIG. 10 which is an example of the synthetic protein based on the base domain (4) and optimized based on the codon frequency of bifidobacteria is as shown in SEQ ID NO: 39 (The corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 40).
  • the gene to be encoded can be obtained by, for example, known chemical synthesis.
  • the chemical synthesis method include a chemical synthesis method using a DNA synthesizer utilizing the phosphoramidite method.
  • primers prepared based on the 5′-end and 3′-end base sequences of the base sequence to be obtained and synthesized from mRNA contained in tissues or cells of various derived organisms or cDNA selected from a cDNA library The above gene can also be obtained by amplifying DNA using PCR as a template.
  • a cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of various derived organisms using a DNA or polynucleotide chemically synthesized as a whole or a part thereof as a probe.
  • the above gene can also be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization.
  • the genes encoding the above proteins can be easily obtained from known amino sequence information.
  • the above cDNA library can be obtained by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the gene encoding the known amino sequence.
  • a method for amplifying a target gene from the above, or a gene incorporated in an appropriate vector, and a DNA fragment or synthetic DNA labeled (probe) that encodes part or all of the gene encoding each of the above proteins And a method of sorting by hybridization.
  • the gene encoding each protein may be a DNA that hybridizes with the gene obtained as described above under stringent conditions.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions means DNA obtained by colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot hybridization, or the like using the above DNA as a probe. Specifically, hybridization was performed at about 65 ° C. in the presence of about 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then about 0.1 A DNA that can be identified by washing a filter under a condition of about 65 ° C. using a ⁇ 2-fold SSC solution (the composition of a 1-fold SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). It is done.
  • the hybridizable DNA is a DNA having at least 80% sequence identity with the base sequence of a gene encoding each protein obtained based on the above-mentioned known base sequence information or amino acid sequence information, preferably Include DNA having at least 90% sequence identity, more preferably DNA having at least 95% homology.
  • immunogenic polypeptide surface expression cassette gene and bifidobacteria transformation vector Immunogenic polypeptide surface expression cassette gene or the immunogenic polypeptide surface layer from the gene encoding each protein prepared as described above
  • a recombinant DNA containing an expression cassette gene is prepared.
  • the immunogenic polypeptide surface expression cassette gene is prepared so that the gene encoding the target immunogenic polypeptide is located on the 3 ′ end side of the gene encoding GLBP.
  • the recombinant DNA can be an expression vector or a chromosomal integration vector (for example, a homologous recombination vector).
  • the plasmid used for the preparation of such a vector is not particularly limited as long as it is a plasmid that can be expressed in bifidobacteria.
  • plasmids derived from Bifidobacterium include pTB6, pBL67, pBL78, pNAL8H, pNAL8M, pNAC1, pBC1, pMB1, and pGBL8b.
  • Complex plasmids of these plasmids and E. coli plasmids can also be used, and examples thereof include pBLES100, pKKT427, and pRM2.
  • a composite plasmid synthesized from a Bifidobacterium longum plasmid and an Escherichia coli plasmid is preferable from the viewpoint of the stability of expression and the ease of preparation of DNA for preparing a transformant.
  • the expression vector preferably has a selection marker such as antibiotic resistance or amino acid requirement from the viewpoint of selecting a transformed strain.
  • the expression vector is preferably added with a regulatory sequence for the expression of a fusion protein of GLBP and the target immunogenic polypeptide or so as to be advantageous for the expression.
  • regulatory sequences include promoter sequences, leader sequences, propeptide sequences, enhancer sequences, signal sequences, terminator sequences, and the like. There are no particular restrictions on the origin of these regulatory sequences as long as they are expressed in bifidobacteria.
  • the promoter sequence is not particularly limited as long as it is expressed in bifidobacteria. From the viewpoint of expression efficiency, a Bifidobacterium longum histone-like protein (HU) promoter sequence, LDH promoter, and the like are preferably used.
  • HU Bifidobacterium longum histone-like protein
  • the terminator sequence of the HU gene is preferably used.
  • a leader sequence, a propeptide sequence, an enhancer sequence, a signal sequence, etc. can be arranged as necessary.
  • a gene encoding a linker having an appropriate length may be arranged between a gene encoding GLBP and a gene encoding a target immunogenic polypeptide.
  • a cloning vector is prepared by introducing a regulatory sequence such as a promoter sequence and a terminator sequence and a selectable marker gene into the above-described plasmid as necessary.
  • Selectable markers include spectinomycin (SPr), ampicillin (Ampr), tetracycline (TETr), kanamycin (KMr), streptomycin (STr), neomycin (NEOr) and other antibiotic resistance markers; green fluorescent protein (GFP), Examples include fluorescent markers such as red fluorescent protein (REP); enzymes such as LacZ.
  • a linker having a multicloning site downstream of the promoter of the cloning vector.
  • the gene (DNA) encoding the fusion protein is incorporated so that the fusion protein can be expressed downstream of the promoter and in frame.
  • plasmids for cloning vectors include pBLES100 and pBREM100 (Japanese Patent No. 3642755).
  • a vector for expressing the fusion protein on the surface of Bifidobacteria by incorporating the obtained HU promoter sequence, the gene encoding GLBP, and the gene encoding the target immunogenic polypeptide into this plasmid pBLES100 in frame. Is obtained.
  • the expression vector obtained by such a method is used for transformation of bifidobacteria.
  • Examples of bifidobacteria surface expression vectors include plasmid pJT101 (Patent Document 4 and Non-Patent Document 4), and E. coli-Bifidobacterium shuttle vector pJW241 (Patent Document 4 and Non-Patent Document 4).
  • the plasmid pJT101 contains a GLBP gene (SEQ ID NOs: 1 and 2: Patent Document 4 and Non-patent Document 4) derived from Bifidobacterium longum JCM1217 (ATCC 15707), and a target immunogen downstream of the GLBP gene.
  • a gene encoding a sex polypeptide can be incorporated in frame.
  • a ligated product (immunogenic polypeptide surface expression cassette gene) encoding the GLBP gene incorporated into pJT101 and the immunogenic polypeptide of interest can be excised and incorporated into the E. coli-Bifidobacterium shuttle vector pJW241.
  • Recombinant DNA for example, the expression vector prepared as described above, can be introduced into the host bifidobacteria to prepare the transformed bifidobacteria.
  • a gene homologous recombination method using a plasmid replicable in bifidobacteria can also be used.
  • an immunogenic polypeptide surface expression cassette gene for example, a fusion gene in which a gene encoding an immunogenic polypeptide of interest is linked to the 3 ′ end of a gene encoding GLBP
  • a temperature-sensitive plasmid having a homologous site with the bifidobacterial chromosomal gene (a plasmid that does not replicate at a high temperature (eg, 42 ° C. or higher)) can be used (for example, Appl. Microbiol. Biotechnol., 95, 499-509, year 2012).
  • an immunogenic polypeptide surface expression cassette gene is inserted between the homologous sites of a temperature-sensitive plasmid having a homologous site with the bifidobacterial chromosome gene, this plasmid is introduced into bifidobacteria and cultured at high temperature.
  • bifidobacteria in which the gene of interest is integrated into the chromosome by gene homologous recombination can be selectively cultured.
  • any known method can be used for introducing an expression vector for transformation or a plasmid capable of replicating in Bifidobacteria.
  • Specific examples include an electroporation method (electroporation method), a calcium phosphate method, a lipofection method, a calcium ion method, a protoplast method, a microinjection method, and a particle gun method.
  • an electroporation method it is preferable to use an electroporation method.
  • the electroporation method it can be performed under conditions of 0.5 to 20 kV / cm and 0.5 ⁇ sec to 10 msec. For example, it is performed at 2 to 10 kV / cm and 50 ⁇ sec to 5 msec.
  • the transformed strain is selected by utilizing the selection marker possessed by the fusion protein expression vector, the property of the plasmid that can replicate in Bifidobacteria (for example, temperature sensitivity), and the like.
  • a medium for cultivating the transformed strain a medium suitable for each host microorganism, for example, glucose blood liver (BL) agar medium, De Mann-Logosar sharp (MRS) agar medium, Gifu University anaerobic (GAM) agar Medium, modified GAM (TGAM) agar medium, Briggs agar medium, and yeast extract glucose peptone (YGP) agar medium.
  • Antibiotics are added to these media according to the selection marker, or amino acids are deleted or added to obtain a selective pressure.
  • the culture conditions are preferably anaerobic culture in which bifidobacteria can be cultured. By culturing under anaerobic conditions, the growth of aerobic bacteria can be prevented.
  • the anaerobic condition is in a sealed container that can maintain an anaerobic degree to which bifidobacteria can grow, and examples include conditions that are possible in an anaerobic chamber or an anaerobic box.
  • the culture temperature may be any temperature at which bifidobacteria can be cultured, and is usually 4 ° C to 45 ° C, preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 24 ° C to 37 ° C.
  • a transformed bifidobacteria in which not only a vector for displaying a fusion protein of GLBP and a target protein or peptide on the surface but also a vector for displaying a fusion protein of GLBP and a protein having an adjuvant function are simultaneously introduced. May be prepared.
  • the introduction of the gene encoding the fusion protein may be confirmed by electrophoresis after extracting the plasmid from the transformed bifidobacteria and treating with the restriction enzyme, or the sequence of the restriction enzyme-treated fragment may be directly sequenced.
  • Confirmation of expression of the fusion protein of the obtained transformed bifidobacteria can be performed, for example, by Western blotting.
  • the transformed bifidobacteria are lysed using, for example, a nonionic surfactant.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan esters (Tween® 20, 40, 60, 65, 80, 85), sorbitan esters (Span® 20, 40, 60, 65, 80). , 85).
  • the target immunogenic polypeptide is easily displayed on the surface of bifidobacteria by an immunoantibody method using an antibody against the target protein or peptide and a FITC-labeled anti-IgG antibody against the transformed bifidobacteria. Can be confirmed.
  • the immunogenicity of bifidobacteria expressed on the surface of the immunogenic polypeptide is based on antigen-specific IgA antibody (induction of local mucosal immunity) contained in stool, antigen-specific IgG antibody contained in serum (systemic immunity) Induction) as well as induction of intracellular cytokine (eg, interferon ⁇ (IFN- ⁇ )) production by antigen stimulation.
  • IgA antibody induction of local mucosal immunity
  • serum systemic immunity
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • the transformed bifidobacteria in which the surface layer of the target immunogenic polypeptide has been confirmed may be cultured and recovered by a method commonly used by those skilled in the art and used directly in the preparation of the preparation. Or you may dry and use. Drying is performed by a treatment method that allows growth when exposed to growth conditions such as intestinal environment or culture medium by performing low-temperature treatment such as freeze-drying and low-temperature drying.
  • the transformed bifidobacteria may be post-treated by a known method. For example, rough purification may be performed by centrifugation or the like. In addition, if desired, after rough purification, it may be dissolved or suspended in a solvent conventionally used in the art such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), or lactic acid-containing Ringer's solution. Moreover, you may freeze-dry or spray-dry as needed, and you may make it a powdery thing or a granular material.
  • a solvent conventionally used in the art
  • physiological saline such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), or lactic acid-containing Ringer's solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the vaccine composition of the present invention contains the transformed bifidobacteria as an active ingredient.
  • the vaccine composition of the invention can be administered to a patient in an amount that sufficiently induces an appropriate immune response against HCV infection.
  • the transformed bifidobacteria can be stored as frozen, lyophilized, suspension, or cell pastes of the live bacteria, or in combination with a solid or gel or liquid medium.
  • the dosage form of the administration preparation is not limited, but a powder, a liquid in which the lyophilized powder is suspended, a capsule in which the lyophilized powder is enclosed, and the like are preferable.
  • As the capsule for example, an acid-resistant capsule described in Patent Document 5 can be suitably used.
  • the administration route is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and parenteral administration. Oral administration or nasal administration is preferred, and oral administration is more preferred.
  • preparations suitable for oral administration include, for example, granules, fine granules, powders, syrups, solutions, capsules or suspensions.
  • preparations suitable for parenteral administration include, for example, injections, drops, inhalants, sprays, suppositories, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, and the like.
  • liquid preparations for oral administration for example, sugars such as water, sucrose, sorbit, fructose; glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol; oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil; p-hydroxybenzoic acid Additives for preparations such as preservatives such as acid esters can be used.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol
  • disintegrants such as starch and sodium alginate
  • magnesium stearate such as magnesium stearate, talc Lubricants such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin and other binders; fatty acid esters and other surfactants; and glycerin and other plasticizers.
  • preparations for intravascular administration such as injections and infusions can be prepared preferably using an aqueous medium isotonic with human blood.
  • an injection can be prepared as a solution, suspension or dispersion with an appropriate auxiliary agent using an aqueous medium selected from a salt solution, a glucose solution, or a mixture of a salt solution and a glucose solution according to a conventional method.
  • Suppositories for enteral administration can be prepared, for example, using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or hydrogenated fatty acid.
  • the spray uses a carrier that does not irritate the human oral cavity and airway mucosa, and can promote absorption by dispersing the transformed bifidobacteria as an active ingredient as fine particles.
  • a carrier for example, lactose or glycerin can be used.
  • lactose or glycerin can be used.
  • it can be prepared as a preparation in the form of an aerosol or dry powder.
  • a preparation for parenteral administration for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • a diluent for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • a surfactant for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • plasticizer for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a
  • the content of the transformed bifidobacteria in the vaccine composition of the present invention is appropriately determined according to the type or dosage form of the preparation, the age, sex, body weight or disease state of the administration subject, method of administration or intake, timing or time, etc. Can be set.
  • the immunogenic polypeptide is an HCV antigen polypeptide (for example, NS3-derived antigen polypeptide)
  • the transformed bifidobacteria of the present invention is an effective oral vaccine against HCV infection.
  • the vaccine composition containing the immunogenic HCV antigen polypeptide surface-expressing transformed bifidobacteria of the present invention can be used for either prevention or treatment of HCV infection.
  • the present vaccine composition can be used in combination with existing interferon therapy and the like.
  • the transformed bifidobacteria of the present invention suppressed the growth of tumor cells expressing NS3 / 4A (Example 9, FIG. 14).
  • This is considered to mean that the transformed bifidobacteria of the present invention functioned as a vaccine and activated cellular immunity against NS3. That is, by orally administering the bifidobacteria of the present invention, NS3 protein-specific cytotoxic T cells (cytotoxic T lymphocyte; CTL) are induced, and the CTL attacks the tumor cell EL4 expressing NS3 / 4A. It is thought that tumor growth was suppressed. This confirmed that antigen peptide-specific cellular immunity was induced by the oral vaccine containing the bifidobacteria of the present invention.
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • the transformed bifidobacteria of the present invention can also be used for the purpose of suppressing the growth of tumor cells.
  • administration of B. longum 2165 expressing NS3 protein inhibited the growth of tumors expressing NS3 protein. This is considered to be because NS3 expressed in the surface layer of B. longum 2165 functions as an antigen, induces induction of NS3-specific CTL, and the CTL suppresses the growth of a tumor expressing NS3.
  • a tumor-specific cellular immunity is elicited by expressing and administering a polypeptide that is tumor-specifically expressed on the cell surface and not expressed at all in normal cells on the surface of bifidobacteria. It is thought that the growth of is suppressed.
  • cancer antigens that are specifically expressed on the surface of the tumor and not expressed at all in normal cells have been reported so far, for example, in MAGE, MART-1, and breast cancer in malignant melanoma HER2 / neu, CEA in colorectal cancer, WT1, NY-ESO-1 and PSMA in various leukemias and various cancers are well known, but not limited thereto.
  • the cancer antigen can be identified by in-silico or wet experiments. It is possible to perform primary screening for cancer antigens by identifying genes that are presumed to be expressed on the cell surface in Insilico, creating microarrays, and examining expression patterns.
  • Presence or absence of cancer antigen gene expression can be confirmed by preparing mRNA and performing RT-PCR.
  • antibodies are prepared and protein expression is performed by methods well known to those skilled in the art, such as Western blotting and ELISA. Can be confirmed.
  • cancer antigen proteins are expressed on the cell surface of bifidobacteria and can be used orally for cancer prevention and treatment as a cancer vaccine.
  • Example 1 Design of HCV NS3 polypeptide gene for surface expression of bifidobacteria
  • NS3 derived antigen peptide at the N-terminal and C-terminal of the base domain based on the NS3 linker site (positions 1196 to 1215) and upstream ⁇ - ⁇ - ⁇ domain (positions 1216 to 1350) of the HCV-1b polypeptide
  • Two amino acid sequences shown in FIG. 2 were designed to be linked.
  • Amino acid sequence 1 (> 1: SEQ ID NO: 23 in FIG. 2) links a region containing QSFLATCINGVCVCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) to the N-terminal side of the base domain, and the C-terminal side.
  • EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7)
  • KLSALGVNA positions 1406 to 1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9
  • VATALLMTGYTGDFDSVID (positions 1435 to 1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10) are connected in this order.
  • Amino acid sequence 2 (> 2 in FIG. 2: SEQ ID NO: 24) links a region containing QSFLATCCINGVCVCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) to the N-terminal side of the base domain, and the C-terminal side. Is linked to a region containing EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7).
  • the base domain is a region corresponding to positions 1196 to 1350 of the HCV-1b type antigen polypeptide, and the base domain itself is ETTMRSPVFTDNSTPPAVP (positions 1202 to 1220, CD4 epitope 2: SEQ ID NO: 13), ITYSTYGK (1291) Positions 1298, CD8 epitope 3: SEQ ID NO: 6), and GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG (positions 1303-1330, CD4 epitope 3: SEQ ID NO: 14).
  • Example 2 Preparation of NS3 protein surface expression transformed bifidobacteria
  • a gene matched to the codon usage frequency of Bifidobacterium http://www.kazusa.or.jp/codon/
  • Sequences 1 and 2 SEQ ID NOs: 25 and 27, respectively; the corresponding amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 26 and 28, respectively
  • the respective gene fragments were totally synthesized (the former “ Long type ", the latter also called” short type "). The total synthesis of gene fragments was commissioned to GenScript.
  • the obtained gene fragment was treated with XhoI and SalI, and inserted into a recombinant plasmid pJT101 (Patent Document 4 and Non-Patent Document 4) similarly treated with XhoI and SalI.
  • the plasmid pJT101 contains a GLBP gene (SEQ ID NOs: 1 and 2: Patent Document 4 and Non-patent Document 4) derived from Bifidobacterium longum JCM1217 (ATCC 15707). Through the above insertion, a “long” or “short” gene fragment was ligated downstream of the GLBP gene.
  • a forward primer (5'-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3 ': SEQ ID NO: 29) and reverse primer (5'-TTTCATCTGTGCATAGTCGACTTCAGGTGTTGCAGTCGA-3': SEQ ID NO :) using a plasmid containing a fusion gene of "long" gene downstream of the GLBP gene as a template PCR was performed using the primer pair of 30).
  • a forward primer (5'-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3 ': SEQ ID NO: 29) and reverse primer (5'-TTTCATCTGTGCATATTCACAGCGGGATGGCCTTGCCGTAGA-3': PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 31).
  • E. coli-Bifidobacterium shuttle vector pJW241 (Patent Document 4 and Non-Patent Document 4) was cleaved with NdeI, and the resulting PCR amplified fragment was cloned into this site by the In-fusion method (Clontech Laboratories, Inc .: Clontech Laboratories, Inc. .).
  • the surface expression vector containing the “long” fusion gene thus obtained was named pJW2165, and the surface expression vector containing the “short” fusion gene was named pJW2164.
  • the resulting surface expression vector pJW2165 or pJW2164 was introduced into Bifidobacterium longum 105-A strain (Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 61, pages 1211-1212, 1997) by electroporation. As a result, transformed Bifidobacterium longum was obtained.
  • the transformed Bifidobacterium longum introduced with pJW2165 was named Bifidobacterium longum 2165
  • the transformed Bifidobacterium longum introduced with pJW2164 was named Bifidobacterium longum 2164.
  • Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum 2012) expressing only GLBP was produced.
  • Example 3 NS3 protein surface expression of transformed Bifidobacterium longum
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • each lane is as follows: Molecular weight marker; 1. Wild type Bifidobacterium longum 245; 2. Bifidobacterium longum 2164; Bifidobacterium longum 2165.
  • the molecular weight of the GLBP-NS3 fusion protein is 66 kDa for Bifidobacterium longum 2164 and 69 kDa for Bifidobacterium longum 2165, and the position of each band in FIG. 3 is indicated by an arrow.
  • Both Bifidobacterium longum 2164 and Bifidobacterium longum 2165 can confirm a band at the target position (lanes 2 and 3, respectively) and express a protein with a molecular weight as designed. I understood.
  • Bifidobacterium longum 2164 and Bifidobacterium longum 2165 were immunostained.
  • Bifidobacterium longum 2164 and Bifidobacterium longum 2165 cultured anaerobically in GAM medium overnight were washed, diluted with PBS, and blocked with 1% -BSA / PBS at 37 ° C. for 30 minutes. . 50 times diluted rabbit anti-NS3 IgG (operon), 1000 times diluted Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H + L) (Invitrogen) in the order of 1 hour each at 37 °C Fluorescence development was observed.
  • Example 4 Oral administration of transformed Bifidobacterium longum to mice
  • the transformed Bifidobacterium longum was anaerobically cultured overnight in GAM medium and diluted with PBS to 5 ⁇ 10 8 CFU / ml. 100 ⁇ l of this bacterial solution was orally administered intragastrically to 8-week-old female BALB / C mice. Administration was performed 3 times a week for 4 weeks.
  • a PBS administration group, a wild type Bifidobacterium longum 245 administration group, and a Bifidobacterium longum 2012 administration group expressing only GLBP were used, and administration was performed under the same conditions.
  • the tail vein was collected on days 0, 14, and 28, and feces were collected.
  • the mice were anesthetized and then euthanized by cervical dislocation, dissected and the spleen removed.
  • NS3 antigen-specific IgA antibody contained in stool was detected by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent
  • Feces were dissolved in 5% skim milk / 0.1 mg / ml soybean trypsin inhibitor / 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride / PBS to prepare a fecal solution.
  • a 96-well immunoplate (NUNC) was coated with GST-NS3 antigen peptide and blocked with 5% skim milk / PBS at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. 5 shows the results of ELISA method for examining NS3 antigen-specific IgA antibody contained in stool. Symbols in FIG. 5 are as follows: Black square: PBS administration group; Black triangle: Bifidobacterium longum 245 administration group; Black circle: Bifidobacterium longum 2012 administration group; White triangle: Bifidobacteria Um longum 2164 administration group; and white circle: Bifidobacterium longum 2165 administration group. * Indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • the Bifidobacterium longum 2165 administration group had a significantly higher absorbance (OD 450) than the PBS, Bifidobacterium longum 245, and Bifidobacterium longum 2012 administration groups. (P ⁇ 0.05). On the other hand, although no significant difference was observed, Bifidobacterium longum 2164 also showed a slightly higher value.
  • FIG. 6 shows the result of ELISA method for examining NS3 antigen-specific IgG antibody contained in serum.
  • the symbols in FIG. 6 are the same as those in FIG. ** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01.
  • the amount of IgG antibody increased with time
  • PBS Bifidobacterium longum 245, Bifidobacterium longum 2012 on day 14 and 28 The value was significantly higher than that of the administration group (p ⁇ 0.01).
  • Bifidobacterium longum 2164 and Bifidobacterium longum 2165 were confirmed to induce local mucosal immunity and systemic immune response by oral administration.
  • the spleen was subdivided using a 70 ⁇ l cell strainer (BD), hemolyzed with 0.83% NH 4 Cl / PBS, and then washed.
  • the cells were suspended in 10% FBS / RPMI medium to 4 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in a 96-well microplate for 3 days while stimulating with 2 ⁇ g of GST-NS3 antigen peptide.
  • mouse IFN- ⁇ Quantikine ELISA Kit R & D
  • the amount of interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) in the culture supernatant of spleen cells was measured.
  • Results are shown in FIG.
  • the vertical axis in FIG. 7 represents the amount of IFN- ⁇ (pg / ml) in the culture supernatant of spleen cells.
  • Bifidobacterium longum 245 administration group Bifidobacterium longum 2012 administration group
  • Bifidobacterium longum 2164 administration group Bifidobacterium longum 2165 administration group
  • white bar graph represents NS3 antigen stimulation.
  • IFN- ⁇ production was increased by antigen stimulation, and a significant difference was observed compared to the non-stimulated control group cultured under the same conditions (p ⁇ 0.01).
  • In the Bifidobacterium longum 2164 administration group no significant difference was observed, but the IFN- ⁇ production increased due to antigen stimulation.
  • Example 5 Design 2 of HCV NS3 polypeptide gene for surface expression of bifidobacteria
  • the amino acid sequence shown in FIG. 8 was designed so that the NS3-derived antigen peptide was linked to the N-terminus and C-terminus of the base domain based on the NS3 ⁇ -helical domain (positions 1510 to 1657) of the HCV-1b type polypeptide.
  • the amino acid sequence of FIG. 8 (SEQ ID NO: 32) links a region containing QSFLATCINGVCWTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) on the N-terminal side of the base domain, and EIPFYKKAI (1372) on the C-terminal side. Position-1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), KLSALGVNA (positions 1406-1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9) and VATALLMTGYTGDFDSVIDC (positions 1435-1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10) in this order Concatenate the areas to be included.
  • the base domain is a region corresponding to positions 1510 to 1657 of the HCV-1b type antigen polypeptide, and the base domain itself is TPAETSVRLRAYLNTPG (positions 1531 to 1547, CD4 epitope 4: SEQ ID NO: 15), and GAVQNEVTL (1629). Positions 1637, CD8 epitope 8: SEQ ID NO: 11).
  • the gene sequence (SEQ ID NO: 33; the corresponding amino acid sequence is SEQ ID NO: 34) matched to the codon usage frequency of Bifidobacterium (http://www.kazusa.or.jp/codon/) Designed).
  • Example 6 Design 3 of HCV NS3 polypeptide gene for bifidobacteria surface expression
  • the amino acids shown in FIG. 9 are linked so that the NS3-derived antigen peptide is linked to the N-terminus and C-terminus of the base domain based on the ⁇ 3- ⁇ - ⁇ -domain (positions 1351 to 1509) downstream of NS3 of the HCV-1b polypeptide.
  • the sequence was designed. In the base domain, 3 amino acids from positions 1351 to 1353 were deleted, and two K (lysine) at positions 1398 to 1399 were replaced with Q (glutamine: 1398 position) and L (leucine: 1399 position).
  • the amino acid sequence of FIG. 9 (SEQ ID NO: 35) links a region containing QSFLATCINGVCVCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4) to the N-terminal side of the base domain, and TPAETSVRLRAYLNTPG (1531) to the C-terminal side. Position to 1547, the region containing CD4 epitope 4: SEQ ID NO: 15) is linked.
  • the base domain itself includes EIPFYGKAI (positions 1372 to 1380, CD8 epitope 4: SEQ ID NO: 7), LIFCHSKQL (positions 1391 to 1399, CD8 epitope 5 with KK replaced by QL: SEQ ID NO: 21), KLSALGVNA (1406 Positions 1414, CD8 epitope 6: SEQ ID NO: 9), and VATALLMTGYTGDFDSVID (positions 1435-1454, CD8 epitope 7: SEQ ID NO: 10).
  • the gene sequence (SEQ ID NO: 36; corresponding amino acid sequence is SEQ ID NO: 37) in accordance with the codon usage frequency of Bifidobacterium (http://www.kazusa.or.jp/codon/) Designed).
  • Example 7 Design 4 of HCV NS3 polypeptide gene for Bifidobacterium surface expression
  • NS3-derived antigenic peptide at the C-terminal of the base domain based on the ⁇ -barrel domain (positions 1027 to 1195) of NS3 in which a part of the NS4A region of the HCV-1b polypeptide (positions 1677 to 1690) is linked to the N-terminus
  • the amino acid sequence shown in FIG. 10 was designed so that In the basal domain, the amino acids at positions 1027-1028 and amino acids 1195 are deleted, and the two Rs (arginine) at positions 1144-1145 are replaced by Q (glutamine: position 1144) and L (leucine: position 1145). Replaced.
  • the amino acid sequence of FIG. 10 is ETTMRSPVFTDNSTPPAVP (positions 1202 to 1220, CD4 epitope 2: SEQ ID NO: 13), ITYSTYGK (positions 1291 to 1298, CD8 epitope 3: sequence) on the C-terminal side of the base domain. No.
  • the NS4A region and the base domain based on the NS3 ⁇ -barrel domain itself include QSFLATCINGVCWCTVYHGAG (positions 1067 to 1086, CD8 epitope 1: SEQ ID NO: 4), LYLVTRHAVDPVRRQLGDSR (positions 1130 to 1149, QR of CD4 epitope 1) ): SEQ ID NO: 22), and LLCPSGHVV (positions 1169 to 1177, CD8 epitope 2: SEQ ID NO: 5).
  • the gene sequence (SEQ ID NO: 39; the corresponding amino acid sequence is SEQ ID NO: 40) matched to the codon usage frequency of Bifidobacterium (http://www.kazusa.or.jp/codon/) Designed).
  • Example 8 Preparation of transformed EL4 cells for subcutaneous tumor Since mice were not infected with HCV, subcutaneous tumors were created in the mice, and the following experiment was conducted to evaluate the effect of the vaccine of the present invention by its growth inhibitory effect.
  • plasmid pSG5 / NS3 / 4A a fragment encoding NS3 / 4A was excised with BamHI and inserted into the BamHI site of plasmid pBApo-CMVCMNeo (TAKARA) to obtain plasmid pBApo-CMV Neo / NS3 / 4A ( FIG. 11).
  • This plasmid pBApo-CMV Neo / NS3 / 4A was prepared and introduced into EL4 cells (mouse lymphoma cells) using TransIT-293 Transfection Reagent (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Transformed EL4 cells were selected with a medium containing 800 ⁇ g / ml of G418, and a clonal strain of transformed EL4 cells (NS3 / 4A-EL4 cells) was obtained by the limiting dilution method.
  • RT-PCR and Western blotting were performed to confirm that the cells were transformed cells.
  • RT-PCR is carried out by preparing cDNA from total RNA by a conventional method, using a primer (SEQ ID NO: 41: CGGCCCTCAGGCATGTTCGATTCTTC, SEQ ID NO: 42: CCGGACAAGATGATCCTGCCCACAATG), incubating at 94 ° C. for 120 seconds, 98 ° C., 10 seconds, 30 cycles of 64 ° C, 30 seconds, 68 ° C and 40 seconds were performed to amplify the DNA fragment encoding NS3 / 4A, agarose gel electrophoresis, staining with ethidium bromide, and confirming the amplified DNA fragment under UV (FIG. 12).
  • 1 is the plasmid pSG5 / NS3 / 4A
  • 2 is the transformed EL4 cell
  • 3 is the Mock-infected EL4 cell
  • the target band was confirmed in 1 and 2.
  • Western blotting was performed by fractionating the cell extract by SDS-PAGE, transferring it to a nylon membrane, blocking, and then detecting NS3 / 4A protein with an antibody (FIG. 13).
  • FIG. 13 a 73 kDa NS3 / 4A protein band was detected in transformed EL4 cells (lane 2).
  • no NS3 / 4A protein band was detected in control lane 3. This confirmed that it was a clonal strain of NS3 / 4A-EL4 cells.
  • Example 9 Examination of antitumor effect by oral administration of B. longum 2165)
  • the body weight was measured the day before subcutaneous inoculation (Day 0), and NS3 / 4A-EL4 cells confirmed to be a transformant were transplanted subcutaneously into C57BL / 6N mice.
  • NS3 / 4A-EL4 cells confirmed to be a transformant were transplanted subcutaneously into C57BL / 6N mice.
  • 1 ⁇ 10 6 cells were embedded in 200 ⁇ l of RPMI1640 & Matrigel and inoculated subcutaneously.
  • Day 1 an oral administration experiment of bifidobacteria expressing NS3 / 4A protein on the surface was started.
  • the tumor volume was remarkably increased, but in the group administered with 2165 (GLBP-NS3) and inactivated 2165 (GLBP-NS3), the tumor volume was significantly increased. The increase was suppressed.
  • GLBP-NS3 gene-expressing bifidobacteria are effective in suppressing the growth of tumor cells that express NS3 / 4A protein on the cell surface. This effect was observed not only in live bacteria but also in inactivated bacteria. Therefore, it is thought that it has an effect as an antigen irrespective of the life and death of bifidobacteria.
  • an immunogenic polypeptide can be expressed and presented on the cell surface of Bifidobacterium.
  • NS3-specific immunity can be induced in an animal in which bifidobacteria presenting, for example, hepatitis C virus antigen polypeptide is orally administered to the surface layer of bifidobacteria, and thus the vaccine composition (for example, it can be used as an oral vaccine.
  • a vaccine composition is expected to increase the cure rate of HCV chronic infection in combination with existing interferon therapy and the like.

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Abstract

　ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、該遺伝子は、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、該免疫原性ポリペプチドが、所定の基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含み、該少なくとも１つの抗原ペプチドは、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。本発明のビフィズス菌表層発現遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことができる。

Description

免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌
　本発明は、免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌、より詳細には、例えば、Ｃ型肝炎ワクチン組成物を製造することができる免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌に関する。
　Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のキャリアは世界中で１億７０００万人以上おり、約７０％が慢性肝炎に移行し、肝硬変や肝癌のリスクに曝されている。日本にも約２００万人のキャリアが存在し、そのうち約８０％が１ｂ型に感染している。
　Ｃ型肝炎の治療として、主にインターフェロン治療が行なわれている。しかし、ペグ化インターフェロンαと抗ウイルス薬のリバビリンとを組み合わせた併用療法では、１型ウイルス排除率が５０％以下であること、および治療期間が長い上に副作用が重いことから、より有効な治療薬の開発および治療法の確立が必要である。
　ＨＣＶは、フラビウイルス科に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、４種の構造タンパク質領域（Ｃ－Ｅ１－Ｅ２－Ｐ７）および６種の非構造タンパク質領域（ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂ）から構成される。このうち、ＮＳ３タンパク質は、Ｎ末端側の３分の１にセリンプロテアーゼ活性を有し、Ｃ末端側の３分の２がＲＮＡヘリカーゼ活性を有している。このようなプロテアーゼ－ヘリカーゼの２つの活性を有するＮＳ３タンパク質について、立体構造の解明のためにＸ線結晶解析によりその立体構造が調べられている（非特許文献１）。
　ＨＣＶ感染が治癒した患者において、ＮＳ３特異的な強い免疫応答がみられた（非特許文献２）。また、ＮＳ３タンパク質は遺伝学的に保存性が高く、多数の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープが同定されている（非特許文献３）。
　Ｃ型肝炎の予防または治療のためのＮＳ３タンパク質由来ポリペプチドの利用が報告されている。例えば、特許文献１には、ＨＣＶのＮＳ３領域のアミノ酸１１８８～１４６３位に由来する少なくとも８アミノ酸連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつＴ細胞刺激性エピトープを含むポリペプチドが記載されている。特許文献２には、ＨＣＶコア配列の少なくとも一部分に連結されたＨＣＶ　ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部を含むＨＣＶ融合タンパク質を発現する酵母細胞を、ワクチンのベースとすることが記載されている。特許文献３には、ＮＳ３などの全長タンパク質または免疫原性タンパク質を発現し、分泌する弱毒化リステリア・モノサイトゲネスなどの細菌をワクチンプラットフォームとすることが記載されている。
　他方、遺伝子組換えによる形質転換微生物を経口ワクチンとして用いる方法が着目されている。ビフィドバクテリウム属微生物（本明細書においては、「ビフィズス菌」ともいう）の細胞膜に存在するＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（本明細書においては、「ＧＬＢＰ」ともいう）を用いてサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）由来のフラジェリンを表層発現させた形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）をマウスに経口投与することにより、血中にフラジェリン特異的抗体が産出され、腸管粘膜免疫を介して全身性免疫が誘導され、そしてネズミチフス菌の経口感染によるマウスの致死作用が効果的に抑制されることが報告されている（非特許文献４および特許文献４）。また、サルモネラ菌、コレラ菌（Vibrio cholerae）、または赤痢菌（Shigella dysenteriae）由来のフラジェリンを細胞内または分泌発現する形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムを含有する耐酸性カプセル製剤からなる経口ワクチンも報告されている（特許文献５）。
特表平９－５０４５３４号公報 特表２００８－５１６６１０号公報 特表２０１１－５２９０７７号公報 国際公開第２０１１／０３４１８１号 国際公開第２００８／１１４８８９号
Structure, 7巻、1353-1363頁、1999年 J. Gene. Med., 10巻、177-186頁、2008年 J. Clin. Invest., 95巻、521-530頁、1995年 Vaccine, 28巻、6684-6691頁、2010年
　本発明は、ＨＣＶ感染の治療のために、より有効な治療薬を提供することを目的とする。本発明はさらに、経口投与によりＨＣＶ感染による疾患の治療に有効な治療薬を提供することも目的とする。本発明はまた、ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するための方法を提供することも目的とする。
　本発明者らは、ＨＣＶ複製に関する領域である非構造タンパク質３（non-structural protein 3：ＮＳ３）の免疫原性に着目し、ＮＳ３タンパク質由来のＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープを含む合成ポリペプチドを設計することにより、ＨＣＶ抗原ポリペプチドを表層に発現および提示するビフィズス菌を作製すること、ならびにこのＨＣＶ抗原ポリペプチド表層発現ビフィズス菌を経口投与した動物において、ＮＳ３特異的な免疫応答を誘導（すなわち、ＮＳ３特異的な腸管粘膜免疫と全身性液性免疫、ならびに細胞性免疫の誘導）することに成功した。さらに、このような合成ポリペプチドの設計を応用することにより、免疫原性ポリペプチドに対して広範に利用可能なビフィズス菌表層発現遺伝子を提供することができることを見出した。
　本発明は、ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子を提供し、
　該遺伝子は、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
　該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含むＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
　該基盤ドメインが、
（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
（４）配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群より選択される１つ以上を含み、
　該抗原ペプチドが、配列番号４～１５のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号４～１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つであり、
　該少なくとも１つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。
　１つの実施態様では、
（１）前記基盤ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（２）前記基盤ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（３）前記基盤ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；または
（４）前記基盤ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドドを含み、Ｃ末端側に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する。
　１つの実施態様では、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、該ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質の３’末端側に位置している。
　本発明はまた、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミドを提供する。
　本発明はさらに、上記のプラスミドを保持し、上記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。
　本発明はさらに、ゲノム中に、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、上記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。
　本発明はまた、上記Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを細胞表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、Ｃ型肝炎ワクチン組成物を提供する。
　１つの実施態様では、上記ワクチン組成物は、経口ワクチンである。
　本発明はさらに、ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドを設計する方法を提供し、該方法は、
　立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを選択する工程；ならびに
　該少なくとも１つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
を含む。
　１つの実施態様では、上記基盤ドメインは、少なくとも１つのＣＤ４エピトープもしくはＣＤ８エピトープまたはその両方を含む。
　本発明はまた、癌細胞の表層で特異的に発現するポリペプチドを、細胞表層で発現する形質転換ビフィズス菌を提供する。
　１つの実施態様では、上記形質転換ビフィズス菌は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。
　本発明はまた、上記形質転換ビフィズス菌を含む癌ワクチンを提供する。
　本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に免疫原性ポリペプチドを発現および提示することができる。さらに、本発明によれば、例えば、ビフィズス菌の表層に免疫原性のＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを提示するビフィズス菌を経口投与した動物において、Ｃ型肝炎ウイルス抗原に特異的な免疫を誘導することができ、よってワクチン組成物（例えば、経口ワクチン）として利用することができる。
ＨＣＶ－１ｂ型のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０８１２０．１）のＮＳ３タンパク質全長領域を含むアミノ酸配列を示す。 ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のリンカー部位およびＮ末端側のβ－α－βドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの例となるアミノ酸配列１および２を示す。 野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５における合成ＮＳ３タンパク質の発現に関するウエスタンブロットの結果を示す写真である。 ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５（１、４）、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４（２、５）、およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５（３、６）の明視野顕微鏡写真（１～３）および蛍光顕微鏡写真（４～６）を示す。 ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体の経日変化を示すグラフである。 ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス血清に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体の経日変化を示すグラフである。 ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス脾臓細胞における、ＮＳ３抗原を刺激の有無によるIFN-γ量の比較を示すグラフである。 ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のα－ヘリカルドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。 ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のＣ末端側β－α－β－ドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。 ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ４Ａ領域の一部をＮ末端に連結したＮＳ３のβ－バレルドメインに基づく基盤ドメインのＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。 プラスミドｐＢＡｐｏ－ＣＭＶＮｅｏ／ＮＳ３／４Ａの構築を示す。 ＲＴ－ＰＣＲによるＮＳ３／４Ａ断片の検出を示す。 ウェスタン・ブロッティングによるＮＳ３／４Ａの検出を示す。 ＮＳ３／４Ａを発現するＥＬ４細胞の増殖抑制に関するＮＳ３発現ビフィズス菌ワクチンの効果を示す。
　（ビフィズス菌）
　本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・パーブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム（B. pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナル（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・セクラル（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカードビ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B. thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム（B. thermophilum）が挙げられる。また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。
　これらの菌株は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B．longum）JCM1217（ATCC15707）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）ATCC11863、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61巻、1211-1212頁、1997年）などが挙げられる。
　（ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質）
　ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（ＧＬＢＰ）は、ビフィズス菌が有するラクト－Ｎ－ビオース（すなわち、Ｎ－アセチル－３－Ｏ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－Ｄ－グルコサミン）およびガラクト－Ｎ－ビオース（すなわち、Ｎ－アセチル－３－Ｏ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－Ｄ－ガラクトサミン）を輸送するＡＢＣタンパク質（ATP Binding Cassette protein）ファミリーに属する膜タンパク質である。ＡＢＣタンパク質とは、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のＡＢＣタンパク質が存在している。そのため、ＡＢＣタンパク質であるＧＬＢＰは、ＧＬＢＰ表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217（ATCC15707）株由来のＧＬＢＰは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する（対応する塩基配列は配列番号１に示す）。
　ＧＬＢＰの構造は天然に存在するＧＬＢＰに限定されず、ビフィズス菌の細胞表層に発現する能力を有していれば、該ＧＬＢＰを構成するアミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。
　（免疫原性ポリペプチド）
　本発明においては、ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドは、立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインと、少なくとも１つの抗原ペプチドとで構成される。該少なくとも１つの抗原ペプチドは、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。
　「免疫原性」とは、抗原が抗原特有のＴ細胞応答（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）を誘導することができることを意味する。
　基盤ドメインとしては、立体構造を保持し（例えば、結晶構造上で二次構造（例えば、β－シートまたはα－ヘリックス）を形成する）、かつ細胞分泌能を有する（例えば、連続した塩基性アミノ酸残基を含まない、または含まないように改変された）領域を用いることができる。立体構造を保持するドメインとしては、α－β－αドメイン、β－バレルドメイン、α－ヘリックスドメインなどが挙げられる。タンパク質の立体構造は、例えば、当業者が通常用いるＸ線結晶構造解析によって決定することができ、基盤ドメインは、公知または推定のＸ線構造解析情報に基づいて選択することができる（例えば、Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；Bioinformatics, 22巻, 195-201頁, 2006年；およびProtein Science, 2巻, 305-314頁, 1993年）。基盤ドメインは、好ましくは、ドメイン内に少なくとも１つのＣＤ４エピトープおよび／またはＣＤ８エピトープを含む。
　「細胞分泌能」とは、ポリペプチド（タンパク質）が、ビフィズス菌の細胞膜上の輸送装置によって細胞外に分泌される能力を有することを意味する。細胞分泌能を有するには、領域が塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）を２アミノ酸以上連続して含まない（すなわち、領域中の塩基性アミノ酸の前および後のアミノ酸が、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸である）ことが望ましい。領域中に２アミノ酸以上連続する塩基性アミノ酸が含まれる場合、以下に説明するように、別のアミノ酸と置換することによって、当該領域を改変することもできる。
　「抗原ペプチド」とは、抗原性を発揮する任意のペプチドを意味する。抗原性を発揮するペプチドは、ＣＤ４エピトープ（ヘルパーＴ細胞認識エピトープ）およびＣＤ８エピトープ（細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ）を包含する。このようなペプチドは、例えば、当業者が通常用いるエピトープマッピングによって決定し、入手することができる。
　抗原ペプチドは、所望の特性（特に抗原性）を発揮する能力を有する限り、エピトープを構成するアミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。例えば、抗原ペプチドは、エピトープが由来する（すなわち、本来存在する）タンパク質内の該エピトープのＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１～５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該エピトープのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該エピトープのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。
　基盤ドメインが由来する本来のタンパク質の対応する立体構造領域のアミノ酸配列内に同種または異種の塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）が２アミノ酸以上連続する場合、望ましい作用（基盤ドメインの立体構造および分泌能）を奏するように別のアミノ酸に置換され得る。２アミノ酸以上連続する塩基性アミノ酸は全て置換される必要はなく、その中の１つの塩基性アミノ酸を除いて残りが置換されればよい。置換後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸以外であればよく、例えば、アラニン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、好ましくは、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、より好ましくは、グルタミンとロイシンとの順に配列されるように置換され得る。基盤ドメインは、そのドメインの立体構造を保持することができ、かつ細胞分泌能を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。また、複数種の基盤ドメインを用いてもよい。基盤ドメインが由来する（すなわち、本来存在する）タンパク質内の基盤ドメインのＮ末端および／またはＣ末端の領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１～５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該基盤ドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該基盤ドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。
　上記１以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する変異体は、好ましくは、保存的に改変された変異体である。「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一アミノ酸配列をコードする核酸、および１つ以上の同類置換を有するアミノ酸配列を包含する。同類置換の例は、以下のグループのうちの１つにおけるアミノ酸と同グループの別のアミノ酸の交換である：
（１）疎水性：イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、トリプトファン、グリシン；
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン；および
（７）小さなアミノ酸：グリシン、アラニン、セリン。
　そのような変異体のアミノ酸配列は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有する。「配列同一性パーセント」および「配列同一性％」という用語は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列の比較もしくはアライメントによって見つけられる配列同一性の割合を意味する。同一性パーセントは、配列を並べ、２つの整列配列間の一致の正確な数を計算し、短配列の長さで割り、その結果に１００をかけることによって２つの分子間の配列情報の直接比較によって決定され得る。同一性パーセントの計算のためのアルゴリズムは、スミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムである（例えば、Proteins, 48巻、367-376頁、2002年；Bioinformatics, 17巻、327-337頁、2001年）。
　抗原ペプチドは、基盤ドメインと組み合わせてビフィズス菌細胞表層に発現および提示されることにより、免疫原性を発揮できる。少なくとも１つの抗原ペプチドは、基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の一方または両側に付加され得る。例えば、付加される抗原ペプチドが１つより多い場合、基盤ドメインは、各抗原ペプチドをその片側または両側に付加し得る。基盤ドメインがエピトープ領域を有する場合、例えば、連結される抗原ペプチドは、該抗原ペプチドによるエピトープと該基盤ドメイン内のエピトープとによって免疫原性を発揮できるように選択され得る。
　以下、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドの例を挙げて説明する。
　図１は、ＨＣＶ－１ｂ型のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０８１２０．１）のＮＳ３タンパク質全長領域を含むアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図１中の１０２７位～１６５７位のアミノ酸配列がＮＳ３の全長である（本明細書中において、アミノ酸の位置番号について特に記載しない限り、ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチド全長における位置に基づく）。ＮＳ３タンパク質は、β－バレルドメイン（１０２７位～１１９５位）、リンカー部位（１１９６位～１２１５位）、２つのβ－α－β－ドメイン（Ｎ末端側ドメイン１２１６位～１３５０位とＣ末端側ドメイン１３５１位～１５０９位）、およびα－ヘリカルドメイン（１５１０位～１６５７位）から形成されている（非特許文献１）。
　図１は、ＮＳ３タンパク質領域におけるＣＤ８エピトープ（図１中、下線で示す）およびＣＤ４エピトープ（図１中、二重下線で示す）の分布もまた示す。図１中、ＣＤ８エピトープは、
　１０６７位～１０８６位：ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、
　１１６９位～１１７７位：ＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）、
　１２９１位～１２９８位：ＩＴＹＳＴＹＧＫ（ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、
　１３７２位～１３８０位：ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、
　１３９１位～１３９９位：ＬＩＦＣＨＳＫＫＫ（ＣＤ８エピトープ５：配列番号８）、
　１４０６位～１４１４位：ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、
　１４３５位～１４５４位：ＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）、および
　１６２９位～１６３７位：ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）であり、ＣＤ４エピトープは、
　１１３０位～１１４９位：ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧＤＳＲ（ＣＤ４エピトープ１：配列番号１２）、
　１２０２位～１２２０位：ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、
　１３０３位～１３３０位：ＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）、および
　１５３１位～１５４７位：ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）である。
　Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドの基盤ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる：
（１）ＨＣＶ－１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のリンカー部位（１１９６位～１２１５位）およびＮ末端側β－α－βドメイン（１２１６位～１３５０位）に基づく基盤ドメイン（図２）
ＶＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＶＤＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＡＰＩＴＹＳＴＹＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬＡＴＡＴ（配列番号１６）；
（２）ＨＣＶ－１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のα－ヘリカルドメイン（１５１０位～１６５７位）に基づく基盤ドメイン（図８）
ＧＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＦＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＫＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＦＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴ（配列番号１７）；
（３）ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のＣ末端側β－α－β－ドメイン（１５１０位～１６５７位）に基づく基盤ドメイン（但し、１３５１位～１３５３位の３アミノ酸が欠失し、そしてＮＳ３の下流側β－α－β－ドメインの１３９８～１３９９位の２つのＫ（リジン）をＱ（グルタミン：１３９８位）、Ｌ（ロイシン：１３９９位）に置換したもの）（図９）
ＳＶＴＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹＧＫＡＩＰＬＥＡＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＱＬＣＤＥＬＡＡＫＬＳＡＬＧＶＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＩＩＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＶＰＱＤＡＶＳＲＳＱＭＱＧＲＴＧＲＧＲＧＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳ（配列番号１８）；および
（４）ＮＳ４Ａ領域の一部（例えば、１６７７位～１６９０位）をＮ末端に連結したＮＳ３タンパク質のβ－バレルドメイン（１０２７位～１１９５位）に基づく基盤ドメイン（但し、１０２７～１０２８位の２アミノ酸および１１９５位のアミノ酸が欠失し、そして１１４４～１１４５位の２つのＲ（アルギニン）をＱ（グルタミン：１１４４位）、Ｌ（ロイシン：１１４５位）に置換したもの）（図１０）
ＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤ（配列番号１９：図１０中のＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧ（配列番号２０）はＮＳ４Ａ領域に由来する）。
　ビフィズス菌表層発現されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドは、上記基盤ドメイン（１）～（４）の１つ以上を基盤ドメインとして含むことができる。例えば、基盤ドメイン（１）～（４）は、単独または他の１つ以上の基盤ドメインと組み合わせて用いられ得る。
　基盤ドメイン（１）は、例えば、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位～１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位～１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位～１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む。
　基盤ドメイン（２）は、例えば、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位～１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）、およびＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（１６２９位～１６３７位、ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）を含む。
　基盤ドメイン（３）は、例えば、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＬＩＦＣＨＳＫＱＬ（１３９１位～１３９９位、ＣＤ８エピトープ５のＫＫをＱＬに置換したもの：配列番号２１）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を含む。
　基盤ドメイン（４）は、例えば、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲ（１１３０位～１１４９位、ＣＤ４エピトープ１中のＲＲをＱＬに置換したもの：配列番号２２）、およびＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（１１６９位～１１７７位、ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）を含む。
　基盤ドメインのＮ末端側および／またはＣ末端側に、ＨＣＶ抗原ペプチドの少なくとも１つが連結される。該抗原ペプチドは、例えば、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む：
　ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）、
　ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧＤＳＲ（配列番号１２）、
　ＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（配列番号５）、
　ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（配列番号１３）、
　ＩＴＹＳＴＹＧＫ（配列番号６）、
　ＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（配列番号１４）、
　ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）、
　ＬＩＦＣＨＳＫＫＫ（配列番号８）、
　ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）、
　ＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）、
　ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）、および
　ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号１１）。
　上記ペプチドは、ＨＣＶ－１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質に由来するＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープである。ＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープは図１に示すように配置されているが、基盤ドメインに連結される抗原ペプチドのエピトープの種類および個数、基盤ドメインに対する連結させる位置（Ｎ末端側かＣ末端側か）および末端に複数連結させる場合の連結の順序は特に問わない。抗原ペプチドとして、上記基盤ドメイン（１）～（４）のようなエピトープを含む領域を用いることもできる。抗原ペプチドは、基盤ドメインに配置されているエピトープと重複してもよい。例えば、連結される抗原ペプチドは、該抗原ペプチドによるエピトープと基盤ドメイン内のエピトープとによって免疫原性を発揮できるように選択され得る。
　抗原ペプチド内の上記ＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープは、それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。例えば、抗原ペプチドは、上記エピトープが由来する（すなわち、本来存在する）ＮＳ３タンパク質内の該エピトープのＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１～５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該エピトープのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該エピトープのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ抗原ポリペプチドに用いられる抗原ペプチドは、それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、上記ＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープのペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　基盤ドメインとして選択する本来のＮＳ３タンパク質の対応する領域内に塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）が２アミノ酸以上連続する場合、望ましい作用（基盤ドメインの立体構造および細胞分泌能）を奏するように別のアミノ酸に置換され得る。置換後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸以外であればよく、例えば、アラニン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、好ましくは、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、より好ましくは、グルタミンとロイシンとの順に配列されるように置換され得る。
　基盤ドメインは、そのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。基盤ドメインは、基盤ドメインが由来する（すなわち、本来存在する）ＮＳ３タンパク質内の該基盤ドメインが対応する領域のＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１～５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該基盤ドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該基盤ドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ抗原ポリペプチドに用いられる基盤ドメインは、そのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、上記基盤ドメイン（１）～（４）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　基盤ドメイン（１）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側には、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得、そしてＣ末端側には、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれか１つを順不同で含む領域、より好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）を含む領域、あるいは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（１）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図２のアミノ酸配列１および２に示すとおりである（図２中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す）。
　基盤ドメイン（２）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得る。Ｃ末端側には、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれか１つを順不同で含む領域、より好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（２）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図８のアミノ酸配列に示すとおりである（図８中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す）。
　基盤ドメイン（３）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得る。Ｃ末端側には、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位～１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）を含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（３）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図９のアミノ酸配列に示すとおりである（図９中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す；太字の「ＱＬ」は置換後アミノ酸を示す）。
　基盤ドメイン（４）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側には抗原ペプチドを連結せず、Ｃ末端側に、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位～１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位～１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位～１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む基盤ドメイン（１）（またはそのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、上記基盤ドメイン（１）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有する）を含む領域を連結し、さらにＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれかを順不同で含む領域、好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（４）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図１０のアミノ酸配列に示すとおりである（図１０中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す；太字の「ＱＬ」は置換後アミノ酸を示す）。
　（ビフィズス菌表層提示融合タンパク質）
　本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示される免疫原性ポリペプチドは、ＧＬＢＰとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、Ｎ末端からＧＬＢＰおよび目的の免疫原性ポリペプチドの順に連結されている。
　この融合タンパク質を発現するための遺伝子は、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子およびＧＬＢＰをコードする遺伝子を含む（免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子とも称する）。
　目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に位置している。免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子は、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子がＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に連結されている融合遺伝子であってもよく、またはＧＬＢＰをコードする遺伝子と目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子が配置されていてもよい。
　（形質転換ビフィズス菌の調製）
　以下、目的の免疫原性ポリペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順の一例について、説明する。
　１．遺伝子の取得
　ＧＬＢＰをコードする遺伝子および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該ビフィズス菌のＧＬＢＰの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
　例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）のＧＬＢＰをコードする遺伝子は、Acta Crystallographica Section F.，F63巻、751頁、2007年に記載されたビフィドバクテリウム・ロンガムのＧＬＢＰの構造遺伝子配列から入手可能である。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、入手することができる。
　目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、設計したアミノ酸配列から、公知のまたは推定の遺伝子配列情報に基づき、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子配列を決定し、さらに必要に応じて宿主のコドン頻度を考慮して最適化した遺伝子配列を得ることができる。
　例えば、基盤ドメイン（１）に基づく合成タンパク質の例である図２のアミノ酸配列１および２のそれぞれをコードする遺伝子配列１および２は、ビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された塩基配列からなる。遺伝子配列１および２の塩基配列はそれぞれ配列番号２５および２７に示されるとおりである（その対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２８に示す）。
　基盤ドメイン（２）に基づく合成タンパク質の例である図８のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３３に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号３４に示す）。
　基盤ドメイン（３）に基づく合成タンパク質の例である図９のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３５に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号３６に示す）。
　基盤ドメイン（４）に基づく合成タンパク質の例である図１０のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３９に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号４０に示す）。
　このようにして得た遺伝子配列に基づいて、コードする遺伝子は、例えば、公知の化学合成によって得ることができる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機により化学合成する方法が挙げられる。また、取得すべき塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に基づいてプライマーを調製し、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。またさらに、公知塩基配列情報に基づき、その全長または一部を化学合成したＤＮＡまたはポリヌクレオチドをプローブとして、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。
　また、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、公知のアミノ配列情報からも容易に得ることができる。公知のアミノ配列情報から上記の各タンパク質をコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、公知のアミノ配列をコードする遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって上記ｃＤＮＡライブラリーなどから目的とする遺伝子を増幅する方法、または適切なベクターに組込んだ遺伝子と、上記各タンパク質をコードする遺伝子の一部あるいは全域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などが挙げられる。
　上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、上記のようにして取得した遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７～１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、約０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡが挙げられる。上記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には、上記公知塩基配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
　２．免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子およびビフィズス菌形質転換用ベクターの調製
　上記のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子から、免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子または該免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを調製する。免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子は、上述したように、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に位置するように調製される。本発明において、組換え体ＤＮＡは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター（例えば、相同組換え型ベクター）であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、ｐＴＢ６、ｐＢＬ６７、ｐＢＬ７８、ｐＮＡＬ８Ｈ、ｐＮＡＬ８Ｍ、ｐＮＡＣ１、ｐＢＣ１、ｐＭＢ１、ｐＧＢＬ８ｂなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＫＫＴ４２７、ｐＲＭ２などが挙げられる。
　発現の安定性および形質転換株の調製のためのＤＮＡの調製の容易さという観点から、上記プラスミドの中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミドと大腸菌のプラスミドとから合成された複合プラスミドが好ましい。
　発現ベクターは、形質転換株を選択する観点から、抗生物質耐性、アミノ酸要求性などの選択マーカーを有することが好ましい。
　発現ベクターは、ＧＬＢＰと目的の免疫原性ポリペプチドとの融合タンパク質の発現のために、または発現に有利となるように、調節配列を付加したものが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが挙げられる。これらの調節配列は、ビフィズス菌で発現するものであれば、その由来は特に制限はない。
　プロモーター配列としては、ビフィズス菌で発現するものであれば特に制限はない。発現効率の観点からは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのヒストン様タンパク（ＨＵ）のプロモーター配列、ＬＤＨプロモーターなどが好ましく用いられる。
　また、発現効率を高める観点からは、ターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列としては、上記ＨＵ遺伝子のターミネーター配列が好ましく用いられる。
　その他、必要に応じて、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列などを配置することができる。また、ＧＬＢＰをコードする遺伝子と目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子を配置してもよい。
　このように、上記のプラスミドに、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列などの調節配列、および選択マーカー遺伝子を導入して、クローニングベクターが調製される。選択マーカーとしては、スペクチノマイシン（ＳＰｒ）、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン（ＴＥＴｒ）、カナマイシン（ＫＭｒ）、ストレプトマイシン（ＳＴｒ）、ネオマイシン（ＮＥＯｒ）などの抗生物質耐性マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＥＰ）などの蛍光マーカー；ＬａｃＺなどの酵素などが挙げられる。
　クローニングベクターのプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトを有するリンカーなどを備えていることが好ましい。このようなリンカーを用いることにより、上記融合タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）がプロモーターの下流に、かつ、インフレームで融合タンパク質を発現することができるように、組み込まれる。クローニングベクター用のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＢＬＥＭ１００などが挙げられる（特許第３６４２７５５号公報）。
　例えば、このプラスミドｐＢＬＥＳ１００に上記取得したＨＵプロモーター配列、ＧＬＢＰをコードする遺伝子、および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことにより、融合タンパク質をビフィズス菌の表層に発現するベクターが得られる。このような方法で得られる発現ベクターは、ビフィズス菌の形質転換に用いられる。
　ビフィズス菌表層発現用ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＪＴ１０１（特許文献４および非特許文献４）、および大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターのｐＪＷ２４１（特許文献４および非特許文献４）もまた挙げられる。プラスミドｐＪＴ１０１は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＣＭ１２１７（ＡＴＣＣ１５７０７）由来ＧＬＢＰ遺伝子（配列番号１および２：特許文献４および非特許文献４）を含み、当該ＧＬＢＰ遺伝子の下流に目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことができる。さらに、ｐＪＴ１０１に組み込んだＧＬＢＰ遺伝子および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子の連結物（免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子）を切り出し、大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターｐＪＷ２４１に組み込むこともできる。
　３．融合タンパク質を発現する形質転換ビフィズス菌の調製
　組換え体ＤＮＡ、例えば、上記のように調製された発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入し、形質転換ビフィズス菌を調製することができる。
　形質転換ビフィズス菌の調製には、ビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドを利用する遺伝子相同組換え法を用いることもできる。遺伝子相同組換え法によれば、免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子（例えば、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を連結した融合遺伝子）をビフィズス菌染色体に挿入することが可能である。例えば、ビフィズス菌染色体遺伝子と相同部位を有する温度感受性プラスミド（高温（例えば、４２℃以上）で複製しないプラスミド）が用いられ得る（例えば、Appl. Microbiol. Biotechnol., 95巻、499-509頁、2012年）。より具体的には、ビフィズス菌染色体遺伝子と相同部位を有する温度感受性プラスミドの相同部位間に免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子を挿入し、このプラスミドをビフィズス菌に導入し、高温で培養することにより、遺伝子相同組換えによって当該目的遺伝子が染色体に組み込まれたビフィズス菌を選択的に培養することができる。
　形質転換のための発現ベクターまたはビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドの導入は、公知の方法であればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、０．５～２０ｋＶ／ｃｍ、０．５μｓｅｃ～１０ｍｓｅｃの条件で行うことが可能である。例えば、２～１０ｋＶ／ｃｍ、５０μｓｅｃ～５ｍｓｅｃで行われる。
　形質転換株は、融合タンパク質発現ベクターが有する選択マーカー、ビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドの性質（例えば、温度感受性）などを利用して選択される。形質転換株を培養する培地としては、宿主微生物それぞれに適した培地、例えば、ブドウ糖血液肝臓（ＢＬ）寒天培地、デ・マン－ロゴサ－シャープ（ＭＲＳ）寒天培地、岐阜大学嫌気性（ＧＡＭ）寒天培地、改良ＧＡＭ（ＴＧＡＭ）寒天培地、ブリッグス（Ｂｒｉｇｇｓ）寒天培地、および酵母エキスブドウ糖ペプトン（ＹＧＰ）寒天培地が挙げられる。これらの培地に選択マーカーに応じて抗生物質を添加し、あるいはアミノ酸を欠失または添加し、選択圧とする。
　なお、培養条件は、ビフィズス菌が培養可能な嫌気培養で行うことが好ましい。嫌気性条件下で培養することにより、好気性菌の増殖を防ぐことができる。嫌気性条件下とは、ビフィズス菌が増殖可能な程度の嫌気度を保てる密閉容器中であり、例えば、嫌気チャンバーまたは嫌気ボックスなどにおいて可能な条件が挙げられる。培養温度は、ビフィズス菌を培養可能な温度であればよく、通常、４℃～４５℃、好ましくは１５℃～４０℃、より好ましくは２４℃～３７℃である。
　なお、ＧＬＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を表層提示させるためのベクターだけでなく、ＧＬＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質との融合タンパク質を表層提示させるためのベクターも同時に導入した形質転換ビフィズス菌を調製してもよい。
　融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を、形質転換ビフィズス菌からプラスミドを抽出して、制限酵素処理後に電気泳動で確認してもよく、制限酵素処理断片の配列を直接シーケンスしてもよい。
　得られた形質転換ビフィズス菌の融合タンパク質の発現の確認は、例えば、ウエスタンブロッティング法で行うことができる。まず、形質転換ビフィズス菌を、例えば、非イオン性界面活性剤を用いて、溶菌する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）などが挙げられる。次いで、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）－塩酸緩衝液などを用いて希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、トリス－グリシン－ポリアクリルアミドゲルなどを用いて電気泳動を行う。次いで、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＦ）膜などに転写し、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））と反応させ、さらに蛍光標識を有する２次抗体で反応させることにより、融合タンパク質の発現を確認することができる。
　特に、目的の免疫原性ポリペプチドがビフィズス菌表層に提示されていることは、形質転換ビフィズス菌に対して、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって容易に確認し得る。免疫原性ポリペプチドが表層発現するビフィズス菌の免疫原性は、糞便に含まれる抗原特異的ＩｇＡ抗体（局所的な粘膜免疫の誘導）、血清に含まれる抗原特異的ＩｇＧ抗体（全身性免疫の誘導）、ならびに抗原刺激による細胞内サイトカイン（例えば、インターフェロンγ（IFN-γ））産生の誘導などによって決定することができる。
　目的の免疫原性ポリペプチドの表層提示が確認された形質転換ビフィズス菌は、当業者が通常用いる方法により培養し、回収して、そのまま製剤の製造に用いてもよい。あるいは、乾燥して用いてもよい。乾燥は、凍結乾燥、低温乾燥などの低温処理を行い、腸内環境あるいは培地などの生育条件下に曝したときに生育可能となるような処理方法により行われる。
　形質転換ビフィズス菌は、公知の方法で後処理を行ってもよい。例えば、遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または乳酸配合リンゲル液などの当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。
　（形質転換ビフィズス菌含有ワクチン組成物）
　本発明のワクチン組成物は、上記形質転換ビフィズス菌を有効成分として含有する。例えば、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドを表層発現する形質転換ビフィズス菌の場合、本発明のワクチン組成物は、ＨＣＶ感染に対する適切な免疫応答を十分に誘導する量で、患者に投与され得る。
　ワクチンのために、形質転換ビフィズス菌は、その生菌の冷凍、凍結乾燥、懸濁液、または細胞ペーストとして、あるいは固型媒またはゲルもしくは液状媒と組み合わせて保存され得る。投与製剤の剤型としては、限定されないが、粉末、該凍結乾燥粉末を懸濁した液剤、または該凍結乾燥粉末を封入するカプセル剤などが好ましい。カプセル剤として、例えば、特許文献５に記載の耐酸性カプセルが好適に用いられ得る。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与が挙げられる。経口投与または経鼻投与が好ましく、経口投与がより好ましい。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などが挙げられる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などが挙げられる。
　経口投与用の液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。
　非経口投与用の製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えば、カカオ脂、水添油脂または水添脂肪酸などの担体を用いて調製することができる。
　非経口投与用の製剤のうち噴霧剤は、ヒトの口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である形質転換ビフィズス菌を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。形質転換ビフィズス菌および用いる担体の性質により、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。非経口投与用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。
　本発明のワクチン組成物内の形質転換ビフィズス菌の含有量は、製剤の種類または剤形、投与対象の年齢、性別、体重または疾患状態、投与または摂取の方法、時期または時間などに応じて適宜設定され得る。
　本発明の形質転換ビフィズス菌は、例えば、免疫原性ポリペプチドがＨＣＶ抗原ポリペプチド（例えば、ＮＳ３由来抗原ポリペプチド）である場合、ＨＣＶの感染に対して有効な経口ワクチンとなる。本発明の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチド表層発現形質転換ビフィズス菌を含むワクチン組成物は、ＨＣＶ感染症の予防または治療のいずれにも用いられ得る。さらに、本ワクチン組成物は、既存のインターフェロン療法等と併用することもできる。
　本発明の形質転換ビフィズス菌は、ＮＳ３／４Ａを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制した（実施例９、図１４）。このことは、本発明の形質転換ビフィズス菌がワクチンとして機能し、ＮＳ３に対する細胞性免疫を活性化したことを意味すると考えられる。すなわち、本発明のビフィズス菌を経口投与することで、ＮＳ３タンパク特異的な細胞障害性T細胞（cytotoxic T lymphocyte; CTL）が誘導され、そのCTLがＮＳ３／４Ａを発現する腫瘍細胞ＥＬ４を攻撃し、腫瘍の増殖を抑制したと考えられる。このことから、本発明のビフィズス菌を含む経口ワクチンにより、抗原ペプチド特異的な細胞性免疫が誘導されていることが確認された。
　本発明の形質転換ビフィズス菌は、腫瘍細胞の増殖を抑制する用途にも使用しうる。実施例９に示すように、ＮＳ３タンパク質を発現するB. longum 2165を投与することにより、ＮＳ３タンパク質を発現する腫瘍の増殖が抑制された。これは、B. longum 2165の表層で発現するＮＳ３が抗原として機能し、ＮＳ３特異的なCTLの誘導を引き起こし、そのCTLがＮＳ３を発現する腫瘍の増殖を抑制したためと考えられる。
　このことから、細胞表層で腫瘍特異的に発現し、正常細胞で全く発現しないポリペプチドを、ビフィズス菌の表層で発現させ、投与することにより、腫瘍特異的な細胞性免疫が惹起され、腫瘍細胞の増殖が抑制されると考えられる。
　細胞表層で腫瘍特異的に発現し、正常細胞で全く発現しない抗原（癌抗原）は、これまでに多数報告されており、例えば、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるMAGE、MART-1、乳癌などにおけるHER2/neu、大腸癌におけるCEA、各種白血病や各種癌におけるWT1、NY-ESO-1、PSMAなどがよく知られているがこれらに限られない。また、前記癌抗原は、in silicoでも、wetな実験によっても同定することができる。In silicoで細胞表層で発現すると推定される遺伝子を同定し、マイクロアレイを作成して発現パターンを調べることにより、癌抗原か否かの１次スクリーニングをすることが可能である。癌抗原の遺伝子発現の有無は、mRNAを調製し、RTーPCRを行うことにより確認することができ、また、抗体を作成してウェスタン・ブロットやELISA等当業者に周知な方法でタンパク質の発現を確認することができる。あるいは、マイクロアレイを用いて癌特異的に発現する遺伝子を網羅的にスクリーニングし、その中から細胞表層で発現するものを同定することもできる。
　これらの癌抗原タンパク質（またはポリペプチド）を、ビフィズス菌の細胞表層で発現させ、その菌を経口投与することにより、癌ワクチンとして、癌の予防、治療に使用できると考えられる。
　癌抗原は、アミノ酸配列がわかれば、ヒトゲノム中の対応する遺伝子を同定し、プライマーをデザインしてPCR法により増幅して該癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子断片をクローニングすることは当業者にとって周知の技術である。クローニングした増幅断片をビフィズス菌の細胞表層発現ベクターに組み込み発現させることも技術的には容易である。それにより、各種癌抗原に応じた癌ワクチンが製造できる。このような癌ワクチンを投与することにより、癌の予防、治療が可能になると考えられる。本発明の癌ワクチンに含まれる形質転換ビフィズス菌は生菌であっても、殺菌した死菌であってもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
　（実施例１：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ　ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計）
　ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３リンカー部位（１１９６位～１２１５位）および上流側のβ－α－βドメイン（１２１６位～１３５０位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図２に示す２つのアミノ酸配列を設計した。
　アミノ酸配列１（図２の＞１：配列番号２３）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。
　アミノ酸配列２（図２の＞２：配列番号２４）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）を含む領域を連結している。
　上記基盤ドメインは、ＨＣＶ－１ｂ型抗原ポリペプチドの１１９６位～１３５０位に対応する領域であり、基盤ドメイン自体は、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位～１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位～１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位～１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む。
　（実施例２：ＮＳ３タンパク質表層発現形質転換ビフィズス菌の調製）
　実施例１で設計したアミノ酸配列１および２（それぞれ配列番号２３および２４）を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列１および２（それぞれ配列番号２５および２７；それぞれ対応するアミノ酸配列を配列番号２６および２８に示す）を設計し、これらの遺伝子配列情報に基づき、それぞれの遺伝子断片を全合成した（前者を「長型」、後者を「短型」ともいう）。遺伝子断片の全合成はGenScript社に委託した。得られた遺伝子断片をＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて処理し、同様にＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて処理した組換えプラスミドｐＪＴ１０１（特許文献４および非特許文献４）に挿入した。プラスミドｐＪＴ１０１は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＣＭ１２１７（ＡＴＣＣ１５７０７）由来ＧＬＢＰ遺伝子（配列番号１および２：特許文献４および非特許文献４）を含む。上記挿入によりＧＬＢＰ遺伝子の下流に「長型」または「短型」の遺伝子断片を連結させた。
　ＧＬＢＰ遺伝子の下流に「長型」遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、フォワードプライマー（5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：配列番号２９）およびリバースプライマー（5’-TTTCATCTGTGCATAGTCGACTTCAGGTGTTGCAGTCGA-3’：配列番号３０）のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。他方、ＧＬＢＰ遺伝子の下流に「短型」遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、フォワードプライマー（5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：配列番号２９）およびリバースプライマー（5’-TTTCATCTGTGCATATTCACAGCGGGATGGCCTTGCCGTAGA-3’：配列番号３１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターのｐＪＷ２４１（特許文献４および非特許文献４）をＮｄｅＩで切断し、この部位に、得られたＰＣＲ増幅断片をIn-fusion法（クローンテック・ラボラトリーズ社:Clontech Laboratories, Inc.）を用いて連結した。これにより得られた「長型」の融合遺伝子を含む表層発現ベクターをｐＪＷ２１６５、および「短型」の融合遺伝子を含む表層発現ベクターをｐＪＷ２１６４と命名した。
　得られた表層発現ベクターであるｐＪＷ２１６５またはｐＪＷ２１６４をエレクトロポレーション法にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61巻、1211-1212頁、1997年）に導入し、形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムを得た。ここで、ｐＪＷ２１６５を導入した形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５、ｐＪＷ２１６４を導入した形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４と命名した。さらにＧＬＢＰのみを発現するビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２）を作製した。
　（実施例３：形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムのＮＳ３タンパク質表層発現）
　上記の方法で作製したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５がＧＬＢＰ－ＮＳ３融合タンパク質を正しい分子量で発現しているか、ウエスタンブロット法により確認を行った。ＧＡＭ培地（「ニッスイ」：日水製薬株式会社）で一晩嫌気培養したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５を洗浄後、１％TritonX/ＰＢＳで希釈し、菌液をポリアクリルアミド電気泳動で分離した。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）/０．１％Tween20/生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて４℃で一晩ブロッキングを行った。1000倍希釈rabbit anti-NS3 IgG（オペロン社：operon）、1000倍希釈goat anti-rabbit IgG HRP Conjugated（サンタクルーズ社：Santa Cruz）の順にそれぞれ室温で１時間振盪反応させ、化学発光法によりＧＬＢＰ－ＮＳ３融合タンパク質の検出を行った。
　ウエスタンブロッティング法の結果を図３に示す。図３において、各レーンは以下の通りである：Ｍ．分子量マーカー；１．野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５；２．ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４；および３．ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５。ＧＬＢＰ－ＮＳ３融合タンパク質の分子量は、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４で６６ｋＤａ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５で６９ｋＤａであり、図３中のそれぞれのバンドの位置を矢印で示す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５は、いずれも目的の位置にバンドを確認することができ（それぞれレーン２および３）、設計通りの分子量のタンパク質を発現していることが分かった。
　さらに、ＮＳ３タンパク質がビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５の表層に発現しているかを確認するため、菌体の免疫染色を行った。ＧＡＭ培地で一晩嫌気培養したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５を洗浄後、ＰＢＳで希釈し、１％－ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて37℃で30分ブロッキングを行った。50倍希釈rabbit anti-NS3 IgG（operon）、1000倍希釈Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)（インビトロジェン社:invitrogen)の順にそれぞれ37℃で１時間反応させ、蛍光顕微鏡で菌体の蛍光発色を観察した。
　免疫染色法の結果を図４に示す。各写真は以下の通りである：１、４：ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５；２、５：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４；３、６：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５；１～３：明視野（400倍）；４～６：蛍光顕微鏡下（400倍）。野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５と比較して、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５は強い蛍光を確認することができ、ビフィズス菌表層に目的のＮＳ３タンパク質が発現していることが分かった。
　（実施例４：形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムのマウスへの経口投与）
　形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをGAM培地で一晩嫌気培養し、5×108CFU/mlとなるようＰＢＳで希釈した。この菌液を100μlずつ８週齢のメスBALB/Cマウスに胃内経口投与を行った。投与は週３回、４週間行った。コントロールとしてＰＢＳ投与群、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群、およびＧＬＢＰのみ発現するビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群を用い、同じ条件で投与を行った。投与開始日を１日目とし、０、１４、２８日目に尾静脈採血を行うとともに糞便を回収した。２９日目にはマウスに麻酔処置をした後、頸椎脱臼により安楽死させ、解剖し脾臓を摘出した。
　（４－１：ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ－ＮＳ３抗原特異的抗体の検出）
　糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体を酵素結合イムノソルベント（ELISA）法により検出した。糞便を５％スキムミルク/0.1mg/ml大豆トリプシン阻害剤/2mMフッ化フェニルメチルスルホニル/ＰＢＳに溶解させ、糞便溶解液を作製した。９６穴イムノプレート（NUNC）にＧＳＴ－ＮＳ３抗原ペプチドをコーティングし、５％スキムミルク/ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロッキングを行った。適当な濃度に希釈した糞便溶解液、1000倍希釈goat anti-mouse IgA HRP（Santa Cruz）の順にそれぞれ３７℃で1.5時間反応させた。最後にＴＭＢ発色試薬（ベクトン・ディッキンソン社：BD）を添加し２０分間発色させ、波長450nmで吸光度を測定した（OD 450）。また、同様に尾静脈採血で得た血液の血清中に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体を1000倍希釈goat anti-mouse IgG HRP（R&Dシステムズ社：R＆D）を用いてELISA法により検出した。
　糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体を調べたELISA法の結果を図５に示す。図５中の記号は以下の通りである：黒四角：ＰＢＳ投与群；黒三角：ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群；黒丸：ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群；白三角：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群；および白丸：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群。＊はｐ＜０．０５にて有意差があることを表す。２８日目に採取した糞便について、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群はＰＢＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群と比較して有意に高い吸光度（OD 450）を示した（ｐ＜０．０５）。一方、有意差は認められなかったものの、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４もわずかに高い値を示した。
　血清に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体を調べたELISA法の結果を図６に示す。図６中の記号は図５と同様である。＊＊はｐ＜０．０１にて有意差があることを表す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５ともに経日的にＩｇＧ抗体量が上昇し、１４、２８日目においてＰＢＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群と比較し有意に高い値を示した（ｐ＜０．０１）。
　ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５ともに、経口投与による局所的な粘膜免疫の誘導および全身性の免疫応答の誘導を確認することができた。
　（４－２：抗原刺激による脾臓細胞のサイトカイン産生）
　脾臓を70μlセルストレイナー（BD）を用いて細分化し、0.83% NH4Cl/PBSで溶血させた後、洗浄した。細胞を4×105細胞／穴となるよう１０％FBS/RPMI培地で懸濁し、ＧＳＴ－ＮＳ３抗原ペプチド2μgで刺激しながら96穴マイクロプレートで３日間培養した。Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit（R&D）を用いて、脾臓細胞の培養上清中のインターフェロンγ（IFN-γ）量を測定した。
　結果を図７に示す。図７の縦軸は、脾臓細胞の培養上清中のIFN-γ量（pg/ml）である。左から順に、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群、およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群であり、黒棒グラフはＮＳ３抗原刺激なし（対照群）、そして白棒グラフはＮＳ３抗原刺激ありを表す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群は、抗原刺激によりIFN-γ産生量が増加し、同じ条件で培養した非刺激対照群と比較して有意な差が認められた（ｐ＜０．０１）。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群においては、有意な差は見られなかったが、抗原刺激によりIFN-γ産生量は増加した。
　（実施例５：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ　ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計２）
　ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３　α－ヘリカルドメイン（１５１０位～１６５７位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図８に示すアミノ酸配列を設計した。
　図８のアミノ酸配列（配列番号３２）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。基盤ドメインは、ＨＣＶ－１ｂ型抗原ポリペプチドの１５１０位～１６５７位に対応する領域であり、基盤ドメイン自体は、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位～１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）、およびＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（１６２９位～１６３７位、ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）を含む。
　図８のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３３；対応するアミノ酸配列を配列番号３４に示す）を設計した。
　（実施例６：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ　ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計３）
　ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３　下流側β－α－β－ドメイン（１３５１位～１５０９位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図９に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、１３５１位～１３５３位の３アミノ酸を欠失させ、１３９８～１３９９位の２つのＫ（リジン）をＱ（グルタミン：１３９８位）およびＬ（ロイシン：１３９９位）に置換した。
　図９のアミノ酸配列（配列番号３５）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位～１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）を含む領域を連結している。基盤ドメイン自体は、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＬＩＦＣＨＳＫＱＬ（１３９１位～１３９９位、ＣＤ８エピトープ５のＫＫをＱＬに置換したもの：配列番号２１）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を含む。
　図９のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３６；対応するアミノ酸配列を配列番号３７に示す）を設計した。
　（実施例７：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ　ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計４）
　ＨＣＶ－１ｂ型ポリペプチドのＮＳ４Ａ領域の一部（１６７７位～１６９０位）をＮ末端に連結したＮＳ３のβ－バレルドメイン（１０２７位～１１９５位）に基づく基盤ドメインのＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図１０に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、１０２７～１０２８位の２アミノ酸および１１９５位のアミノ酸を欠失させ、そして１１４４～１１４５位の２つのＲ（アルギニン）をＱ（グルタミン：１１４４位）およびＬ（ロイシン：１１４５位）に置換した。
　図１０のアミノ酸配列（配列番号３８）は、上記基盤ドメインのＣ末端側にＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位～１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位～１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位～１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む基盤ドメイン（１）の領域、ならびにＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位～１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位～１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位～１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。上記ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ３のβ－バレルドメインに基づく基盤ドメイン自体は、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位～１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲ（１１３０位～１１４９位、ＣＤ４エピトープ１中のＲＲをＱＬに置換したもの：配列番号２２）、およびＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（１１６９位～１１７７位、ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）を含む。
　図１０のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３９；対応するアミノ酸配列を配列番号４０に示す）を設計した。
（実施例８：皮下腫瘍用形質転換EL4細胞の作成）
　マウスにHCVが感染しないことから、マウスに皮下腫瘍を作成し、その増殖抑制効果により本発明のワクチンの効果を評価するために以下の実験を行った。
　プラスミドpSG5/NS3/4Aより、NS3/4Aをコードする断片をBamHIで切り出し、プラスミドpBApo-CMV Neo（TAKARA）のBamHIサイトに挿入することにより、プラスミドpBApo-CMV Neo/NS3/4Aを得た（図１１）。このプラスミドpBApo-CMV Neo/NS3/4Aを調製し、TransIT-293 Transfection Reagent（タカラバイオ株式会社製）を用いてEL4細胞（マウスリンパ腫細胞）に導入した。G418を８００μグラム／ｍｌ含む培地で形質転換EL４細胞を選択し、限界希釈法により形質転換EL４細胞（NS3/4A-EL4細胞）のクローン株を得た。
　形質転換細胞であることを確認するために、RT-PCRおよびウエスタン・ブロッティングを行った。RT―PCRは常法により、全RNAからｃDNAを調製し、プライマー（配列番号４１：CGGCCCTCAGGCATGTTCGATTCTTC、配列番号４２：CCGGACAAGATGATCCTGCCCACAATG）を用いて、９４℃にて、１２０秒保温後、９８℃、１０秒、６４℃、３０秒、６８℃、４０秒を３０サイクル行い、NS3／４AをコードするDNA断片を増幅させ、アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウムにより染色し、UV下で増幅したDNA断片を確認した（図１２）。図１２において、１はプラスミドpSG5/NS3/4A、２は形質転換EL4細胞、３はMock感染EL4細胞であり、１および２において目的のバンドが確認された。
　ウェスタン・ブロッティングは、細胞抽出液をSDS―PAGEにより分画し、ナイロン膜に転写してブロッキング後、抗体によりNS3／４Aタンパク質を検出することにより行った（図１３）。図１３では、形質転換EL4細胞において７３ｋDaのNS3/4Aタンパク質のバンドが検出された（レーン２）。また、コントロールのレーン３にはNS3/4Aタンパク質のバンドは検出されなかった。これにより、NS3/4A-EL4細胞のクローン株であることが確認された。
（実施例９：B. longum 2165経口投与による抗腫瘍効果の検討）
　皮下接種前日に体重を測定し（Day0）、形質転換体であることが確認されたNS3/4A-EL4細胞をC57BL/6Nマウスの皮下に移植した。移植は、1×106 個の細胞を200μl のRPMI1640＆マトリゲルに包埋して皮下接種した。皮下接種日をDay１として、NS3/4Aタンパク質を表層発現するビフィズス菌の経口投与実験を開始した。
　経口投与群は、各実験区毎に個体数６匹を用いて、PBS、B. longum 2012 (GLBP遺伝子発現株)、B. longum 2165 (GLBP-NS3遺伝子発現株)、不活化B. longum 2165（5×108 CFU/ml 菌液 250μl を65℃、5分間加熱）をそれぞれの実験区に週３回、５×１０７CFUを100μlのPBSに溶解して投与した（計1３回）。その後、腫瘍長径および短径を２日毎に計測した。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、PBS、GLBP投与区では、腫瘍体積が顕著に増大したが、2165（GLBP-NS3）および不活化2165（GLBP-NS3）を投与した区においては、有意に腫瘍体積の増加が抑制されていた。このことは、GLBP-NS3遺伝子発現ビフィズス菌がNS3/4Aタンパク質を細胞表層で発現する腫瘍細胞の増殖の抑制に効果があることを示している。また、この効果は、生菌のみならず、不活化した菌においても観察された。よって、ビフィズス菌の生死と関係なく抗原としての効果を有すると考えられる。
　本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に、免疫原性を有するポリペプチドを発現および提示することができる。さらに、本発明によれば、ビフィズス菌の表層に例えばＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを提示するビフィズス菌を経口投与した動物において、ＮＳ３特異的な免疫を誘導することができ、よってワクチン組成物（例えば、経口ワクチン）として利用できる。このようなワクチン組成物は、既存のインターフェロン療法等と併用して、ＨＣＶ慢性感染の治癒率を高めることが期待される。

Claims (13)

  1. 　ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
    　該遺伝子が、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
    　該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含むＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
    　該基盤ドメインが、
    （１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
    （４）配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    からなる群より選択される１つ以上を含み、
    　該抗原ペプチドが、配列番号４～１５のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号４～１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つであり、
    　該少なくとも１つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される、
    　ビフィズス菌表層発現遺伝子。
  2. 　請求項１に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
    （１）前記基盤ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
    （２）前記基盤ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
    （３）前記基盤ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；または
    （４）前記基盤ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、Ｃ末端側に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する、
    　ビフィズス菌表層発現遺伝子。
  3. 　ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、該ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質の３’末端側に位置している、請求項１または２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  4. 　請求項３に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用ベクター。
  5. 　請求項４に記載のベクターを保持し、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
  6. 　ゲノム中に、請求項３に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
  7. 　請求項５または６に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、Ｃ型肝炎ワクチン組成物。
  8. 　経口ワクチンである、請求項７に記載のワクチン組成物。
  9. 　ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドを設計する方法であって、　立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを選択する工程；ならびに
    　該少なくとも１つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
    を含む、方法。
  10. 　前記基盤ドメインが、少なくとも１つのＣＤ４エピトープもしくはＣＤ８エピトープまたはその両方を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 　癌細胞の表層で特異的に発現するポリペプチドを、細胞表層で発現する形質転換ビフィズス菌。
  12. 　ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１１の形質転換ビフィズス菌。
  13. 　請求項１１または１２に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、癌ワクチン。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016208332A1 (ja) * 2015-06-25 2016-12-29 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチン
WO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2017-12-21 サンスター株式会社 新規トリペプチド
WO2018123507A1 (ja) * 2016-12-26 2018-07-05 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチンと免疫抑制阻害剤との併用によるがん治療
WO2022163647A1 (ja) * 2021-01-26 2022-08-04 国立大学法人神戸大学 経口コロナウイルス感染症ワクチン

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102018071672A2 (pt) * 2018-10-22 2021-11-16 Fundação Oswaldo Cruz Polipeptídeo, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, kit para triagem imunológica de hcv e/ou diagnóstico de hepatite c, composição, uso de pelo menos um polipeptídeo, e, métodos para produzir um polipeptídeo, para triagem imunológica de hcv e para o diagnóstico de hepatite c

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034181A1 (ja) * 2009-09-17 2011-03-24 森下仁丹株式会社 ビフィズス菌表層提示融合タンパク質発現遺伝子

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0992580B1 (en) 1993-11-04 2005-03-09 Innogenetics N.V. Immunodominant human T-cell epitopes of Hepatitis C virus
JP3642755B2 (ja) 2000-09-21 2005-04-27 純 天野 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
US20070054262A1 (en) * 2003-03-28 2007-03-08 Baker Denise M Methods of identifying optimal variants of peptide epitopes
AU2005295317B2 (en) 2004-10-18 2011-10-13 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
CA2680876C (en) 2007-03-19 2018-01-16 Morishita Jintan Co., Ltd. Oral vaccine
EP2331123A4 (en) 2008-07-24 2012-11-07 Aduro Biotech COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEPATITIS C
JP5753090B2 (ja) * 2008-10-29 2015-07-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 改良型ｈｃｖワクチンおよびその使用方法
CN104428408A (zh) * 2012-07-13 2015-03-18 学校法人帝京平成大学 抗肿瘤剂、肿瘤检测标志物及口服疫苗剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034181A1 (ja) * 2009-09-17 2011-03-24 森下仁丹株式会社 ビフィズス菌表層提示融合タンパク質発現遺伝子

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. L. ERICKSON ET AL.: "The Outcome of Hepatitis C Virus Infection Is Predicted by Escape Mutations in Epitopes Targeted by Cytotoxic T Lymphocytes", IMMUNITY, vol. 15, 2001, pages 883 - 895 *
A. M. WERTHEIMER ET AL.: "Novel CD 4+ and CD 8+ T- Cell Determinants Within the NS3 Protein in Subjects With Spontaneously Resolved HCV Infection", HEPATOLOGY, vol. 37, 2003, pages 577 - 589, XP002990777, DOI: doi:10.1053/jhep.2003.50115 *
C. N. HAEFELIN ET AL.: "Analysis of the Evolutionary Forces in an Immunodominant CD 8 Epitope in Hepatitis C Virus at a Population Level", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 82, no. 7, 2008, pages 3438 - 3451 *
F. X. L. LABRADOR ET AL.: "The use of class-I HLA tetramers for the detection of hepatitis C virus NS3-specific CD 8+ T cells in patients with chronic infection", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 287, 2004, pages 91 - 99, XP004503472, DOI: doi:10.1016/j.jim.2004.01.023 *
H. YU ET AL.: "Priming with CpG-enriched plasmid and boosting with protein formulated with CpG oligodeoxynucleotides and Quil A induces strong cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus NS3", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 85, 2004, pages 1533 - 1543 *
J. S. ZUR WIESCH ET AL.: "Broad Repertoire of the CD 4+ Th Cell Response in Spontaneously Controlled Hepatitis C Virus Infection Includes Dominant and Highly Promiscuous Epitopes", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 175, 2005, pages 3603 - 3613, XP055174994, DOI: doi:10.4049/jimmunol.175.6.3603 *
K. ITO ET AL.: "Identification of novel hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocyte epiotpe in NS3 region", HEPATOLOGY RESEARCH, vol. 36, 2006, pages 294 - 300, XP028036716, DOI: doi:10.1016/j.hepres.2006.08.011 *
S. E. GOGO ET AL.: "Protective vaccination with hepatitis C virus NS3 but not core antigen in a novel mouse challenge model", THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 10, 2008, pages 177 - 186, XP002676138, DOI: doi:10.1002/JGM.1144 *
S. TAKEI ET AL.: "Oral administration of genetically modified Bifidobacterium displaying HCV-NS3 multi-epitope fusion protein could induce an HCV-NS3-specific systemic immune response in mice", VACCINE, vol. 32, 2014, pages 3066 - 3074 *
T. MASHIBA ET AL.: "Identification of CTL epitopes in hepatitis C virus by a genome-wide computational scanning and a rational design of peptide vaccine", IMMUNOGENETICS, vol. 59, 2007, pages 197 - 209, XP019489448, DOI: doi:10.1007/s00251-006-0185-3 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016208332A1 (ja) * 2015-06-25 2016-12-29 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチン
CN108350411B (zh) * 2015-06-25 2021-06-22 白川利朗 口服肿瘤疫苗
JPWO2016208332A1 (ja) * 2015-06-25 2018-06-28 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチン
US10695385B2 (en) * 2015-06-25 2020-06-30 National University Corporation Kobe University Oral cancer vaccine
CN108350411A (zh) * 2015-06-25 2018-07-31 白川利朗 口服肿瘤疫苗
EP3315599A4 (en) * 2015-06-25 2019-03-06 National University Corporation Kobe University ORAL ANTITUMOR VACCINE
US10676505B2 (en) 2016-06-16 2020-06-09 Sunstar Inc. Tripeptides having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and uses thereof
JPWO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2019-04-04 サンスター株式会社 新規トリペプチド
WO2017217535A1 (ja) * 2016-06-16 2017-12-21 サンスター株式会社 新規トリペプチド
CN110214028A (zh) * 2016-12-26 2019-09-06 国立大学法人神户大学 联合使用口服肿瘤疫苗和免疫抑制阻滞剂的癌症治疗
JPWO2018123507A1 (ja) * 2016-12-26 2020-01-16 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチンと免疫抑制阻害剤との併用によるがん治療
WO2018123507A1 (ja) * 2016-12-26 2018-07-05 国立大学法人神戸大学 経口腫瘍ワクチンと免疫抑制阻害剤との併用によるがん治療
US11666646B2 (en) * 2016-12-26 2023-06-06 National University Corporation Kobe University Cancer therapy utilizing combination of oral tumor vaccine and immunosuppression inhibitor
WO2022163647A1 (ja) * 2021-01-26 2022-08-04 国立大学法人神戸大学 経口コロナウイルス感染症ワクチン

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