CN1763093A - 含有hiv转导结构域的生存素突变体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种Survivin点突变体融合蛋白基因TAT(m)－Survivin(T34A)及其重组表达载体、含有该表达载体的工程菌及其制备方法、表达产物TAT(m)－Survivin(T34A)制备以及其在治疗肿瘤药物中的应用。经过克隆、突变、酶切与酶连等一系列基因操作过程，重组得到TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白基因，构建重组表达载体，重组表达载体转化大肠杆菌而得到表达TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白的工程菌。工程菌经过发酵，离心沉淀，超声破碎，阳离子层析，分子筛层析步骤获得目的融合蛋白。本发明所述的TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白基因重组表达载体构建简便，目的蛋白表达量高，纯化工艺简单，蛋白活性高，对癌细胞有明显的促凋亡作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种含有HIV蛋白转导结构域的生存素(Survivin)突变体及其制备方法。
背景技术
生存素(Survivin)是1997年耶鲁大学的Aitieric DC等利用效应细胞蛋白酶受体ECR-1(Effector cell protease receptor-1，EPR-1)在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一个最新成员。Survivin是至今为止克隆出的最小的IAP，它通过阻断半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7等调节通路抑制细胞凋亡，使一些转化细胞逃避机体免疫系统的监视而无法清除，从而异常存活、积累，形成优势克隆参与肿瘤的发生。与其他凋亡抑制因子不同，survivin表达于胚胎和发育的胎儿组织，在终末分化的成人组织中不表达，但在人类大多数的肿瘤组织和转化细胞中大量表达。进一步研究表明survivin在不同癌细胞中的表达水平高低与肿瘤的病理演进直接相关，而且其表达情况与肿瘤的预后密切相关，因此，患者体内的survivin抗体可作为一个较为普遍的肿瘤标志物之一，用于肿瘤的早期诊断和肿瘤治疗的预后判定，目前国外已经在乳腺癌、膀胱癌的早期诊断中，取得了一定进展。
近两年来，国内外学者对Survivin抑制癌细胞凋亡的机理进行了深入的研究，认为Survivin可能主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：其一是通过直接抑制凋亡终末效应分子caspase-3和caspase-7的活性，从而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，如紫外线，多种化药，紫杉醇等，进而增加了癌细胞对多种抗癌药物的耐药性和物理作用的抵抗性；其二是Survivin也可通过P21间接抑制caspase-3，从而抑制癌细胞凋亡。因此survivin在恶性肿瘤细胞的耐受和抵抗药物治疗、放疗和化疗中起着重要作用。
目前的研究认为，抑制或干扰Survivin的作用，可以起到促进癌细胞凋亡的作用。Mesri等把含有磷酸化缺失的Survivin突变体(Thr34Ala)的腺病毒PADT34-A体外分别转染乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌和结肠癌细胞后都发生自发性地凋亡，线粒体释放细胞色素C，caspase-3的活性增加。将PADT34-A注射入3只移植有乳腺癌细胞的裸鼠体内，结果PADT34-A抑制了新生肿瘤的形成，已形成的肿瘤生长抑制了40％，而且腹膜内肿瘤的扩散减少。但是直接以工程病毒携带治疗性基因进入体内在有效性、可操作性和安全性等方面面临着不少问题，尤其是导致基因突变和生殖毒性问题，制约了Survivin(Thr34Ala)基因治疗在临床上的应用。
将Survivin(Thr34Ala)蛋白作为治疗性药物，是克服基因治疗缺陷的一个方向，然而蛋白质大分子不能高效的进入到细胞内，是本领域长期存在的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够有效导入到细胞的生存素突变体，以克服现有技术的不足；
本发明的另一目的是提供上述含有HIV蛋白转导结构域的突变体的制备方法；
本发明的再一目的是提供上述突变体的应用。
本发明的构思是这样的：在Survivin(Thr34Ala)基因的上游可操作的插入一种蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)序列，表达得到含有蛋白转导域的Survivin(Thr34Ala)融合蛋白，该蛋白可以有效导入细胞。
本发明的技术方案之一是提供了一种含有HIV蛋白转导结构域的生存素突变体，即TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白，在Survivin(T34A)的N端插入了经突变的来自HIV-1Tat(Trans-Activating Transduction protein)的蛋白转导域(TatPTD)，该转导域的序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。
本发明的融合蛋白具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO.1
Met Try Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg Met Gly Ala
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg
20 25 30
Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys
35 40 45
Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
50 55 60
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu
65 70 75
Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys
80 85 90
Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe
95 100 105
Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Pro Glu Pro
110 115 120
Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu
125 130 135
Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Pro Pro Ala Ile Glu Gln Leu
140 145 150
Ala Ala Met Asp
在一个优选的方案中，本发明的融合蛋白具有如下核酸序列：SEQ ID NO.2
ctgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaa
aagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaag
aacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaactgcgaagaaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcc
本发明的另一个技术方案是提供了一种TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的方法，包括如下步骤：
构建TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因；将融合蛋白基因插入表达载体；将带有融合蛋白基因的表达载体转入到相应的表达细胞；培养该表达细胞；诱导表达；收集并纯化表达产物。
TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因的构建采用PCR方法在Survivin(T34A)基因的5‘端分2步引入HIV-1 Tat蛋白转导域序列，引入突变的PCR引物序列为：
Ptat1：5’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCA TGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’；
Ptat2：5’-CG
CATATG TAC GCT CGT AAA GCT CGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’，在Ptat2的5’端均设计有NdeI限制性酶切位点。
将本发明中TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因与表达载体重组，形成重组表达载体，不限于特定的表达载体，可采用真核表达载体或原核表达载体。将本发明中重组表达载体可按常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能表达所述重组表达载体。
在一个优选的方案中，表达载体为pREST-B，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)在大肠杆菌中以包涵体形式表达，包涵体经洗涤，溶解后，经阳离子交换层析、凝胶层析，得到98％纯度的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白。
TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白对乳腺癌细胞系B-CAP-37和宫颈癌细胞系Hela的抑制活性。TAT(M)-Survivin(Thr34Ala)能显著抑制B-CAP-37和Hela细胞的生长，并有剂量依赖性，而且对B-CAP-37的抑制率明显高于对Hela细胞的抑制率。
本发明的另一个技术方案是提供一种TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的用途，用于制备治疗肿瘤疾病的药物。
本发明所提及的肿瘤疾病可以是任何类型的肿瘤，进一步优选的为乳腺癌和宫颈癌。
本发明所提及的治疗肿瘤疾病药物包括TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白制剂和药学上可以接受的药物载体。
在本发明中，使用如下定义：
本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。更佳地，“药学上可被接受”是指不影响蛋白活性的无毒物质。
本文中，“药物载体”是用于将蛋白传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可根据给药方式而选择的。
本发明的特点与优点在于：
本发明得到的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白，能够有效导入把细胞、进而杀伤靶细胞。相对于Survivin(T34A)基因治疗，可以避免基因突变和生殖毒性。
TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白对B-CAP-37和Hela细胞的生长具有显著抑制活性，并有剂量依赖性，同时对前者的抑制作用较后者更明显，MTT检测结果显示体外活性抑制率达60％(120μg/ml 48h)，因此，该基因工程蛋白预示着作为良好的抗癌药物，尤其是抗乳腺癌药物的前景。
附图说明
图1生存素cDNA克隆、34位氨基酸突变过程与重组表达载体pRSET-B-TAT(m)-survivin(T34A)的构建策略示意图；
图2PCR扩增结果与酶切鉴定结果的琼脂糖凝胶电泳图；
图3重组表达载体pREST-B-TAT(m)(m)-survivin(T34A)构建结果的序列测定与分析；
图4TAT(m)-survivin(T34A)融合蛋白表达的SDS-PAGE和Western Blotting电泳结果；
图5TAT(m)-survivin(T34A)蛋白经阳离子交换(左)与分子排阻(右)纯化的色谱图；
图6重组TAT(m)-survivin(T34A)蛋白纯化结果的SDS-PAGE分析结果
1：为标准分子量蛋白；2：为阳性表达株诱导表达的总蛋白；3：为重组蛋白经SPSepharose阳离子交换柱纯化结果；4：为重组蛋白经superdex-75分子排阻层析纯化结果。
图7重组蛋白TAT(m)-survivin(T34A)对乳腺癌细胞系B-cap37和宫颈癌细胞系Hela细胞的凋亡抑制效果的MTT法检测结果。
本发明利用RT-PCR从乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的全长编码区DNA序列，进行定点突变得到Survivin(T34A)，然后利用PCR在其N-末端引入突变的HIV-TAT蛋白转导序列(TAT(m))，然后构建入表达载体中，形成重组表达载体再转化大肠杆菌进行诱导表达及表达产物的纯化。
本发明包含以下步骤：
1.引物设计：用PCR法得到Survivin的全长编码区DNA序列，用重组法对Survivin34位Thr定点突变为Ala，并在N-端引入突变的HIV-TAT蛋白转导序列和两端的不同酶切位点。
本发明设计的克隆引物：Pb1：5’-TAG AAT TCG GCC GGC TGC GGG GCA TTCGC-3′；P2：5′-GTC GAA TTC TCA CAG GTC TGA GCA GCG ATC CTG CTT GCT-3’，在DNA片段的上游和下游分别引入EcoR I和Xhol I位点
突变引物：Pm1：5’-CTT GGA GGG CTG CGC CTG C
GCC CCG GAG CGG ATGGCC GAG GC-3’and Pm2：5’-GCC TCG GCC ATC CGC TCC GG
GGC GCA GGC GCAGCC CTC CAA G-3’。将蛋白的34位Thr突变为Ala。
HIV-TAT蛋白转导序列添加引物：Ptat1：5’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCATGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’；and Ptat2：5’-CG
CATATG TAC GCT CGT AAA GCTCGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’，Ptat2：的5’端均设计有Nde I限制性酶切位点。
TAT(m)-Survivin(T34A)基因片段上游的酶切位点是NdeI，下游的酶切位点是XhoI。
2.基因克隆和定点突变
利用克隆引物Pb1和P2经RT-PCR从乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的全长编码区DNA序列，利用突变引物Pm1和Pm2经重组法对Survivin蛋白的34位Thr突变为Ala，并将Survivin基因突变体加尾后装入pEGM-T载体，测序鉴定。
3.原核表达载体pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)构建
利用HIV-TAT蛋白转导序列添加引物Ptat1和Ptat2为测序正确的Survivin基因突变体的5‘端添加高效蛋白转导序列和适当的酶切位点，TAT(m)-Survivin(T34A)基因加尾后克隆pEGM-T载体，测序鉴定。测序正确的TAT(m)-Survivin(T34A)限制性内切酶酶切后，亚克隆进表达载体pREST-B中，构建原核表达载体pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)，并进行测序和酶切鉴定。
4.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)的转化和转化子的诱导表达
根据《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)，利用CaCl2法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，和42℃/90秒热冲激方法进行重组表达载体的转化，在LT液体培养基中，利用终浓度为0.5mM的IPTG 37℃诱导小量表达5小时，或者利用3.7L发酵罐发酵表达10小时后，6000rmp离心弃上清取沉淀。
5.融合蛋白TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化和复性
融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)在大肠杆菌中以包涵体形式表达。发酵收集菌体超声破碎后，所得包涵体经洗涤，溶解后，将样品上至阳离子层析柱，阳离子层析柱的洗脱组分上凝胶层析柱，不同组分分别收集，即可得到98％纯度的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白。
6.体外细胞活性
本发明中检测了融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)对乳腺癌细胞系B-CAP-37和宫颈癌细胞系Hela的抑制活性。在96孔板，待细胞80％-90％长满时，按一定梯度加入经纯化和复性处理后融合蛋白TAT(M)-Survivin，并以相同缓冲液作为对照，对培养的细胞系通过MIT法进行活性测定。研究结果表明：TAT(M)-Survivin(Thr34Ala)能显著抑制B-CAP-37和Hela细胞的生长，并有剂量依赖性。而且对B-CAP-37的抑制率明显高于对Hela细胞的抑制率。
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料
以下实验所用主要药品来源：乳腺癌细胞系B-cap37和宫颈癌细胞系Hela细胞购自ATCC；pEGM-T载体、pREST-B载体来自Invitrogen；ECL Western Blotting检测试剂购自Amersham Pharmacia Biotech；工具酶、引物合成以及基因测序来自上海生工生物技术公司。
实施例1.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)载体系统的构建
从B-Cap-37中用Trizol试剂抽提总RNA，经变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。用提取的总RNA由引物Pb1：5’-TAG AAT TCG GCC GGC TGC GGG GCA TTC GC-3′和P2：5′-GTC GAA TTC TCA CAG GTC TGA GCA GCG ATC CTG CTT GCT-3’，反转录成cDNA，以此为模板，经PCR扩增，获得扩增产物即为人Survivin基因编码序列，将此Survivin段装入pEGM-T载体。再以此为模板，用Survivin突变引物Pm1：5’-CTTGGAGGGCTGCGCCTGC
GCCCCGGAGCGGATGGCCGAGGC-3’Pm2：5’-GCCTCGGCCATCCGCTCCGG
GGCGCAGGCGCAGCCCTCCAAG-3’经重组法对Survivin34位Thr定点突变为Ala，将突变后的Survivin基因装入pEGM-T载体，测序正确。用HIV-TAT蛋白转导序列添加引物对Survivin基因突变体添加突变的高效HIV-TAT蛋白转导序列和酶切位点。经NotI和XholI双酶切，将此PCR扩增产物装入经NotI和XholI双酶切pREST-B中。得到pREST-B-TAT(M)-Survivin(T34A)。至此完成了此载体系统的构建。PCR鉴定电泳结果(如图1所示)表明，TAT(M)-Survivin(T34A)段确已装入表达载体，测序结果与分析如图3所示。
实施例2.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)载体转化大肠杆菌
大肠杆菌BL21(DE3)感受态制备方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的CaCl2法，从-80℃冰箱取感受态细胞50μl/管，常温复苏冷冻的菌株后，加入已构建正确的pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)表达载体1μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟，立即转到42℃水浴中放置2分钟，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培养基，37℃水浴中15分钟后，37℃摇床轻摇45分钟，取100μl转化菌体，均匀涂布于含100mg/ml氨苄的琼脂平板培养基上，室温晾干后，37℃倒置培养过夜。
实施例3.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的小量表达
从LB(含AMP抗性)板上挑取7个克隆培养在50mlLB培养基中(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％NaCl，Ph7.0，0.5％AMP)，37℃，250rpm下培养至O.D.600＝0.6。加1mmol IPTG诱导蛋白表达。37℃、250rpm条件下培养4h，离心收集细胞，取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示。
实施例4.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的大量表达。
挑选表达量最高的克隆进行大量表达，即在3.7升发酵罐中进行分批发酵。基础培养基1％酵母粉，1％蛋白胨，1％葡萄糖，1％甘油，pH7.0，0.5％AMP。发酵过程中用氨水调pH，OD600＝3.0加1mmol IPTG诱导蛋白表达5小时后离心收集菌体，-80℃保存。取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示。
实施例5.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的纯化
取1升发酵得菌体，加入20mM磷酸盐缓冲液300ml，超声破菌。10000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀用含2M尿素和0.5％Triton X-100的20mM磷酸盐缓冲液洗涤，离心弃上请。沉淀用含8M尿素和5mM DTT的20mM磷酸盐缓冲液进行溶解包含体。然后将样品上至阳离子层析柱(SP Sepharose)，经平衡液(20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5，8M尿素，5mM DTT)充分平衡，用洗脱液(20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5，1M NaCl)将目的蛋白洗下。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图3所示。阳离子层析柱的洗脱组分上凝胶层析柱(superdex-75)，缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5，不同组分分别收集，即可得到98％纯度的TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图3所示
实施例6.Western Blotting检测融合蛋白
将以上TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中包括未经诱导的BL21细胞裂解液作为阴性对照。分离出的目的蛋白由semi-dry transferapparatus(Bio-Rad Laboratories)转移至PVDF膜上。将膜用封闭缓冲液(PBST中含有5％脱脂奶粉)封闭1小时。进行三次洗涤，每次用PBST洗10分钟，之后室温下与温育1小时。同样三次洗涤后，在由辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG1 1∶1000稀释液中温育1小时。再经三次洗涤后，膜用ECL Western Blotting检测试剂(AmershamPharmacia Biotech.)处理后送去暗室曝光。Western Blotting结果如图4所示。
实施例7.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的活性检测
乳腺癌细胞系B-CAP-37和宫颈癌细胞系Hela复苏后于细胞培养基含10％的FBS和抗生素(100u/ml penicillin-G和10U/ml streptomycin)RMPI1640中，在37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞80％-90％长满时，胰酶酶解消化，按每孔10000细胞接种于96孔板，待细胞80％-90％长满时，按一定梯度加入经纯化和复性处理后重组蛋白TAT(m)-Survivin，并以相同缓冲液作为对照，对培养的细胞系通过MIT法进行活性测定。研究结果表明：TAT(m)-Survivin(Thr34Ala)能显著抑制B-CAP-37和Hela细胞的生长，并有剂量依赖性。而且对B-CAP-37的抑制率明显高于对Hela细胞的抑制率。不同浓度的TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白对细胞生存率的影响见图5。
序列表
<110>华东理工大学
<120>含有HIV转导结构域的生存素突变体及制备方法和应用
<130>SPI058251
<160>2
<170>Patent In Version 2.1
<210>1
<211>154
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(46)
<223>mutation
<400>1
Met Try Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg Met Gly Ala
1 5 10 15
Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg
20 25 30
Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys
35 40 45
Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
50 55 60
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu
65 70 75
Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro lle Glu Glu His Lys
80 85 90
Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe
95 100 105
Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Pro Glu Pro
110 115 120
Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu
125 130 135
Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Pro Pro Ala Ile Glu Gln Leu
140 145 150
Ala Ala Met Asp
<210>2
<211>465
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(136)
<223>mutation
<400>2
atg tac gct cgt aaa gct cgt cgt caa gca cgt cgc atg ggt gcc 45
ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac cac cgc 90
atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc tgc 135
gcc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act 180
gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag 225
ctg gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa 270
aag cat tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt 315
gaa gaa tta acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga 360
gcc aag aac aaa att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa 405
ttt gag gaa act gcg aag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg 450
gct gcc atg gat tga 465
Claims (9)
1.一种生存素突变体，其特征在于，Survivin(T34A)蛋白的N端插入一种蛋白转导肽。
2.如权利要求1所述的生存素突变体，其特征在于，所说的蛋白转导肽是来自HIV-1 Tat(Trans-Activating Transduction protein)的蛋白转导域(TatPTD)，该转导域的序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。
3.如权利要求1所述的生存素突变体，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1。
4.如权利要求1所述的生存素突变体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO.2。
5.制备权利要求1所述的生存素突变体的方法，包括如下步骤：
构建TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因；将融合蛋白基因插入表达载体；将带有融合蛋白基因的表达载体转入到相应的表达细胞；培养该表达细胞；诱导目的蛋白表达；收集并纯化表达产物。
TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因的构建采用PCR方法，在Survivin(T34A)基因的5‘端分2步引入HIV-1 Tat蛋白转导域序列，引入突变的PCR引物序列为：
Ptat1：5’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCA TGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’
Ptat2：5’-CG CATATG TAC GCT CGT AAA GCT CGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’
下游引物：
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，表达载体为pREST-B，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)包涵体经洗涤，溶解后，经阳离子交换层析、凝胶层析，得到TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白纯品。
8.权利要求1～4任一项所述的生存素突变体在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤疾病为乳腺癌或宫颈癌。
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