CN1284798C - 聚胸腺素-α1、其组合物、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚胸腺素-α1、其组合物、制备方法和应用,所述聚胸腺素-α1包括胸腺素-α1二聚体活性片断、胸腺素-α1三聚体活性片断;可通过基因工程和化学合成方法制备,所述聚胸腺素-α1可应用于制备治疗肝炎病毒感染性疾病、肿瘤免疫功能低下疾病的药物。本发明聚胸腺素-α1具有可大量制备、成本低、活性高、半衰期长、疗效显著的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫增强聚合物,尤其涉及一种聚胸腺素-α1、其组合物、其制备方法和应用。
背景技术
20世纪60年代以前,人类对胸腺的功能了解甚少。1961年,在Miller等人发现了胸腺与抗体的免疫功能及淋巴细胞的发育有密切关系以后,对胸腺中的物质成分进行了大量的探讨。1966年Goldstein首先从小牛胸腺组织中提取出一种具有生物活性的物质,命名为胸腺素(Thymosin),随之进行了临床应用。1974年美国开始把小牛胸腺素应用于临床,主要用于治疗原发性细胞免疫缺陷病和某些肿瘤等。我国生产的猪胸腺素,主要用于治疗自身免疫病症,以及重症肝炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、复发性口疮等,疗效显著。
胸腺素是一类由多种多肽组成的混合物,相对分子量在1000-15000之间,PI值在3.5-9.5之间,对于这些多肽的鉴别和比较,根据它们的PI值等电聚焦电泳分离时顺序而命名,共分三个区域:α-区包括PI值小于5.0的组分;β-区包括pI值在5.0-7.0之间的组分;γ-区指pI值大于7.0以上的组分。对分离出的多肽进行免疫活性测定,有活性的称为胸腺素,如胸腺素-α1,无活性的称多肽,如多肽β1。现在已研究明白,胸腺素组分5含有胸腺素-α1、胸腺素-α5、胸腺素-α7、胸腺素-β3和胸腺素-β4等具有调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分,其中主要成分为胸腺素-α1。一般研究表明,胸腺素-α1单一组分的活性为胸腺素组分5的10-1000倍。
胸腺素-α1组分在1977年被确定,其分子结构为含有28个氨基酸残基的小分子多肽。根据广泛而又深入的研究表明,胸腺素-α1无论是在体内还是在体外,对机体免疫系统具有强烈刺激作用,可以促进T细胞的成熟,是T淋巴细胞的免疫增强因子;现代研究表明,胸腺素-α1的生物学作用很广泛,如能刺激机体产生干扰素、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3及其受体的表达;增加NK细胞的杀伤活性。此外,它还与细胞周期调控、血管生长、细胞迁移、组织修复、以及精子的活力有关。因此,在临床上可以应用于与许多与免疫系统相关疾病的辅助治疗,如乙型、丙型肝炎,肿瘤,免疫缺陷、免疫低下,以及AIDS等。
虽然胸腺素-α1有着较高的临床应用价值,但由于胸腺素-α1是由28个氨基酸组成的小分子多肽药物,目前利用基因工程方法生产的胸腺素-α1都是先利用大肠杆菌表达多聚体的胸腺素-α1,然后用化学裂解方法(如利用溴化氢或羟胺)获得单体。但是这种用基因工程的常规方法很难在大肠杆菌中直接表达并大量制备单分子的胸腺素-α1;而胸腺素-α1采用化学合成方法制备成本较高,价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫增强聚合物,尤其提供一种聚胸腺素-α1、其组合物、其制备方法和应用,克服了小分子多肽胸腺素-α1单体用基因工程的常规方法很难在大肠杆菌中直接表达大量制备、而且化学合成成本高、价格昂贵、活性不高、半衰期不长、疗效不显著的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
聚胸腺素-α1,属于一种生物活性多肽,包括胸腺素-α1二聚体活性片断或胸腺素-α1三聚体活性片断;以及胸腺素-α1二聚体活性片断和胸腺素-α1三聚体活性片断;
所述胸腺素-α1二聚体活性片断的结构式为:
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn;
所述胸腺素-α1三聚体活性片断的结构式为:
Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn;
所述聚胸腺素-α1,其中胸腺素-α1分子间可通过氨基酸相连接,尤其聚胸腺素单体间通过蛋氨酸以肽键相联接;所述聚胸腺素单体结构式为Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn;并连接片断Met-His-Lys-Cys-Asp保护基因。
本发明所述聚胸腺素-α1的制备方法,包括通过基因工程方法、化学合成方法来获得;
所述聚胸腺素-α1基因工程的制备方法,包括以下步骤:
具体包括以下步骤:
获得聚胸腺素-α1基因:利用DNA自动合成仪,根据Genebank公布的胸腺素-α1的DNA序列合成聚胸腺素-α1基因,序列如下:
5′-ATGCACAAGAGCGACATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAAGCGGAAAAT-3′。以所述氨基酸片断Met-His-Lys-Cys-Asp为引物或保护基因,进行所述单体的扩增合成。
利用基因工程手段获得“聚胸腺素-α1”重组表达产物:
将上述合成的胸腺素-α1基因片断通过已知的基因操作方法进行拼接、融合,连接后融合的基因形式有:
a、胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因
b、胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因
体外DNA的重组:
将融合后的聚胸腺素-α1基因与载体DNA相连接,载体DNA可以是质粒、噬菌体和病毒;连接方式可以为粘性末端连接法、平端连接法和人工接头连接法。
DNA重组体的转化,将DNA重组体导入到宿主细胞:
将上述融合后的基因通过重组整合到合适的大肠杆菌中表达,获得表达蛋白,宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母菌和动物细胞,尤其将胸腺素-α1基因导入大肠杆菌DH5α,在大肠杆菌中合成聚胸腺素-α1。具体的导入方法包括:大肠杆菌转化用氯化钙处理制备感受态细胞和用电激法导入;酵母菌用原生质体或乙酸锂法转化;动物细胞用磷酸钙、DEAE-葡萄糖、电穿孔及显微注射法导入外源DNA。
聚胸腺素-α1基因的表达:
聚胸腺素α1基因的表达可以利用非融合蛋白表达方式、融合蛋白表达方式和分泌型表达方式进行;表达系统可为已知的表达系统,如原核表达系统、酵母表达系统、真核系统表达等。
聚胸腺素-α1的纯化:
聚胸腺素-α1的分离:将表达到一定时间的工程菌株,利用已知的超声波、高浓度的尿素等多种细胞裂解方法将细胞裂解,然后进行蛋白质分级盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析、如亲和层析、超滤、高压液相层析等蛋白质纯化方法,纯化表达蛋白。
聚胸腺素-α1纯度的鉴定:将分离得到的聚胸腺素-α1利用已知的蛋白质纯化方法,纯化表达蛋白,如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析、超滤等。尤其用SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳、高压液相层析等方法鉴定,通过纯化方法获得纯度达96%以上的聚胸腺素-α1。
所述聚胸腺素-α1化学合成的制备方法,可采用已知的化学合成方法合成聚胸腺素-α1,尤其选用自动固相合成法来合成聚胸腺素-α1,具体步骤如下:
氨基酸氨基的保护:
将各种氨基酸的氨基用叔丁酸进行保护,得到Boc-氨基酸,即叔丁羰酰氨基酸。
C末端氨基酸的连接:
先将上述Boc-天冬氨酸与氯甲基化的树脂反应,通过苄酯键连接在树脂上,得到Boc-天冬氨酸苄酯树脂,然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基,并用水和乙醇洗涤。
肽链的延长:
所述天冬氨酸苄酯树脂在DCCI缩合剂的作用下,与C-末端的第二个氨基酸Boc-谷氨酸缩合,得到Boc-谷氨酸-天冬氨酸二肽,并用水和乙醇交替洗涤,除去未反应的Boc-谷氨酸,然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基,然后按照聚胸腺素-α1的从C末端到N末端的氨基酸顺序依次连接Boc氨基酸。
聚胸腺素-α1的回收:
当肽链合成完毕后,将连接有肽链的树脂悬浮在无水三氟乙酸中,通入干燥的溴化氢,使肽链从树脂上解离下来,同时除去保护基,得到合成的多肽。
纯度检测和鉴定同前述基因工程法。
本发明聚胸腺素-α1,与单体胸腺素-α1相比,可更大规模地制备,制备成本更低。
本发明还提供了一种治疗免疫功能疾病的药物,包括聚胸腺素-α1;所述聚胸腺素-α1选自胸腺素-α1二聚体、胸腺素-α1三聚体、或其生理变异体之一或其组合;
所述药物组合物,还可进一步包括可药用的载体;
所述治疗免疫功能疾病的药物组合物,包括以下重量份组分:胸腺素-α1二聚体1-99、可药用的载体适量、还可进一步包括胸腺素-α1三聚体1-99;优选为以下重量份组分:胸腺素-α1二聚体3-20和可药用的载体、还可进一步包括胸腺素-α1三聚体3-20;
最好为以下重量份组分:胸腺素-α1二聚体15和可药用的载体、还可进一步包括胸腺素-α1三聚体15;所述胸腺素-α1二聚体、胸腺素-α1三聚体还可由其生理变异体代替;
所述可药用的载体是指药学上所说的载体,尤其是根据《中国生物制品主要原辅材料质控标准》所添加的各种添加剂、赋型剂,如:甘露糖、阿拉伯胶、蔗糖等;
所述药物的生理变异体为结构变化产生的变异体,主要有三个方面,一种是单体间的连接氨基酸由蛋氨酸变为其它氨基酸;另一种是在N末端进行修饰,如乙酰化修饰;第三种变异体主要是药物N末端前六个氨基酸序列和长短的变化,即这段氨基酸序列可以由各种氨基酸组成的2-10肽所取代产生的变化。
所述药物可制成药学上可用剂型,尤其为冻干针剂、胶囊、片剂、膏剂、口服水剂、糖浆剂等;
所述药物制剂可通过以下途径给药:鼻腔、口腔、直肠、阴道、静脉、肌肉注射等。
本发明还提供了所述聚胸腺素-α1在制备治疗肝炎、肿瘤、抗病毒治疗、感冒预防与治疗、细菌感染性疾病、提高免疫功能药物方面的应用;所述聚胸腺素-α1选自胸腺素-α1二聚体、胸腺素-α1三聚体、其生理变异体之一或其组合。
发明人还发现,由两分子或三分子胸腺素-α1聚合形成的聚胸腺素-α1不但与胸腺素-α1单体具有相同的生物学功能,而且活性更高、生物半衰期更长;实验药代动力学半衰期研究证明如下:
由11个20-30岁的健康志愿者参加的研究试验表明,以900μg/m2的剂量聚胸腺素-α1单次给药,体内浓度在1.4个小时后达到浓度最大值,最大浓度为48.30μg/L,半衰期为2.5小时,肾排泄量为30%。
以同样的剂量连续给药5天,发现体内浓度在1.42小时内达到最大值,最大浓度为49.52μg/L,半衰期是2.1小时,肾排泄为60%。
与胸腺素α1单体相比较,聚胸腺素-α1半衰期分别为2.1小时,胸腺素α1为1.7小时,半衰期明显延长。
为证明本发明聚胸腺素-α1的治疗效果,进行了以下实验:
一、体外聚胸腺素-α1的活性测定
(1)E-玫瑰花试验:采集新鲜猪胸腺,制备淋巴细胞悬液,45℃温浴1小时脱E-受体,洗涤细胞调整细胞浓度至106个/ml,分置于小试管中,每管0.2ml,加入0.1ml稀释成不同浓度的纯化聚胸腺素-α1溶液,37℃培养1小时,将绵羊红细胞洗涤后调整细胞浓度至107个/ml,500g离心2分钟,4℃放置过液。次日计数玫瑰花结形成率。结果如下表1:
表1:玫瑰花环实验结果(n=6)
聚胸腺素-α1的浓度(mg/L) | 玫瑰花环率(%) |
0 | 12.0±0.3 |
0.006 | 12.5±0.1 |
0.060 | 16.0±0.4a |
0.600 | 21.0±0.3b |
6.000 | 24.0±0.1b |
60.00 | 20.0±0.2b |
600.0 | 15.0±0.5a |
ap<0.0 1 bp<0.001
结论:聚胸腺素-α1可以明显提高E-玫瑰花的结花率。
(2)体外淋巴细胞增值试验
a、脾细胞悬液的制备:颈椎脱臼处死Bal B/C小鼠,置入75%酒精中浸泡消毒1分钟,无菌取小鼠的脾脏,100目铁丝网研磨,试管收集细胞悬液,离心1500/min,10分钟,去上清,细胞团块用3ml Tris缓冲氯化铵溶红细胞液溶解红细胞,混合作用5分钟用培养液或PBS液迅速洗去NH4Cl,调细胞浓度为2×106,进行淋巴细胞增殖试验(采用3H胸腺嘧啶掺入法及MTT法进行)
b、取上述细胞铺入96孔板,每孔0.1ml,继而加入等量的对照及不同浓度的聚胸腺素进行细胞培养,相应孔中加入10ul ConA,聚胸腺素培养终浓度为100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625,0.78125,0.390625,0.1953125,0.0976ug/ml,均设3复孔。
3H胸腺嘧啶掺入法测定时,于培养56小时后,加入10ul 3H胸腺嘧啶工作液,继续培养16小时,多头细胞收集器收集细胞,液体闪烁计数仪测射线强度。结果见表2及图1。
表2 MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果1
组别 | OD值 |
无conA对照conA对照97.6195.3390.6781.31562.531256250125002500050000100000 | 0.103±0.0150.244±0.0340.280±0.0270.276±0.0220.288±0.0410.256±0.0250.243±0.0290.268±0.0200.253±0.0320.247±0.0380.274±0.0140.305±0.027*0.406±0.058*** |
与ConA对照组比较,*P<0.05,***P<0.001
MTT法测定时,于培养68小时后,每孔加入5mg/ml的MTT无菌溶液20μl,继续培养4小时后,终止培养。小心吸弃培养上清液,每孔加入150μlDMSO,振荡10分钟,使结晶充分溶解。用酶标仪检测490nm波长下各孔吸光度值。此试验重复2次,结果见表3、表4及图2、图3。
结论:当聚胸腺素-α1达到一定浓度后可以刺激淋巴细胞大量增值。
表3 MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果2
组别 | OD值 |
无conA对照conA对照97.6195.3 | 0.114±0.0030.315±0.0490.268±0.0350.273±0.030 |
390.6781.31562.531256250125002500050000100000 | 0.324±0.0100.380±0.0200.431±0.028*0.405±0.0350.407±0.0230.417±0.009*0.470±0.018*0.505±0.010**0.499±0.035* |
表4 3H掺入法测定聚胸腺素体外细胞增殖结果
组别 | cpm值 |
无conA对照conA对照97.6(ng/ml)195.3390.6781.31562.531256250125002500050000100000 | 991±595.413176±2021.617326±3308.711648±551.9813319±4018.615537±4285.212845±4344.415229±1934.912881±6794.813495±3781.914813±1113.617115±2320.8*24509±1877.4*** |
与ConA对照组比较,*P<0.05,***P<0.001
(3)体外淋巴细胞激活试验—细胞因子IL-2测定
采用ELISA法进行测定,试剂盒由北京晶美生物工程有限公司购得。加样及细胞培养方法同上(2)体外淋巴细胞增值试验。72小时后收集培养上清,按试剂盒提供的操作步骤进行IL-2测定,取双复孔测定平均值进行统计分析。结果见图4、图5。
结论:聚胸腺素-α1可以刺激IL-2的分泌,但与药的浓度无对应关系。
结果表明:体外的E-玫瑰花试验,可以观察到聚胸腺素-α1能明显提高淋巴细胞形成E-玫瑰花的能力;体外的淋巴细胞增值试验,从人全血分离得到淋巴细胞,加入3H-TdR和聚胸腺素-α1,可以检测到聚胸腺素-α1能明显提高淋巴细胞的DNA合成能力;体外的淋巴细胞激活试验,从人全血分离得到淋巴细胞,加入聚胸腺素-α1,可以检测到淋巴细胞表面白介素-2受体的表达明显增加。
二、体内实验
(1)乙型肝炎临床在体试验的治疗观察
接受聚胸腺素-α1治疗的患者,每周两次皮下注射1.6mg,持续6个月,有37.2%患者在停药12个月后,其血清中的谷丙转氨酶、乙肝抗原及乙肝病毒DNA转阴,远高于使用安慰剂的对照组19%的转阴率。如下表5、表6、表7:
表5聚胸腺素-α1和安慰剂对乙型肝炎的疗效比较
胸腺素-α1 | 安慰剂组 | |
病例总数 | 113 | 110 |
患者在治疗停止12个月后,血清中丙氨酸转移酶、乙肝病毒DNA转阴的人数 | 42 | 21 |
37.2% | 19% |
表6 聚胸腺素-α1和干扰素联合作用与单独使用干扰素对丙型肝炎的疗效比较
聚胸腺素-α1 | 干扰素 | |
病例总数 | 66 | 54 |
停止治疗6个月后,丙氨酸转移酶及丙肝病毒RNA转阴的人数 | 32 | 12 |
治疗有效率 | 48.5% | 22.2% |
(2)丙型肝炎的临床在体试验的治疗观察
接受聚胸腺素-α1及干扰素联合治疗的患者,皮下注射1.6mg胸腺素-α1,每周两次,肌肉注射3MU干扰素,每周三次,持续治疗6个月,有48.5%患者在停药6个月后,其血清中谷丙转氨酶及丙型肝炎病毒RNA转阴,疗效显著高于单独使用干扰素的22.2%、使用安慰剂的对照组的20.7%。
(3)聚胸腺素动物免疫力的增加试验提示可作为免疫辅助药物
SPF级雌性ICR小鼠90只,随机分组,每组10只。模型1:皮下注射环磷酰胺(CTX)100mg/kg,每日一次,连续3天。第3天致敏;模型2:于第3天致敏后立即单次皮下注射CTX 100mg/kg,6小时后给予相应药物;模型3:第1天单次皮下注射CTX 250mg/kg后给予相应药物,于第3天致敏。以上3组均于第8天攻击,第9天处理动物,采集指标。结果如下表7、图6:
表7 聚胸腺素化疗免疫低下动物模型预试(n=10)
组别 | 胸腺指数 | 肿胀度 |
模型1聚小200聚大500模型2聚小200聚大500模型3聚小200聚大500 | 2.206±0.6662.33±0.3042.406±0.5432.959±0.8622.501±0.4452.469±0.732*2.314±0.7792.229±0.7012.366±0.691 | 2.7±1.5673.5±1.7323.1±1.7925.2±1.9978.2±3.615*5±3.6977.3±3.5348.7±4.59610.1±3.788* |
*p<0.05
注:聚大表示聚胸腺素化疗大鼠;聚小表示聚胸腺素化疗大小鼠
结论:聚胸腺素-α1可以提高小鼠的免疫力
(4)聚胸腺素-α1肿瘤抑制试验提示用于肿瘤治疗
无菌条件下取荷瘤小鼠肝癌H22腹水,以生理盐水洗涤,调细胞浓度为1×107/ml,每只小鼠左腹股沟皮下接种瘤液0.2ml。接种将小鼠随机分为如下6组,每组5只,连续皮下注射给予相应药物,给药容积为0.1ml/10g体重,每日一次。各组动物试验日程见下表。致敏及攻击方法同上,攻击24h后处死小鼠,剪下左右耳壳,于同一部位取直径8mm耳片称重,左右耳片重量之差为肿胀度,并取胸腺称重计算脏器指数。
试验日程安排:
第一组:do接种,d4致敏,d9攻击,d10测耳肿胀度。
第二组:d0接种,d9致敏,d14攻击,d15测耳肿胀度。
第一组试验结果
肿胀度 | 胸腺指数 | 瘤重(g) | |
对照组给药组 | 6.6±5.0308.0±4.74 | 391±182.5446.1±191.7 | 540±102.6536.2±144.7 |
第二组试验结果
肿胀度 | 胸腺指数 | 瘤重(g) | |
对照组给药组 | 10±1.87110±3.000 | 434.2±84.12453.9±97.83 | 1450±646.5921.6±476.59 |
结论:胸腺素-α1可以抑制肿瘤的生长
本发明具有以下优点:
1、通过一系列实验证明,聚胸腺素-α1具有良好的治疗作用,其作用是提高机体的免疫能力,可通过提高机体免疫力来治疗的疾病,如各种肝炎的治疗、各种肿瘤的治疗、各种抗病毒治疗、感冒预防与治疗、各种细菌感染性疾病等。因此,它可应用于治疗肝炎、肿瘤、抗病毒治疗、感冒预防与治疗、细菌感染性疾病等。同时聚胸腺素-α1也具有提高机体免疫能力作用,凡是需要提高机体免疫力来治疗的疾病都可是它的适应症。
2、本发明聚胸腺素-α1及其组合物具有可大量制备、成本低、活性高、半衰期长、疗效显著的优点。
3、本发明聚胸腺素-α1及其组合物制剂,无毒副作用。
附图说明
图1为3H掺入法测定聚胸腺素体外细胞增殖实验曲线
图2为MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖实验曲线1
图3为MTT法测定聚胸腺素体外细胞增殖实验曲线2
图4为聚胸腺素IL-2分泌影响实验曲线之一
图5为聚胸腺素IL-2分泌影响实验曲线之二
图6为聚胸腺素动物免疫力的增加试验图谱
具体实施方式
实施例1
基因工程方法制备聚胸腺素-α1
材料
克隆、表达、测序一体化载体pLDH4及大肠杆菌DH5α均由解放军第四军医大学生物化学及分子生物学教研室构建和保存;EcoRV、HindIII、T4DNA联接酶、T4DNA聚和酶购自Gibco公司;质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程公司;凝胶回收试剂盒购自Qiange公司,蛋白质含量分析BCA试剂盒购自Pierce公司;胸腺素-α1核酸片断采用Genebank公用数据库公布的人28胸腺素-α1的基因序列,由上海生物工程公司合成。
步骤如下:
1、合成聚胸腺素-α1基因:利用DNA自动合成仪,根据Genebank公布的胸腺素-α1的DNA序列合成聚胸腺素-α1基因,序列如下:5′-ATGCACAAGAGCGACATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAAGCGGAAAAT-3′。以氨基酸片断Met-His-Lys-Cys-Asp为引物或保护基因,进行扩增合成;
上述合成的胸腺素-α1基因片断通过常规基因操作方法进行拼接、融合,连接后融合的基因有两种形式:
a、胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因,即聚胸腺素-α1二聚体
b、胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因—胸腺素-α1基因,即聚胸腺素-α1三聚体
2、利用基因工程手段获得“聚胸腺素-α1”重组表达产物
(1)聚胸腺素-α1基因克隆及表达载体—体外DNA的重组
将融合后的聚胸腺素-α1基因与载体DNA相连接,载体DNA为质粒,用粘性末端连接法进行连接。具体为:
将合成的胸腺素-α1 cDNA核酸片断等比例混合,100℃热变性10分钟,室温退火,T4DNA聚合酶补平后用HindIII双酶切,Qiagen kit回收得到的大小片断安1∶3比例混合,以T4DNA联接酶联接,转化DH5α感受肽菌,筛选阳性克隆进行酶切、测序。
(2)聚胸腺素-α1的诱导表达及纯化
经测序正确的阳性克隆菌株在42℃温度诱导下表达目的蛋白质,SDS-PAGE肽电泳观察表达结果。
包括:DNA重组体的转化,将DAN重组体导入到宿主细胞。即:将上述融合后的胸腺素-α1基因导入大肠杆菌DH5α,在大肠杆菌中合成聚胸腺素-α1,获得表达蛋白,宿主细胞还可以是酵母菌和动物细胞,均获得相同效果。具体的导入方法分别是:大肠杆菌转化用氯化钙处理制备感受态细胞和用电激法导入;酵母菌用原生质体或乙酸锂法转化;动物细胞用磷酸钙、DEAE-葡萄糖、电穿孔及显微注射法导入外源DAN。
聚胸腺素-α1基因的表达获得了聚胸腺素-α1,即:利用已知的非融合蛋白表达方式、融合蛋白表达方式和分泌型表达方式进行聚胸腺素α1基因的表达。表达系统:为酵母表达系统。
(3)通过纯化方法获得纯度达98%以上的聚胸腺素-α1。
a、聚胸腺素-α1的分离:将表达的工程菌株,利用常规的超声波细胞裂解方法将细胞裂解,然后进行蛋白质分级盐析、Source RPC反相层析柱和QSepharose HP阴离子交换柱来纯化所述目的蛋白质。
b、聚胸腺素-α1纯度的鉴定:将上述纯化的聚胸腺素-α用Pierce公司BCA蛋白质检测试剂盒检测蛋白含量不低于98%。
实施例2:
用化学合成方法—自动固相合成法来合成聚胸腺素-α1
1、氨基酸氨基的保护
将氨基酸的氨基用叔丁酸进行保护,得到Boc-氨基酸(叔丁羰酰氨基酸)。
2、C末端氨基酸的连接
将所述Boc-天冬氨酸与氯甲基化的树脂反应,通过苄酯键连接在树脂上,得到Boc-天冬氨酸苄酯树脂,然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基,并用水和乙醇洗涤。
3、肽链的延长
天冬氨酸苄酯树脂在DCCI缩合剂的作用下,与C-末端的第二个氨基酸Boc-谷氨酸缩合,得到Boc-谷氨酸-天冬氨酸二肽,并用水和乙醇交替洗涤,除去未反应的Boc-谷氨酸,然后用盐酸-乙酸脱去Boc-保护基,然后按照聚胸腺素-α1的从C末端到N末端的氨基酸顺序依次连接Boc氨基酸。
4、聚胸腺素-α1的回收
当肽链合成完毕后,将连接有肽链的树脂悬浮在无水三氟乙酸中,通入干燥的溴化氢,使肽链从树脂上解离下来,同时除去保护基,得到合成的多肽。
5、纯度及鉴定方法,同实施例1获得纯度达98%以上的聚胸腺素-α1
实施例3
冻干剂
根据实施例1或2得到的溶液在体温条件下直接真空干燥,得到聚胸腺素-α1二聚体或三聚体冻干剂,分装得到含量为1.6mg/支。
实施例4
片剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体30、甘露糖20
制备方法:取实施例1得到的聚胸腺素-α1二聚体,加入赋型剂甘露糖,混合干燥,整粒,压片,紫外灭菌10分钟即得。
实施例5
片剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1三聚体30、甘露糖20
制备方法:同实施例4。
实施例6
胶囊剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体15、蔗糖20
制备方法:取实施例1得到的聚胸腺素-α1三聚体,加入蔗糖,混合过筛100目,干燥,整粒,装胶囊,紫外灭菌15分钟即得。
实施例7
胶囊剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1三聚体15、蔗糖20
制备方法:同实施例6。
实施例8
胶囊剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体3、蔗糖20
制备方法:同实施例6。
实施例9
胶囊剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1三聚体3、蔗糖20
制备方法:同实施例6。
实施例10
溶液剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体1、聚胸腺素-α1三聚体99。
制备方法:取实施例1得到的聚胸腺素-α1二聚体、聚胸腺素-α1三聚体,混合,加入蒸馏水调至100ml。
实施例11
溶液剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体99、聚胸腺素-α1三聚体1。
制备方法:同实施例10。
实施例12
溶液剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体3、聚胸腺素-α1三聚体20。
制备方法:取实施例1得到的聚胸腺素-α1二聚体、聚胸腺素-α1三聚体,混合,加入蒸馏水调至10ml。
实施例13
溶液剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体20、聚胸腺素-α1三聚体3、蔗糖20。
制备方法:同实施例10,还包括加入蔗糖。
实施例14
胶囊剂直肠给药制剂
称取以下原料(克):聚胸腺素-α1二聚体15、聚胸腺素-α1三聚体3、蔗糖15、椰子油10。
制备方法:取实施例1得到的聚胸腺素-α1二聚体、三聚体,加入椰子油混合,装胶囊,紫外灭菌15分钟即得。
Claims (5)
1、一种聚胸腺素-α1三聚体活性片断,所述胸腺素-α1三聚体活性片断的结构式为:Met-His-Lys-Cys-Asp-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Met-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
2、权利要求1所述的聚胸腺素-α1三聚体的制备方法,包括以下步骤:
根据Genebank公布的胸腺素-α1的DNA序列合成聚胸腺素-α1基因,序列如下:5’-ATGCACAAGAGCGACATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAAGCGGAAAAT-3’;以氨基酸片断Met-His-Lys-Cys-Asp为引物或保护基因,进行扩增合成;
将上述合成的聚胸腺素-α1基因片断通过已知的基因融合方法进行拼接、融合,获得权利要求1所述的聚胸腺素-α1重组表达产物;
将融合后的聚胸腺素-α1基因与载体DNA相连接,进行体外DNA的重组,将DNA重组体导入宿主细胞,进行DNA重组体转化;
所述融合后的基因通过重组整合到宿主细胞中;
利用已知的蛋白表达方式进行聚胸腺素-α1基因的表达,所述表达系统为已知的表达系统。
3、一种治疗免疫功能疾病的药物组合物,包括权利要求1所述的聚胸腺素-α1三聚体以及药用载体。
4、根据权利要求3所述的药物组合物,所述组合物制成冻干针剂、胶囊、片剂、膏剂、口服水剂或糖浆剂。
5、权利要求1所述的聚胸腺素-α1在制备治疗肝炎、肿瘤、细菌感染性疾病或感冒药物中的用途。
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