CN110607267A

CN110607267A - 一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用

Info

Publication number: CN110607267A
Application number: CN201910912262.8A
Authority: CN
Inventors: 汪川; 周玉真; 刘思静; 张云雯
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110607267B

Abstract

本发明涉及一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用，在actA和plcB双基因减毒LI菌株的基础上，利用同源重组的方法得到缺失四个基因(actA、plcB、dal、dat)的减毒营养缺失株(LI△actAplcB△dal△dat)，该减毒营养缺失株在不添加D‑丙氨酸的营养环境中不能生长，再构建dal基因回补质粒导入此菌株，则获得了LI平衡致死系统，即回补菌(LI△actAplcB△dal△dat:dal)。本发明获得的LI平衡致死系统遗传稳定。本发明获得的LI平衡致死系统的细菌胞内含有的回补质粒，可作为插入外源抗原基因的载体，使该系统能稳定携带、表达外源基因，再利用LI本身具有的与抗原递呈相关的生物学特性，即可作为一种制备疫苗的载体加以应用。

Description

一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用。

背景技术

绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，LI)属于李斯特菌菌属，能进入巨噬细胞等抗原递呈细胞，并在胞内增殖，但其极少引起人类疾病，具有安全性。将结核分枝杆菌抗原插入LI基因组获得的重组细菌免疫小鼠，可引起以分泌IFN-γ为主的抗原特异性CD8⁺T细胞免疫反应，证实LI可用作疫苗载体。现报道的LI载体疫苗的构建方法是将外源抗原基因直接插入LI基因组或是将表达外源抗原的质粒导入LI中，前一种方法获得的重组菌的抗原表达量较低，疫苗抗原性较弱；后一种方法则需要抗生素来筛选质粒，质粒在细菌胞内的遗传稳定性也需要抗生素来维持，因此在体内缺乏抗生素压力的环境下，表达质粒会丢失，致使抗原表达量大大下降，疫苗抗原性下降；而且，这种带有抗生素耐药基因的质粒的疫苗菌在体内使用时，会随之导入抗生素耐药基因，可能引发细菌耐药问题。因此，为解决上述问题，本发明开发一种新的适用于LI的抗原表达系统——LI平衡致死系统。

目前，国内外对平衡致死系统的研究主要集中在沙门菌平衡致死系统，还尚未有LI平衡致死系统的报道。如要构建平衡致死系统，首先需要找到一种或两种细菌生长必需基因。现有的LI各基因功能的相关研究资料不多，我们只能参考李斯特菌属中另一种细菌——单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的相关研究。研究发现LM中存在2种控制细菌细胞壁主要成分D-丙氨酸合成的基因dal与dat，当这2种基因全部缺失时，由于不能产生D-丙氨酸，在无外源D-丙氨酸添加时，该dal/dat双基因缺失的LM将发生溶菌死亡。LI基因组成虽与LM相似，但关于LI各基因功能、致病机理、体内体外生物学特征研究的资料还很匮乏。尤其是目前尚未有研究明确LI dal和LI dat基因的功能，也没有报道当缺失dal和(或)dat基因时，LI是否会出现与LM类似的现象，以及缺失上述基因后的细菌在溶血能力、细胞侵袭增殖能力等方面的变化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用，该平衡致死系统可用作制备疫苗的载体。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种绵羊李斯特菌平衡致死系统的构建方法，具体步骤如下：

(1)构建dal、dat基因打靶质粒pCW107-LI dal、pCW107-LI dat，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；

(2)制备感受态LIΔactAplcB-lacZ，LIΔactAplcB-lacZ简称为LIΔ，向其中转入质粒pCW107-LI dal，经传代培养后敲除绵羊李斯特菌dal基因，得到LIΔactAplcB Δdal；制备感受态LIΔactAplcBΔdal，向其中转入质粒pCW107-LI dat，经传代培养后敲除dat基因，得到LIΔactAplcBΔdalΔdat，简称为LIΔdd；

(3)构建绵羊李斯特菌回补株LIΔactAplcBΔdalΔdat:dal，简称为LIΔdd:dal。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：

(1-2)提取质粒pCW107，以限制性内切酶Xba Ⅰ和Spe Ⅰ进行酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化处理，得到打靶质粒载体线性片段；

(1-2)以LIΔ为模板，用SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的引物扩增LIdal基因5＇端上游991bp长的一段序列LIdal-up，即LIdal基因上游同源臂，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；用SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的引物扩增LIdal基因3＇端下游857bp长的一段序列LIdal-down，即LIdal基因下游同源臂，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示；用SEQ IDNO.9和SEQID NO.10所示的引物扩增LIdat基因5＇端上游970bp长的一段序列LIdat-up，即LIdat基因上游同源臂，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示；用SEQ ID NO.12和SEQID NO.13所示的引物扩增LIdat基因3＇端下游899bp长的一段序列LIdat-down，即LIdat基因下游同源臂，其核苷酸序列如SEQID NO.14所示；然后分别以LI dal-up和LIdal-down、LIdat-up和LI dat-down为模板，分别以SEQ ID NO.3和SEQID NO.7所示的引物、SEQ ID NO.9和SEQIDNO.13所示的引物进行overlapPCR反应实现拼接，得到插入片段LI dal-updown和LI dat-updown，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQID NO.16所示；

(1-3)将步骤(1-1)所得线性片段与步骤(1-2)所得插入片段LI dal-updown、LIdat-updown分别进行连接，筛选获得打靶质粒pCW107-LI dal和pCW107-LI dat并保存。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：

(2-1)提取质粒pCW107-LI dal和pCW107-LI dat；

(2-2)制备感受态LIΔ；

(2-3)将质粒pCW107-LI dal电转入感受态LIΔ中；

(2-4)利用SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQID NO.20所示的引物进行PCR筛选，获得阳性菌并提取质粒验证；

(2-5)挑选符合PCR和质粒验证的阳性菌进行接种，培养，实现同源重组；

(2-6)进行红霉素抗性筛选，符合者利用SEQ ID NO.21、SEQID NO.22所示的引物对进行PCR筛选，PCR筛选的阳性菌经测序验证完全正确的命名为LIΔactAplcBΔdal；

(2-7)按照步骤(2-2)～(2-6)的方法制备感受态LIΔactAplcBΔdal，将质粒pCW107-LI dat电转LIΔactAplcBΔdal，同源重组，利用SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的引物进行PCR筛选，PCR筛选的阳性菌经测序验证完全正确的命名为LIΔactAplcBΔdalΔdat，简称为LIΔdd。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：

(3-1)先提取质粒pCW-gfp，以限制性内切酶SalⅠ和SpeⅠ进行酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化处理，得到去除Ery^R基因的载体；再以LM10403s菌为模板，SEQ ID NO.25和SEQIDNO.26所示的引物扩增LM phly基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；以SEQ ID NO.28和SEQID NO.29所示的引物扩增LM dal基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；接着以LMphly基因和LM dal基因为模板，SEQ ID NO.25和SEQID NO.29所示的引物进行overlapPCR，得到拼接产物LM phly-dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；然后将去除Ery^R基因的载体与LM phly-dal进行连接，筛选，验证，得到阳性质粒pCW-gfp-amp-LM dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；

(3-2)提取质粒pCW-gfp-amp-LM dal，以限制性内切酶SapI和AtaII进行酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化处理，得到去除Amp^R基因的载体；然后用乙醇沉淀纯化上述去除Amp^R基因的载体DNA，平末端连接，得到连接产物pCW-gfp-LM dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

(3-3)制备感受态LIΔΔ；

(3-4)将步骤(3-2)所得pCW-gfp-LM dal电转步骤(3-3)所得LIΔΔ感受态，以SEQID NO.34和SEQID NO.35所示的引物及SEQ ID NO.19和SEQID NO.20所示的引物进行PCR筛选，得到回补株LIΔactAplcBΔdalΔdat:dal，简称为LIΔdd:dal。

2、利用上述构建方法得到的一种绵羊李斯特菌平衡致死系统。

3、上述一种绵羊李斯特菌平衡致死系统作为疫苗载体的应用。

作为优选的技术方案之一，所述疫苗载体为疫苗活菌载体。

本发明的有益效果在于：

作为一种疫苗载体，必须首先保证安全性。本发明是在actA和plcB双基因减毒LI菌株的基础上，利用同源重组的方法得到缺失四个基因(actA、plcB、dal、dat)的减毒营养缺失株(LI△actAplcB△dal△dat)，该减毒营养缺失株在不添加D-丙氨酸的营养环境中不能生长，再构建dal基因回补质粒导入此菌株，则获得了LI平衡致死系统，即回补菌(LI△actAplcB△dal△dat:dal)。本发明获得的LI平衡致死系统不含抗生素耐药基因，遗传稳定；回补菌能进入吞噬细胞等抗原递呈细胞增殖，也能进入肝细胞等非吞噬细胞增殖；生化特性与出发菌(actA和plcB双基因减毒LI菌株)相似，表明回补菌恢复了出发菌的特性；经过减毒处理，对小鼠毒力较弱，比出发菌株更安全；此外，该LI平衡致死系统还加入了绿色荧光蛋白基因，能发绿色荧光，可作为示踪标记。本发明获得的LI平衡致死系统的细菌胞内含有的回补质粒，可作为插入外源抗原基因的载体，使该系统能稳定携带、表达外源基因，再利用LI本身具有的与抗原递呈相关的生物学特性，即可作为一种制备疫苗的载体加以应用。具体如下：

1、本发明获得的回补株LIΔactAplcBΔdalΔdat:dal(LIΔdd:dal)不含有抗生素耐药基因，不会引起细菌耐药问题；2、本发明获得的LI平衡致死系统的基因组成稳定，质粒能稳定地随细菌遗传到子代，不会丢失；3、本发明获得的回补株LIΔdd:dal经过减毒处理，对小鼠毒力较弱，在小鼠脾脏2-3天、肝脏5～7天就被清除完全，具有生物安全性，回补株中的回补质粒在体内遗传稳定；4、在减毒株LIΔactAplcB(LIΔ)的基础上进行dal和dat基因双缺失而得的LI减毒营养缺失株LIΔactAplcBΔdalΔdat(LIΔdd)，其生长必须依赖于额外添加D-丙氨酸，而加入回补质粒后的回补株LIΔdd:dal，不依赖于D-丙氨酸，能在普通培养基上生长；5、本发明获得的LI平衡致死系统携带绿色荧光蛋白，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，可作为体内外对该LI平衡致死系统进行示踪的标记；6、本发明获得的LI平衡致死系统体外生长良好，生化特性与出发菌相似，对吞噬细胞和非吞噬细胞的侵袭黏附和在胞内增殖的能力与出发菌相当，表明其能够跟出发菌一样，作为抗原递呈的载体，引发抗原特异性免疫应答，可作为一种制备疫苗的活菌载体加以应用；7、本发明获得的LI平衡致死系统的细菌胞内含有的回补质粒，可作为插入外源抗原基因的载体，使该系统能稳定携带、表达外源基因，再利用LI本身具有的与抗原递呈相关的生物学特性，作为一种制备疫苗的载体加以应用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为dal基因和dat基因打靶质粒的示意图。a为dal基因打靶质粒示意图，b为dat基因打靶质粒示意图；图2为绵羊李斯特菌dal、dat基因的敲除过程示意图；图3为回补株PCR验证结果。a中，M表示DL2000marker，1表示回补株以引物对“LMdal-F/R”进行PCR扩增结果；b中，M表示DL5000marker，1表示回补株以引物对“LI-orfBAldh-f/r”进行PCR扩增结果；图4为LIΔdd:dal的生长曲线。***表示与亲本株LIΔ相比，P<0.001；图5为第5、10、15、20、25代的LIΔdd:dal稳定性检测PCR结果；图6为绵羊李斯特菌平衡致死系统各菌株在巨噬细胞RAW264.7中的增殖情况。*：P<0.05,**：P<0.01，***：P<0.001；图7为绵羊李斯特菌平衡致死系统各菌株对Hepa1-6细胞黏附与侵袭率。a：对Hepa1-6细胞黏附率，b：对Hepa1-6细胞侵袭率，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；图8为小鼠尾静脉接种回补株后肝脾载菌量变化图(分别滴板于BHI和D-BHI平板计数)。a为LIΔdd:dal在小鼠肝脏中的载菌量；b为LIΔdd:dal在小鼠脾脏中的载菌量。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1.构建dal、dat基因打靶质粒的基本方法

1.1 打靶质粒载体线性片段的准备

1.1.1 提质粒

按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒pCW107(Wang C,Zhang F,YangJ,Khanniche A,Shen H.Expression of Porcine Respiratory and ReproductiveSyndrome Virus membrane-associated proteins in Listeria ivanovii via a genomesite-specific integration and expression system.J Mol Microbiol Biotechnol,2014,24(3):191-195.)，以35μL Elution Buffer洗脱。

1.1.2 酶切

取质粒pCW107以限制性内切酶XbaⅠ和SpeⅠ酶切，酶切体系按试剂说明进行。37℃水浴1h进行酶切后加入0.5μL碱性磷酸酶(CIAP)，37℃水浴30min去磷酸化。

1.1.3 胶回收

将酶切混合物与适量6×Loading Buffer混合，在质量浓度1％的琼脂糖凝胶、94V的条件下进行电泳(以下电泳条件均于此相同)。成像后切下6319bp的目的片段，按照OMEGADNA产物纯化试剂盒说明书回收载体片段，以35μL Elution Buffer洗脱，并用Nanodrop对上述DNA片段进行浓度及纯度检测。

1.2 插入片段的准备

1.2.1 LI dal、dat基因上下游同源臂的扩增

挑取BHI平板上的单个LI PAM55(Zhou M,Jiang M,Ren C,Liu S,Pu Q,GoldfineH,Shen H,Wang C.Listeria ivanovii infection in mice:restricted to the liverand lung with limited replication in the spleen.Front Microbiol,2016,7:790.)菌落于100μL纯水中，沸水浴煮沸15min，离心取上清作为模板；使用快速高保真pfu酶以引物对“LI-Dal-up-F/R”扩增LIdal基因5＇端上游991bp长的一段序列LIdal-up(LIdal基因上游同源臂)，以引物对“LI-Dal-down-F/R”扩增LIdal基因3＇端下游857bp长的一段序列LIdal-down(LIdal基因下游同源臂)，以引物对“LI-Dat-up-F/R”扩增LIdat基因5＇端上游970bp长的一段序列LIdat-up(LIdat基因上游同源臂)，以引物对“LI-Dat-down-F/R”扩增LIdat基因3＇端下游899bp长的一段序列LIdat-down(LIdat基因下游同源臂)，PCR体系和反应程序见表1，反应产物电泳，在紫外成像系统中切下含目的片段的凝胶，进行胶回收，以35μL Elution Buffer洗脱，并用Nanodrop定量。

表1 快速高保真酶的PCR体系及扩增条件

1.2.2 LI dal、dat基因上下游同源臂的拼接

用Overlap PCR以LI dal-up和LIdal-down为模板(所用引物为“LI-Dal-up-F”与“LI-Dal-down-R”)、LIdat-up和LI dat-down为模板(所用引物为“LI-Dat-up-F”与“LI-Dat-down-R”)进行扩增，PCR反应程序见表1，PCR反应体系见表2，反应完成后进行电泳并回收相应拼接产物LI dal-updown、LI dat-updown，具体方法同前。

表2 Overlap PCR体系

1.3 连接

将酶切和去磷酸化后的载体线性片段和插入片段LI dal-updown和LI dat-updown分别按表3比例混匀后，50℃连接15min。将连接产物按热休克法转化至大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板(含100μg/mL Amp溶液的LB平板)，37℃培养16～20h。

表3 无缝克隆体系

1.4 筛选并保存

1.4.1 PCR筛选

挑取LA平板上单个白色菌落进行增菌培养，分别以引物“LI-Dal-up-F”与“LI-Dal-down-R”、“LI-Dat-up-F”与“LI-Dat-down-R”进行PCR筛选，PCR体系中酶换成2×TaqMastermix，其余成分和反应程序与表1相同，反应产物电泳检测。

1.4.2 酶切验证

将PCR筛选阳性的菌落以LA肉汤(含100μg/mL Amp溶液的LB肉汤)增菌，提质粒，以XbaⅠ和SpeⅠ进行酶切，酶切结束后，酶切混合物进行电泳检测。

1.4.3 测序验证

按前述方法提取PCR筛选和酶切验证均符合预期的质粒，送往北京擎科新业有限公司进行测序验证。将测序验证后完全正确的阳性质粒分别命名pCW107-LI dal、pCW107-LI dat，携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-20℃和-80℃。质粒结构示意图如图1。

实施例2.绵羊李斯特菌dal、dat基因的敲除

2.1 提质粒

分别提取质粒pCW107-LI dal和pCW107-LI dat，以35μL无菌ddH₂O洗脱。

2.2 制备感受态细胞

挑取BHI平板上新鲜培养的LIΔactAplcB-lacZ(简称LIΔ)(Wang C,Zhang F,Yang J,Khanniche A,Shen H.Expression of Porcine Respiratory and ReproductiveSyndrome Virus membrane-associated proteins in Listeria ivanovii via a genomesite-specific integration and expression system.J Mol Microbiol Biotechnol,2014,24(3):191-195.)菌落接种于15mL含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤，37℃180rpm过夜培养；将上述肉汤培养物全部接种于250mL含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤，37℃180rpm摇育，以含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤调零，定期测定A₆₀₀值；当A₆₀₀值达到0.4时，加入盘尼西林G(终浓度为12.5μg/mL)，混匀后继续摇育；当A₆₀₀值达到0.7时，将肉汤培养物分装至50mL离心管，4℃13000rpm离心5min，弃上清；加入20mL 0.5mol/L蔗糖溶液洗涤沉淀，4℃10000rpm离心10min，弃上清；重复洗涤1次；每管加入300μL 0.5mol/L蔗糖重悬，50μL/支分装1.5mL EP管，-80℃保存。

2.3 电转

取感受态细胞LIΔ冰浴自融；用预冷的枪头吸取5μL打靶质粒pCW107-LI dal加入50μL上述感受态细胞中；轻柔混匀，冰浴5min；将液体转移至预冷的电转杯中，冰浴5min；在电压1500V条件下电击5ms；点击后电转杯取出冰浴5min，加入预热750μL含1mol/L蔗糖的BHI肉汤，30℃，150rpm摇育2h；将菌液涂布于BE₃平板(含3μg/mL Ery溶液的BHI平板)，37℃培养48-72h。

2.4 电转后筛选

2.4.1 PCR筛选

挑取BE₃平板上单个菌落进行增菌培养，分别以引物“E53-LIdal-F”和引物“0725-ZYZ-2”以及引物对“LI-orfBAldh-F/R”进行PCR筛选，PCR体系和反应程序同1.4.1。PCR产物电泳检测。

2.4.2 提质粒验证

将PCR筛选的阳性菌接种于BE₁₀肉汤(含10μg/mL Ery溶液的BHI肉汤)，30℃180rpm过夜培养；取新鲜菌液于1.5mL EP管中，13000rpm离心1min，弃去上清；加入250μL含有20mg/mL溶菌酶的SolutionⅠ(含RNA酶)，重悬细菌沉淀，于37℃水浴45min进行破壁；其余步骤按OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒，电泳检测。

2.5 同源重组

挑选符合PCR和质粒验证的阳性菌落接种于D-BE₃平板(含200μg/mL D-丙氨酸的BE3平板)，于42℃培养48～72h，传2-3代；将菌落接种于含200μg/mL D-丙氨酸的BHI肉汤，30℃180rpm摇育24h，连续接种6代，取第6代培养物50μL用PBS溶液进行10⁶稀释，取100μL稀释液涂布于D-BHI(含200μg/mL D-丙氨酸的BHI平板)平板，37℃培养24～48h。

2.6 筛选并保存

2.6.1 红霉素抗性筛选

挑取D-BHI平板上长出的菌落分别划线接种D-BE₃平板和D-BHI平板，37℃培养24～48h；挑取能在D-BHI平板上生长且在相应D-BE₃平板不生长的菌落进行PCR验证。

2.6.2 PCR筛选

挑取符合红霉素抗性筛选的菌落，以引物对“LI dal-F/R”进行PCR筛选，PCR体系和反应程序同1.4.1，PCR产物电泳检测。

2.6.3 测序验证

PCR筛选的阳性菌株送至北京擎科新业有限公司进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为LIΔactAplcBΔdal。

按照前述方法制备LIΔactAplcBΔdal感受态，将质粒pCW107-LI dat电转LIΔactAplcBΔdal感受态细菌，按前述方法进行同源重组，用引物对“LIdat-F/R”进行PCR筛选出dat基因被敲除的菌株，PCR筛选的阳性菌株送至北京擎科新业有限公司进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为LIΔactAplcBΔdalΔdat，简称为LIΔdd。过程示意图如图2。

实施例3.绵羊李斯特菌回补株的构建

3.1 去除Ery^R基因的回补质粒的构建

3.1.1 提质粒

按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒pCW-gfp(Zhang X,Su L,HuangH,Jiang M,Liu S,Li Y,Liu T,Zhou Y,Tang T,Mahdy SE,Wang C.Coating withchitooligosaccharides enhances the cytokine induction of Listeria ivanovii-based vaccine strain.J Pharm Sci,2019,108(9):2926-2933.)，以35μL ElutionBuffer洗脱，并用Nanodrop检测其浓度及纯度。

3.1.2 酶切去除Ery^R基因

取质粒pCW-gfp以限制性内切酶Sal Ⅰ和Spe Ⅰ酶切。37℃水浴1h进行酶切后加入0.5μL CIAP，37℃水浴30min去磷酸化。

3.1.3 胶回收

酶切混合物电泳，在紫外成像系统中切下含5828bp的目的片段的凝胶，按照OMEGADNA产物纯化试剂盒说明书回收载体片段，以35μL Elution Buffer洗脱，并用Nanodrop对上述DNA片段进行浓度及纯度检测。

3.1.4 LM phly基因及LM dal基因的扩增

挑取BHI平板上的单个LM 10403s(Zhou M,Jiang M,Ren C,Liu S,Pu Q,GoldfineH,Shen H,Wang C.Listeria ivanovii infection in mice:restricted to the liverand lung with limited replication in the spleen.Front Microbiol,2016，7:790.)菌落于100μL纯水中，沸水浴煮沸15min，离心取上清作为模板；使用快速高保真pfu酶以引物对“LM-phly-F/R”扩增LM phly基因、以引物对“LM-dal-phly-F/R”扩增LM dal基因。PCR体系和反应程序见表1，反应产物电泳，在紫外成像系统中切下目的片段，进行胶回收，以35μL Elution Buffer洗脱，并用Nanodrop定量。

3.1.5 LM phly基因与LM dal基因的拼接

用Overlap PCR以LM phly基因和LM dal基因为模板，以引物“LM-phly-F”与“LM-dal-phly-R”按表1进行扩增，得到产物LM phly-dal，电泳并回收相应拼接产物。

3.1.6 连接

将3.1.3获得的载体和3.1.5获得的插入片段LM phly-dal按表3混匀后，50℃连接15min。将连接产物按热休克法转化至大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板，37℃培养16～20h。

3.1.7 PCR筛选

挑取LA平板上单个白色菌落进行增菌培养，以引物“LMdal回补筛选-F”(5’-AATTCATTTAAAAGTAGATA-3’)和引物“pCW-gfp筛选/测序-R”(5’-CAGTACCGGCATAACCAAGC-3’)进行PCR筛选，PCR体系和反应程序同1.4.1，PCR产物进行电泳检测。

3.1.8 酶切验证

将PCR筛选阳性的菌落以LA肉汤增菌，提质粒，以SalⅠ和SpeⅠ进行酶切，酶切混合物进行电泳检测。

3.1.9 测序验证

按前述方法提取PCR筛选和酶切验证均符合预期的质粒，送往北京擎科新业有限公司进行测序验证，完全正确的阳性质粒命名为pCW-gfp-amp-LM dal，此时质粒上Ery^R片段已被切除，而Amp^R片段依旧存在。

3.2 去除Amp^R基因的回补质粒的构建

3.2.1 提质粒

按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒pCW-gfp-amp-LM dal，以35μLElution Buffer洗脱，并用Nanodrop检测其浓度及纯度。

3.2.2 酶切

取质粒pCW-gfp-amp-LM dal以限制性内切酶SapI和AtaII进行酶切以去除Amp^R基因片段并按前述步骤进行胶回收。

3.2.3 平末端连接

3.2.3.1 乙醇沉淀DNA

将胶回收产物利用无水乙醇沉淀DNA：取2μg载体片段，加入1/10体积的乙酸钠(3mol/L，pH＝5.2)与其充分混匀，使其终浓度为0.3mol/L；加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中60min；12000rpm离心10min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；加入1/2离心管容量的体积浓度70％乙醇，12000rpm离心2min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；于室温下将开盖的EP管置于实验桌上以使残留的液体挥发至干。

3.2.3.2 平末端连接

以Takara公司的DNA Blunting Kit为例。取8μL灭菌纯水重悬DNA，加入1μL10×Buffer混匀，70℃保温5min，立即37℃保温5min。加入1μL T4 DNA poly，37℃反应5min(保温时间需准确)。加入适量体积DNA dilution Buffer使DNA浓度达到1μg/50μL，剧烈震荡混匀使T4 DNA poly失活，置于冰上，取2μL DNA片段(约50ng)，加4倍体积溶液A和1倍体积溶液B，16℃连接过夜，得到pCW-gfp-LM dal。

3.3 LIΔΔ感受态的制备

按实施例2(2.2)所述制备感受态，特别注意的是需在培养肉汤中加入不少于200μg/mL的D-丙氨酸。

3.4 回补株的构建

3.4.1 连接产物电转营养缺失株

将3.2.3.2的连接产物pCW-gfp-LM dal按3.2.3.1经过乙醇沉淀纯化后电击转化LIΔΔ感受态，电转方法同2.3，涂布于BHI平板，37℃培养24～48h。

3.4.2 电转后筛选

挑取BHI平板上单个菌落进行增菌培养，分别以引物对“LMdal-F/R”和引物对“LI-orfBAldh-f/r”进行PCR筛选，PCR体系和反应程序同1.4.1，PCR产物进行电泳检测，筛选出回补株LIΔactAplcBΔdalΔdat:dal，简称为LIΔdd:dal。回补株验证结果见图3。

实施例4.绵羊李斯特菌营养缺失株(LIΔdd)与回补株(LIΔdd:dal)的生长特性比较

LIΔdd和LIΔdd:dal分别接种添加终浓度400μg/mL D-丙氨酸的BHI肉汤和普通BHI肉汤37℃过夜培养；将过夜培养的菌液13000rpm离心5min，弃去上清，加入5mL BHI肉汤(这一步为了去除肉汤中未消耗完的D-丙氨酸)，取适量菌液接种于50mL BHI肉汤(LIΔdd培养管需添加终浓度为400μg/mL的D-丙氨酸)；以BHI肉汤为空白调零，调节各菌液的A₆₀₀值为0.07左右，37℃180rpm摇床培养；每隔1h测定一次菌液的A₆₀₀值直至第10h。结果如图4所示，LIΔdd在普通BHI肉汤中无法生长，在添加了终浓度为400μg/mL D-丙氨酸的BHI肉汤中，营养缺失株LIΔdd能够正常生长，且与亲本株的生长趋势一致，回补株LIΔdd:dal在普通BHI肉汤能够正常生长，但生长速度慢于亲本株。

实施例5.绵羊李斯特菌回补株在体外培养的遗传稳定性

将构建好的回补株LIΔdd:dal在BHI肉汤中连续培养25代，每37℃培养24h为1代，于第5、10、15、20、25代吸取1mL菌液，离心，用无菌纯水离心洗涤2次后加入200μL无菌纯水重悬，煮沸15min后离心取上清，以引物对“HomoLIdal-F/R”(F:5’-CGGGCTAGAAGCTTTACCA-3’；R:5’-GGTTTCTGATGTCCCTTAAATC-3’)、“LMdal-F/R”进行PCR验证回补株的稳定性，PCR体系和反应程序同1.4.1。PCR产物电泳检测，结果如图5所示，第5、10、15、20、25代的回补株分别以引物对“LMdal-F/R”扩增，均检测出909bp的条带，表明回补质粒上的dal基因能稳定存在且表达；以引物对“HomoLIdal-F/R”进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分别在1976bp、2051bp处存在明显条带，而亲本株对照则分别在3083bp、3158bp处出现条带，表明回补株细菌的dal基因缺失。

实施例6.绵羊李斯特菌营养缺失株与回补株在鼠巨噬细胞内增殖能力的比较

6.1 鼠巨噬细胞的培养与传代

从液氮罐中取出冻存的RAW264.7巨噬细胞(Zhang X,Su L,Huang H,Jiang M,LiuS,Li Y,Liu T,Zhou Y,Tang T,Mahdy SE,Wang C.Coating with chitooligosaccharidesenhances the cytokine induction of Listeria ivanovii-based vaccine strain.JPharm Sci,2019,108(9):2926-2933.)，置于37℃水浴锅中快速融化，转移到含5mL DMEM培养液的无菌离心管中，1000rpm离心5min后弃去上清，加入4mL含体积浓度20％的胎牛血清(FBS)的DMEM(20％FBS-DMEM)(含双抗)培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置于CO₂培养箱中37℃培养。每天观察细胞生长状况，当细胞密度达到80％～90％进行传代。

6.2 细胞计数与铺板

细胞传至第3代，洗涤、消化后将细胞吹打到20％FBS-DMEM(不含双抗)培养液中制成细胞悬液，取适量悬液与苔盼蓝混合后用细胞计数板进行计数。将适量细胞悬液接种至24孔细胞培养板中(每孔1×10⁶个)，每孔再加入1mL含体积浓度10％的FBS的DMEM(10％FBS-DMEM)(不含双抗)培养液，置于CO₂培养箱37℃过夜培养。

6.3 细菌的准备

吸取250μL过夜培养的新鲜LIΔ、LIΔdd和LIΔdd:dal菌液，接种于5mL BHI肉汤(培养LIΔdd的BHI肉汤需加入终浓度400μg/mL D-丙氨酸)，于37℃180rpm摇床中培养，定时测定A₆₀₀值，当A₆₀₀值为0.4时，取出试管。将试管中的菌液转移到15mL离心管中，4℃13000rpm离心5min，弃上清，用5mL PBS洗涤，4℃13000rpm离心2min，弃上清，用适量10％FBS-DMEM培养液重悬细菌置于冰上备用，此时细菌浓度约为10⁸CFU/mL。

6.4 细菌在鼠巨噬细胞RAW264.7内的增殖与计数

6.4.1 细菌的感染

将24孔细胞培养板取出，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入900μL 10％FBS-DMEM(不含双抗)培养液。以MOI约20：1的感染量加入100μL菌液，晃动培养板使细菌分布均匀，于37℃CO₂培养箱中作用1h。

根据接种的细菌分为4组：①亲本株LIΔ；②营养缺失株LIΔdd；③营养缺失株LIΔdd+D-丙氨酸(培养液加入终浓度400μg/mL的D-丙氨酸)；④回补株LIΔdd:dal。

6.4.2 杀死胞外细菌

弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含200μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM培养液(不含双抗)，37℃CO₂培养箱中作用1h以杀灭胞外细菌。

6.4.3 不同时间点细胞内的细菌计数

取部分孔弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，多次吹打后将悬液转移到EP管中，用体积浓度0.1％Triton-100溶液连续10倍稀释，每一稀释度取20μL平行双样点种于BHI平板(其中LIΔdd需点种在D-BHI平板上以确保细菌正常生长)，37℃培养48h，菌落计数，此时计数的细菌标为2h组。剩余孔继续培养，之后每隔2h取部分孔洗涤细胞收集细菌直至8h。增殖倍数＝各时间点回收的胞内细菌数/入侵细胞的细菌数(2h时回收的胞内细菌数)。结果如图6所示，亲本株LIΔ和回补株LIΔdd:dal均能在巨噬细胞内增殖，感染4h后出现增殖趋势，在6h时增殖倍数到达峰值，之后菌量逐渐减少，回补株LIΔdd:dal在感染6h后增殖倍数与亲本株LIΔ无统计学差异(P>0.05)，营养缺失株LIΔdd基本不能在巨噬细胞内增殖，在营养缺失株感染过程中加入400μg/mL的D-丙氨酸后，菌株表现出与亲本株同样的增殖趋势。

实施例7.绵羊李斯特菌营养缺失株与回补株对鼠肝癌细胞黏附侵袭能力比较

7.1 鼠肝癌细胞Hepa1-6的培养与传代

从液氮罐中取出冻存的鼠肝癌细胞Hepa1-6，其余操作如6.1，但鼠肝癌细胞Hepa1-6贴壁细胞加入1mL胰酶后，于37℃CO₂培养箱中需消化3min。

7.2 细胞计数与铺板

按6.2操作。

7.3 细菌的准备

按6.3操作。

7.4 黏附与侵袭的计数

7.4.1 细菌的感染

将培养后的24孔板取出，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入900μL 10％FBS-DMEM(不含双抗)培养液。以MOI约10：1的感染量加入100μL菌液，晃动培养板使细菌分布均匀，于37℃CO₂培养箱中作用1h。

根据接种的细菌分为4组：①亲本株LIΔ；②营养缺失株LIΔdd；③营养缺失株LIΔdd+D-丙氨酸(加入终浓度400μg/mL的D-丙氨酸)；④回补株LIΔdd:dal。

7.4.2 黏附率的计算

弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，混匀后吸至EP管中；连续10倍稀释，取20μL稀释液点种于BHI平板(平行双样)(LIΔdd需点种在D-BHI平板上以确保细菌正常生长)，37℃培养48h，菌落计数；细菌黏附率计算公式＝((胞内细菌数+黏附细菌数)/接种菌数)×100％。

7.4.3 侵袭率的计算

弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含200μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM培养液(不含双抗)，37℃CO₂培养箱中作用1h以杀死胞外细菌。弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含20μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM(不含双抗)细胞培养液置于37℃CO₂培养箱继续培养1h后弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，混匀后吸至EP管中；连续10倍稀释，每一稀释度取20μL稀释液点种于BHI平板(平行双样)(LIΔdd需点种在D-BHI平板上以确保细菌正常生长)，37℃培养48h，菌落计数；细菌侵袭率计算公式＝(胞内细菌数/接种菌数)×100％。结果如图7所示，亲本株LIΔ、营养缺失株LIΔdd、感染过程中加入终浓度400μg/mL D-丙氨酸的营养缺失株LIΔdd、回补株LIΔdd:dal对鼠肝癌细胞细胞的黏附率分别为2.1％、0.19％、1.2％和0.59％，与亲本株相比，营养缺失株黏附率明显降低(P<0.001)；在感染过程中加入D-丙氨酸后，黏附率有所提高(P<0.01)；回补dal基因后，菌株黏附能力有所提高，但仍低于亲本株(P<0.01)；亲本株LIΔ、营养缺失株LIΔdd、感染过程中加入终浓度400μg/mL D-丙氨酸的营养缺失株LIΔdd、回补株LIΔdd:dal对鼠肝癌细胞细胞的侵袭率分别为0.24％、0.022％、0.16％和0.14％，与亲本株相比，营养缺失株侵袭率明显降低(P<0.001)；在感染过程中加入D-丙氨酸后，侵袭率有所提高(P<0.05)；回补dal基因后，菌株侵袭能力有所提高，但仍低于亲本株。

实施例8.绵羊李斯特菌营养缺失株与回补株对小鼠毒力的比较

8.1 细菌的准备

按6.3操作，根据表4用PBS分别配制高、中、低剂量的LIΔdd和LIΔdd:dal。

表4 营养缺失株和回补株的接种量及菌悬液浓度

8.2 小鼠毒力测定

6～8周龄的C57BL/6雌鼠随机分组，剪耳标记，适应性饲养3d；75％酒精消毒小鼠尾部皮肤后，尾静脉缓慢注射100μL菌悬液；接种完毕后，对菌液进行10倍梯度稀释，各稀释度取20μL平行双样滴种于BHI平板(其中LIΔdd需点种在D-BHI平板上以确保细菌正常生长)，37℃培养，48h后进行菌落计数，以测定各接种液中菌液的实际剂量。连续10d观察和记录小鼠体重和死亡情况。所得结果为低、中、高剂量组的小鼠均无死亡，故选取5×10⁸CFU作为免疫小鼠的最高免疫剂量。

实施例9.绵羊李斯特菌回补株在小鼠体内的生长情况及稳定性

9.1 菌悬液制备

配制5×10⁹CFU/mL LIΔdd:dal菌悬液的方法同6.3。

9.2 体内稳定性及脏器载菌量测定

小鼠随机分组，剪耳标记，适应性饲养3d后；75％酒精消毒小鼠尾部皮肤，尾静脉缓慢注射100μL上述菌悬液；分别于接种后1、2、3、5、7和14d以颈椎脱臼法处死小鼠；无菌操作取出小鼠肝脏、脾脏。在肝脏、脾脏中分别加入2mL、1mL体积浓度0.1％Triton X-100溶液，转移至裂解介质管进行匀浆；对匀浆液用无菌PBS进行10倍系列稀释，取20μL稀释液分别点种于BHI平板和D-BHI平板(平行双样)，37℃培养24～48h，于BHI平板生长的菌落计为回补株，于D-BHI平板生长的菌落计为丢失回补质粒的回补株与未丢失回补质粒的回补株，通过对比BHI平板和D-BHI上生长的菌落数可分析出回补株在体内的传代稳定性，将平板计数菌落换算成各脏器中的细菌载量(lgCFU/organ)可得到回补株在小鼠体内肝脏、脾脏的生长规律。结果如图8所示，在接种后1d，LIΔdd:dal在小鼠肝脏中的载菌量能达到10⁵，随后菌量逐渐降低，在接种后第7d小鼠肝脏内菌量均下降至检出限以下，表明细菌已从肝脏中清除，接种后14d肝脏中也未检测到细菌，表明细菌未复燃；在接种1d后，LIΔdd:dal在小鼠脾脏中的载菌量能达到10³，随后逐渐降低，接种后第3d，小鼠脾脏内菌量下降至检出限以下，表明细菌已被脾脏清除，接种后14d也均未在脾脏中检测到细菌，表明细菌未复燃迹象。LIΔdd:dal接种后的小鼠肝脾内的细菌在D-BHI和BHI平板上生长的数量没有差异(P>0.05)，由此可说明回补株在小鼠体内没有发生质粒丢失。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用

<130> 2019

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8713

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tcatgtttga cagcttatca tcgtcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 60

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 180

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 900

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 960

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 1020

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 1080

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 1140

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1200

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1260

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1320

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1380

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 1440

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 1500

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 1560

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 1620

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 1680

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 1740

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 1800

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 1860

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 1920

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 1980

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 2040

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 2100

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 2160

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 2220

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 2280

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 2340

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 2400

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 2460

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat 2520

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 2580

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 2640

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 2700

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 2760

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 2820

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 2880

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 2940

aggccctttc gtcttcaaga attcccagca tggagccaca caactgtcgg cggccttcca 3000

attactgaat ggattagcga agatgaacaa ggtgcaatgg atactatttt cgtaagtgtt 3060

cgtgatgcag cttatgaaat tattaataaa aaaggcgcta cattctacgg cgttgctgca 3120

gctcttgctc gtattacaaa agcaattcta aataacgaaa atgcgatttt gccactttct 3180

gtttatttag atggccatta cggtatgaac gatatttata taggtgcacc agcagtcgtt 3240

aaccgtcaag gcgttcgcca tattgttgaa atgaacttaa atgacaaaga aaaagaacaa 3300

atgaaaaact ccgcagatac acttaaaaaa gttctagagc ttatagagcc acttttatct 3360

ggtatttatg caggagatat ttataaaatg agcttgcggg caacatttcc gcaatttgaa 3420

gaagcagtgg ctaaacacgg tagtttgatg gaaggcctgc aacaaaacca gctgaacacg 3480

accggaacca aagcaactat tggtgcattc aggacgctag atggcgggct agaagcttta 3540

ccaaaagcag ttgaacaagc tcttcctaag aaccatttgc acacaggaaa acaagcaacg 3600

caaattttga aaaaaggtca ttcttatgaa attttttttg aaaatggaga taaaatatct 3660

gctgatggcg tcattattgc tgctactcac gatacattaa ttgatttact tggagccagg 3720

gtaacagaac cgtttgccaa ccagccatta accagccttg caacagtctc attagcttat 3780

aatgaaagtg atgtacccat tttaccggat ggaacgggtt atttagttgc tagaactgct 3840

ccttatcgaa ccactgcttg tacatgggtg caaaaaaaat ggccacatat ggtacctgaa 3900

aataaaatgc tactacgagg ttttgttggt aaagcaggtg aaacttggtt agaagaggca 3960

agtgatgaag caattatttc tgctgtttta gcagattatg ccgaaatgat ggatatcgaa 4020

agagcgccac ttttttatga agtaagtcgg atgaagtctg caatgccaca gtatttagtg 4080

acacaccaag ctagactaaa acaactaaaa gaaaatattg cgacagacta cccgggaatt 4140

tattttgcag gaatgagtta tcaaggtgtt ggaattcctg attgtattgc tggggcgaaa 4200

ctagctgtta atgacgttac tgattttttg aaagaggtgt aagatgatta aaggtattgg 4260

gcttgatatg attgatttag cacgagtaaa acaagtttta gaaaagaatc cccgttttat 4320

ggagcggatt ttaacagaaa aagaaattag ccaatttgaa aaatatgaag gtagtcgtaa 4380

aattgaattt ttagcggggc gttttgctgc caaagaagct tatgcaaaag cgaacggaac 4440

tggatttgga aaacatttaa gctttacgga tgtagaaatt ttacaagtag aagatggcag 4500

acctcacgtg acaatgccga tcaaacctgg tgagtcggtg tttgtgagta ttacccacac 4560

ggcgagatct gctgcggcac aagtgattat tgaagtttag aaaggaatgt ggaaattaag 4620

gtaatattcg tgcttttttg aggagaagcg tttataatct aacatatgaa actttatagc 4680

tacatctagg acttaaggga ggatgttgga taaaactata acaatcttaa caagtaaatg 4740

ctaaataact cttttcttca tggcttgata atggtacgat atagttgtta cttacaggta 4800

cgaggctttg ggggtgtgac acgtgttaga gaaagaaaag cggatgataa tatccgtaga 4860

actgacacaa gaaatggtac aggaactcga cgtagttgta gaaaaagaaa aaatggggcg 4920

gagtgaagtt ataatggaag caacgcaaca atttttgcaa gagaaaaggg cacgtgagtt 4980

gagagacgag atggagcgcg gctatgcgga aatggcgaca attaactttg ctatcgcatg 5040

cgagtgtacc catgtcgaat cagaagcaga agacagaaat attagtattt taggaggtta 5100

atggctgatg gtgaagcgtg gtgacgtata ctacgcggac ctttcccccg tggtcggaag 5160

cgagcaaggg ggaatacggc ctgttctcat cattcaaaac gacattggta atagattcag 5220

cccaactgtg attgtggcag caataaccgc aaagattcaa aaagcaaagc tgccaacaca 5280

tgtggaagct actcgtaaag atggctttga aagagattct gtcattcttt tagaacaaat 5340

tagaacaatt gacaaacaac gcctgacaga taagattaca catttggacg aggaactaat 5400

ggtcaaggta aaccaggcgc tggaagtcag tctaggagta gtagaattct aaacaaccta 5460

aaaatataac atagaatgat gaacgcagga tagtaaataa gtccgacgta gaagaatacc 5520

aaatacataa tgaactaatt aaccacttta caagatttaa gggacatcag aaacctacaa 5580

acaatgcgta tgattcatcc ttcgctaaag ttgtttctaa tgtctttttt taaaaagtag 5640

ttaatcaaat cgcagaaaaa aagagagatc tttaaggtgg agaaaggttg gaaaataatc 5700

aatgtataaa gattttgcaa acttcatccg gaactagtcc cggggcgaat tgcatctgac 5760

cgaattttac gtttccctga ataattctca tcaatcgttt catcaatttt atctttatac 5820

tttatatttt gtgcgttaat caaatcataa tttttatatg tttcctcatg atttatgtct 5880

ttattattat agtttttatt ctctctttga ttatgtcttt gtatcccgtt tgtattactt 5940

gatcctttaa ctctggcaac cctcaaaatt gaatgagaca tgctacacct ccggataata 6000

aatatatata aacgtataaa gatttcataa agtctaacac actagactta tttacttcgt 6060

aattaagtcg ttaaaccgtg tgctctacga ccaaaactat aaaaccttta agaactttct 6120

ttttttacaa gaaaaaagaa attagataaa tctctcatat cttttattca ataatcgcat 6180

ccgattgcag tataaattta acgatcactc atcatgttca tatttatcag agctcgtgct 6240

ataattatac taattttata aggaggaaaa aatatgggca tttttagtat ttttgtaatc 6300

agcacagttc attatcaacc aaacaaaaaa taagtggtta taatgaatcg ttaataagca 6360

aaattcatat aaccaaatta aagagggtta taatgaacga gaaaaatata aaacacagtc 6420

aaaactttat tacttcaaaa cataatatag ataaaataat gacaaatata agattaaatg 6480

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agaggtgtaa tttcgtaact gccattgaaa tagaccataa attatgcaaa actacagaaa 6600

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ttcctaaaaa ccaatcctat aaaatatatg gtaatatacc ttataacata agtacggata 6720

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aaaggaggaa tacggtgcat tttaaacaaa aaaagataga cagcactggc atgctgccta 7980

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tcaagaatat ataaaatcaa atcggtataa atctgaccga tagattttga atttaggtgt 8640

cacaagacac tcttttttcg caccagcgaa aactggttta agccgagtgc gcaaaagaca 8700

taatcgggaa ttc 8713

<210> 2

<211> 8118

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

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tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

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gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

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taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

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agtgaatagc tcacttatca gattaagtag aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa 6360

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<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

ttgcccaaac ctcaagacac tccttgctag 30

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

agatgcaatt cgccccggga ctagttacca gatcatgcta gtgccat 47

<210> 14

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

ctcaagacac tccttgctag ttaatttatt ggaactatct aaaaacttaa ttaaatagag 60

aaactgccgc aaaactaagc tttgcagcag ttaatttttt caattataac ccttactttg 120

ctaatttgta aagcgcttct gcgtaaattg ctgtcgcttt taacaaatcg tcaaaataac 180

tgaattcgtc tttttggtgc atcgtatctt cgcggcctgg gaatagtgcg ccaaacgcca 240

cacctgtttc catatgacgt gcataagttc cgccaccaat tgcaagtaaa gtagcttctt 300

ctcctgtttg tttcgtataa acttcttgta aagtttgaat taatgggtgg tcttttggta 360

cgaaaagcgg tttggaatca ctgtaatgtg tgtactgtgc attatattca tatacgacag 420

tttgcatttt atttttcagc ttatccatgt ttgcagtaac tgggtaacgg aaattaagtc 480

cgtatttccc accttcccca acatcataac ggataacgcc aacattcatc gttaattcgc 540

cactttcttt atcttcgtag ctaataccaa gttttacagc acgagaatcg ccaaataagt 600

aatcacgacc aaatgtaacg aaatcattag cagcaccagt taatttaaat ttacctaaga 660

aggctactaa atgaagacct gcattgatac cattatttgg ttccattgca tgagcagatt 720

ttccaaccat gttaatttta actgttttac cgtcttcttc taacgtacct tctactggat 780

ggttagctaa gaaagttttg aaagtacttg ttagtttatc gtagtctttc acgttttcga 840

tgatggcact agcatgatct ggta 864

<210> 15

<211> 1824

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 15

cagatacact taaaaaagtt ctagatgatg gcgtcattat tgctgctact cacgatacat 60

taattgattt acttggagcc agggtaacag aaccgtttgc caaccagcca ttaaccagcc 120

ttgcaacagt ctcattagct tataatgaaa gtgatgtacc cattttaccg gatggaacgg 180

gttatttagt tgctagaact gctccttatc gaaccactgc ttgtacatgg gtgcaaaaaa 240

aatggccaca tatggtacct gaaaataaaa tgctactacg aggttttgtt ggtaaagcag 300

gtgaaacttg gttagaagag gcaagtgatg aagcaattat ttctgctgtt ttagcagatt 360

atgccgaaat gatggatatc gaaagagcgc cactttttta tgaagtaagt cggatgaagt 420

ctgcaatgcc acagtattta gtgacacacc aagctagact aaaacaacta aaagaaaata 480

ttgcgacaga ctacccggga atttattttg caggaatgag ttatcaaggt gttggaattc 540

ctgattgtat tgctggggcg aaactagctg ttaatgacgt tactgatttt ttgaaagagg 600

tgtaagatga ttaaaggtat tgggcttgat atgattgatt tagcacgagt aaaacaagtt 660

ttagaaaaga atccccgttt tatggagcgg attttaacag aaaaagaaat tagccaattt 720

gaaaaatatg aaggtagtcg taaaattgaa tttttagcgg ggcgttttgc tgccaaagaa 780

gcttatgcaa aagcgaacgg aactggattt ggaaaacatt taagctttac ggatgtagaa 840

attttacaag tagaagatgg cagacctcac gtgacaatgc cgatcaaacc tggtgagtcg 900

gtgtttgtga gtattaccca cacggcgaga tctgctgcgg cacaagtgat tattgaagtt 960

tagaaaggaa tgtggaaatt aaggtaatat tcgtgctttt ttgaggagaa gcgtttataa 1020

tctaacatat gaaactttat agctacatct aggacttaag ggaggatgtt ggataaaact 1080

ataacaatct taacaagtaa atgctaaata actcttttct tcatggcttg ataatggtac 1140

gatatagttg ttacttacag gtacgaggct ttgggggtgt gacacgtgtt agagaaagaa 1200

aagcggatga taatatccgt agaactgaca caagaaatgg tacaggaact cgacgtagtt 1260

gtagaaaaag aaaaaatggg gcggagtgaa gttataatgg aagcaacgca acaatttttg 1320

caagagaaaa gggcacgtga gttgagagac gagatggagc gcggctatgc ggaaatggcg 1380

acaattaact ttgctatcgc atgcgagtgt acccatgtcg aatcagaagc agaagacaga 1440

aatattagta ttttaggagg ttaatggctg atggtgaagc gtggtgacgt atactacgcg 1500

gacctttccc ccgtggtcgg aagcgagcaa gggggaatac ggcctgttct catcattcaa 1560

aacgacattg gtaatagatt cagcccaact gtgattgtgg cagcaataac cgcaaagatt 1620

caaaaagcaa agctgccaac acatgtggaa gctactcgta aagatggctt tgaaagagat 1680

tctgtcattc ttttagaaca aattagaaca attgacaaac aacgcctgac agataagatt 1740

acacatttgg acgaggaact aatggtcaag gtaaaccagg cgctggaagt cagtctagga 1800

gtagactagt cccggggcga attg 1824

<210> 16

<211> 1849

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

cagatacact taaaaaagtt ctagaagtaa ggcaaatcct cctcggagca cgcgttcctg 60

gtcgcttagt tctcggccgg atatccaatc ttttccagta actgctgaag aggcttctag 120

tgcgccaaat cctactccaa gtgctaatcc ggctggtggg cagacgatac ttacgcccac 180

aatcaccacg gcggcaacga tattgaccca gaactctttc tcttcttgtt cgtcttggac 240

ggatttataa tcaaacgcac gagtatgtaa catccccatt ttaaaatcgg cttcgctaac 300

cttttggtcc ggattttcat gcttccagac ttcgtattgg agggtcattt ggttggcgta 360

gaagttatcg ccattcatta agtcctcaat agttgcattt tcttttaccg attcaatcac 420

ttggggctga ttactgtacg aagacatata cgtttgtgtc gacttagccc caatacggtt 480

tgtagttgag tatgtcgtga tactcaagtc ttgcatccca tctacaaatg catccaactt 540

cttgtaaaaa ggctcatcaa tcagcgtttc gattttctcc cctgcgtgac aactaaactg 600

atacagcacc tttaagtctt cctcgatttc cccgtacttg cttcgatggt cggtatgttg 660

gaaatgaatc gcgtgatcgg tgtctaagtc acggatatcg tcttccgcat tctccatatt 720

tttcgacact ttttctaaat gattaaatag gccaccaaac caattggctg cattaaatgg 780

agctagggca cttttggctt tttaccagtc gtcttctcgg tagtttacgt ctttcattca 840

tctgtcctcg actttctttg ttatatgagc tgtatattaa tgaaagttca tctccaaatc 900

ttgttatatg tttcttttaa tcaatataag caaccatcct tttaagatgg ttgcccaaac 960

ctcaagacac tccttgctag ttaatttatt ggaactatct aaaaacttaa ttaaatagag 1020

aaactgccgc aaaactaagc tttgcagcag ttaatttttt caattataac ccttactttg 1080

ctaatttgta aagcgcttct gcgtaaattg ctgtcgcttt taacaaatcg tcaaaataac 1140

tgaattcgtc tttttggtgc atcgtatctt cgcggcctgg gaatagtgcg ccaaacgcca 1200

cacctgtttc catatgacgt gcataagttc cgccaccaat tgcaagtaaa gtagcttctt 1260

ctcctgtttg tttcgtataa acttcttgta aagtttgaat taatgggtgg tcttttggta 1320

cgaaaagcgg tttggaatca ctgtaatgtg tgtactgtgc attatattca tatacgacag 1380

tttgcatttt atttttcagc ttatccatgt ttgcagtaac tgggtaacgg aaattaagtc 1440

cgtatttccc accttcccca acatcataac ggataacgcc aacattcatc gttaattcgc 1500

cactttcttt atcttcgtag ctaataccaa gttttacagc acgagaatcg ccaaataagt 1560

aatcacgacc aaatgtaacg aaatcattag cagcaccagt taatttaaat ttacctaaga 1620

aggctactaa atgaagacct gcattgatac cattatttgg ttccattgca tgagcagatt 1680

ttccaaccat gttaatttta actgttttac cgtcttcttc taacgtacct tctactggat 1740

ggttagctaa gaaagttttg aaagtacttg ttagtttatc gtagtctttc acgttttcga 1800

tgatggcact agcatgatct ggtaactagt cccggggcga attgcatct 1849

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

ggcttgataa tggtacgata 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 18

ggatcaagta atacaaacgg ga 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 19

gattaaagat tggtgattta aag 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 20

acaaaaaacg gaaatcagtt ag 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 21

gaaagcaaac gcctatggtc 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 22

tacgctcagt tagcatacag g 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 23

ttatttagct aatactaatt 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 24

atgaaagtat tagtaaataa c 21

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 25

tgaactatac aaataaacta gtcagtgtga tggatatctg c 41

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 26

ctgtcaccat gggtttcact ctcctt 26

<210> 27

<211> 275

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 27

tgaactatac aaataaacta gtcagtgtga tggatatctg cagaattaat tcggctttct 60

agagtgactt ttatgttgag gcattaacat ttgttaacga cgataaaggg acagcaggac 120

tagaataaag ctataaagca agcatataat attgcgtttc atctttagaa gcgaatttcg 180

ccaatattat aattatcaaa agagaggggt ggcaaacggt atttggcatt attaggttaa 240

aaaatgtaga aggagagtga aacccatggt gacag 275

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 28

agtgaaaccc atggtgacag gctggc 26

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 29

accgcattaa agcttgtcga cctaatggat gtattttcta g 41

<210> 30

<211> 1138

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 30

agtgaaaccc atggtgacag gctggcatcg tccaacatgg attgaaatag accgcgcagc 60

aattcgcgaa aatataaaaa atgaacaaaa taaactcccg gaaagtgtcg acttatgggc 120

agtagtcaaa gctaatgcat atggtcacgg aattatcgaa gttgctagga cggcgaaaga 180

agctggagca aaaggtttct gcgtagccat tttagatgag gcactggctc ttagagaagc 240

tggatttcaa gatgacttta ttcttgtgct tggtgcaacc agaaaagaag atgctaatct 300

ggcagccaaa aaccacattt cacttactgt ttttagagaa gattggctag agaatctaac 360

gctagaagca acacttcgaa ttcatttaaa agtagatagc ggtatggggc gtctcggtat 420

tcgtacgact gaagaagcac ggcgaattga agcaaccagt actaatgatc accaattaca 480

actggaaggt atttacacgc attttgcaac agccgaccag ctagaaacta gttattttga 540

acaacaatta gctaagttcc aaacgatttt aacgagttta aaaaaacgac caacttatgt 600

tcatacagcc aattcagctg cttcattgtt acagccacaa atcgggtttg atgcgattcg 660

ctttggtatt tcgatgtatg gattaactcc ctccacagaa atcaaaacta gcttgccgtt 720

tgagcttaaa cctgcacttg cactctatac cgagatggtt catgtgaaag aacttgcacc 780

aggcgatagc gttagctacg gagcaactta tacagcaaca gagcgagaat gggttgcgac 840

attaccaatt ggctatgcgg atggattgat tcgtcattac agtggtttcc atgttttagt 900

agacggtgaa ccagctccaa tcattggtcg agtttgtatg gatcaaacca tcataaaact 960

accacgtgaa tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac 1020

ggtaacagca gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt 1080

gttaaatgag cgcataccta gaaaatacat ccattaggtc gacaagcttt aatgcggt 1138

<210> 31

<211> 1393

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 31

tgaactatac aaataaacta gtcagtgtga tggatatctg cagaattaat tcggctttct 60

agagtgactt ttatgttgag gcattaacat ttgttaacga cgataaaggg acagcaggac 120

tagaataaag ctataaagca agcatataat attgcgtttc atctttagaa gcgaatttcg 180

ccaatattat aattatcaaa agagaggggt ggcaaacggt atttggcatt attaggttaa 240

aaaatgtaga aggagagtga aacccatggt gacaggctgg catcgtccaa catggattga 300

aatagaccgc gcagcaattc gcgaaaatat aaaaaatgaa caaaataaac tcccggaaag 360

tgtcgactta tgggcagtag tcaaagctaa tgcatatggt cacggaatta tcgaagttgc 420

taggacggcg aaagaagctg gagcaaaagg tttctgcgta gccattttag atgaggcact 480

ggctcttaga gaagctggat ttcaagatga ctttattctt gtgcttggtg caaccagaaa 540

agaagatgct aatctggcag ccaaaaacca catttcactt actgttttta gagaagattg 600

gctagagaat ctaacgctag aagcaacact tcgaattcat ttaaaagtag atagcggtat 660

ggggcgtctc ggtattcgta cgactgaaga agcacggcga attgaagcaa ccagtactaa 720

tgatcaccaa ttacaactgg aaggtattta cacgcatttt gcaacagccg accagctaga 780

aactagttat tttgaacaac aattagctaa gttccaaacg attttaacga gtttaaaaaa 840

acgaccaact tatgttcata cagccaattc agctgcttca ttgttacagc cacaaatcgg 900

gtttgatgcg attcgctttg gtatttcgat gtatggatta actccctcca cagaaatcaa 960

aactagcttg ccgtttgagc ttaaacctgc acttgcactc tataccgaga tggttcatgt 1020

gaaagaactt gcaccaggcg atagcgttag ctacggagca acttatacag caacagagcg 1080

agaatgggtt gcgacattac caattggcta tgcggatgga ttgattcgtc attacagtgg 1140

tttccatgtt ttagtagacg gtgaaccagc tccaatcatt ggtcgagttt gtatggatca 1200

aaccatcata aaactaccac gtgaatttca aactggttca aaagtaacga taattggcaa 1260

agatcatggt aacacggtaa cagcagatga tgccgctcaa tatttagata caattaatta 1320

tgaggtaact tgtttgttaa atgagcgcat acctagaaaa tacatccatt aggtcgacaa 1380

gctttaatgc ggt 1393

<210> 32

<211> 7178

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 32

tcatgtttga cagcttatca tcgtcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 60

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 180

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 900

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 960

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 1020

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 1080

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 1140

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1200

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1260

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1320

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1380

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 1440

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 1500

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 1560

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 1620

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 1680

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 1740

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 1800

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 1860

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 1920

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 1980

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 2040

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 2100

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 2160

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 2220

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 2280

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 2340

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 2400

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 2460

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat 2520

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 2580

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 2640

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 2700

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 2760

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 2820

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 2880

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 2940

aggccctttc gtcttcaaga attcccagca tggagccaca caactgtcgg cggccttcca 3000

attactgaat ggattagcga agatgaacaa ggtgcaatgg atactatttt cgtaagtgtt 3060

cgtgatgcag cttatgaaat tattaataaa aaaggcgcta cattctacgg cgttgctgca 3120

gctcttgctc gtattacaaa agcaattcta aataacgaaa atgcgatttt gccactttct 3180

gtttatttag atggccatta cggtatgaac gatatttata taggtgcacc agcagtcgtt 3240

aaccgtcaag gcgttcgcca tattgttgaa atgaacttaa atgacaaaga aaaagaacaa 3300

atgaaaaact ccgcagatac acttaaaaaa gttctagaca gtgtgatgga tatctgcaga 3360

attaattcgg ctttctagag tgacttttat gttgaggcat taacatttgt taacgacgat 3420

aaagggacag caggactaga ataaagctat aaagcaagca tataatattg cgtttcatct 3480

ttagaagcga atttcgccaa tattataatt atcaaaagag aggggtggca aacggtattt 3540

ggcattatta ggttaaaaaa tgtagaagga gagtgaaacc catgagtaaa ggagaagaac 3600

ttttcactgg agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat gggcacaaat 3660

tttctgtcag tggagagggt gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc cttaaattta 3720

tttgcactac tggaaaacta cctgttccat ggccaacact tgtcactact ttcggttatg 3780

gtgttcaatg ctttgcgaga tacccagatc atatgaaaca gcatgacttt ttcaagagtg 3840

ccatgcctga aggttatgta caggaaagaa ctatattttt caaagatgac gggaactaca 3900

agacacgtgc tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag 3960

gtattgattt taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa attggaatac aactataact 4020

cacacaatgt atacatcatg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt aacttcaaaa 4080

ttagacacaa cattgaagat ggaagcgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc 4140

caattggcga tggccctgtc cttttaccag acaaccatta cctgtccaca caatctgccc 4200

tttcgaaaga tcccaacgaa aagagagacc acatggtcct tcttgagttt gtaacagctg 4260

ctgggattac acatggcatg gatgaactat acaaataaac tagtcagtgt gatggatatc 4320

tgcagaatta attcggcttt ctagagtgac ttttatgttg aggcattaac atttgttaac 4380

gacgataaag ggacagcagg actagaataa agctataaag caagcatata atattgcgtt 4440

tcatctttag aagcgaattt cgccaatatt ataattatca aaagagaggg gtggcaaacg 4500

gtatttggca ttattaggtt aaaaaatgta gaaggagagt gaaacccatg gtgacaggct 4560

ggcatcgtcc aacatggatt gaaatagacc gcgcagcaat tcgcgaaaat ataaaaaatg 4620

aacaaaataa actcccggaa agtgtcgact tatgggcagt agtcaaagct aatgcatatg 4680

gtcacggaat tatcgaagtt gctaggacgg cgaaagaagc tggagcaaaa ggtttctgcg 4740

tagccatttt agatgaggca ctggctctta gagaagctgg atttcaagat gactttattc 4800

ttgtgcttgg tgcaaccaga aaagaagatg ctaatctggc agccaaaaac cacatttcac 4860

ttactgtttt tagagaagat tggctagaga atctaacgct agaagcaaca cttcgaattc 4920

atttaaaagt agatagcggt atggggcgtc tcggtattcg tacgactgaa gaagcacggc 4980

gaattgaagc aaccagtact aatgatcacc aattacaact ggaaggtatt tacacgcatt 5040

ttgcaacagc cgaccagcta gaaactagtt attttgaaca acaattagct aagttccaaa 5100

cgattttaac gagtttaaaa aaacgaccaa cttatgttca tacagccaat tcagctgctt 5160

cattgttaca gccacaaatc gggtttgatg cgattcgctt tggtatttcg atgtatggat 5220

taactccctc cacagaaatc aaaactagct tgccgtttga gcttaaacct gcacttgcac 5280

tctataccga gatggttcat gtgaaagaac ttgcaccagg cgatagcgtt agctacggag 5340

caacttatac agcaacagag cgagaatggg ttgcgacatt accaattggc tatgcggatg 5400

gattgattcg tcattacagt ggtttccatg ttttagtaga cggtgaacca gctccaatca 5460

ttggtcgagt ttgtatggat caaaccatca taaaactacc acgtgaattt caaactggtt 5520

caaaagtaac gataattggc aaagatcatg gtaacacggt aacagcagat gatgccgctc 5580

aatatttaga tacaattaat tatgaggtaa cttgtttgtt aaatgagcgc atacctagaa 5640

aatacatcca ttaggtcgac aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac 5700

gcagtcaggc accgtgtatg aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca 5760

ccctggatgc tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggatc 5820

gatagaaagc gtgagaaaca gcgtacagac gatttagaga tgtagaggta cttttatgcc 5880

gagaaaactt tttgcgtgtg acagtcctta aaatatactt agagcgtaag cgaaagtagt 5940

agcgacagct attaactttc ggttgcaaag ctctaggatt tttaatggac gcagcgcatc 6000

acacgcaaaa aggaaattgg aataaatgcg aaatttgaga tgttaattaa agaccttttt 6060

gaggtctttt tttcttagat ttttggggtt atttagggga gaaaacatag gggggtacta 6120

cgacctcccc cctaggtgtc cattgtccat tgtccaaaca aataaataaa tattgggttt 6180

ttaatgttaa aaggttgttt tttatgttaa agtgaaaaaa acagatgttg ggaggtacag 6240

tgatagttgt agatagaaaa gaagagaaaa aagttgctgt tactttaaga cttacaacag 6300

aagaaaatga gatattaaat agaatcaaag aaaaatataa tattagcaaa tcagatgcaa 6360

ccggtattct aataaaaaaa tatgcaaagg aggaatacgg tgcattttaa acaaaaaaag 6420

atagacagca ctggcatgct gcctatctat gactaaattt tgttaagtgt attagcaccg 6480

ttattatatc atgagcgaaa atgtaataaa agaaactgaa aacaagaaaa attcaagagg 6540

acgtaattgg acatttgttt tatatccaga atcagcaaag ccgagtggtt agagtattta 6600

aaagagttac acattcaatt tgtagtgctc cattacatga tagggatact gatacagaag 6660

gtaggatgaa aaaagagcat tatcatattc tagtgatgta tgagggtaat aaatcttatg 6720

aacagataaa aataataaca gaagaattga atgcgactat tccgcagatt gcaggaagtg 6780

tgaaaggtct tgtgagatat atgcttcaca tggacgatcc taataaattt aaatatcaaa 6840

aagaagatat gatagtttat ggcggtgtag atgttgatga attattaaag aaaacaacaa 6900

cagatagata taaattaatt aaagaaatga ttgagtttat tgatgaacaa ggaatcgtag 6960

aatttaagag tttaatggat tatgcaatga agtttaaatt tgatgattgg ttcccgcttt 7020

tatgtgataa ctcggcgtat gttattcaag aatatataaa atcaaatcgg tataaatctg 7080

accgatagat tttgaattta ggtgtcacaa gacactcttt tttcgcacca gcgaaaactg 7140

gtttaagccg agtgcgcaaa agacataatc gggaattc 7178

<210> 33

<211> 5238

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 33

tcatgtttga cagcttatca tcgtcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 60

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 180

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 900

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggct aagaaaccat 960

tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga 1020

attcccagca tggagccaca caactgtcgg cggccttcca attactgaat ggattagcga 1080

agatgaacaa ggtgcaatgg atactatttt cgtaagtgtt cgtgatgcag cttatgaaat 1140

tattaataaa aaaggcgcta cattctacgg cgttgctgca gctcttgctc gtattacaaa 1200

agcaattcta aataacgaaa atgcgatttt gccactttct gtttatttag atggccatta 1260

cggtatgaac gatatttata taggtgcacc agcagtcgtt aaccgtcaag gcgttcgcca 1320

tattgttgaa atgaacttaa atgacaaaga aaaagaacaa atgaaaaact ccgcagatac 1380

acttaaaaaa gttctagaca gtgtgatgga tatctgcaga attaattcgg ctttctagag 1440

tgacttttat gttgaggcat taacatttgt taacgacgat aaagggacag caggactaga 1500

ataaagctat aaagcaagca tataatattg cgtttcatct ttagaagcga atttcgccaa 1560

tattataatt atcaaaagag aggggtggca aacggtattt ggcattatta ggttaaaaaa 1620

tgtagaagga gagtgaaacc catgagtaaa ggagaagaac ttttcactgg agttgtccca 1680

attcttgttg aattagatgg tgatgttaat gggcacaaat tttctgtcag tggagagggt 1740

gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc cttaaattta tttgcactac tggaaaacta 1800

cctgttccat ggccaacact tgtcactact ttcggttatg gtgttcaatg ctttgcgaga 1860

tacccagatc atatgaaaca gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcctga aggttatgta 1920

caggaaagaa ctatattttt caaagatgac gggaactaca agacacgtgc tgaagtcaag 1980

tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt taaagaagat 2040

ggaaacattc ttggacacaa attggaatac aactataact cacacaatgt atacatcatg 2100

gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa cattgaagat 2160

ggaagcgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc 2220

cttttaccag acaaccatta cctgtccaca caatctgccc tttcgaaaga tcccaacgaa 2280

aagagagacc acatggtcct tcttgagttt gtaacagctg ctgggattac acatggcatg 2340

gatgaactat acaaataaac tagtcagtgt gatggatatc tgcagaatta attcggcttt 2400

ctagagtgac ttttatgttg aggcattaac atttgttaac gacgataaag ggacagcagg 2460

actagaataa agctataaag caagcatata atattgcgtt tcatctttag aagcgaattt 2520

cgccaatatt ataattatca aaagagaggg gtggcaaacg gtatttggca ttattaggtt 2580

aaaaaatgta gaaggagagt gaaacccatg gtgacaggct ggcatcgtcc aacatggatt 2640

gaaatagacc gcgcagcaat tcgcgaaaat ataaaaaatg aacaaaataa actcccggaa 2700

agtgtcgact tatgggcagt agtcaaagct aatgcatatg gtcacggaat tatcgaagtt 2760

gctaggacgg cgaaagaagc tggagcaaaa ggtttctgcg tagccatttt agatgaggca 2820

ctggctctta gagaagctgg atttcaagat gactttattc ttgtgcttgg tgcaaccaga 2880

aaagaagatg ctaatctggc agccaaaaac cacatttcac ttactgtttt tagagaagat 2940

tggctagaga atctaacgct agaagcaaca cttcgaattc atttaaaagt agatagcggt 3000

atggggcgtc tcggtattcg tacgactgaa gaagcacggc gaattgaagc aaccagtact 3060

aatgatcacc aattacaact ggaaggtatt tacacgcatt ttgcaacagc cgaccagcta 3120

gaaactagtt attttgaaca acaattagct aagttccaaa cgattttaac gagtttaaaa 3180

aaacgaccaa cttatgttca tacagccaat tcagctgctt cattgttaca gccacaaatc 3240

gggtttgatg cgattcgctt tggtatttcg atgtatggat taactccctc cacagaaatc 3300

aaaactagct tgccgtttga gcttaaacct gcacttgcac tctataccga gatggttcat 3360

gtgaaagaac ttgcaccagg cgatagcgtt agctacggag caacttatac agcaacagag 3420

cgagaatggg ttgcgacatt accaattggc tatgcggatg gattgattcg tcattacagt 3480

ggtttccatg ttttagtaga cggtgaacca gctccaatca ttggtcgagt ttgtatggat 3540

caaaccatca taaaactacc acgtgaattt caaactggtt caaaagtaac gataattggc 3600

aaagatcatg gtaacacggt aacagcagat gatgccgctc aatatttaga tacaattaat 3660

tatgaggtaa cttgtttgtt aaatgagcgc atacctagaa aatacatcca ttaggtcgac 3720

aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg 3780

aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata 3840

ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggatc gatagaaagc gtgagaaaca 3900

gcgtacagac gatttagaga tgtagaggta cttttatgcc gagaaaactt tttgcgtgtg 3960

acagtcctta aaatatactt agagcgtaag cgaaagtagt agcgacagct attaactttc 4020

ggttgcaaag ctctaggatt tttaatggac gcagcgcatc acacgcaaaa aggaaattgg 4080

aataaatgcg aaatttgaga tgttaattaa agaccttttt gaggtctttt tttcttagat 4140

ttttggggtt atttagggga gaaaacatag gggggtacta cgacctcccc cctaggtgtc 4200

cattgtccat tgtccaaaca aataaataaa tattgggttt ttaatgttaa aaggttgttt 4260

tttatgttaa agtgaaaaaa acagatgttg ggaggtacag tgatagttgt agatagaaaa 4320

gaagagaaaa aagttgctgt tactttaaga cttacaacag aagaaaatga gatattaaat 4380

agaatcaaag aaaaatataa tattagcaaa tcagatgcaa ccggtattct aataaaaaaa 4440

tatgcaaagg aggaatacgg tgcattttaa acaaaaaaag atagacagca ctggcatgct 4500

gcctatctat gactaaattt tgttaagtgt attagcaccg ttattatatc atgagcgaaa 4560

atgtaataaa agaaactgaa aacaagaaaa attcaagagg acgtaattgg acatttgttt 4620

tatatccaga atcagcaaag ccgagtggtt agagtattta aaagagttac acattcaatt 4680

tgtagtgctc cattacatga tagggatact gatacagaag gtaggatgaa aaaagagcat 4740

tatcatattc tagtgatgta tgagggtaat aaatcttatg aacagataaa aataataaca 4800

gaagaattga atgcgactat tccgcagatt gcaggaagtg tgaaaggtct tgtgagatat 4860

atgcttcaca tggacgatcc taataaattt aaatatcaaa aagaagatat gatagtttat 4920

ggcggtgtag atgttgatga attattaaag aaaacaacaa cagatagata taaattaatt 4980

aaagaaatga ttgagtttat tgatgaacaa ggaatcgtag aatttaagag tttaatggat 5040

tatgcaatga agtttaaatt tgatgattgg ttcccgcttt tatgtgataa ctcggcgtat 5100

gttattcaag aatatataaa atcaaatcgg tataaatctg accgatagat tttgaattta 5160

ggtgtcacaa gacactcttt tttcgcacca gcgaaaactg gtttaagccg agtgcgcaaa 5220

agacataatc gggaattc 5238

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 34

gaacaaaata aactcccgga a 21

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 35

tacttttgaa ccagtttgaa at 22

Claims

1.一种绵羊李斯特菌平衡致死系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建dal、dat基因打靶质粒pCW107-LI dal、pCW107-LI dat，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)制备感受态LIΔactAplcB-lacZ，LIΔactAplcB-lacZ简称为LIΔ，向其中转入质粒pCW107-LI dal，经传代培养后敲除绵羊李斯特菌dal基因，得到LIΔactAplcBΔdal；制备感受态LIΔactAplcBΔdal，向其中转入质粒pCW107-LI dat，经传代培养后敲除dat基因，得到LIΔactAplcBΔdalΔdat，简称为LIΔdd；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)提取质粒pCW107，以限制性内切酶XbaⅠ和SpeⅠ进行酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化处理，得到打靶质粒载体线性片段；

(1-2)以LIΔ为模板，用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增LIdal基因5＇端上游991bp长的一段序列LIdal-up，即LIdal基因上游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物扩增LIdal基因3＇端下游857bp长的一段序列LIdal-down，即LIdal基因下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物扩增LIdat基因5＇端上游970bp长的一段序列LIdat-up，即LIdat基因上游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；用SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示的引物扩增LIdat基因3＇端下游899bp长的一段序列LIdat-down，即LIdat基因下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；然后分别以LI dal-up和LIdal-down、LIdat-up和LI dat-down为模板，分别以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的引物、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.13所示的引物进行overlapPCR反应实现拼接，得到插入片段LI dal-updown和LI dat-updown，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；

(1-3)将步骤(1-1)所得线性片段与步骤(1-2)所得插入片段LI dal-updown、LI dat-updown分别进行连接，筛选获得打靶质粒pCW107-LI dal和pCW107-LI dat并保存。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：

(2-1)提取质粒pCW107-LI dal和pCW107-LI dat；

(2-2)制备感受态LIΔ；

(2-3)将质粒pCW107-LI dal电转入感受态LIΔ中；

(2-4)利用SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的引物进行PCR筛选，获得阳性菌并提取质粒验证；

(2-6)进行红霉素抗性筛选，符合者利用SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的引物对进行PCR筛选，PCR筛选的阳性菌经测序验证完全正确的命名为LIΔactAplcBΔdal；

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：

(3-1)先提取质粒pCW-gfp，以限制性内切酶SalⅠ和SpeⅠ进行酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化处理，得到去除Ery^R基因的载体；再以LM10403s菌为模板，SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的引物扩增LM phly基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；以SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的引物扩增LM dal基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；接着以LM phly基因和LM dal基因为模板，SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.29所示的引物进行overlapPCR，得到拼接产物LM phly-dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；然后将去除Ery^R基因的载体与LM phly-dal进行连接，筛选，验证，得到阳性质粒pCW-gfp-amp-LM dal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；

(3-3)制备感受态LIΔΔ；

(3-4)将步骤(3-2)所得pCW-gfp-LM dal电转步骤(3-3)所得LIΔΔ感受态，以SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35所示的引物及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的引物进行PCR筛选，得到回补株LIΔactAplcBΔdalΔdat:dal，简称为LIΔdd:dal。

5.利用权利要求1～4中任一项所述构建方法得到的一种绵羊李斯特菌平衡致死系统。

6.权利要求5所述一种绵羊李斯特菌平衡致死系统作为疫苗载体的应用。