CN107073094A - 表达异源性抗原融合蛋白的重组李斯特菌菌株及其使用方法 - Google Patents

表达异源性抗原融合蛋白的重组李斯特菌菌株及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了编码融合至免疫原性多肽的肿瘤抗原的重组核酸和包含所述重组核酸的重组李斯特菌菌株、其制备方法、以及包括施用其来诱导免疫应答和治疗、抑制或阻遏癌症或肿瘤的方法。

Description

表达异源性抗原融合蛋白的重组李斯特菌菌株及其使用方法
技术领域
本文公开了编码融合至免疫原性多肽的肿瘤抗原的重组核酸和包含所述重组核酸的重组李斯特菌菌株、其制备方法、以及包括施用其来诱导免疫应答和治疗、抑制或阻遏癌症或肿瘤的方法。
背景技术
大量的临床前证据和早期临床试验数据表明，免疫系统的抗肿瘤能力可用于治疗患有已确立癌症的患者。疫苗策略利用与各种类型的癌症相关的肿瘤抗原。用表达肿瘤相关抗原的活疫苗例如病毒或细菌载体进行免疫是一种引起对抗肿瘤的强CTL应答的策略。
单核细胞增多性李斯特菌(Lm)是一种革兰氏阳性兼性细胞内细菌，其直接进入抗原呈递细胞如巨噬细胞和树突状细胞的细胞质，这主要是由于李斯特菌溶血素-O(LLO)的成孔活性。LLO在被细胞吞噬后由Lm分泌并穿透吞噬溶酶体膜，从而允许细菌逃逸液泡并进入细胞质。LLO可通过MHC I类分子非常有效地呈递给免疫系统。此外，Lm-衍生肽也可通过吞噬溶酶体来获得MHC II类呈递。
存活素是一种凋亡抑制蛋白，其在大多数癌症中高度表达，并且与化疗耐性、肿瘤复发增加和患者存活期缩短相关。一直需要找到有效对抗癌症的疗法。由于存活素存在于许多类型的癌症肿瘤乳例如腺癌和结肠癌、淋巴瘤、白血病和黑素瘤中，因此其可用作抗癌免疫疗法的通用靶抗原。
本发明通过提供编码包含存活素抗原的融合蛋白的重组核酸、包含所述重组核酸的重组李斯特菌菌株以及使用其来治疗和预防表达存活素的癌症的方法来解决上述需求。
发明内容
在一个方面，本发明公开了包含编码重组多肽的开放读框的重组核酸分子，所述重组多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在一个相关的方面，本发明公开了包含编码重组多肽的开放读框的重组核酸分子，所述重组多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素，其中所述核酸还包含可操作地连接至第一启动子序列的革兰氏阴性复制起点序列、革兰氏阳性复制起点序列和可操作地连接至第二启动子序列的编码代谢酶的开放读框。
在另一个相关的方面，本发明公开了包含本文所公开的重组核酸分子的重组李斯特菌菌株。
在一个方面，本文提供了诱导受试者的对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在一个相关的方面，本发明提供了治疗、阻遏或抑制受试者的癌症的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在另一个相关的方面，本发明提供了治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种肿瘤的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
本发明的其他特征和优点将由于以下详细描述的实例和附图而变得显而易见。但是，应当理解，该详细描述和具体实例尽管指出了本发明的优选实施例，但是仅仅通过例证给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对阅读了该详细描述的本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1.示出(A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的714bp的条带，缺乏野生型蛋白的分泌信号序列。
图2.示出(A)pADV134质粒的图谱。(B)使来自LmddA-134培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离，并且通过Western印迹使用抗E7单克隆抗体来检测LLO-E7蛋白。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人PSA基因(klk3)组成。(C)pADV142质粒的图谱。(D)Western印迹显示使用抗PSA和抗LLO抗体的LLO-PSA融合蛋白的表达。
图3.示出(A)在具有和不具有选择压力(D-丙氨酸)的情况下培养时LmddA-LLO-PSA的体外质粒稳定性。首先列出菌株和培养条件，然后列出用于CFU测定的板。(B)LmddA-LLO-PSA体内清除率和此时间期间的潜在质粒损失的评价。静脉内注射细菌并且在指定时间点从脾脏分离。在BHI和BHI+D-丙氨酸板上测定CFU。
图4.示出(A)在C57BL/6小鼠中施用108个CFU之后的菌株LmddA-LLO-PSA的体内清除率。通过在BHI/str板上铺板来测定CFU数量。此方法的检测限为100个CFU。(B)使用10403S、LmddA-LLO-PSA和XFL7菌株的J774细胞的细胞感染测定。
图5.示出(A)在强化剂量之后第6天时，未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中的PSA四聚物特异性细胞。(B)使用PSA肽刺激未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ的胞内细胞因子染色5小时。使用基于卡斯蛋白酶(caspase)的测定(C)和基于铕的测定(D)，在不同效应子/靶比率下，来自LmddA-LLO-PSA免疫小鼠和未暴露的小鼠的体外刺激效应T细胞对用PSA肽脉冲处理的EL4细胞的特异性裂解。在PSA肽存在下或无肽存在下刺激24小时后获得的未暴露的和经免疫的脾细胞中的IFNγ斑点数(E)。
图6.示出用LmddA-142免疫引起Tramp-C1-PSA(TPSA)肿瘤消退。小鼠不做处理(n＝8)(A)或在第7天、第14天和第21天用LmddA-142(1×108个CFU/小鼠)(n＝8)(B)或Lm-LLO-PSA(n＝8)(C)腹膜内免疫。测量各个肿瘤的肿瘤尺寸并且值表示为以毫米为单位的平均直径。各线表示单个小鼠。
图7.示出(A)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫的小鼠的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的PSA-四聚物+CD8+ T细胞的分析。(B)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的CD4+调节性T细胞(定义为CD25+FoxP3+)的分析。
图8.示出(A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的760bp的条带。
图9.示出(A)Lmdd-143和LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白。使来自细菌培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离并且通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来检测LLO和LLO-PSA蛋白；(B)Lmdd-143和LmddA-143产生的LLO保留溶血活性。将绵羊红细胞与细菌培养上清液的连续稀释液一起培育并且通过590nm下的吸光度测量溶血活性；(C)Lmdd-143和LmddA-143在巨噬细胞样J774细胞内部生长。将J774细胞与细菌一起培育1小时，随后用庆大霉素处理以杀死胞外细菌。通过对在指示时间点获得的J774裂解物的连续稀释液进行铺板来测量胞内生长。Lm 10403S在这些实验中用作对照。
图10.示出用Lmdd-143和LmddA-143免疫小鼠诱导PSA特异性免疫反应。将C57BL/6小鼠用1×108个CFU的Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以1周间隔免疫两次，并且在7天后收获脾脏。在莫能菌素(monensin)存在下用1μMPSA65-74肽刺激脾细胞5小时。针对CD8、CD3、CD62L和胞内IFN-γ对细胞进行染色并且在FACS Calibur细胞计数器中分析。
图11.示出设计三种基于Lm的疫苗，所述疫苗基于之前作图和预测的HLA-A2表位表达不同的HMW-MAA片段(A)。Lm-tLLO-HMW-MMA2160-2258(也称为Lm-LLO-HMW-MAA-C)菌株分泌对应于tLLO-HMW-MAA2160-2258融合蛋白的～62kDa条带(B)。给C57BL/6小鼠(n＝15)皮下接种B16F10细胞，并且在第3天、第10天和第17天用Lm-tLLO-HMW-MAA2160-2258进行腹膜内免疫(n＝8)或不做处理(n＝7)。给BALB/c小鼠(n＝16)皮下接种RENCA细胞，并且在第3天、第10天和第17天用Lm-HMW-MAA-C(n＝8)或等剂量的对照Lm疫苗进行腹膜内免疫。用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫的小鼠阻碍已建立肿瘤的生长(C)。给FVB/N小鼠(n＝13)皮下接种NT-2肿瘤细胞，并且在第7天、第14天和第21天用Lm-HMW-MAA-C(n＝5)或等剂量的对照Lm疫苗进行腹膜内免疫(n＝8)。用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫小鼠显著损害未经工程化来表达HMW-MAA例如B16F10、RENCA和NT-2(D)的肿瘤的生长。测量各个肿瘤的肿瘤尺寸并且值表示为以毫米为单位的平均直径±SEM。*,P≤0.05(Mann-Whitney检验)。
图12.示出用Lm-HMW-MAA-C免疫促进CD8+ T细胞的肿瘤浸润并且减少血管中的周细胞的数量。(A)将NT-2肿瘤移除并切片以进行免疫荧光。对染色组进行编号(1-3)并且每种染色在右方指示。将顺序组织用针对HMW-MAA小鼠同源物AN2的泛血管标记抗CD31或抗NG2抗体以及针对可能TIL的抗CD8α进行染色。第3组示出上述抗体的同种型对照以及用作核标记的DAPI染色。对总共5种肿瘤进行分析，并且示出来自每个组的单个代表图像。血管周围的CD8+细胞用箭头指示。(B)通过使用抗NG2和抗α平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)抗体来对顺序切片的周细胞进行染色。这两种抗体的双重染色/共定位(在合并图像中为黄色)指示周细胞染色(顶部)。使用Image Pro软件对周细胞共定位进行定量并以坐标图示出共定位对象(底部)。对总共3种肿瘤进行分析，并且示出来自每个组的单个代表图像。*,P≤0.05(Mann-Whitney检验)。坐标图示出平均值±SEM。
图13.示出使用了将菌株的m-RNA序列作为模板获得的小鼠存活素的寡核苷酸554/555和人存活素片段的寡核苷酸552/553而得到的PCR产物的大小。
图14.示出质粒pAdv266.7(A)和pAdv265.5(B)的示意性图谱。所述质粒同时包含李斯特菌和大肠杆菌复制起点。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人或小鼠存活素基因组成。
图15.示出来自LmddA-LLO-存活素上清液的Western印迹，其示出以下蛋白的表达：使用单克隆抗体抗B3-19检测的染色体LLO蛋白的表达、使用多克隆抗体抗PEST检测的截短的LLO-存活素融合蛋白和分解的t-LLO蛋白以及使用单克隆抗体抗存活素抗体检测的tLLO-存活素融合蛋白。
图16.示出来自LmddA-LLO-存活素上清液的Western印迹，其示出使用抗存活素抗体二次体内传代后的tLLO-存活素融合蛋白的表达和分泌。
图17.示出在用表达存活素的基于李斯特菌的免疫疗法处理后NT-2肿瘤生长的减少。
应当理解，为了阐述的简洁和清楚，显示在图中的要素未必是按比率绘制的。例如，为了清楚，一些要素的尺寸可以是相对其他要素而放大的。另外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明公开了包含编码重组多肽的开放读框的重组核酸分子，所述重组多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在另一个实施例中，本文所公开的重组核酸分子为DNA载体，其中在另一个实施例中其为质粒。
在另一个实施例中，本文所公开的革兰氏阴性复制起点序列为本领域中可用的任何革兰氏阴性复制起点(Ori)。在另一个实施例中，革兰氏阴性Ori为大肠杆菌Ori。在另一个实施例中，革兰氏阴性Ori为p15序列。
在另一个实施例中，本文所公开的革兰氏阳性复制起点序列为本领域中可用的任何革兰氏阴性复制起点(Ori)。在另一个实施例中，革兰氏阴性Ori为RepR序列或区。
在另一个实施例中，“截短的LLO”或“ΔLLO”指包含推定的PEST氨基酸序列的LLO片段。在另一个实施例中，术语是指包含推定的PEST域的LLO片段。在另一个实施例中，术语“截短的LLO”和“N末端LLO”在本文可互换使用。
在另一个实施例中，本发明公开了包含编码重组多肽的开放读框的重组核酸分子，所述重组多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素，其中所述核酸还包含可操作地连接至第一启动子序列的革兰氏阴性复制起点序列、革兰氏阳性复制起点序列和可操作地连接至第二启动子序列的编码代谢酶的开放读框。
在另一个实施例中，本发明公开了包含本文所公开的重组核酸分子的重组李斯特菌菌株。
在一个实施例中，本发明涉及包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，并且其中所述异源性抗原为存活素。
在另一个实施例中，本文提供了诱导受试者的对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗、阻遏或抑制受试者的癌症的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种肿瘤的方法，所述方法包括施用包含重组核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码多肽的开放读框，所述多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的异源性抗原，并且其中所述异源性抗原为存活素。
在一个实施例中，所述异源性抗原为存活素。如本文中所示，包含编码tLLO-存活素融合蛋白的重组核酸的重组李斯特菌与对照相比可减少肿瘤生长并且具有意外的延长期(参见文中的实例16和图17)。
在一个实施例中，N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽和N末端ActA多肽包含PEST序列。
在一个实施例中，核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与编码包含PEST序列的多肽的内源性核酸序列一起作为开放读框。在一个实施例中，核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与编码LLO的核酸序列一起作为开放读框。在另一个实施例中，核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与编码ActA的核酸序列一起作为开放读框。
在一个实施例中，核酸分子存在于所述重组李斯特菌菌株的质粒中。
在一个实施例中，核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与编码LLO的内源性核酸序列一起处于开放读框中。在一个实施例中，整合不会消除LLO的功能。在另一个实施例中，整合不会消除ActA的功能。在一个实施例中，LLO或ActA的功能为其天然功能。在一个实施例中，LLO功能是允许生物体逃离吞噬溶酶体，而在另一个实施例中，LLO功能是增强其所融合的多肽的免疫原性。
在一个实施例中，核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中的毒力基因。在另一个实施例中，毒力基因包含actA基因、内化素基因例如inlA、inlB或inlC、prfA基因或LLO基因。在另一个实施例中，整合进毒力基因会破坏毒力基因的天然功能。在另一个实施例中，整合使毒力基因失活。在另一个实施例中，整合进毒力基因不会破坏毒力基因的天然功能。在一个实施例中，本发明的重组李斯特菌保留LLO功能，所述LLO功能在一个实施例中为溶血功能，在另一个实施例中为抗原功能。LLO的其他功能在本领域中是已知的，评价LLO功能的方法和测定同样是已知的。在一个实施例中，本发明的重组李斯特菌具有野生型毒力，而在另一个实施例中，本发明的重组李斯特菌具有减弱的毒力。在一些实施例中，本发明的重组李斯特菌是无毒力的。在一个实施例中，本发明的重组李斯特菌具有足够的毒力来逃离吞噬溶酶体并进入胞质溶胶。在一个实施例中，本发明的重组李斯特菌表达融合的抗原-LLO蛋白。因此，在一个实施例中，将第一核酸分子整合进李斯特菌基因组中不会破坏内源性含PEST基因的结构，而在另一个实施例中，其不会破坏内源性含PEST基因的功能。在一个实施例中，将第一核酸分子整合进李斯特菌基因组中不会破坏所述李斯特菌逃离吞噬溶酶体的能力。
在另一个实施例中，核酸分子存在于所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且包含可操作地连接至内源性含PEST多肽或PEST序列的编码异源性抗原的开放读框。在一个实施例中，异源抗原性多肽和内源性含PEST多肽在单个开放读框中被翻译，而在另一个实施例中，异源抗原性多肽和内源性含PEST多肽在被分别翻译后融合。
在一个实施例中，李斯特菌基因组包含内源性ActA基因的缺失，在一个实施例中，基因是毒力因子。在一个实施例中，这样的缺失提供了供人类使用的进一步减毒从而更安全的李斯特菌菌株。在另一个实施例中，李斯特菌是dal/dat基因营养缺陷型的。在另一个实施例中，dal/dat基因在李斯特菌基因组中是突变的。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株为营养缺陷型dal/dat突变体。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株为缺乏内源性actA基因的营养缺陷型dal/dat突变李斯特菌。
在一个实施例中，异源性抗原与LLO同框整合进李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，整合的核酸分子被整合进ActA基因座。在另一个实施例中，编码ActA的染色体核酸被编码抗原的核酸分子替代。
在一个实施例中，核酸分子是被设计用于位点特异性同源重组到李斯特菌基因组中的载体。在另一个实施例中，使用同源重组将构建体或异源基因整合进李斯特菌染色体。
用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如描述于Frankel,FR、Hegde,S、Lieberman,J和Y Paterson.Induction of a cell-mediated immune response to HIVgag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector.J.Immunol.155：4766-4774.1995；Mata,M、Yao,Z、Zubair,A、Syres,K和Y Paterson,Evaluation of arecombinant Listeriamonocytogenes expressing an HIV protein that protectsmice against viral challenge.Vaccine 19:1435-45,2001；Boyer,JD、Robinson,TM、Maciag,PC、Peng,X、Johnson,RS、Pavlakis,G,、Lewis,MG、Shen,A、Siliciano,R、Brown,CR、Weiner,D和Y Paterson.DNA prime Listeria boost induces a cellular immuneresponse to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable oflimited suppression of SIV239 viral replication.Virology.333：88-101,2005。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。每种技术代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，构建体或异源基因采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点。在另一个实施例中，通过转座子诱变将外源基因插入基因组中的位置是未知的。
在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将构建体或异源基因整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY等人，Construction,characterization,and use of two LMsite-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15):4177-86)。在另一个实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可为基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，这种方法产生单拷贝的整合体。每种可能性代表了本文所公开的独立实施例。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的核酸序列可操作地连接至启动子/调控序列。在一个实施例中，启动子/调控序列存在于包含所述核酸序列的游离型质粒上。在一个实施例中，内源性李斯特菌启动子/调控序列控制本发明的方法和组合物的核酸序列的表达。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，本文所公开的核酸序列可操作地连接至驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子、调控序列或它们的组合。可用于驱动基因的组成型表达的启动子、调控序列或它们的组合是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的PhlyA、PActA、hly、actA和p60启动子，链球菌(Streptococcus)bac启动子，灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)sgiA启动子以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。在另一个实施例中，编码本文所公开的肽的核酸的诱导型和组织特异性表达通过将编码该肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的调控下实现。可用于此目的的组织特异性或诱导型调控序列、启动子或它们的组合的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施例中，采用响应于诱导剂(诸如金属、糖皮质素等等)而诱导的启动子。因此，应当理解，本发明包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子或调控序列。在一个实施例中，调控序列为启动子，而在另一个实施例中，调控序列为增强子，而在另一个实施例中，调控序列为抑制子，而在另一个实施例中，调控序列为阻遏子，而在另一个实施例中，调控序列为沉默子。
技术人员将认识到，用于整合的核酸构建体包含整合位点。在一个实施例中，当用于整合进李斯特菌基因组中时，位点为PhSA(来自Scott A的噬菌体)attPP'整合位点。在另一个实施例中，PhSA为单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株ScottA的噬菌体(Loessner,M.J.,I.B.Krause,T.Henle和S.Scherer.1994.Structural proteins and DNAcharacteristics of 14 Listeria typing bacteriophages.J.Gen.Virol.75:701–710，以引用方式并如本文)，是一种在人类李斯特菌病流行期间分离的血清型4b菌株。在另一个实施例中，位点是本领域已知的任何其他整合位点。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，核酸构建体包含整合酶基因。在另一个实施例中，整合酶基因为PhSA整合酶基因。在另一个实施例中，整合酶基因是本领域已知的任何其他代整合酶基因。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，核酸构建体为质粒。在另一个实施例中，核酸构建体为穿梭质粒。在另一个实施例中，核酸构建体为整合载体。在另一个实施例中，核酸构建体为位点特异性整合载体。在另一个实施例中，核酸构建体为本领域已知的任何其他类型的核酸构建体。每种可能性代表了本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，本文所提供的方法和组合物的整合载体为噬菌体载体。在另一个实施例中，整合载体是位点特异性整合载体。在另一个实施例中，载体还包含attPP’位点。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，整合载体为U153载体。在另一个实施例中，整合载体为A118载体。在另一个实施例中，整合载体为PhSA载体。
在另一个实施例中，载体为A511载体(例如GenBank登录号：X91069)。在另一个实施例中，载体为A006载体。在另一个实施例中，载体为B545载体。在另一个实施例中，载体为B053载体。在另一个实施例中，载体为A020载体。在另一个实施例中，载体为A500载体(例如GenBank登录号：X85009)。在另一个实施例中，载体为B051载体。在另一个实施例中，载体为B052载体。在另一个实施例中，载体为B054载体。在另一个实施例中，载体为B055载体。在另一个实施例中，载体为B056载体。在另一个实施例中，载体为B101载体。在另一个实施例中，载体为B110载体。在另一个实施例中，载体为B1ll载体。在另一个实施例中，载体为A153载体。在另一个实施例中，载体为D441载体。在另一个实施例中，载体为A538载体。在另一个实施例中，载体为B653载体。在另一个实施例中，载体为A513载体。在另一个实施例中，载体为A507载体。在另一个实施例中，载体为A502载体。在另一个实施例中，载体为A505载体。在另一个实施例中，载体为A519载体。在另一个实施例中，载体为B604载体。在另一个实施例中，载体为C703载体。在另一个实施例中，载体为B025载体。在另一个实施例中，载体为A528载体。在另一个实施例中，载体为B024载体。在另一个实施例中，载体为B012载体。在另一个实施例中，载体为B035载体。在另一个实施例中，载体为C707载体。
在另一个实施例中，载体为A005载体。在另一个实施例中，载体为A620载体。在另一个实施例中，载体为A640载体。在另一个实施例中，载体为B021载体。在另一个实施例中，载体为HSO47载体。在另一个实施例中，载体为H10G载体。在另一个实施例中，载体为H8/73载体。在另一个实施例中，载体为H19载体。在另一个实施例中，载体为H21载体。在另一个实施例中，载体为H43载体。在另一个实施例中，载体为H46载体。在另一个实施例中，载体为H107载体。在另一个实施例中，载体为H108载体。在另一个实施例中，载体为H110载体。在另一个实施例中，载体为H163/84载体。在另一个实施例中，载体为H312载体。在另一个实施例中，载体为H340载体。在另一个实施例中，载体为H387载体。在另一个实施例中，载体为H391/73载体。在另一个实施例中，载体为H684/74载体。在另一个实施例中，载体为H924A载体。在另一个实施例中，载体为fMLUP5载体。在另一个实施例中，载体为syn(＝P35)载体。在另一个实施例中，载体为00241载体。在另一个实施例中，载体为00611载体。在另一个实施例中，载体为02971A载体。在另一个实施例中，载体为02971C载体。在另一个实施例中，载体为5/476载体。在另一个实施例中，载体为5/911载体。在另一个实施例中，载体为5/939载体。在另一个实施例中，载体为5/11302载体。在另一个实施例中，载体为5/11605载体。在另一个实施例中，载体为5/11704载体。在另一个实施例中，载体为184载体。在另一个实施例中，载体为575载体。在另一个实施例中，载体为633载体。在另一个实施例中，载体为699/694载体。在另一个实施例中，载体为744载体。在另一个实施例中，载体为900载体。在另一个实施例中，载体为1090载体。在另一个实施例中，载体为1317载体。在另一个实施例中，载体为1444载体。在另一个实施例中，载体为1652载体。在另一个实施例中，载体为1806载体。在另一个实施例中，载体为1807载体。在另一个实施例中，载体为1921/959载体。在另一个实施例中，载体为1921/11367载体。在另一个实施例中，载体为1921/11500载体。在另一个实施例中，载体为1921/11566载体。在另一个实施例中，载体为1921/12460载体。在另一个实施例中，载体为1921/12582载体。在另一个实施例中，载体为1967载体。在另一个实施例中，载体为2389载体。在另一个实施例中，载体为2425载体。在另一个实施例中，载体为2671载体。在另一个实施例中，载体为2685载体。在另一个实施例中，载体为3274载体。在另一个实施例中，载体为3550载体。在另一个实施例中，载体为3551载体。在另一个实施例中，载体为3552载体。在另一个实施例中，载体为4276载体。在另一个实施例中，载体为4277载体。在另一个实施例中，载体为4292载体。在另一个实施例中，载体为4477载体。在另一个实施例中，载体为5337载体。在另一个实施例中，载体为5348/11363载体。在另一个实施例中，载体为5348/11646载体。在另一个实施例中，载体为5348/12430载体。在另一个实施例中，载体为5348/12434载体。在另一个实施例中，载体为10072载体。在另一个实施例中，载体为11355C载体。在另一个实施例中，载体为11711A载体。在另一个实施例中，载体为12029载体。在另一个实施例中，载体为12981载体。在另一个实施例中，载体为13441载体。在另一个实施例中，载体为90666载体。在另一个实施例中，载体为90816载体。在另一个实施例中，载体为93253载体。在另一个实施例中，载体为907515载体。在另一个实施例中，载体为910716载体。在另一个实施例中，载体为NN-李斯特菌载体。在另一个实施例中，载体为O1761载体。在另一个实施例中，载体为4211载体。在另一个实施例中，载体为4286载体。
在另一个实施例中，整合载体为本领域已知的能够传染李斯特菌的任何其他位点特异性整合载体。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的整合载体或质粒不会向李斯特菌疫苗菌株赋予抗生素抗性。在另一个实施例中，整合载体或质粒不含抗生素抗性基因。
在另一个实施例中，本发明提供了编码重组多肽的分离的核酸。在一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少70％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少75％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少80％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少85％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少90％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少95％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少97％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码本文所提供的重组多肽的核酸共有至少99％同源性的序列。
在一个实施例中，本文提供了制备本文所提供的表达异源性抗原的重组李斯特菌。在另一个实施例中，所述方法包括用包含编码所述异源性抗原的核酸的游离型表达载体转化所述重组李斯特菌。在另一个实施例中，所述方法包括在本领域已知的有利于抗原表达的条件下在所述重组李斯特菌菌株中表达所述抗原。
在一个实施例中，抗原以与LLO融合的融合蛋白形式表达，所述LLO在一个实施例中为非溶血LLO，并且在另一个实施例中为截短的LLO。在另一个实施例中，抗原以与N末端ActA蛋白融合的融合蛋白形式表达，所述N末端ActA蛋白在一个实施例中为截短的ActA。
在另一个实施例中，本文所提供的重组李斯特菌菌株通过引起对由其表达的抗原的免疫应答来靶向肿瘤。
在另一个实施例中，本文所提供的方法和组合物的游离型表达载体包含同框融合至编码PEST氨基酸(AA)序列的核酸序列的抗原。在另一个实施例中，抗原为存活素。在另一个实施例中，抗原为存活素片段。在另一个实施例中，抗原为存活素片段的免疫原性片段。在另一个实施例中，PEST AA序列为KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，PEST序列为KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID No:2)。在另一个实施例中，抗原与包括本文列举的PEST AA序列之一的任何LLO序列的融合可增强细胞介导的针对存活素的免疫。
在另一个实施例中，PEST AA序列为来自李斯特菌ActA蛋白的PEST序列。在另一个实施例中，PEST序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:3)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:4)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:5)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:6)。在另一个实施例中，PEST序列来自西尔李斯特菌细胞溶素，由lso基因编码。在另一个实施例中，PEST序列为RSEVTISPAETPESPPATP(SEQ ID NO:7)。在另一个实施例中，PEST序列来自链球菌属(Streptococcus sp)的链球菌溶血素O蛋白。在另一个实施例中，PEST序列来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的链球菌溶血素O，例如AA 35-51处的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQID NO:8)。在另一个实施例中，PEST序列来自类马链球菌(Streptococcus equisimilis)的链球菌溶血素O，例如AA 38-54处的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9)。在另一个实施例中，PEST序列具有选自SEQ ID NO:3-9的序列。在另一个实施例中，PEST序列具有选自SEQID NO:1-9的序列。在另一个实施例中，PEST序列为源自原核生物体的另一PEST AA序列。
对PEST序列的鉴定在本领域是熟知的，例如描述于Rogers S等人(Amino acidsequences common to rapidly degraded proteins:the PEST hypothesis.Science1986；234(4774):364-8,以引用方式并入本文)和Rechsteiner M等人(PEST sequencesand regulation by proteolysis.Trends Biochem Sci 1996；21(7):267-71，以引用方式并入本文)。“PEST序列”在另一个实施例中指富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的区域。在另一个实施例中，PEST序列的侧翼为一个多个含有几个带正电荷氨基酸的簇。在另一个实施例中，PEST序列介导含有它的蛋白的快速细胞内降解。在另一个实施例中，PEST序列适合Rogers等人公开的算法。在另一个实施例中，PEST序列适合Rechsteiner等人公开的算法。在另一个实施例中，PEST序列含有一个或多个内部磷酸化位点，这些位点处的磷酸化先于蛋白降解。在一个实施例中，在本文中称为PEST序列的序列为PEST序列。在另一个实施例中，PEST序列为PEST肽序列或简称PEST肽。
在一个实施例中，原核生物体的PEST序列按照例如Rechsteiner和Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)针对单核细胞增多性李斯特菌(LM)所述的方法或Rogers S等人(Science 1986；234(4774):364-8)中的方法来鉴定。或者，来自其他原核生物体的PEST AA序列可也根据此方法鉴定。可预期其中PESTAA序列的其他原核生物体包括但不限于其他的李斯特菌菌种。在一个实施例中，PEST序列适合Rogers等人公开的算法。在另一个实施例中，PEST序列适合Rechsteiner等人公开的算法。在另一个实施例中，PEST序列采用PEST-发现程序(PEST-find program)来鉴定。
在另一个实施例中，通过在指定的蛋白序列中初步扫描带正电荷的氨基酸R、H和K来实现对PEST基序的鉴定。对带正电荷侧翼之间的所有氨基酸都计数，且仅进一步考虑这样的基序：其含有的氨基酸数量等于或高于窗口尺寸参数。在另一个实施例中，PEST序列必须含有至少1个P、1个D或E，以及至少1个S或T。
在另一个实施例中，PEST基序的质量通过基于关键氨基酸的局部富集的得分参数以及该基序的疏水性来优化。D、E、P、S和T的富集以质量百分比(w/w)表示，并相对1当量的D或E、1当量的P和1当量的S或T进行校正。在另一个实施例中，对疏水性的计算按J.Kyte和R.F.Doolittle(Kyte,J和Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982)，以引用方式并入本文)的方法中的原则进行。为了简化计算，使用以下线性变换将初始范围为精氨酸-4.5至异亮氨酸+4.5的Kyte-Doolittle亲水指数转换为正整数，其产生从精氨酸0至异亮氨酸90的值。
亲水指数＝10*Kyte-Doolittle亲水指数+45
在另一个实施例中，潜在的PEST基序的疏水性计算为，每个氨基酸种类的摩尔百分比和疏水性指数的乘积的总和。得到期望的PEST得分，其作为由以下等式表示的局部富集项和疏水性项的组合：
PEST得分＝0.55*DEPST-0.5*疏水性指数。
在另一个实施例中，术语“PEST序列”、“PEST序列”或“PEST肽”可互换使用，是指采用以上算法得分至少为+5的肽。在另一个实施例中，该术语是指得分至少为6的肽。在另一个实施例中，该肽具有至少为7的得分。在另一个实施例中，得分至少为8。在另一个实施例中，得分至少为9。在另一个实施例中，得分至少为10。在另一个实施例中，得分至少为11。在另一个实施例中，得分至少为12。在另一个实施例中，得分至少为13。在另一个实施例中，得分至少为14。在另一个实施例中，得分至少为15。在另一个实施例中，得分至少为16。在另一个实施例中，得分至少为17。在另一个实施例中，得分至少为18。在另一个实施例中，得分至少为19。在另一个实施例中，得分至少为20。在另一个实施例中，得分至少为21。在另一个实施例中，得分至少为22。在另一个实施例中，得分至少为22。在另一个实施例中，得分至少为24。在另一个实施例中，得分至少为24。在另一个实施例中，得分至少为25。在另一个实施例中，得分至少为26。在另一个实施例中，得分至少为27。在另一个实施例中，得分至少为28。在另一个实施例中，得分至少为29。在另一个实施例中，得分至少为30。在另一个实施例中，得分至少为32。在另一个实施例中，得分至少为35。在另一个实施例中，得分至少为38。在另一个实施例中，得分至少为40。在另一个实施例中，得分至少为45。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，使用本领域已知的任何其他方法或算法，例如CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月；21增刊1:i169-76)来鉴定PEST序列。在另一个实施例中，采用以下方法：
通过将1的值分配给氨基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln，计算每个适当长度段(例如30-35个氨基酸的段)的PEST指数。每个PEST残基的系数值(CV)为1，每个其他氨基酸(非-PEST)的系数值为0。
在另一个实施例中，PEST序列是本领域已知的任何其他PEST序列。
在一个实施例中，本发明提供融合蛋白，其在一个实施例中由李斯特菌表达。在一个实施例中，此类融合蛋白融合至PEST序列，其在一个实施例中是指包含PEST序列的蛋白片段。在另一个实施例中，术语包括这样的情况：其中该蛋白片段包含除了PEST序列以外的周围序列。在另一个实施例中，该蛋白片段由PEST序列构成。因此，在一个实施例中，术语“融合”是指融合至两个肽或蛋白片段，无论是在它们各自的末端连接在一起还是一个嵌入另一个中。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物中利用LLO蛋白。在另一个实施例中，本文所提供的组合物和方法的重组李斯特菌菌株包含全长LLO多肽，该全长LLO多肽在一个实施例中为溶血的。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株包含非溶血LLO多肽。在一个实施例中，溶血LLO多肽从李斯特菌染色体表达，而非溶血LLO多肽从游离型质粒表达，所述非溶血LLO多肽以与抗原融合的融合蛋白形式存在于李斯特菌的细胞质中。
在另一个实施例中，LLO多肽为LLO多肽的变体。在另一个实施例中，LLO多肽是N末端LLO片段。在另一个实施例中，多肽为如美国专利申请序列No.2009/0081248中描述的detox LLO，该专利申请也以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，寡肽为完整LLO蛋白。在另一个实施例中，多肽为本领域已知的任何LLO蛋白或其片段，本文所公开。
在一个实施例中，截短的LLO蛋白由本文所公开的游离型表达载体编码，所述游离型表达载体表达多肽，其在一个实施例中为抗原，在另一个实施例中为血管生成因子，或在另一个实施例中为抗原和血管生成因子两者。在另一个实施例中，LLO片段是N末端片段。
在另一个实施例中，N末端LLO片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQ ID NO:10)。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的LLO AA序列包含SEQ ID No:10中示出的序列。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:10的同源物。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:10的变体。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:10的片段。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:10的同种型。
在另一个实施例中，LLO片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(SEQ ID NO:11)。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的LLO AA序列包含SEQ ID No:11中示出的序列。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:11的同源物。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:11的变体。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID No:11的片段。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQID No:11的同种型。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物中使用的LLO蛋白包含序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:12；核酸序列在GenBank登录号X15127中示出)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切除。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本文所公开的疫苗中的LLO片段的来源。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的LLO AA序列包含SEQ ID NO:12中示出的序列。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:12的同源物。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:12的变体。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:12的片段。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:12的同种型。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物中使用的LLO蛋白包含序列：
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的LLO AA序列包含SEQ ID NO:13中示出的序列。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQID NO:13的同源物。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:13的变体。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:13的片段。在另一个实施例中，LLO AA序列为SEQ ID NO:13的同种型。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的LLO多肽的氨基酸序列来自单核细胞增多性李斯特菌10403S菌株，如Genbank登录号：ZP_01942330、EBA21833中示出，或由Genbank登录号：NZ_AARZ01000015或AARZ01000015.1中示出的核酸序列编码。在另一个实施例中，用于本文所公开的组合物和方法中的LLO序列来自单核细胞增多性李斯特菌，其在一个实施例中为4b F2365菌株(在一个实施例中，Genbank登录号：YP_012823)、EGD-e菌株(在一个实施例中，Genbank登录号：NP_463733)或本领域已知的任何其他单核细胞增多性李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，用于本文所公开的组合物和方法中的LLO序列来自黄杆菌目细菌(Flavobacteriales bacterium)HTCC2170(在一个实施例中，Genbank登录号：ZP_01106747或EAR01433；在一个实施例中，由Genbank登录号：NZ_AAOC01000003编码)。在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法中可使用与其他物种中的LLO同源的蛋白，例如蜂房杆菌溶素(alveolysin)，其在一个实施例中存在于蜂房芽胞杆菌(Paenibacillus alvei)(在一个实施例中，Genbank登录号：P23564或AAA22224；在一个实施例中，由Genbank登录号：M62709编码)中。其他此类同源蛋白是本领域中已知的。
在另一个实施例中，可以使用来自其他物种的LLO的同源物，包括已知的溶解素或其片段来形成本文所公开的组合物和方法的LLO与抗原的融合蛋白，其在一个实施例中为HMW-MAA，在另一个实施例中为HMW-MAA的片段。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的LLO片段为PEST域。在另一个实施例中，将包含PEST序列的LLO片段用作本文所公开的组合物的一部分或用于本文所公开的方法中。
在另一个实施例中，LLO片段不包含羧基末端的活化域。在另一个实施例中，LLO片段不包含半胱氨酸484。在另一个实施例中，LLO片段为非溶血片段。在另一个实施例中，LLO片段因活化域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO片段因半胱氨酸484的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO序列因胆固醇结合结构域中的缺失或突变而成为非溶血的，如美国专利申请序列No.2009/0081248中所述。在另一个实施例中，LLO序列因另一位置的缺失或突变而成为非溶血的。
在一个实施例中，本发明提供包含李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的重组蛋白或多肽，其中所述LLO蛋白包含所述LLO蛋白的胆固醇结合结构域(CBD)的残基C484、W491、W492或它们的组合的突变。在一个实施例中，所述C484、W491和W492残基是SEQ ID NO:12的残基C484、W491和W492，而在另一个实施例中，它们是可使用本领域的技术人员已知的序列比对推导的对应残基。在一个实施例中，残基C484、W491和W492是突变的。在一个实施例中，突变是置换，在另一个实施例中，突变是缺失。在一个实施例中，整个CBD是突变的，而在另一个实施例中，CBD的部分是突变的，而在另一个实施例中，仅CBD内的特定残基是突变的。
在另一个实施例中，本发明提供了重组蛋白或多肽，其包含(a)突变LLO蛋白，其中突变LLO蛋白含有内部缺失，该内部缺失包含突变LLO蛋白的胆固醇结合结构域；和(b)目的异源肽。在另一个实施例中，胆固醇结合结构域的序列为ECTGLAWEWWR，其在SEQ ID NO:42)中示出。在另一个实施例中，内部缺失为11-50个氨基酸的内部缺失。在另一个实施例中，内部缺失就该重组蛋白或多肽的溶血活性而言是去活性的。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。
在另一个实施例中，本发明提供了重组蛋白或多肽，其包含(a)突变LLO蛋白，其中突变LLO蛋白含有内部缺失，该内部缺失包含突变LLO蛋白的胆固醇结合结构域的片段；和(b)目的异源肽。在另一个实施例中，内部缺失为1-11个氨基酸的内部缺失。在另一个实施例中，胆固醇结合结构域的序列在SEQ ID NO:42中示出。在另一个实施例中，内部缺失就该重组蛋白或多肽的溶血活性而言是去活性的。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。
在另一个实施例中，本发明的肽为融合肽。在另一个实施例中，“融合肽”是指包含两个或更多个通过肽键或其他化学键连接在一起的蛋白的肽或多肽。在另一个实施例中，蛋白通过肽或其他化学键直接连接在一起。在另一个实施例中，蛋白通过两个或更多个蛋白之间的一个或多个AA(例如，“间隔物”)连接在一起。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的内部缺失的长度为1-50个AA。在另一个实施例中，长度为1-11个AA。在另一个实施例中，长度为2-11个AA。在另一个实施例中，长度为3-11个AA。在另一个实施例中，长度为4-11个AA。在另一个实施例中，长度为5-11个AA。在另一个实施例中，长度为6-11个AA。在另一个实施例中，长度为7-11个AA。在另一个实施例中，长度为8-11个AA。在另一个实施例中，长度为9-11个AA。在另一个实施例中，长度为10-11个AA。在另一个实施例中，长度为1-2个AA。在另一个实施例中，长度为1-3个AA。在另一个实施例中，长度为1-4个AA。在另一个实施例中，长度为1-5个AA。在另一个实施例中，长度为1-6个AA。在另一个实施例中，长度为1-7个AA。在另一个实施例中，长度为1-8个AA。在另一个实施例中，长度为1-9个AA。在另一个实施例中，长度为1-10个AA。在另一个实施例中，长度为2-3个AA。在另一个实施例中，长度为2-4个AA。在另一个实施例中，长度为2-5个AA。在另一个实施例中，长度为2-6个AA。在另一个实施例中，长度为2-7个AA。在另一个实施例中，长度为2-8个AA。在另一个实施例中，长度为2-9个AA。在另一个实施例中，长度为2-10个AA。在另一个实施例中，长度为3-4个AA。在另一个实施例中，长度为3-5个AA。在另一个实施例中，长度为3-6个AA。在另一个实施例中，长度为3-7个AA。在另一个实施例中，长度为3-8个AA。在另一个实施例中，长度为3-9个AA。在另一个实施例中，长度为3-10个AA。在另一个实施例中，长度为11-50个AA。在另一个实施例中，长度为12-50个AA。在另一个实施例中，长度为11-15个AA。在另一个实施例中，长度为11-20个AA。在另一个实施例中，长度为11-25个AA。在另一个实施例中，长度为11-30个AA。在另一个实施例中，长度为11-35个AA。在另一个实施例中，长度为11-40个AA。在另一个实施例中，长度为11-60个AA。在另一个实施例中，长度为11-70个AA。在另一个实施例中，长度为11-80个AA。在另一个实施例中，长度为11-90个AA。在另一个实施例中，长度为11-100个AA。在另一个实施例中，长度为11-150个AA。在另一个实施例中，长度为15-20个AA。在另一个实施例中，长度为15-25个AA。在另一个实施例中，长度为15-30个AA。在另一个实施例中，长度为15-35个AA。在另一个实施例中，长度为15-40个AA。在另一个实施例中，长度为15-60个AA。在另一个实施例中，长度为15-70个AA。在另一个实施例中，长度为15-80个AA。在另一个实施例中，长度为15-90个AA。在另一个实施例中，长度为15-100个AA。在另一个实施例中，长度为15-150个AA。在另一个实施例中，长度为20-25个AA。在另一个实施例中，长度为20-30个AA。在另一个实施例中，长度为20-35个AA。在另一个实施例中，长度为20-40个AA。在另一个实施例中，长度为20-60个AA。在另一个实施例中，长度为20-70个AA。在另一个实施例中，长度为20-80个AA。在另一个实施例中，长度为20-90个AA。在另一个实施例中，长度为20-100个AA。在另一个实施例中，长度为20-150个AA。在另一个实施例中，长度为30-35个AA。在另一个实施例中，长度为30-40个AA。在另一个实施例中，长度为30-60个AA。在另一个实施例中，长度为30-70个AA。在另一个实施例中，长度为30-80个AA。在另一个实施例中，长度为30-90个AA。在另一个实施例中，长度为30-100个AA。在另一个实施例中，长度为30-150个AA。
在另一个实施例中，包含内部缺失的本发明的突变LLO蛋白除了内部缺失之外是全长的。在另一个实施例中，突变LLO蛋白包含另外的内部缺失。在另一个实施例中，突变LLO蛋白不止一个另外的内部缺失。在另一个实施例中，突变LLO蛋白从C末端截短。在另一个实施例中，突变LLO蛋白从N末端截短。
本发明的方法和组合物的内部缺失在另一个实施例中包含SEQ ID NO:12的残基C484。在另一个实施例中，内部缺失包含同源LLO蛋白的相应半胱氨酸残基。在另一个实施例中，内部缺失包含SEQ ID NO:12的残基W491。在另一个实施例中，内部缺失包含同源LLO蛋白的相应色氨酸残基。在另一个实施例中，内部缺失包含SEQ ID NO:12的残基W492。在另一个实施例中，内部缺失包含同源LLO蛋白的相应色氨酸残基。鉴定同源蛋白的相应残基的方法在本领域是熟知的，并且例如包括序列比对。
在另一个实施例中，内部缺失包含残基C484和W491。在另一个实施例中，内部缺失包含残基C484和W492。在另一个实施例中，内部缺失包含残基C491和W492。在另一个实施例中，内部缺失包含残基C484、C491和W492。
在一个实施例中，本发明提供包含突变LLO蛋白或其片段的重组蛋白或多肽，其中突变LLO蛋白或其片段包含突变LLO蛋白或其片段的突变区的非LLO肽置换，突变区包含选自C484、W491和W492的残基。在另一个实施例中，LLO片段是N末端LLO片段。在另一个实施例中，LLO片段的长度为至少492个氨基酸(AA)。在另一个实施例中，LLO片段的长度为492-528个AA。在另一个实施例中，非LLO肽的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，突变区的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，非LLO肽的长度与突变区相等。在另一个实施例中，非LLO肽的长度与突变区不同。在另一个实施例中，就溶血活性而言，该置换是失活突变。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽是非溶血的。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的内部缺失包含突变LLO蛋白或其片段的CBD。例如，由SEQ ID NO:12的残基470-500、470-510或480-500构成的内部缺失包含其CBD(残基483-493)。在另一个实施例中，内部缺失为突变LLO蛋白或其片段的CBD的片段。例如，残基484-492、485-490和486-488都为SEQ ID NO:12的CBD的片段。在另一个实施例中，内部缺失与突变LLO蛋白或其片段的CBD重叠。例如，由SEQ ID NO:12的残基470-490、480-488、490-500或486-510构成的内部缺失包含其CBD。
在另一个实施例中，“溶血”是指裂解真核细胞的能力。在另一个实施例中，细胞是红细胞。在另一个实施例中，真核细胞是本领域已知的任何其他类型的真核细胞。在另一个实施例中，溶血活性在酸性pH下测量。在另一个实施例中，溶血活性在生理pH下测量。在另一个实施例中，溶血活性在pH 5.5下测量。在另一个实施例中，溶血活性在pH 7.4下测量。在另一个实施例中，溶血活性在本领域已知的任何其他pH下测量。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出大于100倍的溶血活性降低。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽表现出大于50倍的溶血活性降低。在另一个实施例中，降低大于30倍。在另一个实施例中，降低大于40倍。在另一个实施例中，降低大于60倍。在另一个实施例中，降低大于70倍。在另一个实施例中，降低大于80倍。在另一个实施例中，降低大于90倍。在另一个实施例中，降低大于120倍。在另一个实施例中，降低大于150倍。在另一个实施例中，降低大于200倍。在另一个实施例中，降低大于250倍。在另一个实施例中，降低大于300倍。在另一个实施例中，降低大于400倍。在另一个实施例中，降低大于500倍。在另一个实施例中，降低大于600倍。在另一个实施例中，降低大于800倍。在另一个实施例中，降低大于1000倍。在另一个实施例中，降低大于1200倍。在另一个实施例中，降低大于1500倍。在另一个实施例中，降低大于2000倍。在另一个实施例中，降低大于3000倍。在另一个实施例中，降低大于5000倍。
在另一个实施例中，降低为至少100倍。在另一个实施例中，降低为至少50倍。在另一个实施例中，降低为至少30倍。在另一个实施例中，降低为至少40倍。在另一个实施例中，降低为至少60倍。在另一个实施例中，降低为至少70倍。在另一个实施例中，降低为至少80倍。在另一个实施例中，降低为至少90倍。在另一个实施例中，降低为至少120倍。在另一个实施例中，降低为至少150倍。在另一个实施例中，降低为至少200倍。在另一个实施例中，降低为至少250倍。在另一个实施例中，降低为至少300倍。在另一个实施例中，降低为至少400倍。在另一个实施例中，降低为至少500倍。在另一个实施例中，降低为至少600倍。在另一个实施例中，降低为至少800倍。在另一个实施例中，降低为至少1000倍。在另一个实施例中，降低为至少1200倍。在另一个实施例中，降低为至少1500倍。在另一个实施例中，降低为至少2000倍。在另一个实施例中，降低为至少3000倍。在另一个实施例中，降低为至少5000倍。
测定溶血活性的方法是本领域中熟知的，并且描述于例如本文的实例中以及Portnoy DA等人(J Exp Med Vol 167:1459-1471,1988)和Dancz CE等人(JBacteriol.184:5935–5945,2002)。
相对于溶血活性的“失活突变”在另一个实施例中是指消除可检测溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指在pH 5.5下消除溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指在pH 7.4下消除溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指在pH 5.5下显著降低溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指在pH 7.4下显著降低溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指在pH 5.5下显著降低溶血活性的突变。在另一个实施例中，该术语是指相对于溶血活性的任何其他类型的失活突变。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的胆固醇结合结构域的序列在SEQ IDNO:42中示出。在另一个实施例中，CBD为本领域已知的任何其他LLO CBD。
在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段包含529个AA全长LLO蛋白的大约前400-441个AA。在另一个实施例中，LLO片段对应于本文所公开的LLO蛋白的AA 1-441。在另一个实施例中，LLO片段由LLO的大约前420个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段对应于本文所公开的LLO蛋白的AA 1-420。在另一个实施例中，LLO片段由LLO的大约AA 20-442构成。在另一个实施例中，LLO片段对应于本文所公开的LLO蛋白的AA 20-442。在另一个实施例中，不含活化域并且含有半胱氨酸484，特别是不含半胱氨酸484的任何ΔLLO均适于本文所公开的方法和组合物。
在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的前400个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的前300个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的前200个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的前100个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段对应于LLO蛋白的前50个AA，其在一个实施例中包含一个或多个PEST序列。
在另一个实施例中，LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含可操作地整合进李斯特菌基因组中与内源性ActA序列一起作为开放读框的核酸分子。在另一个实施例中，本文所公开的游离型表达载体包含含有融合至ActA或截短的ActA的抗原的融合蛋白。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含可操作地整合进李斯特菌基因组中与内源性ActA序列一起作为开放读框的核酸分子。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达载体，所述载体包含编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含融合到ActA或截短的ActA的抗原。在一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-233号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利No.7,655,238中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰型式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序缺失，并且包含非保守的QDNKR置换，如美国专利公布No.2014/0186387中所述。
在一个实施例中，抗原为存活素，而在另一个实施例中，其为存活素的免疫原性片段。在另一个实施例中，其为存活素的表位。在另一个实施例中，存活素表位为HLA-A2存活素表位，具有LMLGEFLKL(SEQ ID NO:14)示出的序列。
在一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的抗原融合至ActA蛋白，其在一个实施例中为ActA蛋白的N末端片段，所述N末端片段在一个实施例中包含ActA的前390个AA或由其组成，在另一个实施例中包含ActA的前418个AA或由其组成，在另一个实施例中包含ActA的前50个AA或由其组成，在另一个实施例中包含ActA的前100个AA或由其组成，其在一个实施例中包含PEST序列例如SEQ ID NO:2中所提供的序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物中所利用的ActA蛋白的N末端片段包含ActA的前150个AA或由其组成，在另一个实施例中包含ActA的前大约200个AA或由其组成，其在一个实施例中包含如本文所述的2个PEST序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物中所利用的ActA蛋白的N末端片段包含ActA的前250个AA或由其组成，在另一个实施例中包含ActA的前300个AA或由其组成。在另一个实施例中，ActA片段含有对应于以上AA范围之一的同源ActA蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源ActA蛋白相对于本文所用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号，对技术人员而言惯例是采用序列比对工具例如本领域所熟知的NCBI BLAST。
在另一个实施例中，ActA蛋白的N末端部分包含1个、2个、3个或4个PEST序列，所述PEST序列在一个实施例中为本文中明确提及的PEST序列或它们的同源物(如本文中所述)，或其他PEST序列，如可使用本文所述的方法和算法或通过使用本领域已知的替代方法来确定。
本文所公开的方法和组合物中利用的ActA蛋白的N末端片段在另一个实施例中具有SEQ ID NO:15中示出的序列：
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP(SEQ ID NO:15)。在另一个实施例中，ActA片段包含SEQ ID NO:15中示出的序列。在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:15的同源物。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:15的变体。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:15的同种型。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ IDNO:15的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:15的同源物的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:15的变体的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ IDNO:15的同种型的片段。
在另一个实施例中，编码ActA蛋白的片段的重组核苷酸包含SEQ ID NO:16中示出的序列：atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca(SEQ ID NO:16)。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ IDNO:16中示出的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。
本文所公开的方法和组合物中利用的ActA蛋白的N末端片段在另一个实施例中具有SEQ ID NO:17中示出的序列：MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRP(SEQ ID NO:17)，其在一个实施例中为来自单核细胞增多性李斯特菌菌株10403S的ActA的前390个AA。在另一个实施例中，ActA片段包含SEQ IDNO:17中示出的序列。在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的同源物。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQID NO:17的变体。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的同种型。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的同源物的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的变体的片段。在另一个实施例中，ActA蛋白为SEQ ID NO:17的同种型的片段。
在另一个实施例中，编码ActA蛋白的片段的重组核苷酸包含SEQ ID NO:18中示出的序列：atgcgtgcgatgatggtagttttcattactgccaactgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattccagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaagtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcagagaaaggtccgaataacaataataacaacggtgagcaaacaggaaatgtggctataaatgaagaggcttcaggagtcgaccgaccaactctgcaagtggagcgtcgtcatccaggtctgtcatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaagaaaagccatagcgtcgtcggatagtgagcttgaaagccttacttatccagataaaccaacaaaagcaaataagagaaaagtggcgaaagagtcagttgtggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagacgagtctacaccacaacctttaaaagcaaatcaaaaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccgatgcttctcggttttaatgctcctactccatcggaaccgagctcattcgaatttccgccgccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcattcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaattatgcgggaaacagcaccttcgctagattctagttttacaagcggggatttagctagtttgagaagtgctattaatcgccatagcgaaaatttctctgatttcccactaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca(SEQ ID NO:18)，其在一个实施例中为单核细胞增多性李斯特菌10403S菌株中前1170个编码ActA的核苷酸。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ IDNO:18中示出的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。
在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的另一ActA片段，其在一个实施例中为包含PEST序列的任何片段。因此，在一个实施例中，ActA片段为ActA序列的氨基酸1-100。在另一个实施例中，ActA片段为ActA序列的氨基酸1-200。在另一个实施例中，ActA片段为ActA序列的氨基酸200-300。在另一个实施例中，ActA片段为ActA序列的氨基酸300-400。在另一个实施例中，ActA片段为ActA序列的氨基酸1-300。在另一个实施例中，本文所公开的重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码完整ActA蛋白的序列。在另一个实施例中，actA片段包含(a)actA的氨基酸1-59；(b)用于宿主细胞细胞骨架的acta介导的调节的至少一个域中的失活突变，所述至少一个域的缺失或所述至少一个域之前的截短。在一些实施例中，ActA包含ActA的多于前59个氨基酸。在一些实施例中，经修饰的actA为如美国专利公开序列No.2007/0207170中所述的actA-N100，该专利据此全文以引用方式并入。
在一个实施例中，用于本文所提供的组合物和方法中的ActA序列来自单核细胞增多性李斯特菌，其在一个实施例中为EGD菌株、10403S菌株(Genbank登录号：DQ054585)、NICPBP 54002菌株(Genbank登录号：EU394959)、S3菌株(Genbank登录号：EU394960)、NCTC5348菌株(Genbank登录号：EU394961)、NICPBP 54006菌株(Genbank登录号：EU394962)、M7菌株(Genbank登录号：EU394963)、S19菌株(Genbank登录号：EU394964)，或本领域已知的单核细胞增多性李斯特菌的任何其他菌株。
在一个实施例中，菌株中缺失的actA区的序列，Lmdd△actA如下：
gcgccaaatcattggttgattggtgaggatgtctgtgtgcgtgggtcgcgagatgggcgaataagaagcattaaagatcctgacaaatataatcaagcggctcatatgaaagattacgaatcgcttccactcacagaggaaggcgactggggcggagttcattataatagtggtatcccgaataaagcagcctataatactatcactaaacttggaaaagaaaaaacagaacagctttattttcgcgccttaaagtactatttaacgaaaaaatcccagtttaccgatgcgaaaaaagcgcttcaacaagcagcgaaagatttatatggtgaagatgcttctaaaaaagttgctgaagcttgggaagcagttggggttaactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctccaagtgatattcttaaaataattcatgaatattttttcttatattagctaattaagaagataactaactgctaatccaatttttaacggaacaaattagtgaaaatgaaggccgaattttccttgttctaaaaaggttgtattagcgtatcacgaggagggagtataagtgggattaaacagatttatgcgtgcgatgatgg tggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgac ccatacgacgttaattcttgcaatgttag ctattggcgtgttctctttaggggcgtttatcaaaattattcaattaagaaaaaataattaaaaacacagaacgaaagaaaaagtgaggtgaatgatatgaaattcaaaaaggtggttctaggtatgtgcttgatcgcaagtgttctagtctttccggtaacgataaaagcaaatgcctgttgtgatgaatacttacaaacacccgcagctccgcatgatattgacagcaaattaccacataaacttagttggtccgcggataacccgacaaatactgacgtaaatacgcactattggctttttaaacaagcggaaaaaatactagctaaagatgtaaatcatatgcgagctaatttaatgaatgaacttaaaaaattcgataaacaaatagctcaaggaatatatgatgcggatcataaaaatccatattatgatactagtacatttttatctcatttttataatcctgatagagataatacttatttgccgggttttgctaatgcgaaaataacaggagcaaagtatttcaatcaatcggtgactgattaccgagaagggaa(SEQ ID NO:19)。在一个实施例中，加下划线的区含有存在于Lmdd△actA菌株中的actA序列元件。在一个实施例中，粗体序列gtcgac代表N-T和C-T序列的连接位点。
在一个实施例中，本文所提供的组合物和方法的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子编码存活素抗原，或在另一个实施例中编码存活素的片段。
在另一个实施例中，小鼠存活素蛋白具有氨基酸(AA)序列：MGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACAPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAA(SEQ ID NO:20)。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的存活素氨基酸序列包含SEQ IDNo:20中示出的序列。在另一个实施例中，存活素序列为SEQ ID No:20的同源物。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQ ID No:20的变体。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQID No:20的片段。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQ ID No:20的同种型。
在另一个实施例中，人存活素蛋白具有以下氨基酸序列：
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的存活素氨基酸序列包含SEQ ID No:21中示出的序列。在另一个实施例中，存活素序列为SEQ ID No:21的同源物。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQ ID No:21的变体。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQ ID No:21的片段。在另一个实施例中，存活素AA序列为SEQ ID No:21的同种型。
在另一个实施例中，小鼠存活素蛋白由以下核酸序列： 编码。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ ID NO:22中示出的序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的编码存活素的核苷酸包含SEQ ID No:22中示出的序列。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:22的同源物。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:22的变体。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:22的片段。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:22的同种型。
在另一个实施例中，人存活素蛋白由以下核酸序列编码：
GGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCGCCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGA(SEQ ID NO:23)。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ ID NO:23中示出的序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的编码存活素的核苷酸包含SEQ ID No:23中示出的序列。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:23的同源物。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ IDNo:23的变体。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:23的片段。在另一个实施例中，编码存活素的核苷酸为SEQ ID No:23的同种型。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的存活素蛋白具有GenBank条目中示出的AA序列，所述GenBank条目具有选自AAX29118.1、1F3H_A和CAG46540.1以及NP_033819.1的登录号。在另一个实施例中，存活素蛋白由以上GenBank条目之一中示出的核苷酸序列编码。在另一个实施例中，存活素蛋白包含以上GenBank条目之一中示出的序列。在另一个实施例中，存活素蛋白为以上GenBank条目之一中示出的序列的同源物。在另一个实施例中，存活素蛋白为以上GenBank条目之一中示出的序列的变体。在另一个实施例中，存活素蛋白为以上GenBank条目之一中示出的序列的片段。在另一个实施例中，存活素蛋白为以上GenBank条目之一中示出的序列的同种型。
在另一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的重组李斯特菌包含编码重组多肽的质粒，所述重组多肽在一个实施例中为血管生成性的，在另一个实施例中为抗原性的。在一个实施例中多肽为存活素，在另一个实施例中多肽为存活素片段。在另一个实施例中，质粒还编码包含PEST序列的多肽。在一个实施例中，本文所提供的方法和组合物的存活素片段融合至包含PEST序列的多肽。在一个实施例中，包含PEST序列的多肽在融合至抗原或血管生成多肽时增强它们的免疫原性。在另一个实施例中，存活素片段嵌入包含PEST序列的肽中。在另一个实施例中，存活素衍生肽整合进LLO片段、ActA蛋白或片段，或PEST序列。
在一个实施例中，包含PEST序列的多肽为李斯特菌溶血素(LLO)寡肽。在另一个实施例中，包含PEST序列的多肽为ActA寡肽。在另一个实施例中，包含PEST序列的多肽为PEST寡肽。在一个实施例中，与LLO、ActA、PEST序列及其片段的融合增强了抗原的细胞介导的免疫原性。在一个实施例中，与LLO、ActA、PEST序列及其片段的融合增强了多种表达系统中的抗原的细胞介导的免疫原性。在另一个实施例中，包含PEST序列的多肽为本领域已知的任何其他包含PEST序列的免疫源性多肽。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的重组李斯特菌菌株表达异源抗原性多肽，所述异源抗原性多肽被肿瘤细胞表达。在一个实施例中，本文所提供的组合物和方法的重组李斯特菌菌株包含各自含有开放读框的第一核酸分子和第二核酸分子，所述开放读框编码融合至含PEST序列例如截短的LLO、截短的ActA或PEST肽的异源性抗原。
在另一个实施例中，本文提供的异源性抗原为肿瘤相关抗原，其在一个实施例中为以下肿瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原、与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原、与乳腺癌相关的KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)、gp100、与黑素瘤相关的MART1抗原或与前列腺癌相关的PSA抗原。在另一个实施例中，用于本文所公开的组合物和方法的抗原为黑素瘤相关抗原，其在一个实施例中为TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它们的组合。
在另一个实施例中，抗原为HPV-E7。在另一个实施例中，抗原为NY-ESO-1。在另一个实施例中，抗原为端粒酶(TERT)。在另一个实施例中，抗原为SCCE。在另一个实施例中，抗原为CEA。在另一个实施例中，抗原为LMP-1。在另一个实施例中，抗原为PSMA。在另一个实施例中，抗原为前列腺干细胞抗原(PSCA)。在另一个实施例中，抗原为WT-1。在另一个实施例中，抗原为HIV-1Gag。在另一个实施例中，抗原为蛋白酶3。在另一个实施例中，抗原为酪氨酸酶相关蛋白2。在另一个实施例中，抗原为PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，抗原选自HPV-E7、HPV-E6、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、EGFR-III、存活素、凋亡重复序列包含棒状病毒抑制因子5(BIRC5)、WT-1、HIV-1Gag、CEA、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或它们的组合。
在一个实施例中，本发明的李斯特菌表达的多肽可为神经肽生长因子拮抗剂，其在一个实施例中为[D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]物质P、[Arg6,D-Trp7,9,NmePhe8]物质P(6-11)。这些实施例和相关的实施例是本领域技术人员可理解的。
在另一个实施例中，抗原是感染性疾病抗原。在一个实施例中，抗原是自体抗原或自身抗原。
在一个实施例中，抗原源自真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIVgag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人类乳头瘤病毒的人类乳头瘤病毒抗原E1和E2、或它们的组合。
在其他实施例中，抗原与以下疾病之一相关：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脑灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、恶性疟原虫环子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。
本文所公开的方法和组合物所诱导的免疫应答在另一个实施例中为T细胞应答。在另一个实施例中，免疫应答包括T细胞应答。在另一个实施例中，应答为CD8+ T细胞应答。在另一个实施例中，应答包括CD8+ T细胞应答。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的重组李斯特菌包含血管生成多肽。在另一个实施例中，抗血管生成癌症疗法大有前景，并且在一个实施例中，一种类型的此类抗血管生成疗法靶向周细胞。在另一个实施例中，在血管内皮细胞和周细胞上的分子靶标是抗肿瘤疗法的重要靶标。在另一个实施例中，血小板源生长因子受体(PDGF-B/PDGFR-β)信号传导对于将周细胞募集到新形成的血管具有重要意义。因此，在一个实施例中，本文所公开的血管生成多肽抑制周细胞信号传导中涉及到的分析，该分子在一个实施例中为PDGFR-β。
在一个实施例中，本发明的组合物包含血管生成因子或其免疫原性片段，其中在一个实施例中，免疫原性片段包含由宿主免疫系统识别的一个或多个表位。在一个实施例中，血管生成因子是在新的血管的形成中涉及到的分子。在一个实施例中，血管生成因子是VEGFR2。在另一个实施例中，本发明的血管生成因子是：血管生成素；血管生成素-1；Del-1；成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)；卵泡抑素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；白细胞介素-8(IL-8)；痩素；中期因子；胎盘生长因子；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)；多效生长因子(PTN)；颗粒蛋白前体；增殖素；存活素；转化生长因子-α(TGF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)/血管渗透因子(VPF)。在另一个实施例中，血管生成因子为血管生成蛋白。在一个实施例中，生长因子为血管生成蛋白。在一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的血管生成蛋白是：成纤维细胞生长因子(FGF)、VEGF、VEGFR和神经菌毛素1(NRP-1)、血管生成素1(Ang1)和Tie2、血小板源生长因子(PDGF、BB-同二聚体)和PDGFR、转化生长因子-β(TGF-β)、内皮因子和TGF-β受体、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、整合素αVβ3、αVβ5和α5β1、VE-钙粘素和CD31、肝配蛋白(ephrin)、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、一氧化氮合酶(NOS)和COX-2、AC133或Id1/Id3。在一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的血管生成蛋白是血管生成素，其在一个实施例中是血管生成素1、血管生成素3、血管生成素4或血管生成素6。在一个实施例中，内皮因子也称为CD105、EDG、HHT1、ORW或ORW1。在一个实施例中，内皮因子TGFβ共受体。
在一个实施例中，本文所公开的癌症疫苗产生能够浸润肿瘤、破坏肿瘤细胞并根除疾病的效应T细胞。在一个实施例中，天然存在的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)与多种肿瘤诸如结肠癌、卵巢癌和黑素瘤中更好的预后相关。在结肠癌中，不具有微转移信号的肿瘤具有增加的免疫细胞浸润和Th1表达谱，这与改善的患者存活相关。此外，T细胞对肿瘤的浸润在临床前和临床试验中都已与免疫疗法的成功相关。在一个实施例中，淋巴细胞浸润到肿瘤部位中依赖于肿瘤血管的内皮细胞中粘附分子的上调，这种上调通常通过促炎性细胞因子诸如IFN-γ、TNF-α和IL-1进行。若干粘附分子已在淋巴细胞浸润到肿瘤中的过程中牵涉，包括细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管内皮细胞粘附分子1(V-CAM-1)、血管粘附蛋白1(VAP-1)和E-选择素。然而，这些细胞粘附分子通常在肿瘤血管中下调。因此，在一个实施例中，本文所公开的癌症疫苗增加TIL，上调粘附分子(在一个实施例中，ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-选择素或它们的组合)，上调促炎性细胞因子(在一个实施例中，IFN-γ、TNF-α、IL-1或它们的组合)或它们的组合。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法提供了抗血管生成疗法，其在一个实施例中可改进免疫疗法策略。在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法通过上调肿瘤血管中的粘附分子和增强白细胞-血管相互作用来防止体内内皮细胞无变应性，这增加了肿瘤浸润性白细胞例如CD8+ T细胞的数量。有趣的是，增强的抗肿瘤保护与VEGF阻断时肿瘤中的活化的CD4+和CD8+肿瘤-浸润性T细胞的数量增加以及调节性T细胞的数量显著减少相关。
在一个实施例中，将抗血管生成抗原与肿瘤相关抗原同时递送给受累于如本文所述的肿瘤的宿主将具有影响肿瘤生长的协同效应和更有效的功效。
在另一个实施例中，通过疫苗接种靶向周细胞将导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润、周细胞破坏、血管失稳定和血管炎症，这在另一个实施例中与内皮细胞中对于淋巴细胞粘附和反式迁移而言重要的粘附分子的上调相关，从而最终提高淋巴细胞浸润肿瘤组织的能力。在另一个实施例中，伴随递送肿瘤特异性抗原产生能够侵袭肿瘤部位并杀死肿瘤细胞的淋巴细胞。
在一个实施例中，血小板源生长因子受体(PDGF-B/PDGFR-β)信号传导对于将周细胞募集到新形成的血管具有重要意义。在另一个实施例中，抑制VEGFR-2和PDGFR-β同时诱导内皮细胞凋亡和肿瘤血管的消退，在一个实施例中，约40％的肿瘤血管。
在另一个实施例中，所述李斯特菌菌株为营养缺陷型李斯特菌菌株。在另一个实施例中，所述李斯特菌菌株为营养缺陷型dal/dat突变体。在另一个实施例中，核酸分子在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组细菌菌株中。
在一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌疫苗载体，该载体因缺失毒力基因actA而为减毒的并保留了质粒，以通过补充dal基因用于期望的异源性抗原或截短的LLO在体内和体外表达。
在另一个实施例中，减毒菌株为Lmdda。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△actA。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PrfA。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PlcB。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PlcA。在另一个实施例中，菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施例中，菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本发明的菌株为表达非溶血LLO的李斯特菌菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株为prfA突变体、actA突变体、plcB缺失突变体或同时缺乏plcA和plcB的双突变体。设想了将所有这些李斯特菌菌株用于本文提供的方法中。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。
在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株为减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏prfA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏inlB基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌同时缺乏actA和inlB基因。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。
在一个实施例中，可以多种方式产生用作疫苗载体的营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，D-丙氨酸营养缺陷型突变体可在一个实施例中以如下方式产生：通过破坏dal基因和dat基因以产生李斯特菌的减毒营养缺陷型菌株，该菌株需要外源添加的D-丙氨酸来生长。在另一个实施例中，可通过来自质粒或游离体的dal基因的表达来补充营养缺陷型。
在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性D-丙氨酸消旋酶(dal)基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性D-氨基酸转移酶(Dat)基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性Dal和Dat基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性Dal/Dat和actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性Dal/Dat/actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性prfA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性Dal/Dat、actA和prfA基因的失活突变。在另一个实施例中，失活突变为缺失突变。在另一个实施例中，失活突变为截短。在另一个实施例中，失活突变为置换或取代突变。
在一个实施例中，造成突变的方法是本领域熟已知的，并考虑用在本发明中。
在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌AA菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。
在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，本文所公开的涉及代谢酶合成的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。
在一个实施例中，所述营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充所述营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，术语“游离型的”及其语法等同形式是指可在宿主细胞的细胞质中自主复制的染色体外DNA。在另一个实施例中，游离体为质粒。在另一个实施例中，游离体为表达载体。
在另一个实施例中，质粒为整合型质粒并且包含允许其整合进宿主染色体的序列。
在另一个实施例中，本文提供的构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原从重组李斯特菌菌株携带的载体表达。在另一个实施例中，所述游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的抗原基因融合至包含PEST序列的寡肽。在另一个实施例中，包含PEST序列的所述内源性多肽为LLO。在另一个实施例中，包含PEST序列的所述内源性多肽是ActA。
在另一个实施例中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，代谢酶为氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于所述重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，代谢酶为丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶为D-氨基酸转移酶。
在另一个实施例中，代谢酶催化用于细胞壁合成的氨基酸(AA)的形成。在另一个实施例中，代谢酶催化用于细胞壁合成的AA的合成。在另一个实施例中，代谢酶参与用于细胞壁合成的AA的合成。在另一个实施例中，AA用于细胞壁生物生成。
在另一个实施例中，代谢酶为D-谷氨酸(一种细胞壁组分)的合成酶。
在另一个实施例中，代谢酶由丙氨酸消旋酶基因(dal)基因编码。在另一个实施例中，dal基因编码丙氨酸消旋酶，该丙氨酸消旋酶催化反应
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的方法和组合物的dal基因由以下序列编码：
atggtgacaggctggcatcgtccaacatggattgaaatagaccgcgcagcaattcgcgaaaatataaaaaatgaacaaaataaactcccggaaagtgtcgacttatgggcagtagtcaaagctaatgcatatggtcacggaattatcgaagttgctaggacggcgaaagaagctggagcaaaaggtttctgcgtagccattttagatgaggcactggctcttagagaagctggatttcaagatgactttattcttgtgcttggtgcaaccagaaaagaagatgctaatctggcagccaaaaaccacatttcacttactgtttttagagaagattggctagagaatctaacgctagaagcaacacttcgaattcatttaaaagtagatagcggtatggggcgtctcggtattcgtacgactgaagaagcacggcgaattgaagcaaccagtactaatgatcaccaattacaactggaaggtatttacacgcattttgcaacagccgaccagctagaaactagttattttgaacaacaattagctaagttccaaacgattttaacgagtttaaaaaaacgaccaacttatgttcatacagccaattcagctgcttcattgttacagccacaaatcgggtttgatgcgattcgctttggtatttcgatgtatggattaactccctccacagaaatcaaaactagcttgccgtttgagcttaaacctgcacttgcactctataccgagatggttcatgtgaaagaacttgcaccaggcgatagcgttagctacggagcaacttatacagcaacagagcgagaatgggttgcgacattaccaattggctatgcggatggattgattcgtcattacagtggtttccatgttttagtagacggtgaaccagctccaatcattggtcgagtttgtatggatcaaaccatcataaaactaccacgtgaatttcaaactggttcaaaagtaacgataattggcaaagatcatggtaacacggtaacagcagatgatgccgctcaatatttagatacaattaattatgaggtaacttgtttgttaaatgagcgcatacctagaaaatacatccattag(SEQ ID No:24GenBank登录号：AF038438)。在另一个实施例中，编码dal的核苷酸与SEQ ID No:24同源。在另一个实施例中，编码dal的核苷酸为SEQ ID No:24的变体。在另一个实施例中，编码dal的核苷酸为SEQ ID No:24的片段。在另一个实施例中，dal蛋白由本领域已知的任何其他dal基因编码。
在另一个实施例中，dal蛋白具有以下序列：
MVTGWHRPTWIEIDRAAIRENIKNEQNKLPESVDLWAVVKANAYGHGIIEVARTAKEAGAKGFCVAILDEALALREAGFQDDFILVLGATRKEDANLAAKNHISLTVFREDWLENLTLEATLRIHLKVDSGMGRLGIRTTEEARRIEATSTNDHQLQLEGIYTHFATADQLETSYFEQQLAKFQTILTSLKKRPTYVHTANSAASLLQPQIGFDAIRFGISMYGLTPSTEIKTSLPFELKPALALYTEMVHVKELAPGDSVSYGATYTATEREWVATLPIGYADGLIRHYSGFHVLVDGEPAPIIGRVCMDQTIIKLPREFQTGSKVTIIGKDHGNTVTADDAAQYLDTINYEVTCLLNERIPRKYIH(SEQ ID No:25；GenBank登录号：AF038428)。在另一个实施例中，dal蛋白与SEQ ID No:25同源。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的变体。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的异构体。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的片段。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的同源物的片段。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的变体的片段。在另一个实施例中，dal蛋白为SEQ ID No:25的异构体的片段。
在另一个实施例中，dal蛋白为本领域已知的任何其他李斯特菌dal蛋白。在另一个实施例中，dal蛋白为本领域已知的任何其他革兰氏阳性dal蛋白。在另一个实施例中，dal蛋白为本领域已知的任何其他dal蛋白。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的dal蛋白保留其酶活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留90％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留80％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留70％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留60％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留50％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留40％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留30％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留20％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留10％的野生型活性。在另一个实施例中，dal蛋白保留5％的野生型活性。
在另一个实施例中，代谢酶由D-氨基酸氨基转移酶基因(dat)编码。D-谷氨酸合成部分地由参与D-glu+pyr向α-酮戊二酸+D-ala转化的dat基因和逆反应控制。
在另一个实施例中，本发明中采用的dat基因具有GenBank登录号AF038439中示出的序列。在另一个实施例中，dat基因为本领域已知的任何其他dat基因。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的方法和组合物的dat基因由以下序列编码：
atgaaagtattagtaaataaccatttagttgaaagagaagatgccacagttgacattgaagaccgcggatatcagtttggtgatggtgtatatgaagtagttcgtctatataatggaaaattctttacttataatgaacacattgatcgcttatatgctagtgcagcaaaaattgacttagttattccttattccaaagaagagctacgtgaattacttgaaaaattagttgccgaaaataatatcaatacagggaatgtctatttacaagtgactcgtggtgttcaaaacccacgtaatcatgtaatccctgatgatttccctctagaaggcgttttaacagcagcagctcgtgaagtacctagaaacgagcgtcaattcgttgaaggtggaacggcgattacagaagaagatgtgcgctggttacgctgtgatattaagagcttaaaccttttaggaaatattctagcaaaaaataaagcacatcaacaaaatgctttggaagctattttacatcgcggggaacaagtaacagaatgttctgcttcaaacgtttctattattaaagatggtgtattatggacgcatgcggcagataacttaatcttaaatggtatcactcgtcaagttatcattgatgttgcgaaaaagaatggcattcctgttaaagaagcggatttcactttaacagaccttcgtgaagcggatgaagtgttcatttcaagtacaactattgaaattacacctattacgcatattgacggagttcaagtagctgacggaaaacgtggaccaattacagcgcaacttcatcaatattttgtagaagaaatcactcgtgcatgtggcgaattagagtttgcaaaataa(SEQ ID No:26；GenBank登录号：AF038439)。在另一个实施例中，编码dat的核苷酸与SEQ ID No:26)同源。在另一个实施例中，编码dat的核苷酸为SEQID NO:26的变体。在另一个实施例中，编码dat的核苷酸为SEQ ID NO:26的片段。在另一个实施例中，dat蛋白由本领域已知的任何其他dat基因编码。
在另一个实施例中，dat蛋白具有以下序列：
MKVLVNNHLVEREDATVDIEDRGYQFGDGVYEVVRLYNGKFFTYNEHIDRLYASAAKIDLVIPYSKEELRELLEKLVAENNINTGNVYLQVTRGVQNPRNHVIPDDFPLEGVLTAAAREVPRNERQFVEGGTAITEEDVRWLRCDIKSLNLLGNILAKNKAHQQNALEAILHRGEQVTECSASNVSIIKDGVLWTHAADNLILNGITRQVIIDVAKKNGIPVKEADFTLTDLREADEVFISSTTIEITPITHIDGVQVADGKRGPITAQLHQYFVEEITRACGELEFAK(SEQ ID No:27；GenBank登录号：AF038439)。在另一个实施例中，dat蛋白与SEQ ID No:27同源。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的变体。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的异构体。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的片段。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的同源物的片段。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的变体的片段。在另一个实施例中，dat蛋白为SEQ ID No:27的异构体的片段。
在另一个实施例中，dat蛋白为本领域已知的任何其他李斯特菌dat蛋白。在另一个实施例中，dat蛋白为本领域已知的任何其他革兰氏阳性dat蛋白。在另一个实施例中，dat蛋白为本领域已知的任何其他dat蛋白。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的方法和组合物的dat蛋白保留其酶活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留90％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留80％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留70％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留60％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留50％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留40％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留30％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留20％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留10％的野生型活性。在另一个实施例中，dat蛋白保留5％的野生型活性。
在另一个实施例中，代谢酶由dga编码。D-谷氨酸合成也部分地由dga基因控制，并且用于D-谷氨酸合成的营养缺陷突变体在不存在D-谷氨酸的情况下不会生长(Pucci等人1995,J Bacteriol.177:336-342)。在另一个实施例中，重组李斯特菌为D-谷氨酸营养缺陷型。另一个实例包括参与二氨基庚二酸合成的基因。这样的合成基因编码β-半醛脱氢酶，并且当失活时，使得突变体对于该合成途径是营养缺陷型(Sizemore等人1995,Science 270:299-302)。在另一个实施例中，dga蛋白为本领域已知的任何其他李斯特菌dga蛋白。在另一个实施例中，dga蛋白为本领域已知的任何其他革兰氏阳性dga蛋白。
在另一个实施例中，代谢酶由alr(丙氨酸消旋酶)基因编码。在另一个实施例中，代谢酶为本领域已知的参与丙氨酸合成的任何其他酶。在另一个实施例中，代谢酶为本领域已知的参与L-丙氨酸合成的任何其他酶。在另一个实施例中，代谢酶为本领域已知的参与D-丙氨酸合成的任何其他酶。在另一个实施例中，重组李斯特菌为D-丙氨酸营养缺陷型。对于丙氨酸合成营养缺陷型的细菌是本领域熟知的，并且描述于例如：大肠杆菌(Strych等人2002,J.Bacteriol.184:4321-4325)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(Tauch等人2002,J.Biotechnol 99:79-91)和单核细胞增多性李斯特菌(Frankel等人，美国专利6,099,848))、乳球菌属物种和乳杆菌属(Lactobacillus)物种(Bron等人2002,ApplEnviron Microbiol,68:5663-70)。在另一个实施例中，本领域已知的任何D-丙氨酸合成基因是失活的。
在另一个实施例中，代谢酶为氨基酸氨基转移酶。
在另一个实施例中，代谢酶由serC(磷酸丝氨酸氨基转移酶)编码。在另一个实施例中，代谢酶由asd(天冬氨酸β-半醛脱氢酶)编码，该asd参与细胞壁成分二氨基庚二酸的合成。在另一个实施例中，代谢酶由gsaB-谷氨酸-1-半醛氨基转移酶编码，该gsaB-谷氨酸-1-半醛氨基转移酶催化由(S)-4-氨基-5-氧代戊酸形成5-氨基乙酰丙酸。在另一个实施例中，代谢酶由HemL编码，该HemL催化由(S)-4-氨基-5-氧代戊酸形成5-氨基乙酰丙酸。在另一个实施例中，代谢酶由aspB编码，aspB是一种天冬氨酸氨基转移酶，其催化由L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸形成草酰乙酸和L-谷氨酸。在另一个实施例中，代谢酶由argF-1编码，该argF-1参与精氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由aroE编码，该aroE参与氨基酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由aroB编码，该aroB参与3-脱氢奎尼酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由aroD编码，该aroD参与氨基酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由aroC编码，该aroC参与氨基酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由hisB编码，该hisB参与组氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由hisD编码，该hisD参与组氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由hisG编码，该hisG参与组氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由metX编码，该metX参与甲硫氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由proB编码，该proB参与脯氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由argR编码，该argR参与精氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由argJ编码，该argJ参与精氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由thiI编码，该thiI参与硫胺素生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由LMOf2365_1652编码，该LMOf2365_1652参与色氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由aroA编码，该aroA参与色氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由ilvD编码，该ilvD参与缬氨酸和异亮氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由ilvC编码，该ilvC参与缬氨酸和异亮氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由leuA编码，该leuA参与亮氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由dapF编码，该dapF参与赖氨酸生物合成。在另一个实施例中，代谢酶由thrB编码，该thrB参与苏氨酸生物合成(全部GenBank登录号NC_002973)。
在另一个实施例中，代谢酶为tRNA合成酶。在另一个实施例中，代谢酶由trpS基因编码，该trpS基因编码色氨酰tRNA合成酶。在另一个实施例中，代谢酶为本领域已知的任何其他tRNA合成酶。
在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株已经在动物宿主中传代。在另一个实施例中，传代使菌株作为疫苗载体的功效最大化。在另一个实施例中，传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，传代稳定李斯特菌菌株的毒性。在另一个实施例中，传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，传代增强李斯特菌菌株的毒性。在另一个实施例中，传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，传代让菌株减毒，或者在另一个实施例中让菌株毒力减小。让重组李斯特菌菌株在动物宿主中传代的方法为本领域所熟知的，例如在美国专利申请No.10/541,614中有描述。
本发明所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株在另一个实施例中是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeriagrayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeriaivanovii)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeriamurrayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组威耳逊李斯特菌(Listeriawelshimeri)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌属菌种的重组菌株。每种可能性代表了本文所公开的独立实施例。在另一个实施例中，用于本文所公开的方法和组合物中的李斯特菌蛋白的序列来自上述菌株中的任一种。
在一个实施例中，本文所公开的单核细胞增多性李斯特菌菌株为EGD菌株、10403S菌株、NICPBP 54002菌株、S3菌株、NCTC 5348菌株、NICPBP 54006菌株、M7菌株、S19菌株或本领域已知的另一种单核细胞增多性李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株为疫苗菌株，其在一个实施例中为细菌疫苗菌株。
在另一个实施例中，用于本发明的方法中的重组李斯特菌菌株已储存在冷冻细胞库中。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株已储存在冻干细胞库中。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的细胞库为主细胞库。在另一个实施例中，细胞库为工作细胞库。在另一个实施例中，细胞库为良好生产规范(GMP)细胞库。在另一个实施例中，细胞库旨在用于制备临床级材料。在另一个实施例中，细胞库符合人用监管规范。在另一个实施例中，细胞库是本领域已知的任何其他类型的细胞库。
“良好生产规范”在另一个实施例中由美国联邦法规(United States Code ofFederal Regulations)的(21CFR 210–211)定义。在另一个实施例中，“良好生产规范”由生产临床级材料或供人类消耗的其他标准定义，例如美国之外的国家/地区的标准。
在另一个实施例中，本发明的方法中所用的重组李斯特菌菌株来自一批疫苗剂量。
在另一个实施例中，本发明的方法中所用的重组李斯特菌菌株来自通过本文所公开的方法制备的冷冻储存物。
在另一个实施例中，本发明的方法中所用的重组李斯特菌菌株来自通过本文所公开的方法制备的冻干储存物。
在另一个实施例中，本发明的细胞库，冷冻储存物或批疫苗剂量表现出在解冻时大于90％的活力。在另一个实施例中，储存后解冻以冷冻保存或冷冻储存24小时。在另一个实施例中，储存持续2天。在另一个实施例中，储存持续3天。在另一个实施例中，储存持续4天。在另一个实施例中，储存持续1周。在另一个实施例中，储存持续2周。在另一个实施例中，储存持续3周。在另一个实施例中，储存持续1个月。在另一个实施例中，储存持续2个月。在另一个实施例中，储存持续3个月。在另一个实施例中，储存持续5个月。在另一个实施例中，储存持续6个月。在另一个实施例中，储存持续9个月。在另一个实施例中，储存持续1年。
在另一个实施例中，本发明的细胞库，冷冻储存物或批疫苗剂量通过如下方法来冷冻保存，所述方法包括在营养培养基中生长李斯特菌菌株的培养物、在包含甘油的溶液中冷冻所述培养物以及在低于-20℃下储存李斯特菌菌株。在另一个实施例中，温度为约-70℃。在另一个实施例中，温度为约-70至-80℃。
在本发明的方法和组合物的另一个实施例中，从细胞库接种培养物(例如用于产生一批李斯特菌疫苗剂量的李斯特菌疫苗株的培养物)。在另一个实施例中，培养物从冷冻储存物接种。在另一个实施例中，培养物从发酵剂培养物接种。在另一个实施例中，培养物从集落接种。在另一个实施例中，培养物在对数生长期中期接种。在另一个实施例中，培养物在大致对数生长期中期接种。在另一个实施例中，培养物在另一生长期接种。
在本发明的方法和组合物的另一个实施例中，用于冷冻的溶液含有量为2-20％的甘油。在另一个实施例中，量为2％。在另一个实施例中，量为20％。在另一个实施例中，量为1％。在另一个实施例中，量为1.5％。在另一个实施例中，量为3％。在另一个实施例中，量为4％。在另一个实施例中，量为5％。在另一个实施例中，量为2％。在另一个实施例中，量为2％。在另一个实施例中，量为7％。在另一个实施例中，量为9％。在另一个实施例中，量为10％。在另一个实施例中，量为12％。在另一个实施例中，量为14％。在另一个实施例中，量为16％。在另一个实施例中，量为18％。在另一个实施例中，量为222％。在另一个实施例中，量为25％。在另一个实施例中，量为30％。在另一个实施例中，量为35％。在另一个实施例中，量为40％。
在另一个实施例中，用于冷冻的溶液含有具有抗冻性质的另一种依数性添加剂或添加剂以代替甘油。在另一个实施例中，除了甘油之外，用于冷冻的溶液含有具有抗冻性质的另一种依数性添加剂或添加剂。在另一个实施例中，添加剂为甘露糖醇。在另一个实施例中，添加剂为DMSO。在另一个实施例中，添加剂为蔗糖。在另一个实施例中，添加剂为本领域已知的具有抗冻性质的任何其他依数性添加剂或添加剂。
在一个实施例中，疫苗是作为暴露于组合物的结果引起对所述组合物中的抗原或多肽的免疫应答的组合物。在另一个实施例中，疫苗另外包含佐剂、细胞因子、趋化因子或它们的组合。在另一个实施例中，疫苗或组合物另外包含抗原呈递细胞(APC)，其在一个实施例中是自体的，而在另一个实施例中，它们对于受试者是同种异体的。
在一个实施例中，疫苗是作为暴露于组合物的结果在宿主中引起对所述组合物中的抗原或多肽的免疫应答的组合物。在一个实施例中，免疫应答针对特定抗原或抗原上的特定表位。在一个实施例中，疫苗可为肽疫苗，在另一个实施例中，可为DNA疫苗。在另一个实施例中，疫苗可以包含在细胞内，并且在另一个实施例中通过细胞递送，在一个实施例中，细胞为细菌细胞，在一个实施例中，细菌细胞为李斯特菌。在一个实施例中，疫苗可防止受试者感染或发展出疾病或病症，其中在另一个实施例中，疫苗对患有疾病或病症的受试者可为治疗性的。在一个实施例中，本发明的疫苗包含本发明的组合物和佐剂、细胞因子、趋化因子或它们的组合。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的重组李斯特菌的免疫原性组合物。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的免疫原性组合物包含本发明的重组疫苗载体。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本发明的质粒。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含佐剂。在一个实施例中，本发明的载体可作为疫苗组合物的一部分施用。
在另一个实施例中，本发明的疫苗与佐剂一起递送。在一个实施例中，佐剂有利于主要由Th1介导的免疫应答。在另一个实施例中，佐剂有利于Th1型免疫应答。在另一个实施例中，佐剂有利于Th1介导的免疫应答。在另一个实施例中，佐剂有利于细胞介导的免疫应答超过抗体介导的应答。在另一个实施例中，佐剂是本领域已知的任何其他类型的佐剂。在另一个实施例中，免疫原性组合物诱导针对靶蛋白的T细胞免疫应答的形成。
在另一个实施例中，佐剂为MPL。在另一个实施例中，佐剂为QS21。在另一个实施例中，佐剂为TLR激动剂。在另一个实施例中，佐剂为TLR4激动剂。在另一个实施例中，佐剂为TLR9激动剂。在另一个实施例中，佐剂为在另一个实施例中，佐剂为咪喹莫特。在另一个实施例中，佐剂为CpG寡核苷酸。在另一个实施例中，佐剂为细胞因子或编码其的核酸。在另一个实施例中，佐剂为趋化因子或编码其的核酸。在另一个实施例中，佐剂为IL-12或编码其的核酸。在另一个实施例中，佐剂为IL-6编码其的核酸。在另一个实施例中，佐剂为脂多糖。在另一个实施例中，佐剂如描述于Fundamental Immunology第5版(2003年8月)：William E.Paul(编辑)；Lippincott Williams&Wilkins Publishers；第43章：Vaccines,GJV Nossal，该文献据此全文以引用方式并入。在另一个实施例中，佐剂为本领域已知的任何其他佐剂。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，本文提供了诱导受试者的对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在一个实施例中，本文提供了诱导受试者的对抗原的抗血管生成免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，所述重组李斯特菌菌株包含第一核酸分子和第二核酸分子。在另一个实施例中，每个所述核酸分子编码异源性抗原。在另一个实施例中，所述第一核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与包含PEST序列的内源多肽一起作为开放读框。
在一个实施例中，本文提供了治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，所述重组李斯特菌菌株包含第一核酸分子和第二核酸分子。在另一个实施例中，每个所述核酸分子编码异源性抗原。在另一个实施例中，所述第一核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与编码包含PEST序列的内源多肽的核酸序列一起作为开放读框。在另一个实施例中，所述抗原中的至少一者由所述癌细胞中的至少一个细胞表达。
在一个实施例中，本文提供延缓受试者的癌症发作的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本发明提供延缓受试者的癌症进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本文提供延长受试者的癌症缓解的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本文提供减小受试者的现有肿瘤的大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本文提供防止现存肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本文提供新肿瘤或另外肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。
在一个实施例中，可在已知易感特定癌症或肿瘤的特定群体中预防癌症或肿瘤。在一个实施例中，这种易感性可归因于环境因素，例如吸烟，其在一个实施例中可导致群体遭受肺癌，而在另一个实施例中，这种易感性可归因于遗传因素，例如具有BRCA1/2突变的群体在一个实施例中可能易感乳腺癌，在另一个实施例中易感卵巢癌。在另一个实施例中，染色体8q24，染色体17q12和染色体17q24.3上的一种或多种突变可增加对前列腺癌的易感性，如本领域已知的。促成癌症易感性的其他遗传和环境因素是本领域已知的。
在另一个实施例中，将重组李斯特菌菌株以1×106-1×107个CFU的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，将重组李斯特菌菌株以1×107-1×108个CFU的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，将重组李斯特菌菌株以1×108-3.31×1010个CFU的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，将重组李斯特菌菌株以1×109-3.31×1010个CFU的剂量施用于受试者。在另一个实施例中，剂量为5-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为7-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为10-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为20-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为30-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为50-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为70-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为100-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为150-500×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-300×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-200×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-15×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-100×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-70×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-50×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-30×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为5-20×108个CFU。在另一个实施例中，剂量为1-30×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为1-20×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为2-30×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为1-10×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为2-10×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为3-10×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为2-7×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为2-5×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为3-5×109个CFU。
在另一个实施例中，剂量为1×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为1.5×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为2×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为3×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为4×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为5×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为6×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为7×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为8×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为10×107个生物体。在另一个实施例中，剂量为1.5×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为2×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为2.5×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为3×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为3.3×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为4×108个生物体。在另一个实施例中，剂量为5×108个生物体。
在另一个实施例中，剂量为1×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为1.5×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为2×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为3×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为4×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为5×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为6×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为7×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为8×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为10×109个生物体。在另一个实施例中，剂量为1.5×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为2×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为2.5×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为3×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为3.3×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为4×1010个生物体。在另一个实施例中，剂量为5×1010个生物体。
在一个实施例中，本发明的方法还包括用本文提供的重组李斯特菌菌株强化受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用强化剂量的疫苗的步骤，所述疫苗包含本文提供的重组李斯特菌菌株。
技术人员将认识到，术语“强化”可涵盖向受试者施用另外的疫苗或免疫原性组合物或重组李斯特菌菌株剂量。在本发明方法的另一个实施例中，施用2次强化(或总共3次接种)。在另一个实施例中，施用3次强化。在另一个实施例中，施用4次强化。在另一个实施例中，施用5次强化。在另一个实施例中，施用6次强化。在另一个实施例中，施用超过6次强化。
在另一个实施例中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施例中，强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施例中，强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，将相同的剂量用于初免和强化接种。在另一个实施例中，将大剂量用于强化。在另一个实施例中，将小剂量用于强化。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化疫苗接种施用于受试者的步骤。在一个实施例中，强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施例中，单次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，三次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在一个实施例中，初免和强化疫苗之间的周期由技术人员通过实验确定。在另一个实施例中，初免和强化疫苗之间的间隔时间为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又另一个实施例中强化疫苗在初免疫苗后8-10周给药。
在一个实施例中，本发明的方法还包括用本文提供的重组李斯特菌菌株强化人受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含本文提供的重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化免疫原性组合物施用于受试者的步骤。在一个实施例中，强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文提供的重组李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，剂量由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。
异源性“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider等人,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人,Vaccine 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA疫苗初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+ T细胞应答或CD8+ T细胞应答的最有效方式。Shiver J.W.等人,Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人,Vaccine20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人,Vaccine 19:95-102(2000)；Sin,J.I.等人,DNA Cell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIV gagDNA对猴进行初免接种后接着以表达HIV gag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIVgag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等人Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172 A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。该专利所考虑的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)和病原菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。
在一个实施例中，核酸分子编码存活素并且所述方法用于治疗、抑制或阻遏淋巴瘤。在另一个实施例中，核酸分子编码存活素并且所述方法用于治疗、抑制或阻遏乳腺癌或本文提供的任何其他类型的癌症。在另一个实施例中，核酸分子编码存活素并且所述方法治疗、抑制或阻遏淋巴瘤转移，所述转移在一个实施例中包括向骨转移，并且在另一个实施例中包括向其他器官转移。
在一个实施例中，淋巴瘤是B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，霍奇金淋巴瘤(HL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或它们的组合。
作为本文所公开的方法和组合物的靶的癌症在另一个实施例中是黑素瘤。在另一个实施例中，癌症为恶性毒瘤。在另一个实施例中，癌症为恶性肿瘤。在另一个实施例中，癌症为间皮瘤(例如恶性间皮瘤)。在另一个实施例中，癌症为神经胶质瘤。在另一个实施例中，癌症为生殖细胞肿瘤。在另一个实施例中，癌症为绒毛膜癌。
在另一个实施例中，癌症为胰腺癌。在另一个实施例中，癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施例中，癌症为胃癌。在另一个实施例中，癌症为胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，癌症为结直肠腺癌。在另一个实施例中，癌症为肺鳞癌。在另一个实施例中，癌症为胃腺癌。在另一个实施例中，癌症为卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施例中，癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施例中，癌症为非小细胞肺癌。在另一个实施例中，癌症为子宫内膜癌。在另一个实施例中，癌症为膀胱癌。在另一个实施例中，癌症为头颈癌。在另一个实施例中，癌症为肛门癌。在另一个实施例中，癌症为食道癌。在另一个实施例中，癌症为胃癌。在另一个实施例中，癌症为前列腺癌。
在另一个实施例中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施例中，癌症为结肠癌。在另一个实施例中，癌症为肺癌。在另一个实施例中，癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，癌症为子宫癌。在另一个实施例中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施例中，癌症为肝细胞癌。在另一个实施例中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施例中，癌症为肝癌。在另一个实施例中，癌症为肾癌。在另一个实施例中，癌症为卡波西氏肉瘤。在另一个实施例中，癌症为恶性毒瘤。在另一个实施例中，癌症为另一种恶性肿瘤或恶性毒瘤。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于治疗与本文所述的任何癌症相关或源自所述任何癌症的实体瘤。在另一个实施例中，肿瘤为Wilms肿瘤。在另一个实施例中，肿瘤为促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤。
在另一个实施例中，在人受试者中测试疫苗，并且使用本领域熟知的方法监测功效，例如，直接测量CD4+和CD8+ T细胞应答，或测量疾病进展，例如，通过确定肿瘤转移的数量或大小，或监测疾病症状(咳嗽，胸痛，体重减轻等)。用于评估前列腺癌疫苗在人受试者中的功效的方法是本领域熟知的，并且描述于例如Uenaka A等人(T cellimmunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex ofcholesterol-bearing hydrophobized pullulan(CHP)and NY-ESO-1 protein.CancerImmun.2007年4月19日；7:9)和Thomas-Kaskel AK等人(Vaccination of advancedprostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cellsinduces DTH responses that correlate with superior overall survival.Int JCancer.2006年11月15日；119(10):2428-34)。
在一个实施例中，本文提供重组李斯特菌菌株，其包含可操作地整合进李斯特菌基因组中的核酸分子。在另一个实施例中，所述核酸分子编码(a)包含PEST序列的内源多肽，和(b)开放读框中包含抗原的多肽。
在一个实施例中，本文提供了治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌菌株。在另一个实施例中，所述重组李斯特菌菌株包含第一核酸分子和第二核酸分子。在另一个实施例中，每个所述核酸分子编码异源性抗原。在另一个实施例中，所述第一核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中与包含PEST序列的天然多肽一起作为开放读框并且其中所述抗原由所述肿瘤的至少一个细胞表达。在另一个实施例中，第一核酸分子和第二核酸分子均被游离型表达。
在一个实施例中，术语“抗原”是指当与生物体接触时导致来自生物体的可检测免疫应答的物质。抗原可为脂质、肽、蛋白质、碳水化合物、核酸或其组合和变型形式。
在一个实施例中，“变体”是指不同于大多数群体但仍然与共同模式足够相似以被认为是它们之一的氨基酸或核酸序列(或在其他实施例中，生物体或组织)，例如剪接变体。
在一个实施例中，“同种型”是指这样一种型式的分子，例如蛋白质，其与同一蛋白质的另一同种型或型式相比仅具有轻微差异。在一个实施例中，同种型可以从不同但相关的基因产生，或在另一个实施例中，可通过选择性剪接从相同基因产生。在另一个实施例中，同种型由单核苷酸多态性引起。
在一个实施例中，“片段”是指比全长蛋白质或多肽更短或包含更少氨基酸的蛋白质或多肽。在另一个实施例中，片段是指比全长核酸更短或包含更少核苷酸的核酸。在另一个实施例中，片段为N末端片段。在另一个实施例中，片段为C末端片段。在一个实施例中，片段是蛋白质、肽或核酸的内切部分。在一个实施例中，片段为功能性片段。在另一个实施例中，片段为免疫原性片段。在一个实施例中，片段具有10-20个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有超过5个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-500个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有50-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有10-250个核酸或氨基酸。
在一个实施例中，本文中使用"免疫原性"或“免疫原性的”来指当蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体被施用于动物时所述蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体在所述动物内引起免疫应答的固有能力。因此，在一个实施例中，"增强免疫原性"是指提高当蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体被施用于动物时所述蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体在所述动物内引起免疫应答的固有能力。在一个实施例中，可通过如下方面测量蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体引起免疫应答的能力的提高：更大量的针对蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体的抗体、更具多样性的针对抗原或生物体的抗体、更大量的特异于蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体的T细胞、针对蛋白质、肽、核酸、抗原或生物体的更强的细胞毒性或辅助T细胞应答等等。
在一个实施例中，“同源物”是指与特定核酸或氨基酸序列共享一定百分比的序列同一性的核酸或氨基酸序列。在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法中可用的序列可为本文所述或本领域已知的特定LLO序列或其N末端片段、ActA序列或其N末端片段或PEST序列的同源物。在一个实施例中，这样的同源物得以维持，在另一个实施例中，本文所公开的组合物和方法中可用的序列可为抗原性多肽的同源物，在一个实施例中，所述抗原性多肽为存活素或其片段。在一个实施例中，本发明的多肽的同源物，以及在一个实施例中，编码这种同源物的核酸维持亲本多肽的功能特性。例如，在一个实施例中，本发明的抗原性多肽的同源物维持亲本多肽的抗原性特征。在另一个实施例中，本文所公开的组合物和方法中可用的序列可为本文所述的任何序列的同源物。在一个实施例中，同源物与特定序列共享至少68％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少70％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少72％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少75％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少78％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少80％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少82％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少83％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少85％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少87％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少88％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少90％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少92％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少93％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少95％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少96％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少97％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少98％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少99％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少100％的同一性。
在一个实施例中，应当理解，本文所公开的和/或如本文所述的任何序列的同源物被认为是本发明的一部分。
在一个实施例中，本文中所使用的"功能性"在本发明内的含义是指蛋白质、肽、核酸、片段或其变体表现出生物活性或功能的固有能力。在一个实施例中，这种生物功能是其与相互作用伴侣例如膜相关受体结合的结合特性，而在另一实施例中，是其三聚化特性。就本发明的功能性片段和功能性变体而言，这些生物功能实际上可以改变，例如在其特异性或选择性方面发生改变，但保留基本的生物功能。
技术人员将理解的是，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是防止或减轻如本文所述的目标病理性病症或障碍。因此，在一个实施例中，治疗可以包括直接影响或治愈、遏制、抑制、预防疾病、障碍或病症，降低其严重程度，延缓其发作，减少与其相关的症状，或它们的组合。因此，在一个实施例中，“治疗”尤其是指延缓进展、加快缓解、引起缓解、增强缓解、加快恢复、提高替代治疗剂的功效或减小对其的抗性、或它们的组合。在一个实施例中，“预防”或“阻遏”尤其是指延缓症状的发作、防止疾病的复发、降低复发事件的次数或频率、延长有症状事件之间的潜伏期、或它们的组合。在一个实施例中，“遏制”或“抑制”尤其是指降低症状的严重程度、降低急性事件的严重程度、减少症状的数量、降低疾病相关症状的发病率、缩短症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期、或它们的组合。
在一个实施例中，症状是原发性的，而在另一个实施例中，症状是继发性的。在一个实施例中，“原发性的”是指作为特定疾病或障碍的直接结果的症状，而在一个实施例中，“继发性的”是指由原发性原因产生或引起的症状。在一个实施例中，用于本发明中的化合物治疗原发性或继发性症状或继发性并发症。在另一个实施例中，“症状”可以是疾病或病理性病症的任何表现。
在一个实施例中，静脉内施用本文所公开的方法中使用的组合物。在另一个实施例中，疫苗经口施用，而在另一个实施例中，疫苗经肠胃外施用(例如皮下，肌肉内等)。
此外，在另一个实施例中，组合物或疫苗作为栓剂施用，例如直肠栓剂或尿道栓剂。此外，在另一个实施例中，药物组合物通过皮下植入丸剂来施用。在另一个实施例中，丸剂提供试剂在一段时间内的受控释放。在另一个实施例中，药物组合物以胶囊形式施用。
在一个实施例中，施用途径可以是肠胃外的。在另一个实施例中、途径可以是眼内的、结膜的、局部的、透皮的、皮内的、皮下的、腹膜内的、静脉内的、动脉内的、阴道的、直肠的、肿瘤内的、经癌灶(parcanceral)、经粘膜的、肌内的、血管内的、心室内的、颅内的、吸入(气雾剂)、鼻吸入(喷雾)、鼻内(滴剂)、舌下、口服、气雾剂或栓剂或它们的组合。对于鼻内施用或通过吸入施用，在合适的适当载体存在下混合并烟雾化或雾化的化合物的溶液或悬浮液。这种气雾剂可包括本文所述的任何试剂。在一个实施例中，本文所述的组合物可以是适合于颅内施用的形式，在一个实施例中，其为鞘内和脑室内施用。在一个实施例中，施用方案将由熟练的临床医生基于诸如所治疗的病症的确切性质、病症的严重性、患者的年龄和一般身体状况、体重和个体患者的反应等因素等来确定。
在一个实施例中，肠胃外施用，特别合适的是可注射的无菌溶液，优选油性或水性溶液，以及悬浮液、乳液或植入物，包括栓剂和灌肠剂。安瓿剂是便利的单位剂量。这种栓剂可包括本文所述的任何试剂。
在一个实施例中，可配制持续或定向释放组合物，例如脂质体或其中活性化合物用可差异降解性包衣例如通过微胶囊化、多重包衣等保护的那些。此类组合物可以配制用于立即或缓慢释放。还可冷冻干燥新化合物并使用所获得的冻干物，例如用于制备注射产品。
在一个实施例中，对于液体制剂，药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的例子为石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油和鱼肝油。
在一个实施例中，本发明的组合物是药学上可接受的。在一个实施例中，术语“药学上可接受的”是指安全的并且为有效量的用于本发明的至少一种化合物的所需施用途径提供适当递送的任何制剂。此术语也指缓冲制剂的使用，其中根据化合物的稳定性和施用途径，将pH维持在范围为pH 4.0至pH 9.0的特定期望值。
在一个实施例中，本发明的方法中的组合物或在本发明的方法中使用的组合物可以单独施用或在组合物内施用。在另一个实施例中，可以使用本发明的组合物与常规赋形剂的混合物，所述赋形剂即为适于肠胃外、肠内(例如经口)或局部施用的不与活性化合物有害反应的药学上可接受的有机或无机载体物质。在一个实施例中，合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、白色石蜡、甘油、藻酸盐、透明质酸、胶原、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。在另一个实施例中，药物制剂可被灭菌并且如果需要与辅助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、调味物质和/或芳香物质等混合，这些辅助剂不会与活性化合物有害地反应。在另一个实施例中，它们也可以根据需要与其他活性剂例如维生素组合。
在一个实施例中，用于本文所公开的方法和组合物的组合物可与载体/稀释剂一起施用。固体载体/稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如、聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或它们的混合物。
在一个实施例中，用于本文所公开的方法和组合物的组合物可包含本发明的组合物和一种或多种有效预防或治疗癌症的其他化合物。在一些实施例中，另外的化合物可包括在化疗中可用的化合物，其在一个实施例中为顺铂。在另一个实施例中，异环磷酰胺、氟尿嘧啶5-FU、伊立替康、紫杉醇(Taxol)、多西他赛、吉西他滨、托泊替康或它们的组合可以与本文所公开的组合物一起施用以用于本文所公开的方法中。在另一个实施例中、安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶(Crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、亚叶酸、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链脲霉素、替加氟尿嘧啶、替莫唑胺、硫鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或它们的组合可与本文所公开的组合物一起施用以用于本文所公开的方法中。
在另一个实施例中，通过包括亚克隆适当序列，然后表达所得核苷酸的方法来制备本文所公开的融合蛋白。在另一个实施例中，克隆子序列，并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。在另一个实施例中，然后连接片段生成所需的DNA序列。在另一个实施例中，编码融合蛋白的DNA使用DNA扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)制备。首先，在天然DNA片段的新末端的任一侧单独扩增。一个扩增的序列的5'末端编码肽接头，而另一个扩增的序列的3'末端也编码肽接头。由于第一片段的5'末端与第二片段的3'末端互补，两个片段(在部分纯化后，如在LMP琼脂糖上)可在第三PCR反应中用作重叠模板。扩增的序列将包含密码子、开口位点羧基侧上的片段(现在形成氨基序列)、接头和开口位点氨基侧上的序列(现在形成羧基序列)。然后将插入片段连接进质粒。在另一个实施例中，类似的策略用于产生其中HMW-MAA片段嵌入异源肽内的蛋白质。
在一个实施例中，本发明还提供包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与包含PEST序列的内源多肽一起作为开放读框。
在一个实施例中，本文提供表达异源性抗原的重组李斯特菌，所述异源性抗原包括可操作地整合进基因组中，与包含PEST序列的多肽或其片段一起作为开放读框的抗原。在另一个实施例中，本文提供重组李斯特菌，所述重组李斯特菌从游离型质粒表达融合至包含PEST序列的多肽或其片段的异源性抗原。在另一个实施例中，抗原和包含PEST序列的多肽从重组李斯特菌的细胞质中存在的游离型载体表达。在另一个实施例中，所述多肽或其片段为ActA或LLO。在另一个实施例中，所述抗原为存活素或本文提供的任何其他抗原。在另一个实施例中，所述片段为免疫原性片段。在另一个实施例中，所述游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。
在另一个实施例中，基因或蛋白质表达通过本领域熟知的方法测定，所述方法在另一个实施例中包括实时PCR、实施例、免疫印迹等。在另一个实施例中，所述第一抗原或第二抗原的表达受诱导型系统控制，而在另一个实施例中，所述第一抗原或第二抗原的表达受组成型启动子控制。在另一个实施例中，诱导型表达系统是本领域熟知的。
用于转化细菌的方法是本领域熟知的，并包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法、噬菌体介导的转导、化学和物理转化技术(de Boer等人1989,Cell 56:641-649；Miller等人1995,FASEB J.,9:190-199；Sambrook等人1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等人,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt等人编辑,1994,Methods for General and MolecularBacteriology,American Society forMicrobiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌疫苗株通过电穿孔转化。
在另一个实施例中，本文提供抑制癌症发作的方法，所述方法包括施用重组李斯特菌组合物的步骤，所述重组李斯特菌组合物表达本文提供的异源性抗原并且由所述癌症特异性表达或在所述癌症中特异性表达。
在一个实施例中，本文提供治疗受试者的肿瘤的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文提供改善与受试者的癌症相关的症状的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。
在一个实施例中，本文提供保护受试者免于癌症的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。
在另一个实施例中，本文提供延缓癌症发作的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。在另一个实施例中，本文提供治疗转移性癌症的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。在另一个实施例中，本文提供了预防转移性癌症或微小转移的方法，所述方法包括施用表达本文提供的异源性抗原的重组李斯特菌组合物的步骤。在另一个实施例中，重组李斯特菌组合物经口、静脉内或胃肠外施用。
在本文所公开的方法和组合物的另一个实施例中，“核酸”或“核苷酸”指一串至少两个碱基-糖-磷酸的组合。该术语在一个实施例中包括DNA和RNA。在一个实施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA等人Genes&Devel 16:2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一个实施例中，该术语还包括可包含其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施例中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施例中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施例中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施例中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NKet al Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell编辑和Methods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。
术语“多肽”、“肽”和“重组肽”在另一个实施例中是指任何长度的肽或多肽。在另一个实施例中，本文所公开的肽或重组肽具有上文针对存活素片段列举的长度之一。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。在一个实施例中，术语“肽”是指原生肽(降解产物、合成法合成的肽或重组肽)和/或模拟肽(通常为合成法合成的肽)，诸如作为肽类似物的拟肽和半拟肽，所述肽类似物可具有例如能使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。此类修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并在例如Quantitative DrugDesign,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中有详细说明，该文献以引用方式并入，如同在本文完整示出一样。下文提供该方面的进一步细节。
在一个实施例中，本文中使用“抗原性多肽”来指在存在于受试者细胞中的MHC I类和/或II类分子上加工和呈递从而当存在于宿主体内时或在另一个实施例中被宿主检测到时导致产生免疫应答的如上文所述的多肽、肽或重组肽。
肽当中的肽键(-CO-NH-)可例如被以下键取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、*-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R为任何烷基，例如甲基)、亚甲基氨基键(carba bond)(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为天然存在于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可出现在沿着肽链的任何键上，甚至同时出现在几个(2-3个)键上。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可被合成的非天然酸诸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr取代。
除以上之外，本文所公开的肽还可包含一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施例中，术语“寡核苷酸”可与术语“核酸”互换，并且可以指可包括但不限于原核序列、真核mRNA、得自真核mRNA的cDNA、得自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列的分子。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。
在另一个实施例中，“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，周期为15代。在另一个实施例中，周期为20代。在另一个实施例中，周期为25代。在另一个实施例中，周期为30代。在另一个实施例中，周期为40代。在另一个实施例中，周期为50代。在另一个实施例中，周期为60代。在另一个实施例中，周期为80代。在另一个实施例中，周期为100代。在另一个实施例中，周期为150代。在另一个实施例中，周期为200代。在另一个实施例中，周期为300代。在另一个实施例中，周期为500代。在另一个实施例中，周期为500代以上。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体外(例如培养中)稳定的保持。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体内稳定的保持。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体外和体内都稳定的保持。
在一个实施例中，术语“氨基酸”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；通常被体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸，羟赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"可包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸，其具有与参考核酸相似或改善的结合特性(就所需目的而言)。该术语还包括以与天然存在的核苷酸类似的方式或以为了所需目的而改进的速率进行代谢的核酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构。本发明提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3'-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)；参见例如，Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,F.Eckstein编辑，IRL Press at Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies,Annals of the New York Academy of Sciences,Volume600,编辑，Baserga and Denhardt(NYAS 1992)；Mulligan(1993)J.Med.Chem.36:1923-1937；Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。PNA含有非离子主链，例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。硫代磷酸酯键描述于例如WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appi.Pharmacol.144:189-197中。该术语涵盖的其他合成主链包括甲基-膦酸酯键或交替的甲基膦酸酯和磷酸二酯键(Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36:8692-8698)，和苄基膦酸酯键(Samstag (1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6:153-156)。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探针和扩增产物互换使用。
在本文所公开的方法和组合物的一个实施例中，术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导位于重组位点侧翼的核酸片段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
“噬菌体表达载体”或“噬粒”指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型或诱导型表达本文所公开的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线状或环状表达系统，并涵盖保持游离或者整合进宿主细胞基因组的两种基于噬菌体的表达载体。
在一个实施例中，如本文所用的术语“可操作地连接”意味着将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来讲，这意味着将启动子和转录引发或起始序列定位在编码区的5'。
在一个实施例中，“开放读框”或“ORF”为生物体基因组的一部分，其含有可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施例中，ORF的开始和结束端不等同于mRNA的末端，但它们通常包含在该mRNA内。在一个实施例中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，在一个实施例中，可操作地整合进基因组中与内源多肽一起作为开放读框的核酸分子为已整合进基因组中与内源多肽处于相同开放读框中的核酸分子。
在一个实施例中，本发明提供包含接头序列的融合多肽。在一个实施例中，“接头序列”是指连接两个异源多肽或其片段或域的氨基酸序列。一般来讲，如本文所用，接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放读框编码的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员将认识到，接头可包含另外的氨基酸，诸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。
在一个实施例中，如本文所用的“内源性”描述已在参考生物体内发育或起源的或因参考生物体内的成因而产生的某物。在另一个实施例中，内源性是指天然的。
技术人员将认识到，术语“异源性”涵盖源自与参考物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表达异源多肽的李斯特菌菌株在一个实施例中将表达不是该李斯特菌菌株天然的或内源性的多肽，或在另一个实施例中，通常不由该李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施例中，来自该李斯特菌菌株之外的来源的多肽。在另一个实施例中，异源性可用于描述源自同一物种内的不同生物体的某物。在另一个实施例中，异源性抗原由李斯特菌的重组菌株表达，并在哺乳动物细胞被该重组菌株感染后加工且呈递到细胞毒性T细胞。在另一个实施例中，由李斯特菌菌种表达的异源性抗原不需要与肿瘤细胞或传染原中对应的未修饰的抗原或蛋白精确匹配，只要其导致可识别在哺乳动物中天然表达的未修饰抗原或蛋白的T细胞应答即可。术语异源性抗原在本文可称为“抗原性多肽”、“异源性蛋白”、“异源性蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原”等。
技术人员将认识到，术语“游离型表达载体”涵盖这样的核酸载体，其可以为线性的或环状的，并且其通常为双链的形式且在染色体外，因为其存在于宿主细菌或细胞的细胞质中，而不是整合进细菌或细胞的基因组。在一个实施例中，游离型表达载体包含所关注的基因。在另一个实施例中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注的基因的扩增，并在另一个实施例中，在必要时提供病毒反式作用因子。在另一个实施例中，游离型表达载体在本文可被称为质粒。在另一个实施例中，“整合型质粒”包含这样的序列，该序列将该质粒的插入或所携带的所关注基因的插入靶向宿主基因组内。在另一个实施例中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合进细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施例中，存在所插入的异源性基因不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施例中，在稳定的转染程序中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNA cloning by direct phenotypiccorrection of a mutant human cell line (HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression vector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho-hematopoietic celllines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体、体外细胞。载体也可以单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
在一个实施例中，术语“融合”是指通过共价键合可操作地连接。在一个实施例中，该术语包括(核酸序列或其开放读框的)重组融合。在另一个实施例中，该术语包括化学偶联。
在一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。在另一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源性DNA分子。
在另一个实施例中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合的方法是本领域熟知的，并例如在Nikodinovic J等人(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006 Nov；56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。
“代谢酶”在另一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，酶为营养物的合成所需。
在一个实施例中，如本文所用的术语“减毒”表示细菌在动物中的致病能力降低。换句话讲，减毒李斯特菌菌株的病原学特性与野生型李斯特菌相比已降低，虽然减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠的静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，甚至更优选地至少约10,000倍，最优选地至少约100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因此是不杀死施用该菌株的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在该环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。本发明的减毒菌株因此是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌表达异源多肽，如本文所述，在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌分泌异源多肽，如本文所述，并且在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌表达并分泌异源多肽，如本文所述。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌包含异源多肽，并且在另一个实施例中，包含编码异源多肽的核酸。
在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株可用于制备疫苗。在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株可用于制备肽疫苗。制备肽疫苗的方法是本领域熟知的，并且描述于例如EP1408048、美国专利申请号20070154953和OGASAWARA等人(Proc.Nati.Acad.Sci.USA，第89卷第8995-8999页，1992年10月)。在一个实施例中，肽进化技术用于产生具有更高免疫原性的抗原。用于肽进化的技术是本领域熟知的并且描述于例如美国专利6773900中。
在一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的疫苗可单独地或与药学上可接受的载体相结合地施用给宿主脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。在另一个实施例中，以有效诱导针对李斯特菌菌株本身或针对已对李斯特菌菌种进行修饰后而表达的异源性抗原的免疫应答的量施用疫苗。在另一个实施例中，待施用的疫苗的量可由本领域的技术人员在拥有本公开时按常规方式确定。在另一个实施例中，药学上可接受的载体包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液。在另一个实施例中，所选择的药学上可接受的载体和将用到的载体的量将取决于多种因素，包括但不限于施用模式、李斯特菌菌株以及接种者的年龄和疾病状态。在另一个实施例中，疫苗的施用可以通过经口途径进行，或其可以是肠胃外的、经鼻内的、经肌内的、经直肠内的、经腹膜内的或多种熟知的施用途径。在另一个实施例中，施用途径可根据传染原或待治疗的肿瘤的类型而选择。
在一个实施例中，本发明提供包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌菌株，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中。在另一个实施例中，核酸分子从游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供诱导受试者的对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括施用包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌菌株，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中。在另一个实施例中，核酸分子从游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供治疗、阻遏或抑制受试者的癌症的方法，所述方法包括施用包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌菌株，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中。在另一个实施例中，核酸分子从游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供治疗、阻遏或抑制受试者的至少一种肿瘤的方法，所述方法包括施用包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌菌株，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中。在另一个实施例中，核酸分子从游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供制备表达抗原的重组李斯特菌菌株的方法，所述方法包括将编码抗原的核酸遗传融合到李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中；以及在有利于抗原表达的条件下在所述重组李斯特菌菌株中表达所述抗原。在另一个实施例中，核酸分子从游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供了使用包含编码异源抗原性多肽或其片段的核酸分子的重组李斯特菌菌株的任一上述方法，其中所述核酸分子可操作地整合进李斯特菌基因组中，与内源性含PEST基因一起处于开放读框中。在另一个实施例中，核酸分子从与内源性含PEST基因一起所处的开放读框中的游离型质粒表达。
在另一个实施例中，本发明提供用于便利地实践本文所公开的方法的试剂盒，该试剂盒包含本文所公开的李斯特菌菌株、施用装置和描述如何使用试剂盒组成部分来实践本文所公开的方法的指导性材料。
如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。
在一个实施例中，术语“受试者”是指需要治疗病症或其后遗症或易受该病症或其后遗症影响的哺乳动物(包括人)。受试者可包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和宠物小鼠以及人。受试者还可包括家畜。在一个实施例中，术语“受试者”不排除在所有方面都健康并且不具有或显示出疾病或病症的体征的个体。
为了更充分地举例说明本发明的优选实施例，提供了以下实例。然而，它们绝不应解释为限制本发明的广泛范围。
实例
开发分泌融合至tLLO的PSA的重组Lm(Lm-LLO-PSA)。此菌株引起与前列腺癌小鼠模型中的肿瘤消退相关的强效PSA特异性免疫应答，其中tLLO-PSA的表达源自基于pGG55的质粒(表1)，其赋予载体以抗生素抗性。我们最近开发出用于基于pADV142质粒的PSA疫苗的新菌株，其不具有抗生素抗性标记并且称为LmddA-142(表1)。此新菌株与Lm-LLO-PSA相比减毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性并且显著更有效地消退PSA表达肿瘤。
表1.质粒和菌株
质粒pAdv142(6523bp)的序列如下：
cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctc 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cggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaaccccTAAcccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcgcggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa(SEQ ID NO:28)。在Genewiz实验室从大肠杆菌菌株对此质粒进行测序。
实例1：构建减毒李斯特菌菌株-Lmdd△actA并且将人klk3基因同框插入Lmdd和Lmdda菌株中的hly基因。
通过毒力因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。构建actA在Lmdaldat(Lmdd)背景下的框内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极化效应。Lm daldatΔactA含有在N-端处的前19个氨基酸和C-端的28个氨基酸残基，缺失了ActA的591个氨基酸。
通过扩增对应于actA的上游(657bp-寡核苷酸的Adv 271/272)部分和下游(625bp-寡核苷酸的Adv273/274)部分的染色体区并且通过PCR接合产生actA缺失突变体。用于此扩增的引物序列在表2中给出。actA的上游和下游DNA区在EcoRI/PstI限制位点克隆到pNEB193中并且来自此质粒，EcoRI/PstI进一步克隆到温度敏感性质粒pKSV7中，从产生△actA/pKSV7(pAdv120)。
表2：用于扩增actA的上游和下游的DNA序列的引物序列
引物 序列 SEQ ID NO:
Adv271-actAF1 cg GAATTCGGATCCgcgccaaatcattggttgattg 29
Adv272-actAR1 gcgaGTCGACgtcggggttaatcgtaatgcaattggc 30
Adv273-actAF2 gcgaGTCGACccatacgacgttaattcttgcaatg 31
Adv274-actAR2 gataCTGCAGGGATCCttcccttctcggtaatcagtcac 32
使用外部结合至actA缺失区的引物来验证从其染色体位置的基因缺失，所述引物在图1中显示为引物3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc,SEQ ID NO:33)和引物4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO:34。在分离自Lmdd和Lm-dd△actA的染色体DNA上进行PCR分析。预期在Lmdd染色体DNA中用两组不同的引物对1/2和3/4扩增以后的DNA片段的大小为3.0Kb和3.4Kb。另一方面，对于Lmdd△actA，使用引物对1/2和3/4的PCR的预期大小为1.2Kb和1.6Kb。因此，在图1中的PCR分析证实actA的1.8kb区在Lmdd△actA菌株中缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区在菌株Lm-dd△actA中的缺失。
实例2：构建用于Lm载体的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统。
用于Lm载体(pAdv142)的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统为不含抗生素的质粒pTV3的下一代(Verch等人,Infect Immun,2004.72(11):6418-25，以引用的方式并入本文中)。用于毒力基因转录活化因子的基因prfA从pTV3缺失，因为李斯特菌菌株Lmdd在染色体中含有prfA基因的拷贝。此外，NheI/PacI限制位点的p60-李斯特菌dal的盒置换为p60-枯草芽孢杆菌dal，从而产生质粒pAdv134(图2A)。李斯特菌和芽孢杆菌dal基因的相似性为～30％，从而实际上消除了质粒与Lmdd染色体中的dal基因的剩余片段之间重组的机会。质粒pAdv134含有抗原表达盒tLLO-E7。将LmddA菌株用pADV134质粒转化并且通过Western印迹确认来自所选克隆的LLO-E7蛋白的表达(图2B)。源自10403S野生型菌株的Lmdd系统缺乏抗生素抗性标记，但具有Lmdd链霉素抗性。
另外，将pAdv134用XhoI/XmaI限制以克隆人PSA klk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv142(图2C，表1)含有在李斯特菌p60启动子控制下的芽孢杆菌dal(B-Dal)。穿梭质粒pAdv142在无外源性D-丙氨酸存在下补充大肠杆菌ala drx MB2159和单核细胞增多性李斯特菌菌株Lmdd的生长。质粒pAdv142中的抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白组成(图2C)。
质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株，从而产生Lm-ddA-LLO-PSA。LLO-PSA融合蛋白经菌株Lm-ddA-LLO-PSA的表达和分泌通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来确认(图2D)。在两次体内传代后，菌株Lm-ddA-LLO-PSA稳定表达和分泌LLO-PSA融合蛋白。
实例3：菌株LmddA-LLO-PSA的体外和体内稳定性
通过在选择性压力存在或不存在下培养LmddA-LLO-PSA李斯特菌菌株八天来检验质粒的体外稳定性。菌株LmddA-LLO-PSA的选择性压力为D-丙氨酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在脑-心输注(BHI)和BHI+100μg/ml D-丙氨酸中传代。在铺板于选择性(BHI)和非选择性(BHI+D-丙氨酸)培养基上之后测定每天的CFU。预期质粒损失将导致铺板于非选择性培养基(BHI+D-丙氨酸)上之后CFU较高。如图3A中所示，选择性和非选择性培养基中的CFU数量之间不存在差异。这表明当实验终止时，质粒pAdv142稳定至少50代。
通过在C57BL/6小鼠中静脉内注射5×107个CFU LmddA-LLO-PSA来测定质粒体内维持。在24小时和48小时从在PBS中均质化的脾脏分离有活力的细菌。在BHI板和BHI+100μg/ml D-丙氨酸上测定各时间点的各样品的CFU。将脾细胞铺板于选择性和非选择性培养基之后，在24小时后回收集落。由于此菌株高度减毒，因此在24小时内体内清除细菌负荷。选择性和非选择性板上未检测到显著CFU差异，指示重组质粒在所有分离的细菌中稳定存在(图3B)。
实例4：菌株LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的体内传代、毒力和清除率
LmddA-142为分泌游离型表达的tLLO-PSA融合蛋白的重组李斯特菌菌株。为了测定安全剂量，将小鼠用多种剂量的LmddA-LLO-PSA免疫并且测定毒性效应。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性效应(数据未示出)。结果表明小鼠良好耐受108个CFU LmddA-LLO-PSA剂量。毒力研究指示菌株LmddA-LLO-PSA高度减毒。
测定在C57BL/6小鼠中腹膜内施用安全剂量108个CFU后LmddA-LLO-PSA的体内清除率。第2天后，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的肝脏和脾脏中不存在可检测的集落。因为此菌株高度减毒，所以其在48小时时完全体内清除(图4A)。
我们进行细胞感染测定来确定LmddA-LLO-PSA的减毒是否会减弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬细胞和胞内生长的能力。将诸如J774A.1的小鼠巨噬细胞样细胞系用李斯特菌构建体体外感染并且对胞内生长进行定量。阳性对照菌株野生型李斯特菌菌株10403S胞内生长，并且prfA突变体阴性对照XFL7不能逃离吞噬溶菌体并且因此不会在J774细胞中生长。LmddA-LLO-PSA的胞质内生长比10403S缓慢，因为此菌株失去从细胞扩散至细胞的能力(图4B)。结果指示LmddA-LLO-PSA有能力感染巨噬细胞和胞质内生长。
实例5：菌株-LmddA-LLO-PSA在C57BL/6小鼠中的免疫原性
使用PSA四聚物染色测定C57BL/6小鼠中由构建体LmddA-LLO-PSA引起的PSA特异性免疫应答。小鼠以一周间隔用LmddA-LLO-PSA免疫两次并且在强化后第6天将脾细胞针对PSA四聚物染色。用PSA特异性四聚物对脾细胞的染色显示LmddA-LLO-PSA引起23％的PSA四聚物+CD8+CD62L低细胞(图5A)。
使用胞内细胞因子染色检验PSA特异性T细胞在用PSA肽刺激5小时后分泌IFN-γ的功能性能力。LmddA-LLO-PSA组相较于未暴露的小鼠，用PSA肽刺激的CD8+CD62L低IFN-γ分泌细胞的百分比提高200倍(图5B)，指示LmddA-LLO-PSA极具免疫原性并且在脾脏中针对PSA引起高水平的功能活性PSA CD8+ T细胞应答。
为了测定用LmddA-LLO-PSA免疫小鼠后针对PSA产生的细胞毒性T细胞的功能性活性，我们在体外测定中测试了PSA特异性CTL对用H-2Db肽脉冲处理的细胞EL4细胞进行裂解的能力。使用基于FACS的卡斯蛋白酶测定(图5C)和铕释放(图5D)来测量细胞裂解。用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞含有对呈现PSA肽作为靶抗原的细胞具有高细胞溶解活性的CTL。
进行Elispot来测定效应T细胞在用抗原刺激24小时后分泌IFN-γ的能力。使用ELISpot，我们观察到来自用特异性肽刺激的LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞中的IFN-γ斑点数相较于未暴露的小鼠的脾细胞提高20倍(图5E)。
实例6：用LmddA-142菌株免疫诱导表达PSA的肿瘤的消退和PSA特异性CTL对肿瘤的浸润。
使用工程化以表达PSA的前列腺腺癌细胞系测定构建体LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的治疗功效(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等人，2008年)。向小鼠皮下植入2×106个TPSA细胞。当肿瘤在肿瘤接种后第6天达到4-6mm可触大小时，小鼠以一周间隔用108个CFULmddA-142、107个CFULm-LLO-PSA(阳性对照)免疫三次或不做处理。未暴露的小鼠逐渐产生肿瘤(图6A)。用LmddA-142免疫的小鼠直至第35天全部无肿瘤并且8只小鼠中有3只逐渐产生肿瘤，其相较于未暴露的小鼠以慢得多的速率生长(图6B)。在第70天，八只小鼠中有五只仍无肿瘤。正如预期，Lm-LLO-PSA接种的小鼠的肿瘤比未暴露的对照小并且肿瘤产生比对照中缓慢(图6C)。因此，构建体LmddA-LLO-PSA可消退TPSA细胞系建立的60％肿瘤并且减缓其他小鼠中的肿瘤生长。仍无肿瘤的治愈小鼠在第68天用TPSA肿瘤再挑战。
用LmddA-142免疫小鼠可控制7天建立的Tramp-C1肿瘤的生长和诱导其消退，相较于未暴露的组中的无结果(图6A)，所述肿瘤经工程化以在超过60％的实验动物中表达PSA(图6B)。使用高度减毒载体(LmddA)和质粒pADV142来构建LmddA-142(表1)。
另外，研究了LmddA-LLO-PSA构建体产生的PSA特异性CD8淋巴细胞浸润肿瘤的能力。将肿瘤和基质胶的混合物皮下植入小鼠，随后以七天间隔用未暴露的或对照(Lm-LLO-E7)李斯特菌或用LmddA-LLO-PSA免疫两次。在第21天切除肿瘤并且分析肿瘤中浸润的CD8+CD62L低PSA四聚物+和CD4+ CD25+FoxP3+调节性T细胞群体。
观察到极低数量的CD8+CD62L低PSA四聚物+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)对未暴露的和Lm-LLO-E7对照免疫小鼠中存在的PSA具有特异性。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠中PSA特异性CD8+CD62L低PSA四聚物+ TIL百分比增加10-30倍(图7A)。有趣的是，脾脏中的CD8+CD62L低PSA四聚物+细胞群体比肿瘤中少7.5倍(图7A)。
另外，测定未处理的小鼠和李斯特菌免疫小鼠的肿瘤中CD4+/CD25+/Foxp3+T调节细胞(Treg)的存在。有趣的是，用李斯特菌免疫导致肿瘤而非脾脏中的CD4+CD25+FoxP3+ T-reg数量显著降低(图7B)。然而，构建体LmddA-LLO-PSA对降低肿瘤中的CD4+ CD25+FoxP3+T-reg的频率的影响比未暴露的和Lm-LLO-E7免疫组强(图7B)。
因此，LmddA-142疫苗可诱导能够浸润肿瘤部位的PSA特异性CD8+ T细胞(图7A)。有趣的是，用LmddA-142免疫与肿瘤中的调节性T细胞数量减少有关(图7B)，从而可能形成对高效抗肿瘤CTL活性更有利的环境。
实例7：尽管PSA融合，但Lmdd-143和LmddA-143分泌功能性LLO。
Lmdd-143和LmddA-143含有全长人klk3基因，其编码PSA蛋白，该蛋白经同源重组下游插入并且与染色体中的hly基因同框。这些构建体使用pKSV7质粒(Smith和Biochimie.1992；74(7-8)第705-711页)通过同源重组制备，所述质粒为温度敏感性复制子，携带hly-klk3-mpl重组盒。因为第二重组事件之后切除质粒，所以失去用于整合选择的抗生素抗性标记。此外，LmddA-143菌株中的actA基因缺失(图8A)。通过两个构建体中的PCR(图8B)和测序(数据未示出)来验证klk3与hly向染色体中的同框插入。
这些染色体构建体的一个重要方面为LLO-PSA的产生将不会完全消除LLO功能，李斯特菌从单核细胞增多性李斯特菌产生的吞噬体、胞质溶胶侵袭和高效免疫性逃离需要所述LLO功能。对来自Lmdd-143和LmddA-143培养上清液的分泌的蛋白质的Western印迹分析揭示出，对应于LLO-PSA融合蛋白的～81kDa条带和～60kDa条带(其为LLO的预期大小)(图9A)，指示LLO从LLO-PSA融合物裂解或仍作为单个蛋白质由单核细胞增多性李斯特菌产生，而与染色体中的融合基因无关。Lmdd-143和LmddA-143分泌的LLO相较于野生型单核细胞增多性李斯特菌10403S保留50％的溶血活性(图9B)。与这些结果一致，Lmdd-143和LmddA-143能够在巨噬细胞样J774细胞系中胞内复制(图9C)。
实例8：Lmdd-143和LmddA-143均引起针对PSA抗原的细胞介导的免疫应答。
在显示Lmdd-143和LmddA-143能够分泌融合至LLO的PSA之后，我们研究这些菌株是否可在体内引起PSA特异性免疫应答。C57Bl/6小鼠不做处理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫两次。通过用PSA65-74肽刺激脾细胞和针对IFN-γ进行胞内染色来测量PSA特异性CD8+ T细胞应答。如图10中示出，染色体和基于质粒的载体诱导的免疫应答类似。
实例9：分泌LLO-HMW-MAA融合蛋白的重组Lm菌株导致广泛的抗肿瘤应答。
示出设计三种基于Lm的疫苗，所述疫苗基于之前作图和预测的HLA-A2表位表达不同的HMW-MAA片段(图11A)。Lm-tLLO-HMW-MMA2160-2258(也称为Lm-LLO-HMW-MAA-C)基于无毒力的Lm XFL-7菌株和基于pGG55的质粒。菌株分泌对应于tLLO-HMW-MAA2160-2258融合蛋白的～62kDa条带(图11B)。tLLO-HMW-MAA2160-2258的分泌有可能由于此片段的高疏水性而相对较弱，所述片段对应于HMW-MAA跨膜结构域。使用用全长HMW-MAA基因转染的B16F10黑素瘤细胞，我们观察到高达62.5％的用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫的小鼠可阻碍已建立肿瘤的生长(图11C)。此结果显示HMW-MAA可在疫苗接种策略中用作靶抗原。有趣的是，我们还观察到用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫小鼠显著损害了未工程化以表达HMW-MAA的肿瘤(例如B16F10、RENCA和NT-2)的生长(图11D)，所述肿瘤来自不同的小鼠品系。在作为表达大鼠HER-2/neu蛋白的乳腺癌细胞系并且源自FVB/N转基因小鼠的NT-2肿瘤模型中，在肿瘤接种后7天用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫不仅损害肿瘤生长，而且诱导5只小鼠中1只小鼠的肿瘤消退(图11D)。
实例10：用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫小鼠诱导CD8+ T细胞浸润肿瘤基质，并显著降低了肿瘤脉管系统中的周细胞覆盖率。
尽管NT-2细胞不表达HMW-MAA同源物NG2，但用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫FVB/N小鼠显著损害NT-2肿瘤的生长，并最终导致肿瘤消退(图11D)。此肿瘤模型用于通过免疫荧光来评价肿瘤部位中的CD8+ T细胞和周细胞。在用Lm-LLO-HMW-MAA-C疫苗免疫的小鼠中，CD8的NT-2肿瘤切片的染色显示CD8+ T细胞浸润到肿瘤和血管周围，但在用对照疫苗免疫的小鼠中没有浸润(图12A)。还通过用αSMA和NG2(HMW-MAA的鼠同源物)抗体的双重染色来分析NT-2肿瘤中的周细胞。与对照(P≤0.05)相比，来自三个独立NT-2肿瘤的数据分析显示用Lm-LLO-HMW-MAA-C免疫的小鼠中的周细胞数量显著减少(图12B)。当分析限于未被疫苗靶向的αSMA染色的细胞时，获得相似的结果(数据未示出)。因此，Lm-LLO-HMW-MAA-C疫苗接种通过靶向周细胞影响肿瘤部位中的血管形成。
实例11：通过同时表达和分泌LLO-PSA和tLLO-HMW-MAA2160-2258融合蛋白、引起对两种异源抗原的免疫应答而具有增强的抗肿瘤活性的重组单核细胞增多性李斯特菌载体的开发。
材料和方法：
pADV168质粒的构建。HMW-MAA-C片段通过XhoI和XmaI限制性内切酶双重消化而从pCR2.1-HMW-MAA2160-2258质粒切离。将该片段克隆进已经用XhoI和XmaI消化而切下E7基因的pADV134质粒中。将pADV168质粒电穿孔进电转化感受态dal(-)dat(-)大肠杆菌菌株MB2159，并筛选阳性克隆用于RFLP和序列分析。
Lmdd-143/168、LmddA-143/168和对照菌株LmddA-168、Lmdd-143/134和LmddA-143/134的构建。以pADV168或pADV134质粒转化Lmdd、Lmdd-143和LmddA-143。在补加了链霉素(250μg/ml)并且无D-丙氨酸的脑心浸液(BHI培养基)琼脂板上选择转化子。采用抗LLO、抗PSA或抗E7抗体通过Western印迹在细菌培养上清液中对各个克隆筛选LLO-PSA、tLLO-HMW-MAA2160-2258和tLLO-E7分泌。将对来自每个菌株的所选克隆在体外和体内评估毒力。每个菌株在体内传代两次以选择最稳定的重组克隆。简而言之，使来自每个构建体的所选克隆生长，并以1×108个CFU/小鼠腹膜内注射至4只小鼠的组。在第1和第3天收获脾，匀化并在BHI琼脂板上铺板。在一次传代后，选择来自每个菌株的一个克隆，并在体内再传代一次。为了防止载体进一步减毒至损害其存活力的水平，在具有不同减毒水平的两个载体(Lmdd-143/168、LmddA-143/168)中产生构建体。
通过J774细胞中的胞内复制进行体外毒力测定。巨噬细胞摄取Lm，随后进行胞质溶胶侵袭和胞内增殖，这是通过基于Lm的疫苗成功的抗原递送和呈递抗原所需的。使用巨噬细胞样J774细胞系的体外侵袭测定用于测试新的重组Lm菌株中的这些特性。简言之，在不含抗生素的培养基中以1:1的MOI用对照野生型Lm菌株10403S或待测试的新Lm菌株感染J774细胞1小时。通过在培养基10μg/ml庆大霉素中温育1小时来杀死胞外细菌。以定期间隔收获样品，并且用水裂解细胞。将裂解液的十倍系列稀释液在BHI板上一式双份铺板，并对每个样品中的集落形成单位(CFU)计数。
体内毒力研究。以两种不同剂量(1×108和1×109个CFU/剂)的Lmdd-143/168、LmddA-143/168、LmddA-168、Lmdd-143/134或LmddA-143/134菌株腹膜内注射四只C57BL/6小鼠(7周龄)的组。跟踪小鼠2周，用于存活和LD50评估。根据其他的基于Lm的疫苗的前期经验，>1×108的LD50构成了可接受的值。
结果
在成功构建pADV168质粒后，为正确HMW-MAA序列的存在进行测序。这些新菌株中的该质粒表达和分泌特异于每个构建体的LLO融合蛋白。这些菌株是高度减毒的，LD50至少为1×108个CFU，对于actA缺陷型(LmddA)菌株可能高于1×109个CFU，该菌株缺乏actA基因，因而缺乏细胞间扩散的能力。测试该构建体，并选择在减毒和治疗功效之间具有更佳平衡的构建体。
实例12：用Lmdd-143/168和LmddA-143/168免疫时引起的免疫应答和抗肿瘤效应的检测。
在小鼠中研究了用Lmdd-143/168和LmddA-143/168免疫时对PSA和HMW-MAA的免疫应答，其中采用标准方法，例如检测针对这些抗原的IFN-γ产生和特异性CTL活性。在TPSA23肿瘤模型中测试了双重表达载体的治疗功效。
针对IFN-γ的胞内细胞因子染色用Lmdd-143/168和LmddA-143/168菌株以1周的间隔将C57BL/6小鼠(每个处理组3只小鼠)免疫两次。作为本实验的对照，用Lmdd-143、LmddA-143、LmddA-142、LmddA-168、Lmdd-143/134、LmddA-143/134免疫小鼠或不做处理(未暴露的组)。7天后收获脾脏并制备脾细胞的单细胞悬浮液。将这些脾细胞以2×106个细胞/孔铺板于圆底96孔板中，在具有IL-2(50U/ml)的新鲜制备的完全RPMI培养基中，并用终浓度为1μM的PSA H-2Db肽、HCIRNKSVIL(SEQ ID NO:35)或HPV16E7H-2Db对照肽RAHYNIVTF(SEQ ID NO:36)进行刺激。由于未对C57Bl/6小鼠中的HMW-MAA表位作图，因此通过用2×105个EL4-HMW-MAA细胞温育2×106个脾细胞来检测HMW-MAA特异性免疫应答。将细胞在莫能菌素存在下温育5小时，以在细胞中保留胞内IFN-γ。温育后，将细胞用抗小鼠CD8-FITC、CD3-PerCP、CD62L-APC抗体染色。然后将它们透化并针对IFNγ-PE染色并在四色FACSCalibur(BD Biosciences)中分析。
细胞毒性测定.为了研究在疫苗接种时产生的PSA和HMW-MAA特异性T细胞的效应子活性，将分离的脾细胞在含有20U/ml小鼠IL-2(Sigma)的完全RPMI培养基中在刺激细胞(用PSA或HMW-MAA牛痘感染的丝裂霉素C处理的MC57G细胞)存在下温育5天。对于细胞毒性测定，将EL4靶细胞用DDAO-SE(0.6μM)(Molecular Probes)标记15分钟，并用完全培养基洗涤两次。将标记的靶细胞用PSA H-2Db肽或HPV16E7H-2Db对照肽以5μM的终浓度脉冲处理1小时。对于HMW-MAA特异性细胞毒性反应，使用EL4-HMW-MAA细胞作为靶标。通过将靶细胞(T)与效应细胞(E)以不同的E:T比例温育2-3小时来进行细胞毒性测定2小时。将细胞用福尔马林固定，透化并染色切割的卡斯蛋白酶-3以检测靶细胞中凋亡的诱导。
抗肿瘤功效。使用T-PSA23肿瘤模型(TrampC-1/PSA)来比较Lmdd-143/168和LmddA-143/168菌株的抗肿瘤功效与LmddA-142和LmddA-168的抗肿瘤功效。向8只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄)的组皮下接种2×106个T-PSA23细胞，7天后用0.1×LD50剂量的Lmdd-143/168、LmddA-143/168、LmddA-142和LmddA-168进行腹膜内免疫。作为对照，对小鼠不做处理或用Lm对照菌株(LmddA-134)免疫。每组接受两次额外剂量的疫苗，间隔为7天。监测肿瘤60天或直到它们达到2cm的大小，此时处死小鼠。
结果
用LmddA-168免疫小鼠免疫导致诱导针对HMW-MAA的特异性应答。相似地，Lmdd-143/168和LmddA-143/168引起针对PSA和HMW-MAA的免疫应答，其与由单独表达每种抗原的单核细胞增多性李斯特菌载体产生的免疫应答相似。用Lmdd-143/168和LmddA-143/168免疫携带T-PSA-23小鼠导致比用LmddA-142或LmddA-168免疫更好的抗肿瘤治疗功效。
实例13：用Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫导致周细胞破坏，内皮细胞中的粘附分子上调和特异于PSA的TIL的浸润增强。
用Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫时诱导的肿瘤浸润性淋巴细胞和内皮细胞粘附分子的表征。通过免疫荧光分析来自用Lmdd-143/168或LmddA-143/168免疫的小鼠的肿瘤，以研究内皮细胞的粘附分子的表达、肿瘤脉管系统中的血管密度和周细胞覆盖率以及免疫细胞(包括CD8和CD4T细胞)对肿瘤的浸润。通过四聚物分析和功能测试来表征特异于PSA的TIL。
肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的分析。对小鼠(n＝3只/组)皮下接种埋入基质胶中的TPSA23细胞，将小鼠在第7天和14天用Lmdd-143/168或LmddA-143/168(取决于根据抗肿瘤研究中获得的结果哪一种更有效)免疫。为了比较，将小鼠用LmddA-142、LmddA-168、对照Lm疫苗免疫或不做处理。在第21天，通过手术切除肿瘤，在冰冷的PBS中洗涤并用手术刀切碎。用分散酶处理肿瘤以溶解基质胶并释放单细胞用于分析。将PSA特异性CD8+ T细胞用PSA65-74H-2Db四聚物-PE和抗小鼠CD8-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5和CD62L-APC抗体染色。为了分析肿瘤中的调节性T细胞，将TIL用CD4-FITC，CD3-PerCP-Cy5.5和CD25-APC染色，随后对FoxP3染色(抗FoxP3-PE，MiltenyBiotec)进行透化。通过FACS Calibur细胞计数器和CellQuestPro软件(BDBiosciences)分析细胞。
免疫荧光.在肿瘤接种后第21天，手术切除埋入基质胶中的TPSA23肿瘤，并将片段立即冷冻保存在OCT冷冻培养基中。将肿瘤片段冷冻切片成8-10μm厚的切片。对于免疫荧光，将样品解冻，采用4％福尔马林固定。封闭后，将切片在37℃的加湿室中在阻断溶液中用抗体染色1小时。根据制造商的说明进行DAPI(Invitrogen)染色。对于细胞内染色(αSMA)，在PBS/0.1％Tween/1％BSA溶液中进行温育。采用含有抗褪色剂的封片溶液(Biomeda)对载玻片加盖玻片，静置24小时，并保持在4℃，直至采用Spot Image软件(2006)和BX51系列Olympus荧光显微镜成像。通过免疫荧光评价CD8、CD4、FoxP3、αSMA、NG2、CD31、ICAM-1、VCAM-1和VAP-1。
统计分析：使用非参数Mann-Whitney和Kruskal-Wallis检验来比较不同治疗组之间的肿瘤大小。在最近的时间点将肿瘤大小与每组中最大数目的小鼠(8只小鼠)进行比较。在这些分析中，小于0.05的p值被视为具有统计学上的显著性。
结果
用Lmdd-143/168和LmddA-143/168免疫携带T-PSA-23小鼠导致更高数量的特异于PSA的效应TIP，并且还降低了肿瘤脉管系统的周细胞覆盖率。此外，细胞粘附标记在免疫小鼠中显著上调。
实例14：表达小鼠和人存活素的基于减毒的单核细胞增多性李斯特菌的疫苗的构建。
材料和方法
将存活素基因克隆到单核细胞增多性李斯特菌(Lmdd△ActA)特异性质粒中
存活素基因的来源是来自City of Hope的Dr.Don Diamond实验室。使用将菌株的m-RNA序列作为模板获得的小鼠存活素的寡核苷酸(Adv554-atctcgagggagctccggcgctgccc(SEQ ID NO:37和Adv555-atcccgggttaggcagccagctgctc(SEQ ID NO:38)以及人存活素片段的寡核苷酸(Adv552-atctcgagggtgccccgacgttgccc(SEQ ID NO:39和Adv553-atcccgggtcaatccatggcagccagc(SEQ ID NO:40)对小鼠(m-存活素)和人存活素(h-存活素)DNA序列进行PCR扩增。PCR扩增后DNA片段的预期大小：m-存活素为423bp，h-存活素为426bp，如图13中所示。纯化片段并将TA TOPO克隆到pCR2.1质粒中，从而得到质粒pAdv261(m-存活素/pCR2.1)和pAdv262(h-存活素/pCR2.1)。对若干h-存活素/pCR2.1和m-存活素/pCR2.1克隆进行PCR筛选，并通过序列验证来确认阳性克隆。
单核细胞增多性李斯特菌(Lm-ddA)疫苗的构建
另外，使用XhoI/XmaI限制酶切割pAdv261(m-存活素/pCR2.1)和pAdv262(h-存活素/pCR2.1)基因片段，并克隆到基于李斯特菌的穿梭载体pAdv142(从XhoI/XmaI限制酶切割的人PSA klk3)中，从而产生质粒pAdv265.5(h-存活素/pAdv142)和pAdv266.7(m-存活素/pAdv142)。将h-存活素/pAdv142和m-存活素/pAdv142 DNA连接转化到大肠杆菌MB2159电感受态细胞中，并测试所得转化体的对所需基因片段的克隆。
质粒pAdv265.5中的人存活素DNA序列
图例标示：
-正常字体大写序列：hly启动子。
-斜体大写序列：p15起点。
-粗体大写序列：。
-斜体且加下划线的大写序列：存活素。
-斜体、粗体且加下划线的大写序列： 。
-小写序列：P60-芽孢杆菌dal。
对于质粒pAdv265.5和pAdv266.7测序的寡核苷酸和DNA区的清单在下表中给出
寡核苷酸编号 测序的DNA区
对于小鼠存活素
Adv16 2393-3242
Adv555 1865-2771
对于人存活素
Adv16 2353-3261
Adv553 1874-2796
LLO-存活素融合蛋白的表达和分泌
将新质粒h-存活素/pAdv142(pAdv 265.5)(图14B)和m-存活素/pAdv142(pAdv266.7)(图14A)转化到李斯特菌LmddA主链中。选择命名为LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)的若干李斯特菌克隆并筛选以下各物的表达和分泌：使用单克隆抗体抗B3-19检测的染色体LLO蛋白、使用多克隆抗体抗PEST检测的截短的LLO-存活素融合蛋白和分解的t-LLO蛋白以及使用单克隆抗体抗存活素检测的tLLO-存活素融合蛋白。选择来自LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)构建体的克隆#1以用于一次体内传代。
实例15：菌株Lm-ddA-LLO-存活素的体内传代
两次体内传代后Lm-ddA-LLO-存活素的表达
制备用于一次体内传代的LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)储存物。对于体内传代(P1)，向一只小鼠腹膜内施用108个CFU的每种构建体，并且在注射后第1天收获小鼠脾脏。在脾脏中回收的集落总数如下所示。
LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)＝9.8×103个CFU/脾脏。
LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)＝1.42×104个CFU/脾脏。
制备LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)储存物以用于二次体内传代。对于二次体内传代(P2)，向一只小鼠腹膜内注射108个CFU的每种构建体，并在注射后第1天收获小鼠脾脏。在脾脏中回收的集落总数如下所示。
LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)＝1.40×104个CFU/脾脏。
LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)＝6.38×104个CFU/脾脏。
选择来自LmddA-265.5(h-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(m-存活素/pAdv142)(P2，第1天)的三个集落以用于蛋白表达。来自这些构建体的所有三个集落在二次体内传代后保留tLLO-存活素融合蛋白的表达和分泌，如通过使用对存活素具有特异性的单克隆抗体的免疫印迹所检测的(图15)。
这些构建体LmddA-265.5(人-存活素/pAdv142)和LmddA-266.7(小鼠-存活素/pAdv142)在C57BL/6小鼠中两次体内传代后保留tLLO-存活素融合蛋白的表达和分泌(图16)。
实例16：在用表达存活素的基于李斯特菌的免疫疗法进行治疗后肿瘤生长的减少
在本研究中，在第0天向小鼠植入1×106个NT-2肿瘤，并在第6、13和20天用2×108个CFU的LmddA265.5(存活素)免疫疗法进行治疗。通过卡尺测量肿瘤生长，并在第65天终止研究。此数据提供了LmddA265.5影响FvB小鼠中已建立NT2肿瘤的生长的证据。用LmddA265.5处理在携带NT2肿瘤的小鼠中导致肿瘤生长的稳定，并且观察到直至第65天(参见图17)。
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<400> 1
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 2
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 3
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 4
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 5
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 6
<211> 33
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 6
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 西尔李斯特菌
<400> 7
Arg Ser Glu Val Thr Ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Ala Thr Pro
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 8
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 类马链球菌
<400> 9
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 10
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N末端LLO片段
<400> 10
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 11
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO片段
<400> 11
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 12
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 12
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 13
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO蛋白
<400> 13
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2存活素表位
<400> 14
Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1 5
<210> 15
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ActA蛋白的N末端片段
<400> 15
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 16
<211> 1170
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 16
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 17
<211> 390
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 17
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 18
<211> 1170
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 18
atgcgtgcga tgatggtagt tttcattact gccaactgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattcc agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattga ggaactagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagcaaaa gcagagaaag gtccgaataa caataataac 300
aacggtgagc aaacaggaaa tgtggctata aatgaagagg cttcaggagt cgaccgacca 360
actctgcaag tggagcgtcg tcatccaggt ctgtcatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 480
aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 600
aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 840
tttaatgctc ctactccatc ggaaccgagc tcattcgaat ttccgccgcc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 1020
atgcgggaaa cagcaccttc gctagattct agttttacaa gcggggattt agctagtttg 1080
agaagtgcta ttaatcgcca tagcgaaaat ttctctgatt tcccactaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 19
<211> 1256
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 19
gcgccaaatc attggttgat tggtgaggat gtctgtgtgc gtgggtcgcg agatgggcga 60
ataagaagca ttaaagatcc tgacaaatat aatcaagcgg ctcatatgaa agattacgaa 120
tcgcttccac tcacagagga aggcgactgg ggcggagttc attataatag tggtatcccg 180
aataaagcag cctataatac tatcactaaa cttggaaaag aaaaaacaga acagctttat 240
tttcgcgcct taaagtacta tttaacgaaa aaatcccagt ttaccgatgc gaaaaaagcg 300
cttcaacaag cagcgaaaga tttatatggt gaagatgctt ctaaaaaagt tgctgaagct 360
tgggaagcag ttggggttaa ctgattaaca aatgttagag aaaaattaat tctccaagtg 420
atattcttaa aataattcat gaatattttt tcttatatta gctaattaag aagataacta 480
actgctaatc caatttttaa cggaacaaat tagtgaaaat gaaggccgaa ttttccttgt 540
tctaaaaagg ttgtattagc gtatcacgag gagggagtat aagtgggatt aaacagattt 600
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacgtc 660
gacccatacg acgttaattc ttgcaatgtt agctattggc gtgttctctt taggggcgtt 720
tatcaaaatt attcaattaa gaaaaaataa ttaaaaacac agaacgaaag aaaaagtgag 780
gtgaatgata tgaaattcaa aaaggtggtt ctaggtatgt gcttgatcgc aagtgttcta 840
gtctttccgg taacgataaa agcaaatgcc tgttgtgatg aatacttaca aacacccgca 900
gctccgcatg atattgacag caaattacca cataaactta gttggtccgc ggataacccg 960
acaaatactg acgtaaatac gcactattgg ctttttaaac aagcggaaaa aatactagct 1020
aaagatgtaa atcatatgcg agctaattta atgaatgaac ttaaaaaatt cgataaacaa 1080
atagctcaag gaatatatga tgcggatcat aaaaatccat attatgatac tagtacattt 1140
ttatctcatt tttataatcc tgatagagat aatacttatt tgccgggttt tgctaatgcg 1200
aaaataacag gagcaaagta tttcaatcaa tcggtgactg attaccgaga agggaa 1256
<210> 20
<211> 140
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Met Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp Gln Leu Tyr Leu Lys Asn
1 5 10 15
Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala
20 25 30
Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu His Arg Lys His
65 70 75 80
Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys Gln Met Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Gln Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Glu Gln Leu Ala Ala
130 135 140
<210> 21
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His
1 5 10 15
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys
20 25 30
Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr Glu
35 40 45
Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu
50 55 60
Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His Ser
65 70 75 80
Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr
85 90 95
Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile
100 105 110
Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys
115 120 125
Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 22
<211> 421
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Gly Gly Gly Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly
1 5 10 15
Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys
20 25 30
Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala
35 40 45
Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys
65 70 75 80
Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly
85 90 95
Cys Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr Gly
100 105 110
Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala
115 120 125
Thr Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Ala
130 135 140
Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly
145 150 155 160
Gly Cys Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr
165 170 175
Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Ala
180 185 190
Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Thr
195 200 205
Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Thr Ala Gly Ala Gly Gly
210 215 220
Ala Gly Cys Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys
225 230 235 240
Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys
245 250 255
Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys
260 265 270
Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Ala Cys
275 280 285
Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly
290 295 300
Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala
305 310 315 320
Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr
325 330 335
Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys
340 345 350
Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr
355 360 365
Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala
370 375 380
Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Cys Ala
385 390 395 400
Ala Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly
405 410 415
Cys Cys Thr Ala Ala
420
<210> 23
<211> 426
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys
20 25 30
Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys
35 40 45
Cys Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala
50 55 60
Ala Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys
85 90 95
Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Gly
100 105 110
Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Thr
115 120 125
Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Gly Gly
145 150 155 160
Cys Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly
165 170 175
Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala
180 185 190
Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly
195 200 205
Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Thr Ala Gly Ala Gly Gly Ala
210 215 220
Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Thr Thr Cys Gly
225 230 235 240
Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys
245 250 255
Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala
260 265 270
Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys
275 280 285
Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala
290 295 300
Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly
305 310 315 320
Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Thr
325 330 335
Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala
340 345 350
Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr
355 360 365
Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly
370 375 380
Ala Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala
385 390 395 400
Thr Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys
405 410 415
Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala
420 425
<210> 24
<211> 1107
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 24
atggtgacag gctggcatcg tccaacatgg attgaaatag accgcgcagc aattcgcgaa 60
aatataaaaa atgaacaaaa taaactcccg gaaagtgtcg acttatgggc agtagtcaaa 120
gctaatgcat atggtcacgg aattatcgaa gttgctagga cggcgaaaga agctggagca 180
aaaggtttct gcgtagccat tttagatgag gcactggctc ttagagaagc tggatttcaa 240
gatgacttta ttcttgtgct tggtgcaacc agaaaagaag atgctaatct ggcagccaaa 300
aaccacattt cacttactgt ttttagagaa gattggctag agaatctaac gctagaagca 360
acacttcgaa ttcatttaaa agtagatagc ggtatggggc gtctcggtat tcgtacgact 420
gaagaagcac ggcgaattga agcaaccagt actaatgatc accaattaca actggaaggt 480
atttacacgc attttgcaac agccgaccag ctagaaacta gttattttga acaacaatta 540
gctaagttcc aaacgatttt aacgagttta aaaaaacgac caacttatgt tcatacagcc 600
aattcagctg cttcattgtt acagccacaa atcgggtttg atgcgattcg ctttggtatt 660
tcgatgtatg gattaactcc ctccacagaa atcaaaacta gcttgccgtt tgagcttaaa 720
cctgcacttg cactctatac cgagatggtt catgtgaaag aacttgcacc aggcgatagc 780
gttagctacg gagcaactta tacagcaaca gagcgagaat gggttgcgac attaccaatt 840
ggctatgcgg atggattgat tcgtcattac agtggtttcc atgttttagt agacggtgaa 900
ccagctccaa tcattggtcg agtttgtatg gatcaaacca tcataaaact accacgtgaa 960
tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac ggtaacagca 1020
gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt gttaaatgag 1080
cgcataccta gaaaatacat ccattag 1107
<210> 25
<211> 368
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 25
Met Val Thr Gly Trp His Arg Pro Thr Trp Ile Glu Ile Asp Arg Ala
1 5 10 15
Ala Ile Arg Glu Asn Ile Lys Asn Glu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Ser
20 25 30
Val Asp Leu Trp Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ile
35 40 45
Ile Glu Val Ala Arg Thr Ala Lys Glu Ala Gly Ala Lys Gly Phe Cys
50 55 60
Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Ala Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ile Leu Val Leu Gly Ala Thr Arg Lys Glu Asp Ala Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Lys Asn His Ile Ser Leu Thr Val Phe Arg Glu Asp Trp
100 105 110
Leu Glu Asn Leu Thr Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ile His Leu Lys Val
115 120 125
Asp Ser Gly Met Gly Arg Leu Gly Ile Arg Thr Thr Glu Glu Ala Arg
130 135 140
Arg Ile Glu Ala Thr Ser Thr Asn Asp His Gln Leu Gln Leu Glu Gly
145 150 155 160
Ile Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Gln Leu Glu Thr Ser Tyr Phe
165 170 175
Glu Gln Gln Leu Ala Lys Phe Gln Thr Ile Leu Thr Ser Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Pro Thr Tyr Val His Thr Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu Leu Gln
195 200 205
Pro Gln Ile Gly Phe Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ile Ser Met Tyr Gly
210 215 220
Leu Thr Pro Ser Thr Glu Ile Lys Thr Ser Leu Pro Phe Glu Leu Lys
225 230 235 240
Pro Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Met Val His Val Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Pro Gly Asp Ser Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Arg
260 265 270
Glu Trp Val Ala Thr Leu Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Leu Ile Arg
275 280 285
His Tyr Ser Gly Phe His Val Leu Val Asp Gly Glu Pro Ala Pro Ile
290 295 300
Ile Gly Arg Val Cys Met Asp Gln Thr Ile Ile Lys Leu Pro Arg Glu
305 310 315 320
Phe Gln Thr Gly Ser Lys Val Thr Ile Ile Gly Lys Asp His Gly Asn
325 330 335
Thr Val Thr Ala Asp Asp Ala Ala Gln Tyr Leu Asp Thr Ile Asn Tyr
340 345 350
Glu Val Thr Cys Leu Leu Asn Glu Arg Ile Pro Arg Lys Tyr Ile His
355 360 365
<210> 26
<211> 870
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 26
atgaaagtat tagtaaataa ccatttagtt gaaagagaag atgccacagt tgacattgaa 60
gaccgcggat atcagtttgg tgatggtgta tatgaagtag ttcgtctata taatggaaaa 120
ttctttactt ataatgaaca cattgatcgc ttatatgcta gtgcagcaaa aattgactta 180
gttattcctt attccaaaga agagctacgt gaattacttg aaaaattagt tgccgaaaat 240
aatatcaata cagggaatgt ctatttacaa gtgactcgtg gtgttcaaaa cccacgtaat 300
catgtaatcc ctgatgattt ccctctagaa ggcgttttaa cagcagcagc tcgtgaagta 360
cctagaaacg agcgtcaatt cgttgaaggt ggaacggcga ttacagaaga agatgtgcgc 420
tggttacgct gtgatattaa gagcttaaac cttttaggaa atattctagc aaaaaataaa 480
gcacatcaac aaaatgcttt ggaagctatt ttacatcgcg gggaacaagt aacagaatgt 540
tctgcttcaa acgtttctat tattaaagat ggtgtattat ggacgcatgc ggcagataac 600
ttaatcttaa atggtatcac tcgtcaagtt atcattgatg ttgcgaaaaa gaatggcatt 660
cctgttaaag aagcggattt cactttaaca gaccttcgtg aagcggatga agtgttcatt 720
tcaagtacaa ctattgaaat tacacctatt acgcatattg acggagttca agtagctgac 780
ggaaaacgtg gaccaattac agcgcaactt catcaatatt ttgtagaaga aatcactcgt 840
gcatgtggcg aattagagtt tgcaaaataa 870
<210> 27
<211> 289
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 27
Met Lys Val Leu Val Asn Asn His Leu Val Glu Arg Glu Asp Ala Thr
1 5 10 15
Val Asp Ile Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr Glu
20 25 30
Val Val Arg Leu Tyr Asn Gly Lys Phe Phe Thr Tyr Asn Glu His Ile
35 40 45
Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Ile Asp Leu Val Ile Pro Tyr
50 55 60
Ser Lys Glu Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Val Ala Glu Asn
65 70 75 80
Asn Ile Asn Thr Gly Asn Val Tyr Leu Gln Val Thr Arg Gly Val Gln
85 90 95
Asn Pro Arg Asn His Val Ile Pro Asp Asp Phe Pro Leu Glu Gly Val
100 105 110
Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Val Pro Arg Asn Glu Arg Gln Phe Val
115 120 125
Glu Gly Gly Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys
130 135 140
Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Asn Ile Leu Ala Lys Asn Lys
145 150 155 160
Ala His Gln Gln Asn Ala Leu Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Gln
165 170 175
Val Thr Glu Cys Ser Ala Ser Asn Val Ser Ile Ile Lys Asp Gly Val
180 185 190
Leu Trp Thr His Ala Ala Asp Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg
195 200 205
Gln Val Ile Ile Asp Val Ala Lys Lys Asn Gly Ile Pro Val Lys Glu
210 215 220
Ala Asp Phe Thr Leu Thr Asp Leu Arg Glu Ala Asp Glu Val Phe Ile
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Ile Glu Ile Thr Pro Ile Thr His Ile Asp Gly Val
245 250 255
Gln Val Ala Asp Gly Lys Arg Gly Pro Ile Thr Ala Gln Leu His Gln
260 265 270
Tyr Phe Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Cys Gly Glu Leu Glu Phe Ala
275 280 285
Lys
<210> 28
<211> 6523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pAdv142
<400> 28
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagattgt gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtgg 2460
cctctcgtgg cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacag 2520
ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatc 2580
ctgaagacac aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgata 2640
tgagcctcct gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgc 2700
tgctccgcct gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgccca 2760
cccaggagcc agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag 2820
aggagttctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 2880
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 2940
cagggggcaa aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt tatggtgtgc 3000
ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgt 3060
acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctaac 3120
ccgggccact aactcaacgc tagtagtgga tttaatccca aatgagccaa cagaaccaga 3180
accagaaaca gaacaagtaa cattggagtt agaaatggaa gaagaaaaaa gcaatgattt 3240
cgtgtgaata atgcacgaaa tcattgctta tttttttaaa aagcgatata ctagatataa 3300
cgaaacaacg aactgaataa agaatacaaa aaaagagcca cgaccagtta aagcctgaga 3360
aactttaact gcgagcctta attgattacc accaatcaat taaagaagtc gagacccaaa 3420
atttggtaaa gtatttaatt actttattaa tcagatactt aaatatctgt aaacccatta 3480
tatcgggttt ttgaggggat ttcaagtctt taagaagata ccaggcaatc aattaagaaa 3540
aacttagttg attgcctttt ttgttgtgat tcaactttga tcgtagcttc taactaatta 3600
attttcgtaa gaaaggagaa cagctgaatg aatatccctt ttgttgtaga aactgtgctt 3660
catgacggct tgttaaagta caaatttaaa aatagtaaaa ttcgctcaat cactaccaag 3720
ccaggtaaaa gtaaaggggc tatttttgcg tatcgctcaa aaaaaagcat gattggcgga 3780
cgtggcgttg ttctgacttc cgaagaagcg attcacgaaa atcaagatac atttacgcat 3840
tggacaccaa acgtttatcg ttatggtacg tatgcagacg aaaaccgttc atacactaaa 3900
ggacattctg aaaacaattt aagacaaatc aataccttct ttattgattt tgatattcac 3960
acggaaaaag aaactatttc agcaagcgat attttaacaa cagctattga tttaggtttt 4020
atgcctacgt taattatcaa atctgataaa ggttatcaag catattttgt tttagaaacg 4080
ccagtctatg tgacttcaaa atcagaattt aaatctgtca aagcagccaa aataatctcg 4140
caaaatatcc gagaatattt tggaaagtct ttgccagttg atctaacgtg caatcatttt 4200
gggattgctc gtataccaag aacggacaat gtagaatttt ttgatcccaa ttaccgttat 4260
tctttcaaag aatggcaaga ttggtctttc aaacaaacag ataataaggg ctttactcgt 4320
tcaagtctaa cggttttaag cggtacagaa ggcaaaaaac aagtagatga accctggttt 4380
aatctcttat tgcacgaaac gaaattttca ggagaaaagg gtttagtagg gcgcaatagc 4440
gttatgttta ccctctcttt agcctacttt agttcaggct attcaatcga aacgtgcgaa 4500
tataatatgt ttgagtttaa taatcgatta gatcaaccct tagaagaaaa agaagtaatc 4560
aaaattgtta gaagtgccta ttcagaaaac tatcaagggg ctaataggga atacattacc 4620
attctttgca aagcttgggt atcaagtgat ttaaccagta aagatttatt tgtccgtcaa 4680
gggtggttta aattcaagaa aaaaagaagc gaacgtcaac gtgttcattt gtcagaatgg 4740
aaagaagatt taatggctta tattagcgaa aaaagcgatg tatacaagcc ttatttagcg 4800
acgaccaaaa aagagattag agaagtgcta ggcattcctg aacggacatt agataaattg 4860
ctgaaggtac tgaaggcgaa tcaggaaatt ttctttaaga ttaaaccagg aagaaatggt 4920
ggcattcaac ttgctagtgt taaatcattg ttgctatcga tcattaaatt aaaaaaagaa 4980
gaacgagaaa gctatataaa ggcgctgaca gcttcgttta atttagaacg tacatttatt 5040
caagaaactc taaacaaatt ggcagaacgc cccaaaacgg acccacaact cgatttgttt 5100
agctacgata caggctgaaa ataaaacccg cactatgcca ttacatttat atctatgata 5160
cgtgtttgtt tttctttgct ggctagctta attgcttata tttacctgca ataaaggatt 5220
tcttacttcc attatactcc cattttccaa aaacatacgg ggaacacggg aacttattgt 5280
acaggccacc tcatagttaa tggtttcgag ccttcctgca atctcatcca tggaaatata 5340
ttcatccccc tgccggccta ttaatgtgac ttttgtgccc ggcggatatt cctgatccag 5400
ctccaccata aattggtcca tgcaaattcg gccggcaatt ttcaggcgtt ttcccttcac 5460
aaggatgtcg gtccctttca attttcggag ccagccgtcc gcatagccta caggcaccgt 5520
cccgatccat gtgtcttttt ccgctgtgta ctcggctccg tagctgacgc tctcgccttt 5580
tctgatcagt ttgacatgtg acagtgtcga atgcagggta aatgccggac gcagctgaaa 5640
cggtatctcg tccgacatgt cagcagacgg gcgaaggcca tacatgccga tgccgaatct 5700
gactgcatta aaaaagcctt ttttcagccg gagtccagcg gcgctgttcg cgcagtggac 5760
cattagattc tttaacggca gcggagcaat cagctcttta aagcgctcaa actgcattaa 5820
gaaatagcct ctttcttttt catccgctgt cgcaaaatgg gtaaataccc ctttgcactt 5880
taaacgaggg ttgcggtcaa gaattgccat cacgttctga acttcttcct ctgtttttac 5940
accaagtctg ttcatccccg tatcgacctt cagatgaaaa tgaagagaac cttttttcgt 6000
gtggcgggct gcctcctgaa gccattcaac agaataacct gttaaggtca cgtcatactc 6060
agcagcgatt gccacatact ccgggggaac cgcgccaagc accaatatag gcgccttcaa 6120
tccctttttg cgcagtgaaa tcgcttcatc caaaatggcc acggccaagc atgaagcacc 6180
tgcgtcaaga gcagcctttg ctgtttctgc atcaccatgc ccgtaggcgt ttgctttcac 6240
aactgccatc aagtggacat gttcaccgat atgttttttc atattgctga cattttcctt 6300
tatcgcggac aagtcaattt ccgcccacgt atctctgtaa aaaggttttg tgctcatgga 6360
aaactcctct cttttttcag aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt 6420
atattgatta atactaagtt tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag 6480
ctccaaaggc taaagaggac tataccaact atttgttaat taa 6523
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv271-actAF1引物
<400> 29
cggaattcgg atccgcgcca aatcattggt tgattg 36
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv272-actAR1引物
<400> 30
gcgagtcgac gtcggggtta atcgtaatgc aattggc 37
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv273-actAF2引物
<400> 31
gcgagtcgac ccatacgacg ttaattcttg caatg 35
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv274-actAR2引物
<400> 32
gatactgcag ggatccttcc cttctcggta atcagtcac 39
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外部结合至actA区的引物3
<400> 33
tgggatggcc aagaaattc 19
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 外部结合至actA区的引物4
<400> 34
ctaccatgtc ttccgttgct tg 22
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PSA H-2Db肽
<400> 35
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E7 H-2Db
<400> 36
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增小鼠存活素的引物
<400> 37
atctcgaggg agctccggcg ctgccc 26
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于扩增小鼠存活素的引物
<400> 38
atcccgggtt aggcagccag ctgctc 26
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增人存活素的引物
<400> 39
atctcgaggg tgccccgacg ttgccc 26
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于扩增人存活素的引物
<400> 40
atcccgggtc aatccatggc agccagc 27
<210> 41
<211> 6235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pAdv265.5中的人存活素DNA序列
<400> 41
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagggtgc cccgacgttg ccccctgcct ggcagccctt tctcaaggac caccgcatct 2460
ctacattcaa gaactggccc ttcttggagg gctgcgcctg cgccccggag cggatggccg 2520
aggctggctt catccactgc cccactgaga acgagccaga cttggcccag tgtttcttct 2580
gcttcaagga gctggaaggc tgggagccag atgacgaccc catagaggaa cataaaaagc 2640
attcgtccgg ttgcgctttc ctttctgtca agaagcagtt tgaagaatta acccttggtg 2700
aatttttgaa actggacaga gaaagagcca agaacaaaat tgcaaaggaa accaacaata 2760
agaagaaaga atttgaggaa actgcgaaga aagtgcgccg tgccatcgag cagctggctg 2820
ccatggattg acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 2880
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 2940
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3000
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3060
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3120
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 3180
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 3240
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 3300
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 3360
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 3420
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 3480
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 3540
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 3600
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 3660
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 3720
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 3780
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 3840
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 3900
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 3960
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4020
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4080
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4140
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 4200
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 4260
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 4320
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 4380
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 4440
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 4500
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 4560
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 4620
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 4680
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 4740
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 4800
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 4860
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 4920
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 4980
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5040
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5100
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 5160
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 5220
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 5280
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 5340
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 5400
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 5460
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 5520
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 5580
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 5640
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 5700
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 5760
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 5820
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 5880
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 5940
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6000
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6060
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6120
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 6180
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 6235
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 42
Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg
1 5 10

Claims (26)

1.一种重组核酸分子，其包含编码重组多肽的开放读框，所述重组多肽包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的异源性抗原，其中所述异源性抗原为存活素，其中所述核酸还包含可操作地连接至第一启动子序列的革兰氏阴性复制起点序列、革兰氏阳性复制起点序列和可操作地连接至第二启动子序列的编码代谢酶的开放读框。
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子为DNA质粒。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ IDNO:41。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组核酸分子，其中所述革兰氏阴性复制起点序列为p15序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组核酸分子，其中所述革兰氏阳性复制起点序列为Rep R序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组核酸分子，其中所述第一启动子序列为hly启动子序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组核酸分子，其中所述代谢酶为D-丙氨酸消旋酶。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组核酸分子，其中所述第二启动子序列为P60启动子序列。
9.一种重组李斯特菌，其包含权利要求1-8所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌在所述内源性dal/dat基因中包含突变。
11.根据权利要求8-10所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌在所述内源性actA基因中包含突变。
12.根据权利要求8-11所述的重组李斯特菌，其中所述突变为缺失或失活。
13.根据权利要求9-12所述的重组李斯特菌菌株，其中所述重组李斯特菌菌株能够逃离所述吞噬溶酶体。
14.根据权利要求9-13所述的重组李斯特菌菌株，其中所述dal/dat突变由所述核酸分子编码的所述代谢酶补充。
15.根据权利要求9-14所述的重组李斯特菌菌株，其中所述重组李斯特菌菌株已经在动物宿主中传代。
16.根据权利要求9-15所述的重组李斯特菌菌株，其中所述重组李斯特菌菌株为重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。
17.一种免疫原性组合物，其包含权利要求9-16所述的重组李斯特菌菌株和佐剂、细胞因子、趋化因子或它们的组合。
18.一种诱导受试者的抗存活素免疫应答的方法，所述方法包括施用权利要求9-16所述的重组李斯特菌或权利要求17所述的免疫原性组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组李斯特菌菌株或所述免疫原性组合物经口或静脉内施用。
20.一种治疗、阻遏或抑制受试者的肿瘤或癌症的方法，其包括施用权利要求9-16所述的重组李斯特菌或权利要求15所述的免疫原性组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肿瘤或癌症为乳腺肿瘤或癌症、卵巢肿瘤或癌症、脑肿瘤或癌症、肺肿瘤或癌症、胃肠肿瘤或癌症、恶性毒瘤、胰腺肿瘤或癌症、淋巴瘤或它们的组合。
22.根据权利要求20-21所述的方法，其还包括施用强化剂量的所述重组李斯特菌或所述免疫原性组合物或其替代形式的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述免疫原性组合物的所述替代形式为编码包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的存活素抗原的重组多肽的DNA疫苗、包含融合至N末端李斯特菌溶血素O(LLO)多肽、N末端ActA多肽或PEST-肽的所述抗原的重组多肽，或编码所述重组多肽的病毒载体。
24.根据权利要求9-17中任一项所述的重组李斯特菌或免疫原性组合物用于诱导受试者的抗存活素免疫应答或用于治疗、阻遏或抑制受试者的表达存活素的癌症，或用于治疗、阻遏或抑制受试者的表达存活素的肿瘤的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述李斯特菌或所述免疫原性组合物经口或静脉内施用。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述肿瘤或癌症为乳腺肿瘤或癌症、卵巢肿瘤或癌症、脑肿瘤或癌症、肺肿瘤或癌症、胃肠肿瘤或癌症、恶性毒瘤、胰腺肿瘤或癌症、淋巴瘤或它们的组合。
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