CN101061136A - 具有白介素－2中和能力的免疫治疗制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制剂，它可用于癌症，并阻断白介素2(IL－2)与其受体的结合。具体地讲，本发明涉及通过在佐剂Montanide ISA 51中将IL－2与脑膜炎奈瑟氏球菌的转运蛋白P64k结合而可增强IL－2的免疫原性的治疗制剂，用于诱导阻断IL－2与其受体结合的自身抗体。本发明还涉及治疗肿瘤包括乳腺癌的有效方法。另外，本发明还涉及基于IL－2的疫苗与基于特异性肿瘤抗原或肿瘤生长因子的其他癌症疫苗以及常规用于肿瘤学实践的放疗或化疗药物的治疗组合。
Description
发明领域
本发明涉及能够增强针对白介素-2(IL-2)的免疫反应并且产生自身抗体的药物制剂，所述抗体能阻断与受体的结合，并且所述制剂可用于治疗肿瘤。
现有技术的说明
免疫系统特别是T细胞能识别肿瘤抗原的能力的发现，是开发用于控制免疫系统以便治疗癌症患者的策略的根本支柱之一。
因此，为了开发回收浸润肿瘤基质的特异性T细胞(被称作肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL))或来自未治疗个体的外周血液或在使用治疗性癌症疫苗之后的个体的外周血液的特异性T细胞的方法，主要努力方向是刺激所述细胞，以便加强它们在体内的抗肿瘤效应能力。
因此，主要策略指向增强它们针对多种肿瘤相关抗原(TAA)的特异性细胞毒活性。主要治疗方法集中在白介素-2(IL-2)的体外应用，以便激活并且扩增来自携带肿瘤的个体的TIL，然后再将这些细胞重新输回到所述个体体内(Rosenberg，S.A.等(1986)Science 233，1318-1321；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6458-6462；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3515-3519)。不过，尽管证实了在体外实现了对细胞免疫反应的刺激作用，所述干预具有有限的治疗结果。由此导致了对基于使用治疗性癌症疫苗的主动特异性免疫方案的应用的治疗模式的评估，设计了包含与IL-2结合的肿瘤抗原的疫苗载体，以便有利于体内有效细胞免疫反应的诱导，不过，上述方法的结果较差(Rosenberg，S.A.，等(1998)Nat.Med.4，321-327)。
目前，主要临床策略业已转向开发基于反应性T细胞从患者获得性转移到其自身的肿瘤抗原的方式。在体外使用抗CD3单克隆抗体(mAb)和IL-2刺激并且扩增所述细胞，在回输到血流中之后，提供IL-2胃肠外用药。该方法构成了为了治疗癌症患者而设计的主要治疗干预之一，尽管治疗结果仍然是谨慎的(Dudley，M.E.，等(2002)Science 298，850-854；Rosenberg，S.A.等(2004)Proc Natl AcadSci USA.101 Suppl 2，14639-45)。
所有这些治疗策略的合理化设计都是基于将白介素-2用作抗肿瘤免疫反应的细胞激活的必要分子(US 6,060,068和US 5,830,452)。
IL-2在免疫中所起作用的背景基于在体外进行的实验。从它的发现起，IL-2就被认识到它刺激T细胞增殖的能力(因此，IL-2的同义词是T细胞生长因子)。进一步证实了T细胞增殖和功能可在体外使用抗IL-2或抗IL-2受体进行抑制，验证了这一发现(Smith，KA.Immunol Rev 51：337-357，1980)。
最近，业已通过实验证实了人类肿瘤能够通过产生具有抗肿瘤免疫性抑制能力的T细胞而减弱免疫系统的反应。所述细胞业已在动物模型和表现不同分化标记的患者中表征，尽管它们的相关性与所述实验模型不同(Bach，J.F.(2003)Nat Rev Immunol 3，189-198；Chakraborty，N.G.，等(2004)Hum Immunol 65，794-802；Markus，Y.M.y Sykes，M.(2004)J Clin Oncol 22，1136-1151)。
分化簇25(CD25)构成了IL-2受体的α链。此外，这种细胞因子的受体的结构包括β(CD122)和γ(CD132)链。它们在静息T淋巴细胞中以组成型方式表达，并且所述细胞的激活，诱导了α链的合成，高亲和力杂三聚体受体的形成和IL-2分泌。CD25在5-10％的CD4+T淋巴细胞中组成型表达，并且在低于1％的外周CD8+T淋巴细胞中表达。所述细胞是无变应性的，并且表现出体外抑制活性(Shevach，E.M.(2002)Nat Rev Immunol 2，389-400)。
最近业已证实，被动施用抗CD25mAb，在某些实验肿瘤中能诱导抗肿瘤反应，尽管其他肿瘤对这种治疗有耐受性(Onizuka，S.等(1999)Cancer Res 59，31 28-31 33)。
免疫系统诱导针对自身分子的反应的能力是有限的，特别是对诸如生长因子的可溶性分子。然而，用与载体蛋白缀合并且在佐剂中乳化的这些因子进行主动免疫，能促进针对所述分子的免疫反应的诱导(U.S.5.984.018)。针对自体或异源分子产生的特异性自身抗体，能抑制其与它们的受体的结合，阻止通过这种结合触发的增殖的机制。
根据以上结果可以将抗肿瘤反应依赖于IL-2的存在视为现有技术。因此，我们决定表征体内抗IL-2自身抗体对肿瘤演变的影响，所述抗体是通过用存在于佐剂中的与载体分子缀合的IL-2主动免疫诱导的。
令人吃惊的是，阻断IL-2与它的受体结合的自身抗体的诱导能促进肿瘤生长的减弱，即使是对通过被动施用抗CD25mAb诱导的抗肿瘤作用具有耐受性的肿瘤。另外，所述自身抗体的存在不会影响治疗对象中对癌症疫苗的免疫反应。
发明详述：
本发明涉及对治疗肿瘤有作用的治疗制剂，对于所述肿瘤来说，对象免疫系统的作用是重要的。具体地讲，本发明包括制备能够产生自身抗体的免疫治疗制剂，所述自身抗体能阻断白介素-2与它的受体的结合，并且抑制肿瘤生长。
本发明的目的是能抑制IL-2与它的受体结合的治疗制剂，可用于治疗癌症患者，其中，该制剂包括与载体蛋白结合的IL-2或它的肽；另外，它含有合适的佐剂。具体地讲，本发明的治疗制剂包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌的载体蛋白P64k，且佐剂选自氢氧化铝和MontanideISA 51。
在本发明的一种实施方案中，所述治疗制剂包括通过化学缀合与P64k缀合的IL-2。在本发明的另一种实施方案中，所述制剂包括融合蛋白形式的IL-2或它的肽与P64k。
本发明还包括能抑制IL-2与它的受体结合的治疗制剂，可用于治疗患有癌症的个体，并且，该制剂包括抗人IL-2(hIL-2)的特异性单克隆抗体。
本发明的另一个目的是治疗癌症患者的方法，其需要阻断IL-2与其受体结合，以便触发针对肿瘤的合适的免疫反应，该方法包括施用含有IL-2或抗IL-2抗体的疫苗组合物。
在本发明的另一方面，披露了基于IL-2的疫苗和基于特异性肿瘤抗原或肿瘤生长因子的其他癌症疫苗以及实际常规应用的化疗剂或放疗的治疗组合。
术语″治疗组合″表示物理组合(即混合物形式)，关于两者作为不同和单独的构成组织(例如以试剂用具形式)并当它们联合用于治疗患者时的关联。因此，药物组合是在涉及施用两种化合物的治疗方案中的有用组合，或通过物理结合，如同在治疗过程中给同一患者施用的独立剂量。
术语″癌症疫苗″表示主动免疫治疗中的有用制剂，以便在接受治疗的对象体内引起免疫反应，该免疫反应识别用于所述疫苗中的抗原，并且可以进行测量。
1.-获得免疫原性组合物。
本发明的疫苗组合物包括与载体蛋白缀合的人重组白介素-2(hIL-2r)作为活性成分，所述载体蛋白优选是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜复合物的蛋白P64k(0474313EP A2和U.S.5.286.484)。另外，该疫苗组合物包括合适的佐剂。本发明的疫苗组合物优选使用Montanide ISA 51作为佐剂。
hIL-2r和载体蛋白之间的缀合可以是通过化学缀合，或者是构建通过遗传工程技术获得的融合蛋白。
-获得包括通过化学缀合与P64k蛋白缀合的hIL-2r的疫苗组合物。
为了获得hIL-2r和P64k蛋白之间的蛋白缀合，以20∶1-5∶1(hIL-2r的摩尔数与P64k蛋白的摩尔数之比)的可变比例混合这两种成分，优选10∶1(hIL-2r的摩尔数与P64k蛋白的摩尔数之比)。将戊二醛添加到该混合物中，至最终浓度为0.02-0.1％，优选0.5％，并且在室温(RT)下温育1-5小时。最后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液进行充分透析。通过10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳验证所述缀合反应(Laemmli UK(1970)Nature 277，680-685)。
-获得包括hIL-2r和P64k蛋白之间的融合蛋白的疫苗组合物。
通过聚合酶链式反应(PCR)，使用特异性引物扩增编码IL-2的基因(447pb)。消化所得到的DNA片段，并且连接在表达载体的特定结合位点中，在该载体中克隆编码所述载体蛋白的基因，以便所得到的蛋白包括这两种分子的一个或多个拷贝。可以使用来自哺乳动物细胞和来自细菌或酵母的任何表达载体。所述载体在载体蛋白的N-末端还可包括六个组氨酸。通过以下方法验证所得到的质粒：在琼脂糖凝胶电泳中进行限制分析，使用酶Sequenace 2.0(Amersham-USB)分析DNA序列，最后，通过″Western印迹″技术，使用特异性抗hIL-2单克隆抗体，分析所述融合蛋白在大肠杆菌的任何表达菌株中的生产。为了获得所述蛋白，使用强力破碎方法破碎细胞壁，然后通过使用硫酸铵的示差沉淀方法和层析方法的组合来纯化所述蛋白。最后，在无菌条件下过滤所述蛋白并且在-20℃下保存或者冻干并且在4℃下保存待用。
-获得包括与P64k蛋白化学缀合或作为融合蛋白结合的来自hIL-2r的肽的疫苗组合物。
通过化学合成获得的来自IL-2的氨基酸序列的肽可以通过化学缀合而结合到P64k蛋白上，如U.S.5,984,018中所述。另外，来自hIL-2r的肽与P64k蛋白的融合蛋白大体上是按照前面部分所述相同方法获得的，例子可以包括来自以下区域的肽：
1)肽 N33-A50
氨基酸数目： 18
序列： NPKLTRMLTFKFYMPKKA
2)肽 T113-T133
氨基酸数目： 21
序列： TIVEFLNRWITFCQSIISTLT
-化学缀合的hIL-2r-P64k的电泳。
可以用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(Laemmli U.K.(1970)Nature 277，680-685)。每个孔添加15μg样品，并且用考马斯染料染色。
2.-由包括hIL-2r和蛋白P64k的疫苗组合物产生的效果的表征。临床前研究。
-疫苗组合物的免疫原性。
为了在动物中研究本发明疫苗制剂的免疫原性，使用了8-12周龄，体重18-20g的雌性BALB/c小鼠。在实验期间，小鼠在按照GoodPractices of Care of and Use of the Experimental Animals的标准操作程序(SOP)下建立的饲养和操作的标准条件下圈养。
可以遵循不同的免疫接种方案：
-方案A，通过肌内途径每2周施用0.1mL的4μg当量剂量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式缀合的hIL-2r的四个剂量，交替肢体的接种部位。
-方案B，通过肌内途径施用0.1mL的10μg当量剂量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式缀合的hIL-2r的四个剂量。前两个剂量是在两个肢体的独立的免疫接种部位同时施用的，并且在两周之后，在另外两个肢体上施用两个剂量。
-评估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗诱导的针对hIL-2r的抗体反应。
可检测血清中的自身抗体滴度，通过现有用于测定封闭性抗体或评估外周血液中特异性免疫反应的方法之一，测定特异性抗体或B细胞。
由疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51诱导的抗hIL-2r抗体可以通过间接ELISA(酶联免疫吸附测定)评估，使用来自免疫动物的血清，参见下文：
用50μl/孔的hIL-2r覆盖96孔平底微量滴定板(Costar，HighBinding，USA)，用碳酸盐-碳酸氢盐0.1M，pH9.6溶液制备成10μg/mL的浓度。在4℃下温育所述平板过夜，并且用200μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-Tween 20)洗涤2次。在37℃下与100μl/孔含有1％的牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA 1％)温育1小时之后，用200l/孔的PBS-Tween 20洗涤平板，然后添加在PBS-BSA 1％中不同稀释度的血清样品50μl/孔。在37℃下温育1小时之后，用PBS-Tween 20洗涤平板，并且添加50μl/孔的与碱性磷酸酶(JacksonImmunoresearch Laboratories)缀合的绵羊抗小鼠血清(它是以1/5000的比例用PBS-BSA稀释的)，并且在37℃下温育1小时。洗涤平板，并且添加50μl/孔的底物溶液，该溶液由1μg/mL的对硝基苯磷酸(Sigma)在pH9.8的二乙醇胺缓冲溶液中组成。在室温(RT)下温育平板30分钟之后，通过ELISA读数器(Organon Teknika，Austria)在405nm波长下测量反应产物的吸光度。
-评估由基于EGF的疫苗诱导的抗hEGF抗体反应
可以检测血清中的自身抗体滴度，通过现有用于测定封闭性抗体或评估外周血液中的特异性免疫反应的方法之一，测量特异性抗体或B细胞。
通过基于EGF的疫苗诱导的抗hEGF抗体可以通过间接ELISA(酶联免疫吸附测定)评估，使用来自免疫动物的血清，参见Gonzalez，G.，等(2002)Vaccine Research 5，233-244。
-在与来自用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51免疫接种的动物血清或针对hIL-2r的特异性单克隆抗体(mAb)温育之后对CTLL-2细胞系增殖的影响。
将IL-2依赖型T-细胞系CTLL-2保持在含有1U/mL的hIL-2h的RPMI-1640培养基中，使它处在连续增殖状态。CTLL-2培养是在装有25mL含有8-20％的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640和0.5×105-106细胞/mL细胞悬浮液的75cm2细胞培养瓶中进行的。所述细胞在体外扩增两天之后使用。
为了进行所述分析，从体外培养物中提取细胞，并且用RPMI-1640或PBS洗涤不少于四次。在96孔平底培养平板(Costar，High Binding，USA)中，接种5×103细胞。用来自免疫动物的血清稀释液处理这些细胞，所述动物是使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的，对IL-2的ELISA滴度为1∶10000，或使用抗IL-2特异性mAb处理细胞，并且添加1U/mL的hIL-2r。在37℃下在潮湿气氛中在含有5％CO2的培养箱中培养24小时。通过在培养的最后18-24小时用[3H]胸苷(1μCi/孔)进行脉冲而测定增殖。通过液体闪烁计数器测定胸苷掺入。所有操作都是在无菌条件下进行的。
3-hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗的抗肿瘤效果。临床前研究。
为了在动物中研究本发明疫苗制剂的抗肿瘤效果，使用了8-12周龄的体重18-20g的雌性BALB/c小鼠。可按照前面详述的方案A和B用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗对动物进行免疫接种，并且在一周之后通过皮下途径同位接种肿瘤细胞系，如乳腺癌F3II，接种量为5×104细胞/动物。将具有可触及的肿瘤的小鼠评分为阳性，并且使用测径器测量肿瘤生长，确定最大表面长度(a)和它的垂直宽度(b)，并且将肿瘤大小报道为a×b。定期检查肿瘤。
令人吃惊和出乎预料的是，本发明的作者业已发现了在携带恶性肿瘤对象体内IL-2与它的受体的结合中和，增强了针对该肿瘤的免疫反应，诱导了肿瘤尺寸的缩小。现有技术表明，这种作用会导致抑制个体免疫系统对肿瘤的反应。
作者业已发现，当对象接受本发明的疫苗组合物的主动治疗时，在循环IL-2水平显著降低时，获得了对肿瘤生长的这种作用，正如这种减轻作用在用抗IL-2单克隆抗体被动治疗下获得时。
为此，本发明产生了在治疗患有恶性肿瘤患者方面的不可否认的优点，并且提供了用IL-2进行免疫接种的方法，该方法有效，简单，并且与这些情况下使用的常规治疗相比对患者来说更容易接受和攻击性更小。
以下实施例包括说明本发明主题的疫苗组合物的免疫学效果的实验细节。
实施例：
用于本发明的疫苗组合物中的人重组IL-2(hIL-2r)可通过商业渠道获得(U.S.5.614.185)。用在该疫苗中的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白P64k是通过重组DNA技术获得的，参见EP 0474313 A2和U.S.5,286,484。
实施例1：由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗诱导的抗体反应。
为了促进针对人白介素-2的免疫原性，通过化学方法将它缀合到来自脑膜炎奈瑟氏球菌的载体蛋白P64k蛋白上。所述化学缀合可以通过戊二醛方法实现(U.S.5.984.018)。通过10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳验证缀合的效率，分别添加每一种成分的样品(hIL-2r，P64k)，与化学缀合物hIL-2r-P64k和标准分子量图谱进行比较。可以通过添加hIL-2r-P64k的泳道中的连续存在验证获得了缀合物(图1)。
为了评估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗诱导的针对hIL-2r的抗体反应，用方案A和B对BALB/c小鼠进行免疫。将来自对hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗有反应的动物的超免疫血清用作阳性对照，并且将免疫前血清用作阴性对照。它被定义为免疫动物的抗体滴度，血清的光密度大于免疫前血清的光密度的平均值加上五倍标准偏差的较大稀释度。为了确定对照动物的滴度，使用与之前相同的标准，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作为阴性对照。
诱导抗体反应达到1∶100-1∶50000的滴度。该免疫方案持续大约52天，这是必须对该方案进行改进以便在较短时间内获得相似或更好抗体滴度的原因，因此我们使用方案B并且获得了类似结果，参见图2。
实施例2：用来自使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的动物的血清处理的CTLL-2细胞系的增殖实验
通过与IL-2依赖型T-细胞系CTLL-2培养评估在用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫接种的动物体内产生的血清抗体的体外IL-2结合能力。在存在IL-2的条件下将CTLL-2细胞接种到培养平板中，让它们生长，并且添加来自动物的抗体滴度为大约1∶10000的不同的血清稀释液。观察到了血清浓度和对CTLL-2细胞系增殖的抑制作用之间的正相关(图3)。证实了来自免疫动物的血清的体外IL-2中和能力。
实施例3：用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗处理的动物的抗肿瘤实验。
按照方案B用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗对动物进行免疫。一周之后，用5×104F3II肿瘤细胞攻击动物。与用PBS-P64k/Montanide ISA 51接种的对照组相比，用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的动物的肿瘤生长动力学较缓慢(图4a)。观察到了这两组之间肿瘤大小在统计学上的显著差异。
实施例4：用抗IL-2特异性mAb处理的CTLL-2细胞系的增殖试验。
通过与IL-2依赖型T-细胞系CTLL-2一起培养评估由S4B6(ATCC#HB-8794)杂交瘤产生的针对hIL-2r的特异性抗体的体外IL-2结合能力。在存在IL-2的条件下将CTLL-2细胞接种到培养平板中，使它们生长，并且添加不同的抗体稀释液。发现了抗体浓度和对CTLL-2细胞系增殖的抑制作用之间的正相关(图5)。发现1∶100的抗体稀释度能够抑制80％以上的CTLL-2细胞系增殖，证实了所述单克隆抗体的体外IL-2中和能力。
实施例5：抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗肿瘤效果。F3II实验模型(乳腺癌)。
连续五天每天用剂量为1mg的特异性单克隆抗体(抗IL-2 mAb或抗CD25 mAb)处理小鼠。两天之后，用5×104细胞/小鼠的实验乳腺癌F3II通过皮下垂直注射而攻击小鼠。定期测量最大表面长度(a)的它的垂直宽度(b)。对照组(用PBS处理)的肿瘤尺寸比用抗IL-2mAb处理组的尺寸大(图6)。两个实验组之间的肿瘤尺寸在统计学上是有差异的。不过，抗CD25 mAb(ATCC-PC61)处理的动物的肿瘤尺寸与对照组类似。这一结果表明，IL-2中和抗体具有有效的抗肿瘤效果，即使对于其中消除CD25调控细胞没有作用的肿瘤也是如此。
实施例6：抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗肿瘤效果。EL4实验模型(淋巴瘤)。
用5×104细胞/小鼠的EL4淋巴瘤皮下攻击C57BL/6动物。在肿瘤攻击之前两天用一个剂量的1mg的抗CD25mAb(PC61)静脉内处理动物，或连续五天每天用1mg剂量的抗IL-2mAb(S4B6)处理，在肿瘤接种之前六天开始。其他组基于前面所述的类似方案同时施用抗CD25和抗IL-2mAb。
记录每一组小鼠的肿瘤生长。在肿瘤攻击之后，每周两次沿两个垂直维度测量每一只小鼠的肿瘤尺寸。EL4肿瘤的统计学差异为*p＝0.0232，**p＝0.0039，***p＜0.0001。图7显示两种单克隆抗体的组合对肿瘤生长具有强烈作用。
实施例7：诱导抗IL-2自身抗体不影响对EGF癌症疫苗的反应。
为了评估由疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51诱导的抗hEGF的抗体反应是否受先前用hIL-2r免疫(诱导自身抗体)的影响，按照方案A用制备的hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗对BALB/c动物进行免疫，并且在19天之后用制备的hEGF-P64k/Montanide ISA 51或hEGF/Montanide ISA 51疫苗免疫。在所有实验中，当用hEGF疫苗接种时，通过肌内途径施用在0.1mL体积中制备的缀合在疫苗中的4μg当量的hEGF。将对疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51有反应的动物的超免疫血清用作阳性对照，将免疫前血清用作阴性对照。将它定义为免疫动物的抗体滴度，血清的光密度大于免疫前血清的光密度的平均值加上5倍标准偏差的较大稀释度。为了确定动物对照的滴度，采用了与之前相同的标准，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作为阴性对照。发现通过用EGF/Montanide ISA 51或hEGF-P64k/Montanide ISA 51免疫诱导的抗EGF抗体的滴度不受抗hIL-2r自身抗体的诱导的影响，参见图8。
实施例8：在体内中和白介素-2恢复细胞裂解活性，在携带肿瘤的宿主的淋巴结细胞中进行评估。
在携带肿瘤的宿主体内评估了IL-2中和作用对于对标称抗原的免疫反应的影响。在标准圈养条件下维持雌性C57BL/6J小鼠(H-2b)。对所有实验来说，使用6-12周龄的小鼠。卵白蛋白(OVA)和肽：VII级OVA(Sigma，St.Louis，MO)是在这些实验中使用的模型蛋白Ag。所使用的优势肽OVA275-264(SIINFEKL)的纯度＞90％。增殖试验：用104细胞的MB16F10肿瘤或PBS通过皮下途径在C57BL/6小鼠的左胁进行攻击。定期测量肿瘤直径。三周之后，对所述小鼠进行皮下免疫接种，在第0天使用1mg的OVA与100g/小鼠的聚肌胞苷酸[poly I：C](PIC)(Sigma，St.Louis，MO)，而在随后2天只施用PIC。同时，连续五天用对hIL-2r的特异性单克隆抗体(αIL-2)或PBS处理动物。用通过荧光染料CFSE(Molecular Probes，Paisley，UK)差示标记的来自幼稚小鼠的脾细胞测定体内细胞裂解活性。将标记CFSEhigh的细胞用作靶标，并且用SIINFEKL脉冲(1μM；90分钟，37℃，5％CO2)，而标记CFSElow的细胞不进行脉冲，以便用作内部对照。对经肽脉冲的靶细胞进行充分洗涤，以便除去游离肽，然后以1∶1的比例对先前免疫的小鼠静脉内共同注射。十六小时之后，取出淋巴结和脾脏，并且通过流式细胞计测量与两种荧光强度(CFSElow和CFSEhigh)相应的总事件。计算未包被的与SIINFEKL包被的百分比之间的比例(CFSEint/CFSEhigh)，以便获得细胞毒性的数值。在体内在用OVA加上PIC免疫的C57BL/6小鼠中评估的淋巴结细胞对OVA肽的细胞裂解活性产生了最大的反应。连续5天每天通过静脉内注射施用1mg剂量的抗IL-2单克隆抗体在这些动物中不影响细胞裂解反应。用MB16F10肿瘤攻击的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，对OVA的细胞裂解活性降低。不过，体内施用具有IL-2中和能力的单克隆抗体恢复了淋巴结细胞的免疫反应(图9)。
实施例9：在体内中和白介素-2恢复细胞裂解活性，在携带肿瘤的宿主的脾细胞中评估。
在携带肿瘤的宿主体内评估了IL-2中和作用对于对标称抗原的免疫反应的影响。用OVA和PIC对C57BL/6小鼠进行免疫，并且在体内评估脾细胞对OVA肽的细胞裂解活性，获得了最大反应。连续5天每天通过静脉内注射施用1mg剂量的抗IL-2单克隆抗体不会影响所述动物中的细胞裂解反应。
用MB16F10肿瘤攻击的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，对OVA的细胞裂解活性降低。不过，体内施用具有IL-2中和能力的单克隆抗体恢复腺细胞的免疫反应(图10)。
实施例10：用制备的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的动物的血细胞计数。
为了评估用制备的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫是否会诱导血细胞数量的改变，对红细胞，白细胞和血小板进行计数，用制备的疫苗免疫过的动物(按照方案A)或者没有免疫过的动物，一直到首次免疫之后100天。参见图11，在分析组之间没有发现细胞计数的差异。
附图的简要说明：
图1-化学缀合的hIL-2r-P64k的电泳。从左到右的条带分别相应于P64k，hIL-2r，hIL-2r-P64k和分子量的标准模式。
图2-通过用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫诱导的抗hIL-2r的抗体的滴度，使用前面所披露的两种免疫方案。y轴表示抗IL-2的抗体滴度的几何平均值。x轴表示相应于用以下物质免疫的动物的组：
对照：P64k/Montanide ISA 51。
Sch A IL-2：hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案A。
Sch B IL-2：hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案B。
图3-在存在hIL-2r和来自动物血清的不同稀释液的条件下CTLL-2细胞系的增殖，所述动物是用疫苗hIL-2r-P64k/MontanideISA 51免疫接种的，并且血清滴度数量级为1∶1000-1∶50000。
图4-用疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51或P64k/MontanideISA 51(对照组)免疫并且随后用F3II肿瘤攻击的动物的肿瘤生长。y轴表示肿瘤面积，定义为由较大的直径乘以垂直选定的较小的直径。
图5-在存在hIL-2r和抗IL-2抗体的不同稀释液的条件下CTLL-2细胞系的增殖。
图6-用抗IL-2mAb，抗CD25 mAb或PBS(对照组)处理并且用F3II肿瘤细胞系攻击的动物的肿瘤生长。y轴表示肿瘤面积，定义为较大直径乘以垂直选定的较小直径。
图7-用αIL-2mAb，抗CD25mAb或PBS(对照组)处理并且随后用淋巴瘤EL4攻击的动物的肿瘤生长。y轴表示肿瘤面积，定义为较大直径乘以垂直选定的较小直径。
图8-通过用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51和hEGF-P64k/Montanide ISA 51接种诱导的对EGF的抗体滴度。y轴表示对EGF的抗体滴度的几何平均值。x轴表示用以下物质免疫的组：
hIL-2r：hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51
hEGF：hEGF/Montanide ISA 51
hIL-2r+hEGF：hIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hEGF/P64k：hIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hIL-2r+hEGF/P64k：hIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/P64k/Montanide。
图9-诱导的对白介素-2的抗体恢复细胞裂解活性，在携带肿瘤的宿主的淋巴结细胞中进行评估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC进行皮下免疫接种，并且在随后2天仅施用PIC。使用来自幼稚小鼠的脾细胞测定体内细胞裂解活性，所述细胞是用荧光染料CFSE进行差示标记的。将标记CFSEhigh的细胞用作靶标，并且用SIINFEKL脉冲，而标记CFSElow的细胞不进行脉冲，用作内部对照。然后以1∶1的比例对先前免疫过的小鼠进行共同静脉内注射。在淋巴结细胞中评估细胞裂解活性。
对照-用PBS处理的动物，αIL-2-用IL-2中和单克隆抗体处理的动物，MB16F10-与对照类似但用MB16F10攻击的动物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和单克隆抗体处理的携带MB16F10肿瘤的小鼠。
图10-诱导的对白介素-2的抗体恢复细胞裂解活性，在携带肿瘤的宿主脾细胞中进行评估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC进行皮下免疫接种，并且在随后2天仅施用PIC。使用来自幼稚小鼠的脾细胞测定体内细胞裂解活性，所述脾细胞是用荧光染料CFSE进行差示标记的。标记CFSEhigh的细胞被用作靶标，并且用SIINFEKL脉冲，而标记CFSElow的细胞不进行脉冲，用作内部对照，然后以1∶1的比例对先前免疫过的小鼠进行共同静脉内注射。在脾细胞中评估细胞裂解活性。
对照-用PBS处理的动物，αIL-2-用IL-2中和单克隆抗体处理的动物，MB16F10-与对照类似但用MB16F10攻击的动物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和单克隆抗体处理的携带MB16F10肿瘤的小鼠。
图11-用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的动物的血细胞计数(白细胞(白血球)，红细胞(红血球)和血小板)与对照(P64k/Montanide ISA 51)的比较。
Claims (17)
1.用于治疗癌症患者的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括下列至少一种：
A.-通过遗传学方法或化学缀合而与任何载体蛋白结合的IL-2或它的任意衍生物，包含合适的佐剂，
B.-抗IL-2单克隆抗体，
C.-基于特异性肿瘤抗原或生长因子的癌症疫苗，
D.-抗CD25单克隆抗体。
2.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括同时或依次施用A+C或A+D或B+C或B+D。
3.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括与载体蛋白结合的IL-2或它的任意衍生物，以及合适的佐剂。
4.如权利要求3的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括与载体蛋白结合的IL-2和合适的佐剂。
5.如权利要求4的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，其中，所用载体蛋白是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64k。
6.如权利要求5的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，其中，所述佐剂选自氢氧化铝和Montanide ISA 51。
7.如权利要求6的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，其中，所述佐剂是Montanide ISA 51。
8.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括IL-2和P64k之间的化学缀合。
9.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括IL-2与P64k的融合蛋白。
10.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括衍生自IL-2的肽与P64k的融合蛋白。
11.如权利要求1的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括抗人IL-2的特异性单克隆抗体。
12.如权利要求2的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括给对象施用与载体蛋白结合的IL-2或它的任何衍生物和佐剂，联合基于特异性肿瘤抗原或生长因子的癌症疫苗。
13.如权利要求12的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，其中，所述癌症疫苗包括EGF。
14.如权利要求2的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括给对象施用与载体蛋白结合的IL-2或它的任意衍生物和佐剂，联合抗CD25特异性单克隆抗体。
15.如权利要求13的引发针对IL-2的免疫反应的治疗制剂，包括抗CD25特异性单克隆抗体。
16.权利要求1-15的治疗制剂用于生产引发针对IL-2的免疫反应的能够抑制癌症患者的肿瘤生长的药物的用途。
17.权利要求1-15的治疗制剂用于抑制肿瘤生长的用途。
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