CN87102457A - 初级细胞的永久化 - Google Patents

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Abstract

应用电穿孔作为一种转染方法，用致癌基因DNA/致癌基因使初级细胞永久化。

Description

此申请为1986年2月28日提交的835，089号待批申请的继续部分。
本发明是关于以致癌基团DNA/致癌基因转染初级细胞，应用电穿孔技术将此DNA转移到这些细胞中以生产永久化初级细胞的一种方法。
将DNA转染到哺乳动物细胞，在基因表达和调节的研究中，作出了重要的贡献。这一技术有助于发现新的基因，而分子探针则对其并不适用。惯常引导基因进入细胞的种种方法，可分为自然的和人工的两个系统。
“自然的”转染是通过完整的（或经遗传操纵处理的）病毒感染细胞来完成的。来自病毒（DNA，RNA）的遗传信息可被整合到宿主细胞DNA中，结果导致缩主细胞的转化作用。
“人工的”转染是在试管中操作处理DNA并将其导入不同起源的完整细胞，通常用化学的或手工的方法来完成。若干技术已发展到引导DNA进入体细胞中。这些技术可分为下述五种，依靠这些不同的方法将大分子转移到受体细胞内：
1.微量注射法〔Graessmann等，Hoppe-seyler′s    Z    Physiol.Chem.，352，527-532，（1971）;Capecchi，Cell，22，470-488（1980）〕。
2.载体介导的转移
一、红细胞影〔Furusawa等，Methods    in    Cell    Biol.，14，17-80，（1976）〕。
-脂质体〔Poste等，细胞生物学方法，（Method    in    Cell    Biol.，14，33-71（1976）;Gregoriadis等Nature，224，170-172（1973）〕
-重建的仙台病毒被膜〔Loyter等，Exp.Cell    Res.，139，223-234（1983）〕。
3.借助促进剂转移
-磷酸钙〔Graham等，Virology，52，456-467，（1973）〕。
-磷酸钙/聚乙二醇-二甲亚砜（DMSO）震荡（Shock）
〔Jonak等，“Monoclonal    Antibodies    and    Functional    Cell    Lines（Progress    and    Applications），”Plerum    Press，418-422，（1984）〕。
-DEAE-葡聚糖〔Graham，Adv.Cancer    Res.，25，1-51，（1977）〕。
-聚乙二醇/蔗糖震荡〔Chu等，Gene，13，197-202（1981）〕。
4.激光微光束〔Tsukakoshi等，Applied    Physics    B.，35，2284-2289，（1984）〕。
5.电穿孔（electroporation）〔Neumann等，Embo.J.，1，841-845，（1982）;Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，（1984）〕
这些技术已用于引导DNA，RNA，蛋白质，脂质，药物，小分子以及细胞器和病毒颗粒进入体细胞。每一种技术都有其使用限制，而且某些生物学问题只有使用特定方法才得以最好的解决。
DNA介导的基因转移，通常是由各种改进的磷酸钙-DNA沉淀技术完成的。此方法需有磷酸钙-DNA-共沉淀物的形成（45分钟）和将受体细胞与共沉淀物作较长时间保温（2小时）。之后经细胞内吞的类似过程收集沉淀物〔Loyter等，Ciba    Found.，symp.，103，163-175（1982）〕。此技术需要应用具有胞吞潜力的成纤维细胞起源的特异细胞，从而限制了它的应用。
各种类型细胞都有特异的效率并借以使之得以被转染。尽管有这些区别，但各种不同类型的细胞均已成功地用于转染。这些细胞包括正常细胞如淋巴细胞，此淋巴细胞是在悬浮液中使用磷酸钙DNA共沉淀/聚乙二醇-DMSO技术被转染的〔Jonak等，Hybridoma，3，107-118（1984）〕。
先前的实验〔Jonak等，Hybridoma，上已引用〕业已表明，将由人白血病细胞分离的DNA为借助磷酸钙DNA-共沉淀/聚乙二醇-DMSO介异导的释放引入到受刺激过的初级小鼠淋巴细胞内可产生有能力在培养中连续增殖的细胞系。因此，用致癌基因DNA经这种释放技术转染正常的、刺激过的淋巴细胞，已表明是一种使小鼠淋巴细胞不会死亡并在培养中持续地保持这些细胞的新的方法学。此种新的细胞系（永久化的小鼠淋巴细胞）会以单克隆的形式生产其产物。
Potter等（引文同上）和Celis〔Biochem.J.，223，281-291，（1984）〕研究了可通过电穿孔将被克隆的人和小鼠的IgK基因引入到小鼠前-B细胞和成纤维细胞内的表达，并揭示此方法可适用于许多类型的细胞，包括那些对传统的转染方法难于奏效的细胞。
Van    Brunt〔Biotechnology，3，187-191，（1985）〕综述了在电场中融合细胞的新方法学，并指出在Technicleone公司工作的Lundak及其同事已从人癌细胞分离了myc基因，将其克隆，插入质粒，并用一高电压脉冲以质粒转染产生抗体的人淋巴球。结果得到一个至少已经稳定了8个月的细胞系。Van    Brunt的文章并不能使本领域内熟练的技术人员重复Lundak的实验，因为其中没有披露：（a）必需用多大电压的脉冲，（b）是否这样的细胞必须在转染之前经激活/或刺激过，（c）在给予脉冲前，如何使细胞和质粒靠得最近，（d）要给多少脉冲，（e）各脉冲的适当的长度（脉冲时间）和振幅，（f）细胞和致癌基因DNA的适当浓度，（g）所用的“myc”基因的性质和起源，（h）使细胞在培养中得以增殖并维持其无限增殖的组织培养条件。
本发明是关于生产永久化的初级细胞系的方法，此方法包括：
（a）提供正常的、被激活/刺激过的初级细胞;
（b）经电穿孔用致癌基因DNA/致癌基因转染初级细胞，从而产生转染了的初级细胞;和
（c）从这种转染的初级细胞中回收永久化了的初级细胞系。
在上述的（b）步骤中用于转化初级细胞的致癌基因DNA/致癌基因在通过电穿孔转染之前，可任意选择地包含于脂质体之中。
本发明还涉及通过该方法生产永久化的初级细胞系。
本发明也涉及生产生物制品的一种方法，制品的编码序列是由包含在本发明的永久化初级细胞系内的DNA组成的。该方法包括在能够生产这种生物制品的条件下培养所说的细胞系、“编码序列”包括那些用来制备本发明之永久化初级细胞系的正常的、经激活/刺激的初级细胞的、天然地存在于DNA内的编码序列以及包含在用于本发明方法的致癌基因DNA/致癌基因的编码序列。
本发明也涉及生产含有一外源功能性DNA序列的共转染的永化初级细胞系的方法，此方法包括：
（a）提供正常的、激活/刺激过的初级细胞;
（b）用致癌基团DNA/致癌基因和外来功能性DNA序列的经电穿孔共转染上述的初级细胞，从而产生共转染的初级细胞;并
（c）从此种共转染的初级细胞中回收含有外来功能性DNA序列的共转染的永久化初级细胞系。
本发明还涉及利用这一方法生产共转染的永久化的初级细胞系。
本发明也涉及一生产物制品的方法，其“密码序列”是由包含于本发明的共转染的永久化初级细胞内的DNA组成的，该方法包括在能够生产这种生物制品的条件下培养上述的细胞系。
“密码序列”包括由在本发明的方法中用于转染的致癌基因DNA/致癌基因组成的，外来功能性DNA序列的编码序列以及那些“自然存在”于为制备本发明之共转染的永久化细胞系而用作DNA受体细胞的正常的、激发/刺激过的初级细胞内的DNA编码序列。
此发明还涉及一永久化初级细胞系，条件是这种永久化作用是用主要含有致癌基因DNA转染正常初级细胞系的结果。
在前述步骤（b）中，用于转染初级细胞的致癌基因DNA和外源功能性DNA在经电穿孔转染之前，可有选择性地含于脂质体之中。
Jonak等〔Hybridoma，3，107-118（1984）〕曾报导：将人白血病细胞DNA由磷酸钙DNA-共沉淀/聚乙二醇-DMSO介导的释放引入经刺激过的小鼠淋巴细胞内，可产生能够在培养中连续增殖的细胞系。现已发现，用致癌基因DNA转染初级细胞（如淋巴细胞等免疫细胞）以影响这类细胞的永久化，取决于用于释放这样的DNA进入细胞的方法学，以及受体细胞的功能状态和用于使之永久化的致癌基因的来源。例如，磷酸钙DNA共沉淀技术，在此种技术中B淋巴细胞均与共沉淀物一同保温，并借助聚乙二醇-DMSO震荡处理（Jonak等，Hybridoma，引文同上）以促进DNA进入被用来将致癌基因DNA转染到各种初级免疫细胞（即造血细胞来源的细胞）内，以试图使这类细胞永久化。这种方法就其产生永久化细胞系的效率来说，只是偶然地获得成功。此外，磷酸钙-DNA共沉淀技术还有与受体细胞的性质有关的其它一些限制。例如，初级细胞（巨噬细胞和具有胞吞潜在能力的成纤维细胞起源的某些细胞除外）均无吞噬能力，因此摄入磷酸钙-DNA共沉淀物并不是将DNA引入这些细胞的一个非常有效的方法。同样，磷酸钙-DNA共沉淀法的另一限制是此法是复杂的而且包括使初级免疫细胞与高浓度盐溶液接触将会直接影响这些细胞的生存能力并干扰此方法的转染效率。
现已发现，电穿孔能可靠地应用于有效地转染从造血和非造血细胞起源的正常的、经激活/刺激的初级细胞，用致癌基因有效地制得永久化初级细胞系。
“初级细胞”一词，是指为从未曾预先经过组织培养或曾预培养过但未经过无限期地组织培养的活的生物体得来的任何细胞，造血组织起源的初级细胞更为适用，特别是多潜能干细胞，B-淋巴细胞，B-系细胞前体，T-淋巴细胞，T-系细胞前体，髓样干细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性白细胞，嗜曙红细胞、巨核细胞和肥大细胞。这样的细胞可用常规技术分离。
“永久化的初级细胞’一词，是指那些用本发明的方法转染后能在培养中连续增殖的初级细胞，此类细胞如未经这样的转染便不能增殖。
“正常的初级细胞”是指非永久化的初级细胞，如果这种正常初级细胞是首先经过激活/刺激的，即能够用本发明的方法使之永久化。“经激活/刺激的初级细胞”是指能够用本发明的方法产生永久化的正常初级细胞，这种经激活/刺激过的初级细胞，可通过将这些细胞暴露于刺激/激活剂中而制得。“刺激/激活剂”是指一种能刺激正常初级细胞增殖（有限的生命期限）的药剂，这样的药剂是本技术中众所周知的。经激活/刺激的初级细胞的制备方法是本领域中人所共知的。更为可取的是，此刺激/激活剂也能刺激正常的初级细胞分化，被应用于激活/刺激正常B细胞的、适用的激活/刺激剂包括抗原、分裂素和生长因子。如果需要通过本发明的永久化初级细胞系生产一特异的单克隆抗体，则要用已知的抗原作为刺激/激活剂。例如经激活/刺激的B淋巴细胞，是一种已经受到抗原攻击并已分化成产生抗体细胞的一种淋巴细胞，这种抗体对于攻击抗原的一种抗原决定因素是特异的。从而，即可用本发明的方法使这样的被激活/刺激的B淋巴细胞永久化。用于激活/刺激正常初级细胞而不是B细胞的适当的刺激/激活剂包含分裂素和生长因子。分裂素是在技术中已知的。应注意到的是，特异的分裂素可能更适合于特殊类型的正常初级细胞。例如，脂多糖（LPS）是更适用于刺激/激活正常B细胞的分裂素;伴刀豆球蛋白A是更适用于刺激/激活正常T细胞（它刺激分化和增殖）的分裂素;美国商陆分裂素是适用于刺激/激活正常B细胞或正常T细胞的分裂素（它刺激分化及增殖）;胰岛素和聚肉豆蔻酸（PMA）则为更适用于刺激/激活正常成纤维细胞的分裂素。
所采用的最适刺激/激活剂和刺激/激活正常初级细胞的最适条件，可由本领域内的熟练技术人员使用通常技术来确定。并将取决于所应用的初级细胞类型和特殊刺激/激活剂等其它因素。
“致癌基因DNA/致癌基因”一词，是指当用本发明的方法转染到正常、激活的初级细胞时，会使这些细胞永久化的任何DNA序列。此中所用的“致癌基因DNA”包括来自肿瘤细胞或肿瘤细胞系的DNA，当用本发明的方法转染到这种初级细胞内时，会使正常，经激活/刺激的初级细胞永久化。致癌基因是分离到的已知其在正常细胞转化为癌细胞中起作用的DNA序列。本文所说的“致癌基因”，包括当用本发明的方法转染到这种细胞内时，能使正常、经激活/刺激的初级细胞永久化的任何分离的DNA序列。重要的是要注意到：按本发明的方法使特殊的正常的激活的初级细胞永久化可能需要不止一种类型的致癌基因。可依照本发明的方法用于使正常、激活/刺激的初级细胞永久化的优选致癌基因包括来自初级细胞肿瘤或肿瘤的初级细胞系的致癌基因，其中癌或癌细胞系具有与被永久化的初级细胞相一致的起源。按照本发明的方法，更为适用于使正常、激活/刺激过的B细胞永久化的致癌基因是从T-24人膀胱癌细胞系分离到的Ha-ras致癌基因，此可从美国马里兰州罗克维尔市美国典型培养物保藏中心〔American    Typeculture    Collection    Rockville，Maryland，U.S.A.（ATCC）〕得到，其登记号为ATCC    HTB4.（Haras）以及P53致癌基因（P53-H7克隆，此克隆从Varda    Rotton医生处获得;对此克隆的详细叙述见Molecular    and    Cel-lular    Biology，Vol.5，NO.8，Pages    1887-1893，1985）。依照本发明的方法，更为适用于使正常的激活的/刺激的B细胞永久化的致癌基因DNA，包括得自人急性淋巴母细胞白血病细胞，即所谓REH细胞系（可从ATCC得到，其登记号为CRL8286）或EL4小鼠胸腺瘤细胞系（可从ATCC得到，其登记号为TIB39）的基因组DNA;以及来自肿瘤B细胞系或B细胞肿瘤、特别是B细胞淋巴肿瘤如美国费城儿童医院病毒室W.Henle医生建株的人Burkitt′s淋巴肿瘤细胞系（BJAB）的基因组DNA。更适合于按本发明的方法使正常、经激活/刺激的T细胞永久化的致癌基因DNA包括得自T细胞肿瘤或肿瘤T细胞系（如EL4）的基因组DNA。更适合于按本发明的方法使其他正常、经激活/刺激的初级细胞永久化的致癌基因DNA包括从初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系得到的基因组DNA，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与要进行永久化的正常初级细胞类型相一致的起源。例如，上皮细胞起源的肿瘤DNA，更适合于按本发明的方法使正常、经激活/刺激过的初级上皮细胞永久化。其他适用于制备本发明的永久化细胞系的致癌基因DNA/致癌基因，可使用本发明方法由熟炼的技术人员确定，并取决于诸如致癌基因DNA/致癌基因的来源和所用的正常、经激活的初级细胞类型等许多因素。近来文献中曾报告了许多不同的致癌基因DNA/致癌基因，某些致癌基因DNA/致癌基因可以从不同来源如ATCC得到。
“电穿孔”一词，意为使细胞暴露于高压电脉冲。从而使细胞膜更易于通过某些高分子量的大分子如DNA。电穿孔用能发射高压电脉冲的任何仪器作用于含有细胞和DNA的容器。例如，有许多可在市场买到的电融合系统，如BTX电动细胞操作器（BTX    Electro    Cell    Manipulator），比较好的有401型（美国加州圣迭戈BTX出品），技术人员可将其配备电穿孔仪器使用。再者，可用Potter等的方法，（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，1984）完成电穿孔。如果采用Potter的方法则最好用LKB＃2197电源（瑞曲LKB公司）作电脉冲电源。
“高电压”一词，是指电压在1000伏/厘米左右到约5500伏/厘米之间。最适电压可由本领域技术人员根据正常、被激活/刺激的初级细胞的性质，致癌基因DNA/致癌基因源的性质，细胞和/或DNA浓缩细胞密度及所用的电穿孔装置的性质等各种不同因素来确定。
本发明涉及生产永久化初级细胞系的方法，此方法包括：
（a）提供正常的、经激活/刺激的初级细胞;
（b）经电穿孔，用致癌基因DNA/致癌基因转染此初级细胞，从而产生转染的初级细胞;并
（c）从转染的初级细胞中回收永久化了的初级细胞系。
本发明还涉及用本发明的方法生产的永久化了的初级细胞系。
通过电穿孔，应用一般方法学将致癌基因DNA/致癌基因转染到正常的、经激活的/刺激的初级细胞内的方法如下：用常规技术分离正常的初级细胞。分离细胞后按上述方法（体内刺激）激活/刺激之，或者作为正常、被激活/刺激的初级细胞从曾在体内暴露于适当的刺激/激活剂的供体（活的生物体）内分离得到。之后将这些正常、被激活/刺激的细胞悬浮于保护培养基中，细胞浓度最好为大约5×106到约2×107细胞/毫升。
“保护”培养基是指在电穿孔期间，可维持正常、被激活/刺激的初级细胞存活力的任何培养基。可应用于本发明之方法的保护培养基的例子包括缓冲液和非离子溶液，如磷酸缓冲盐水（PBS）（pH约7）和葡萄糖（0.3摩尔）。PBS是最为适用的。如果应用PBS，优选的电压条件为1000伏/厘米。如果用葡萄糖（0.3摩尔）则以5500伏/厘米的电压更为合适。
正常的、经激活/刺激的初级细胞在保护培养基中混悬之后，将致癌基因DNA（以约1微克/毫升到约100微克/毫升为较合适）或致癌基因（10毫微克/毫升到约10微克/毫升）加入此悬浮液。加到悬浮液中的致癌基因可以游离DNA的形式，包括基因组DNA或一适当的重组DNA载体，或者可将DNA包裹在脂质体内，此脂质体用对正常的、激活/刺激的初级细胞表面的至少一种抗原决定簇是特异的抗体作包被的。“适当的重组DNA载体”，是指由重组DNA技术制备的载体，其含有一可操纵地连接于致癌基因DNA/致癌基因的表达控制序列。重组DNA载体的制备，技术上是众所周知的。“表达控制序列”，是指一种DNA序列，如启动子（启动基因）它调节致癌基因DNA/致癌基因的转录。“启动子”是指致癌基因DNA/致癌基因上游的任何区域，其允许RNA多聚酶的结合和发生转录。“可操纵地连接”的意思是指致癌基因DNA/致癌基因转录或转译地连接于适当的表达控制序列。脂质体的制备和抗体包被的脂质体的制备，在技术上是众所周知的。
含有正常的、经激活/刺激的初级细胞和致癌基因DNA/致癌基因的悬浮液在经受电穿孔作用之前，最好于约2-4℃保温5-10分钟左右。然后，对悬浮液施以1-10次、最好3-5次的高压电脉冲借以用致癌基因DNA/致癌基因转染正常的、经激活/刺激的初级细胞。在用401型BTX电动细胞操作仪时，较为适当的电脉冲长度（时间）为大约50到99微秒左右，尤以99微秒为好。401型BTX电动细胞操作仪的振幅较为适当，它能达到最大振幅。对释放到细胞/DNA悬浮液中之电脉冲的最适电压、长度、振幅和脉冲数，可由本领域内技术人员使用本发明的方法，并依据所用初级细胞的性质、致癌基因DNA/致癌基因源的性质、悬浮液中初级细胞的浓度，悬浮液中致癌基因DNA/致癌基因的浓度，所用保护培养基和所用电穿孔装置的性能等多种因素加以确定。
在电穿孔作用之后，在加入新的培养基以滋养转染的初级细胞之前，将悬浮液在大约2～4℃放置5～10分钟左右。
在电穿孔作用之后，用鉴定永久化细胞系的常规技术由含有已转染的初级细胞的悬浮液中回收本发明的永久化了的初级细胞系。例如，将细胞悬浮液分配到96孔培养板，并且每周换一次新鲜培养基或根据需要更换培养基。孔中含有细胞的克隆，显示可连续增殖（依细胞克隆数而定），例如可增殖至少6周，即含有本发明的永久化了的初级细胞系。
回收之后，可用常规技术克隆地扩增本发明之永久化初级细胞系，以产生该细胞系均质的细胞群体，该细胞系可在适当的培养基（即一种能维持该细胞系的生存力，并能使其增殖的培养基）中连续维持。
本发明也涉及一生产生物制品的方法，该制品的编码序列是由含在本发明的永久化细胞学内的DNA组成的。该方法包括于能够产生这类生物制品的条件下培养上述细胞系。如上所述，“编码序列”包括那些自然地存在于用以制备本发明的永久化初级细胞系的正常的、经激活/刺激的初级细胞的DNA内编码序列，以及用于本发明方法中的包含致癌基因DNA/致癌基因的编码序列。所有正常的初级细胞均具有生产生物制品的潜在能力，该制品的编码序列包括含在上述初级细胞中的DNA。激活/刺激此初级细胞可使它们能够产生不同的或另外的生物制品。例如，用某种有用的抗原激活/刺激正常B淋巴细胞后，这些正常的被激活/刺激的B细胞便能分化成抗体生成细胞。产生的抗体将对激活/刺激抗原的某一决定簇是特异的。用本发明的方法使这种正常的、经激活/刺激的B淋巴细胞永久化，将产生一种能为单克隆抗体的生产提供连续来源的细胞系，以及包含于该永久化初级细胞系内的致癌基因DNA/致癌基因密码序列的表达产物。同样，其他正常初级细胞的永久化能使它们连续地生产（a）一种其编码序列包括有含在初级细胞内之DNA的生物制品;例如，这样的编码序列可编码淋巴激活素，如白细胞间素-1（IL-1），白细胞间素-2（IL-2）或干扰素;或者某种生长因子，以及（b）包含于这类永久化初级细胞系内的致癌基因DNA/致癌基因编码序列的产物。用以培养能够生产预期生物制品的本发明的之永久化初级细胞系的适当培养基条件，可由本领域内的技术人员按照常规技术并依据所用初级细胞的类型及期望产生的生物制品等其它因素来确定。按照本发明的方法，由本发明的初级细胞系生产的生物制品可被该细胞系直接地分泌到培养基中，在此情况下即可从培养基中分离出这种生物制品，如果想要分离，可由本领域内的技术人员使用常规的蛋白质分离技术来完成。这种生物制品亦可能不会分泌出来，此时如想要得到这类生物制品，则可应用常规技术，从此细胞系的培养物溶解产物中分离之。
本发明还涉及生产经共转染含外源功能性DNA序列之永久化初级细胞系的方法，此方法包括：
（a）提供正常的、经激活/刺激的初级细胞;
（b）用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列，通过电穿孔共转染上述初级细胞，从而产生共转染的初级细胞;以及
（c）从此共转染的初级细胞中回收含有外源功能性DNA序列的永久化初级细胞系。
本发明也涉及用本发明的方法经共转染产生的永久化初级细胞系。
“功能性DNA序列”一词，是指从任何来源衍生的DNA的任何分离区，其在本发明之永久化初级细胞系内是作为一种基因表达单位、结构基因、启动子或一调节区而发挥功能的。“基因表达单位”是指一种结构基因和启动子及为其转录和转译所需的调节区。“启动子”是指允许RNA多聚酶结合和发生转录的结构基因上游的任何区域。“调节区”是指调节结构基因转录的DNA序列。“结构基因”是指用作合成信使RNA之模板的某多肽的编码序列。
“外源功能性DNA序列”，是指一功能性DNA序列，它并非天然地存在于用于本发明之方法的正常的、经激活/刺激的初级细胞DNA中，而且也不是导致按本发明方法使细胞永久化的致癌基因DNA/致癌基因的一部分。更优选的外源功能性DNA序列包括那些为医药学上重要的多肽例如（但并不限于）胰岛素、生长激素、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂、-1-抗胰蛋白酶、水蛭素、用于生产疫苗的抗原、淋巴激活素、生长因子、受体等产物编码的DNA序列，以及为那些能提高本发明之共转染的永久化初级细胞增殖能力的产物编码的DNA序列。
用以生产本发明之共转染的永久化初级细胞的通用方法学，大体上与用以生产本发明之永久化细胞系的方法相同，不同的只是其包括了致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列的共转染。这种共转染可同时或相继地进行。“相继地”是指可先用本发明的方法将经激活/刺激的初级细胞转染成永久化的初级细胞系，然后再用外源功能性DNA序列经电穿孔或任何其他的DNA转染技术转染之。所用外源功能性DNA的量从1微克/毫升左右到100微克/毫升较为合适。所用外源功能性DNA的最适量由本领域的技术人员使用本发明的方法，并依据于所用的外源功能性DNA的性质以及上述影响生产本发明永久化初级细胞之方法的其它因素加以确定。这种外源功能性DNA序列可以游离DNA的形式加入到悬浮液内，掺入到一适当的重组DNA载体中（它也可含有所用的致癌基因DNA/致癌基因），或者可将其包裹在携带对用于共转染的初级细胞表面抗原决定簇特异之抗体的脂质体内。用以共转染的电穿孔的优选条件，即电脉冲振幅、电压和长度（脉冲持续时间），均与上面概述的制备本发明之永久化初级细胞系的条件相同。
电穿孔作用之后，可用下述技术从悬浮液中回收本发明之共转染的永久化初级细胞：
（a）使用上述的，用于常规鉴定永久化细胞系的技术;
（b）使用鉴定包含外源功能性DNA序列之永久化细胞系的常规技术。
回收之后，可用常规技术克隆扩增本发明之共转染的永久化初级细胞系，以生产该细胞系均一群体。该细胞系可在适当的培养基（即能使该细胞系保持活存并连续增殖的培养基）中持续传代。这样的培养基可由本领域内的技术人员来选定。
本发明还涉及一生产生物制品的方法，制品的编码序列包含于含在本发明之共转染的永久化初级细胞系的DNA内;此方法包括在能够生产该生物制品的条件下培养所说的细胞系。如上所述，“编码序列”包括外源功能性DNA序列的编码序列以及天然存在于用以制备本发明之共转染的永久化初级细胞系的正常、经激活/刺激过的初级细胞的DNA中，还包括用于该细胞系之制备的致癌基因DNA/致癌基因的编码序列。
培养本发明之共转染的永久化初级细胞以使之能够产生易于生产的预期之生物制品的适当的培养条件，可由本领域内的技术人员使用常规技术尤其是依据所包括的初级细胞系的类型及所要生产的预期生物制品等因素而很容易地确定下来。依照本发明方法由共转染的永久化初级细胞系产生的生物制品，可由这样的细胞系直接分泌到培养基中，在这种情况下如需要分离产品时，即可由本领域的熟练技术人员使用常规的蛋白质分离技术将此类生物制品从培养基中分离出来;在生物制品不能被细胞系分泌出来的情况下，如想要从中分离出生物制品，即可应用常规技术从此细胞系的培养物溶解产物中得到。
因此，本发明的共转染的永久化初级细胞系提供了下述多肽的持续来源：
（a）由在本发明中应用来制备初级细胞系的、天然存在于本发明之正常的、经激活/刺激过的初级细胞内的DNA编码的多肽;
（b）由用于此发明方法的致癌基因DNA/致癌基因编码的多肽以及
（c）由包含于本发明之共转染的永久化初级细胞系内的外源功能性DNA序列编码的多肽。
现还发现，主要地由致癌基因组成的DNA能用于使正常的初级细胞永久化。因此，本发明也涉及一种永久化的初级细胞系，其条件是这种永久化作用是用主要含致癌基因的DNA转染正常的初级细胞的结果。制备此种永久化的初级细胞系的最适宜的方法是依照本发明的方法，经电穿孔作用介导转染正常的初级细胞。
实施例
下述实施例均更为充分地公开了本发明的特定实施方案。这些实施例旨在作为本发明的例证，而不能构成对本发明之范围的限制。
例1
淋巴细胞的刺激/激活
淋巴细胞的刺激/激活是用常规的技术完成的，如应用下列的通用方法学：
（a）正常人或小鼠淋巴细胞是经用所需的抗原（不同的量）以不同途径注射到动物体内而使之在体内被激活/刺激的。本发明的方法中，激活/刺激和转染两者间的时间间隔，以及注射的次数可能是不同的。从小鼠脾脏中分离得来正常的、经刺激/激活的淋巴细胞，并按〔Kennett等，Current    Topics    in    Microbiol.and    Immunol.，81，77-94（1978）〕处理。
（b）正常人或小鼠淋巴细胞用抗原或分裂素作为刺激/激活剂，于体外被刺激的/激活。用特异抗原在体外刺激/激活是参照Jonak等〔Hybridoma，3，107-118（1984）〕所叙述的改进方法。
（c）在体内已接触抗原的正常的人或小鼠淋巴细胞，再在体外的用预期的抗原/分裂素重复刺激。
例2
人淋巴细胞的永久化
作为依本发明的方法用致癌基因DNA/致癌基因生产永久化初级细胞的一个普通例证，将正常人淋巴细胞悬浮液和致癌基因DNA混合，并暴露于高压电脉冲。具体方法如下：
正常的人淋巴细胞（外周血淋巴细胞）用淋巴细胞分离剂（Iymphoprep）经离心纯化。按实施例1中所述的方法激活/刺激细胞。将这种正常的经激活/刺激的初级细胞悬浮于冰冷的磷酸盐-缓冲盐水（PBS，未加MgCl2或CaCl2）中再次离心（200×克/10分钟）。将所得片状沉淀物再悬浮于PBS缓冲液中，浓度为1-5×107个细胞/毫升。将从人肿瘤细胞系（Burkitt′s淋巴瘤，BJAB）纯化的、其起源与B-淋巴细胞细胞型相一致的基因组DNA（40-50微克/毫升）或含有功能性致癌基因的质粒DNA（P53-H7）（1～20微克/毫升）加入细胞悬浮液内，并在401型BTX电细胞操作仪的电穿孔室中于0℃保温10分钟。之后给予3-5次电脉冲（1000伏/厘米到5，500伏/厘米）（最大振幅）（宽度在99微秒内）。
电脉冲作用后将细胞和DNA在0℃放置10分钟，再加入5毫升经过调节的TY培养基（Jonak等，“Monoclonal    Antibodies    and    Functional    Cell    Lines”Plerum    Press，418-422，1984）并分到96孔的培养板中，供以新鲜培养基，每月一次或根据需要更换新鲜培养基。
在用致癌基因（插入表达载体的功能性致癌基因）P53或得自BJAB人Burkitt氏淋巴瘤细胞系的致癌基因DNA经电穿孔转染人淋巴细胞的实验中，已成功地取得了高效永久化。此成功已清楚地为业经得到的高效的连续增殖细胞数所证明。在对照实验中，同样方法处理淋巴细胞，不同的是以正常DNA代替致癌基因DNA/致癌基因，或被省略之。将用致癌基因DNA/致癌基因转染的培养物与对照组比较，表明用致癌基因DNA/致癌基因转染的细胞中呈现增殖的细胞数（以克隆数表示）高了许多。对照实验中的细胞于三周内死亡。致癌基因DNA/致癌基因转染的细胞则可持续增殖6周到几个月以上，从而证实它们的永久化。
例3
小鼠淋巴细胞的永久化
用全脾脏灌注法制备Balb/c小鼠的脾细胞（雌性，得自Charles River实验室）并用0.83%的NH4Cl在4℃处理5分钟以溶解红细胞。然后离心分离淋巴细胞，将片状沉淀物再悬浮于5毫升Dulbecco′s改进的含高葡萄糖的EAGLE′S培养基（DMEM）（见Cerottini等J.Exp.Med.，140.，703-717，1974）内，并加至一尼龙棉柱上（柱内装尼龙棉10毫升）。将此柱子在37℃保存45分钟，加入20毫升添加了5%胎牛血清（FCS）并加温到37℃的DMEM培养基经过滤而除去T细胞，（Julius等.，Eur.J.Immunol.，3∶645，1973）。用20毫升相同的培养基与尼龙棉混合，从柱子上回收b淋巴细胞。离心出此细胞，将片状沉淀（一个脾约有4×107B细胞）再悬浮于添加了5%FCS的DMEM的Iscove氏改进培养基（RPMI1640）（见Moore等，GAMA，199，519-524，1967）内。此细胞（3×107）装在有20毫升添加了5%热灭活之胎牛血清（FCS），2mM（毫克分子）谷氨酸胺，5×10-5摩尔2-巯基乙醇和庆大霉素的RPMI1640培养基的组织培养瓶中，于37℃并充以7%CO2的条件下保温。
为完成分裂素-诱发的刺激，将纯化的B淋巴细胞加20微克/毫升（20微克/毫升）的脂多糖（LPS）保温。细胞在用LPS（3（H）-胸腺嘧啶参入到DNA中以指示刺激的程度）经刺激24-48小时之后，达到了最大刺激。培养24-48小时后，用PBS缓冲液（无CaCl2或MgCl2）将淋巴细胞洗涤2次，以2×106～2×107细胞/毫升的细胞浓度再悬浮并于0℃保存。致癌基因DNA的来源是由EL4小鼠胸腺瘤细胞系（ATCC.TIB39）纯化的基因组DNA或是插入到合适表达载体内的致癌基因Ha-ras〔从T24（ATCC HTB4）分离的〕。电穿孔是经下列步骤达到的：（a）将106-107细胞/0.5毫升PBS和40微克基因组DNA或10-100毫微克致癌基因悬浮在401型BTX电动细胞操作仪的电穿孔室中，（b）给予3-5次电脉冲（最大时间长度和振幅）。电穿孔后，将细胞于0℃放置10分钟，然后用TY培养基〔见Jonak等，“Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines（Progress and Application），”Plenum Press，418-422（1984）〕。稀释到浓度为106细胞/毫升，将细胞以每孔2×105细胞的浓度加入96孔培养板中于37℃培养。将细胞每周换一次新鲜培养基。培养3-4周后，培养板各孔显现扩增了生长的细胞。这样的细胞具有未成熟细胞的形态，并在培养中生长了几个月。这些实验结果表明这种刺激在永久化中起到一个重要的作用，因为未刺激的淋巴细胞在用致癌基因DNA/致癌基因经电穿孔作用介导转染后并没有生长。
例4
电穿孔/DNA-脂质体释放
本发明的电穿孔技术，能将携带含有致癌基因/致癌基因DNA的脂质体的抗体/蛋白A的应用与电穿孔作用联合起来。
由54摩尔%的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（Avanti极性脂质）、10摩尔%的二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（Avanti）、35摩尔%胆固醇（Sigma）和用n-羟基琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶基二硫丙酸）（SPDP）（Pharmacia）改性的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（Sigma）组成的大单层脂质体囊泡是按照改进的反相蒸发技术的方法（Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75∶4194-4198，1978）制成的。将脂质溶于1毫升氯仿2毫升二异丙醚（Merck）中。按已述方法将水溶液（1毫升在缓冲盐水中含有1～2毫克业经放射标记的质粒DNA的等分式样）和有机相分开放入配有Luer栓的气封玻璃注射器中〔Machy    and    Leserman，Biophy.Biochem.Acta，730∶313-320，（1983），Machy    and    Leserman，“Liposome    Technology”（Gregoriadis，ed.）CRC    Press，Cleveland    Vol.I∶221-234，（1984）〕。注射器均连接一金属三通阀。将水相注射到有机相中，然后使混合液能迅速地从一注射器转到另一注射器内，反复通过10～20次。将此脂质-水乳化液转移到14毫升旋转蒸发管内，加热到45℃，使有机相在350-400毫米汞柱压力时除去。然后通过0.4微毫米（um）单孔聚碳酸酯过滤器（Bio-Red）过滤，根据大小而选择出逆相蒸发囊泡（REV）。（Olson等，Biochem.Biophys.Acta，557∶9-23（1979）〕。
将脂质体与蛋白A（Pharmacia）及经10摩尔SPDP/摩尔蛋白A改性的碘化蛋白A（NEN）之等分试样保温（终浓度为200微克/毫升）〔Leserman等，Nature，288∶602-604，（1980）;Machy等，J.Immunol.，129∶2098-2102，（1982）〕。脂质体的终浓度约为20毫摩尔。偶联反应是于室温下，在L-缓冲液（145毫升NaCl，10毫摩尔Hepes，pH8）中反应20小时完成的。在结合含DNA蛋白A包被的脂质体以前，依下述方法纯化之：将脂质体与在添加了10毫升MgCl2的L-缓冲液中的5微克/毫升的DNase I（Sigma）于25℃保温30分钟。然后使含有DNA的蛋白A包被的脂质体通过用L-缓冲液（pH7.45）平衡过的琼脂糖4B-CL柱。从而使未偶联的蛋白A和降解了的未被包裹的DNA从脂质体制剂中除去。通常约有5%的DNA被包裹并有5-10%的蛋白A偶合到脂质体的表面上。
这些更适用的脂质体与淋巴样细胞按下述方法一起保温：
人B-细胞（107）同40微克/毫升单克隆抗体于4℃保温1小时。然后洗去未结合的抗体并同3微克含有DNA的蛋白A包被的脂质体于4℃保温2小时。脂质与抗体预处理的细胞结合。然后，用上述方法使细胞被电穿孔。例如，当这些细胞在加脂质体之前同抗-HCA抗体保温时，至少有35%的培养孔显示有转染过的细胞。若用不相干的抗体或不加抗体，则只有8-10%的培养孔显示有转染的细胞。当细胞同抗-HCA抗体和脂质体保温但未电穿孔时，则没有细胞受到转染。此实施例的结论是，只有中靶的脂质体才能用电穿孔转染细胞。
这种研究方法的优点是，DNA（包裹到脂质体中）会特异地释放到混合细胞群体中预期类型的细胞内（即：成熟B-细胞、单核细胞）。脂质体的内含物（致癌基因DNA/致癌基因）将会通过施以电脉冲被引入细胞内。必需指出的是，并不期望或需要脂质体同靶细胞融合，但希望经施以电脉冲，使DNA通过靶细胞和脂质体间形成微孔（该微孔是电脉冲的结果）插入到细胞中。此改进方法的优点是，可使DNA特异地释放到淋巴细胞混合群体内的预期之细胞类型中。
虽然以上描述和实施例充分地说明本发明及其优选的实施方案，但不言自明的是，本发明并不限于这些特别公开的实施方案。因此，本发明包括以下权利要求范围内的所有实施方案。

Claims (52)

1、一种生产永久化初级细胞系的方法，此方法包括：
(a)提供正常的、经激活/刺激的初级细胞；
(b)经电穿孔作用用致癌基因DNA/致癌基因(包含或不包含于脂质体中)转染上述初级细胞，从而产生转染了的初级细胞；以及
(c)自上述转染的初级细胞中回收永久化的初级细胞系。
2、根据权利要求1的方法，其中致癌基因DNA是从初级细胞肿瘤或肿癌初级细胞系得来的基因组DNA，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化初级细胞类型相一致的起源。
3、根据权利要求1的方法，其中致癌基因是从一初级细胞肿瘤或肿瘤的初级细胞系得来的，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
4、根据权利要求2的方法，其中初级细胞是造血细胞源。
5、根据权利要求4的方法，其中初级细胞是多潜能干细胞、B-淋巴细胞、B-系细胞前体、T-淋巴细胞。T-系细胞前体、髓样干细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞或肥大细胞。
6、根据权利要求4的方法，其中初级细胞都是B-淋巴细胞。
7、根据权利要求5的方法，其中B一淋巴细胞是已用抗原激活/刺激过的。
8、根据权利要求5的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
9、根据权利要求6的方法，其中致癌基因DNA是从BJAB得来的基因组DNA。
10、根据权利要求6的方法，其中致癌基因DNA是从REH细胞系得来的基因组DNA。
11、根据权利要求6的方法，其中致癌基因DNA是从EL4细胞系得来的基因组DNA。
12、根据权利要求1的方法产生的永久化的初级细胞系。
13、根据权利要求12的细胞系，其中致癌基因DNA是从初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系得来的基因组DNA，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞系类型相一致的起源。
14、根据权利要求12的细胞系，其中致癌基因是从初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系得来的，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
15、根据权利要求12的细胞系，其中初级细胞是造血细胞源。
16、根据权利要求15的细胞系，其中的初级细胞是多潜能干细胞、B-淋巴细胞、B-系细胞前体、T-淋巴细胞、T-系细胞前体、髓样干细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞或肥大细胞。
17、根据权利要求16的细胞系，其中初级细胞是B-淋巴细胞。
18、根据权利要求17的细胞系，其中B一淋巴细胞是已用抗原激活/刺激过的。
19、根据权利要求16的细胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
20、根据权利要求16的细胞系，其中致癌基因DNA是来自BJAB基因组DNA。
21、根据权利要求16的细胞系，其中致癌基因DNA是从REH细胞系得来的基因组DNA。
22、根据权利要求16的细胞系，其中致癌基因DNA是从EL4细胞系得来的基因组DNA。
23、一种生产生物制品的方法，其中生物制品的编码序列包含在含于永久化的初级细胞系中的DNA内，此方法包括：
（a）提供正常的、经激活/刺激的初级细胞;
（b）经电穿孔作用用致癌基因的DNA/致癌基因（可任意选择地包含于脂质体中）转染上述初级细胞，从而产生转染的初级细胞;
（c）自这种转染的初级细胞回收永久化的初级细胞系;并且
（d）在能够生产此生物制品的条件下培养此种永久化的细胞系。
24、一种生产含有外源功能性DNA序列的共转染的永久化初级细胞系的方法，该方法包括：
（a）提供正常的、经激活/刺激过的初级细胞;
（b）用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能能性DNA序列（可任意选择地包含于脂质体中）经电穿孔共转染这种初级细胞，从而产生共转染的初级细胞;
（c）从这种共转染的初级细胞回收含有外源功能性DNA序列的永久化的初级细胞系。
25、根据权利要求24的方法，其中致癌基因DNA是来自初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系的基因组DNA，其中此肿瘤或肿瘤细胞系具有和将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
26、根据权利要求24的方法，其中致癌基因是来自初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系，其中此肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
27、根据权利要求24的方法，其中初级细胞均为造血细胞源。
28、根据权利要求27的方法，其中初级细胞是多潜能干细胞、B-淋巴细胞、B-系细胞前体、T-淋巴细胞、T-系细胞前体、髓样干细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞或肥大细胞。
29、根据权利要求28的方法，其中的初级细胞是B-淋巴细胞。
30、根据权利要求29的方法，其中的B一淋巴细胞是已用抗原激活/刺激过的。
31、根据权利要求29的方法，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
32、根据权利要求29的方法，其中致癌基因DNA是从BJAB得来的基因组DNA。
33、根据权利要求29的方法，其中致癌基因DNA是从REH细胞系得来的基因组DNA。
34、根据权利要求29的方法，其中致癌基因DNA是从EL4细胞系得来的基因组DNA。
35、用权利要求24的方法生产的共转染的永久化初级细胞系。
36、根据权利要求35的细胞系，其中致癌基因的DNA是来自初级细胞肿瘤或肿瘤初级细胞系的基因组DNA，其中此肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
37、根据权利要求35的细胞系，其中致癌基因是来自初级细胞肿瘤或肿瘤的初级细胞系，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
38、根据权利要求35的细胞系，其中初级细胞是造血细胞源。
39、根据权利要求38的细胞系，其中初级细胞为多潜能干细胞、B-淋巴细胞、B-系细胞前体、T-淋巴细胞、T-系细胞前体、髓样干细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞或肥大细胞。
40、根据权利要求39的细胞系，其中初级细胞为B-淋巴细胞。
41、根据权利要求40的细胞系，其中B-淋巴细胞是已用抗原激活/刺激过的。
42、根据权利要求40的细胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因。
43、根据权利要求40的细胞系，其中致癌基因DNA是来自BJAB的基因组DNA。
44、根据权利要求40的细胞系，其中致癌基因DNA是来自REH细胞系的基因组DNA。
45、根据权利要求40的细胞系，其中致癌基因DNA是来自EL4细胞系的基因组DNA。
46、一种生产生物制品的方法，该生物制品的编码序列包括含于含有外有源功能性DNA序列的经转染的永久化细胞系中的DNA内，该方法包括：
（a）提供正常的、经激活/刺激过的初级细胞;
（b）用致癌基因DNA/致癌基因和外源功能性DNA序列（该序列可任选地包裹于脂质体中）经电穿孔以共转染此初级细胞，从而产生共转染的初级细胞;
（c）自此共转染的初级细胞回收含有外源功能性DNA序列的共转染的永久化初级细胞系;以及
（d）在能生产所需生物制品的条件下培养这一共转染的永久化的细胞系。
47、一种永久化的初级细胞系，其条件是这种永久化作用是用主要含致癌基因的DNA转染正常初级细胞的结果。
48、根据权利要求47的细胞系，其中致癌基因是来自初级细胞肿瘤或肿瘤的初级细胞，其中这样的肿瘤或肿瘤细胞系具有与将被永久化的初级细胞类型相一致的起源。
49、根据权利要求47的细胞系，其中初级细胞是造血细胞源。
50、根据权利要求49的细胞系，其中初级细胞是多潜能干细胞、B-淋巴细胞、B-系细胞前体、T-淋巴细胞、T-系细胞前体、髓样干细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞或肥大细胞。
51、根据权利要求50的细胞系，其中初级细胞是B-淋巴细胞。
52、根据权利要求51的细胞系，其中致癌基因是Ha-ras致癌基因或P53-H7致癌基因。
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