JP3059482B2 - 大型多価免疫原 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 政府の権利 この発明が着想された研究はNIH認定RO1C43062のもと
に合衆国政府の援助を受けかつ政府はこの発明およびこ
の特許に対しかつこれに基づくある権利を有する。
に合衆国政府の援助を受けかつ政府はこの発明およびこ
の特許に対しかつこれに基づくある権利を有する。
発明の背景 この発明は免疫学に関し、かつより詳細には新規の生
体内免疫処置／または治療方法に関し、これによればＴ
細胞受容体の複合体単独かまたは他の分子と組合わせた
ものにより結束されたリガンドが約0.2μより大きい直
径を有する固相支持体上に配列され、生体内Ｔ細胞の媒
介による応答反応を誘発しかつこれを増大させることが
わかる。
体内免疫処置／または治療方法に関し、これによればＴ
細胞受容体の複合体単独かまたは他の分子と組合わせた
ものにより結束されたリガンドが約0.2μより大きい直
径を有する固相支持体上に配列され、生体内Ｔ細胞の媒
介による応答反応を誘発しかつこれを増大させることが
わかる。
読者の便宜を図るため、この発明の背景およびこの発
明を記載する上で使用される次の略語を以下のとおり定
義する。
明を記載する上で使用される次の略語を以下のとおり定
義する。
定義 クラスＩタンパク質 たとえばＨ−2KkまたはＨ−2k
等の、ネズミのMHCのＫ、ＤまたはＬ遺伝子座の生産物
（Ｈ−２タンパク質はクラスＩタンパク質と同じであ
る） ConA コンカナバリンＡ（タチナタマ
メ、カナバリアエンシフォルミスの抽出物、マイトジェ
ンレクチン） CTL 細胞溶解性Ｔリンパ球 CY シクロホスファミド DMSO ジメチルスルホキシド Ｅ エフェクター細胞 EL4 ネズミの胸腺腫 I.p. 腹腔内 I.v. 静脈内 LMI 大型多価免疫原（以前の公報で
は（偽性細胞（シュードサイト）と呼ばれていたもの） MHC 主要組織適合複合体 P815 ネズミの肥満細胞腫 PBL 末梢血リンパ球 PBS リン酸緩衝塩水 pCTL 前駆細胞溶解性Ｔリンパ球 PEL 腹腔浸出リンパ球 RDM4 ネズミのリンパ腫 S.c. 皮下 Ｔ 標的細胞 TCR Ｔ細胞受容体 TH Ｔヘルパー細胞 ヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞の活性化は、外来の
抗原に対する体液性および細胞性双方の生体内免疫応答
を誘発する上で重要な役割を果たし、ここでの外来抗原
とは細菌、寄生虫、ウイルス、形質転換された細胞また
は移植された細胞である。外来抗原を含むワクチンによ
る免疫処置は体液性の（抗体）応答を誘発する場合には
効果的であるが、細胞性免疫を活性化させる上では一般
的に効果がない。したがって、現行の処方では外来生物
による侵入に対して、免疫系防御の主要な武器を活性化
させる上で効果がない。
等の、ネズミのMHCのＫ、ＤまたはＬ遺伝子座の生産物
（Ｈ−２タンパク質はクラスＩタンパク質と同じであ
る） ConA コンカナバリンＡ（タチナタマ
メ、カナバリアエンシフォルミスの抽出物、マイトジェ
ンレクチン） CTL 細胞溶解性Ｔリンパ球 CY シクロホスファミド DMSO ジメチルスルホキシド Ｅ エフェクター細胞 EL4 ネズミの胸腺腫 I.p. 腹腔内 I.v. 静脈内 LMI 大型多価免疫原（以前の公報で
は（偽性細胞（シュードサイト）と呼ばれていたもの） MHC 主要組織適合複合体 P815 ネズミの肥満細胞腫 PBL 末梢血リンパ球 PBS リン酸緩衝塩水 pCTL 前駆細胞溶解性Ｔリンパ球 PEL 腹腔浸出リンパ球 RDM4 ネズミのリンパ腫 S.c. 皮下 Ｔ 標的細胞 TCR Ｔ細胞受容体 TH Ｔヘルパー細胞 ヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞の活性化は、外来の
抗原に対する体液性および細胞性双方の生体内免疫応答
を誘発する上で重要な役割を果たし、ここでの外来抗原
とは細菌、寄生虫、ウイルス、形質転換された細胞また
は移植された細胞である。外来抗原を含むワクチンによ
る免疫処置は体液性の（抗体）応答を誘発する場合には
効果的であるが、細胞性免疫を活性化させる上では一般
的に効果がない。したがって、現行の処方では外来生物
による侵入に対して、免疫系防御の主要な武器を活性化
させる上で効果がない。
Ｔ細胞は通常もう１つの細胞の表面上に提示された抗
原への結合の結果として活性化され、この結合および活
性化は抗原に特異的な主要組織適合複合体（MHC）−制
限Ｔ細胞受容体（TCR）により媒介される。生体外の研
究では、MHC分子単独かまたは外来抗原と合わせたもの
は人工の膜上に組込まれたとき、Ｔ細胞を活性化できる
ことが立証されてきた。（Burakoff,S.J.およびM.F.Mes
cher 1982年。リンパ球の相互作用の研究における再構
築された膜およびリポソーム。Poste,G.,Nicholson.B.,
編集によるセルサーフィス リビューに掲載。North H
olland,Elsevier.Goldstein,S.A.N.およびM.F.Mescher
1986年。細胞サイズの、支持された人工膜（偽細
胞）、クラスＩ MHCタンパク質に対する前駆細胞障害
性Ｔリンパ球の応答。J.Immunol.137:3383.）これら生
体外の研究もまた、Ｔ細胞と抗原を保持する膜との間に
可能な表面相互作用の領域が抗原の表面密度と同様に効
率的な活性化において重要であることを示唆していた
（Goldstein,S.A.N.,およびM.F.Mescher 1987年。細胞
サイズの人工膜上でのクラスＩタンパク質による細胞障
害性Ｔ細胞の活性化；抗原密度およびLyt−2/3機能.J.I
mmunol.138;2034.Herrmann,S.H.およびM.F.Mescher 19
86年。クラスＩ抗原認識における抗原の多価性および刺
激された前駆細胞溶解性リンパ球の誘発のための要件。
J.Immunol.136;2816.）。生体外の刺激は起こり得る
が、細胞障害性Ｔ細胞の応答を生体内で刺激および増大
するために、既知のＴ細胞抗原の細胞に似た形態のもの
を効果的に使用することについては知られていない。
原への結合の結果として活性化され、この結合および活
性化は抗原に特異的な主要組織適合複合体（MHC）−制
限Ｔ細胞受容体（TCR）により媒介される。生体外の研
究では、MHC分子単独かまたは外来抗原と合わせたもの
は人工の膜上に組込まれたとき、Ｔ細胞を活性化できる
ことが立証されてきた。（Burakoff,S.J.およびM.F.Mes
cher 1982年。リンパ球の相互作用の研究における再構
築された膜およびリポソーム。Poste,G.,Nicholson.B.,
編集によるセルサーフィス リビューに掲載。North H
olland,Elsevier.Goldstein,S.A.N.およびM.F.Mescher
1986年。細胞サイズの、支持された人工膜（偽細
胞）、クラスＩ MHCタンパク質に対する前駆細胞障害
性Ｔリンパ球の応答。J.Immunol.137:3383.）これら生
体外の研究もまた、Ｔ細胞と抗原を保持する膜との間に
可能な表面相互作用の領域が抗原の表面密度と同様に効
率的な活性化において重要であることを示唆していた
（Goldstein,S.A.N.,およびM.F.Mescher 1987年。細胞
サイズの人工膜上でのクラスＩタンパク質による細胞障
害性Ｔ細胞の活性化；抗原密度およびLyt−2/3機能.J.I
mmunol.138;2034.Herrmann,S.H.およびM.F.Mescher 19
86年。クラスＩ抗原認識における抗原の多価性および刺
激された前駆細胞溶解性リンパ球の誘発のための要件。
J.Immunol.136;2816.）。生体外の刺激は起こり得る
が、細胞障害性Ｔ細胞の応答を生体内で刺激および増大
するために、既知のＴ細胞抗原の細胞に似た形態のもの
を効果的に使用することについては知られていない。
ワクチンまたは治療剤として生体内で使用するための
免疫原の開発はかなり長い間にわたって強い関心が寄せ
られた課題であり、かつ数々の処方が動物のモデルおよ
び人間において試験されてきた。多くのものが体液性応
答を誘発することについては大変効果的であったが、多
くは細胞性免疫を活性化する上では効果がない。多くの
処方が今日報告されている生体内実験により立証された
PCTL活性化のための決定的な要件を満たしていない。効
果的免疫原を作り出す上での多価性の重要性はある程度
まで評価されていた。最近の事例はイスコム（iscom'
s）（免疫刺激複合体）、両親媒性の抗原およびアジュ
バント特性を有する疎水性マトリクス（QuiL Ａ）から
なる粒子、（Morein,B.1988年イスコム抗原提示システ
ム。Nature 332;287）およびリポソーム様の物理的形
態にある抗原を有するプロテオソーム（Lowell,G.H.,L.
F.Smith,R.D.SeidおよびW.D.Zollinger 1988年）とを
含んでいる。疎水性の脚部を介してプロテオソームに結
合されたペプチドは、アジュバントを伴わないでかなり
免疫原性になり得る。（J.Exp.Med.167;658.）。それら
は多価性ではあるが、それでもなお細胞に対しては小さ
く、イスコムは約0.035μの直径を有し、プロテオソー
ムは約0.1μの直径を有する。したがって、それらはマ
クロファージによるＢ細胞との相互作用の取込みを最大
にするかもしれないが、PCTLの活性化のために決定的な
大きさをかなり下回る。その上、最近処方された免疫原
は、Ｈ−２−制限CTLによる認識に含まれるクラスIMHC
タンパク質を保有していない。
免疫原の開発はかなり長い間にわたって強い関心が寄せ
られた課題であり、かつ数々の処方が動物のモデルおよ
び人間において試験されてきた。多くのものが体液性応
答を誘発することについては大変効果的であったが、多
くは細胞性免疫を活性化する上では効果がない。多くの
処方が今日報告されている生体内実験により立証された
PCTL活性化のための決定的な要件を満たしていない。効
果的免疫原を作り出す上での多価性の重要性はある程度
まで評価されていた。最近の事例はイスコム（iscom'
s）（免疫刺激複合体）、両親媒性の抗原およびアジュ
バント特性を有する疎水性マトリクス（QuiL Ａ）から
なる粒子、（Morein,B.1988年イスコム抗原提示システ
ム。Nature 332;287）およびリポソーム様の物理的形
態にある抗原を有するプロテオソーム（Lowell,G.H.,L.
F.Smith,R.D.SeidおよびW.D.Zollinger 1988年）とを
含んでいる。疎水性の脚部を介してプロテオソームに結
合されたペプチドは、アジュバントを伴わないでかなり
免疫原性になり得る。（J.Exp.Med.167;658.）。それら
は多価性ではあるが、それでもなお細胞に対しては小さ
く、イスコムは約0.035μの直径を有し、プロテオソー
ムは約0.1μの直径を有する。したがって、それらはマ
クロファージによるＢ細胞との相互作用の取込みを最大
にするかもしれないが、PCTLの活性化のために決定的な
大きさをかなり下回る。その上、最近処方された免疫原
は、Ｈ−２−制限CTLによる認識に含まれるクラスIMHC
タンパク質を保有していない。
前駆体（PCTL）およびエフェクタ細胞溶解性Ｔリンパ
球（eCTL）の抗原特異的な生体外活性化のための細胞表
面分子の研究にはかなりの研究努力が集中的になされて
きた。これに対する主な方法は、適切なアフィニティ精
製された抗原を保持するはっきりした人工膜を使用する
ことであった。細胞サイズの（＞0.2μ、たとえば５μ
の直径）のビーズ上に支持された人工膜を準備するため
の新規な方法が開発され、かつここに開示するように、
これら人工の膜が小さい免疫原の注入に起因しない生体
内の免疫原応答を作り出すことが現在発見されている。
これらの支持された膜は、我々の以前の刊行物では偽細
胞と呼ばれていたもので、大型多価免疫原（LMI）と名
付けられる。
球（eCTL）の抗原特異的な生体外活性化のための細胞表
面分子の研究にはかなりの研究努力が集中的になされて
きた。これに対する主な方法は、適切なアフィニティ精
製された抗原を保持するはっきりした人工膜を使用する
ことであった。細胞サイズの（＞0.2μ、たとえば５μ
の直径）のビーズ上に支持された人工膜を準備するため
の新規な方法が開発され、かつここに開示するように、
これら人工の膜が小さい免疫原の注入に起因しない生体
内の免疫原応答を作り出すことが現在発見されている。
これらの支持された膜は、我々の以前の刊行物では偽細
胞と呼ばれていたもので、大型多価免疫原（LMI）と名
付けられる。
発明の要約 この発明は、大型多価免疫原（LMI）［0.2μ（直径ま
たは最大直径で）より大きい物理的支持体上の安定した
配列にあるリガンド］の製造、および予防または治療目
的でそれらを生体内に導入することを特徴とする。リガ
ンドが含むものは、ｉ）抗原に特有の態様で、Ｔ細胞受
容体を含む表面受容体により結合される分子、およびi
i）非−抗原特異的な態様で細胞表面成分と相互作用し
て抗原特異的な相互作用または細胞活性化を促進する分
子である。LMIの製造は安定した表面配列を結果として
もたらす様々な方法のいずれかにより行なわれ、これら
の方法は膜内への組込みもしくは表面への吸着または共
有結合を含み、重要なパラメータはその物理的支持体の
大きさである。
たは最大直径で）より大きい物理的支持体上の安定した
配列にあるリガンド］の製造、および予防または治療目
的でそれらを生体内に導入することを特徴とする。リガ
ンドが含むものは、ｉ）抗原に特有の態様で、Ｔ細胞受
容体を含む表面受容体により結合される分子、およびi
i）非−抗原特異的な態様で細胞表面成分と相互作用し
て抗原特異的な相互作用または細胞活性化を促進する分
子である。LMIの製造は安定した表面配列を結果として
もたらす様々な方法のいずれかにより行なわれ、これら
の方法は膜内への組込みもしくは表面への吸着または共
有結合を含み、重要なパラメータはその物理的支持体の
大きさである。
生体外の結果に基づき、細胞サイズの、大型多価免疫
原（LMI）と呼ばれる抗原保有人工膜を投与することの
生体内の効果を探求するために実験が行なわれてきた。
LMI保有アロ抗原は、i.p.投与されたとき、CTL応答の形
成を刺激しない。しかしながら、それらは同種異系の腫
瘍細胞とともに投与されたときアロ抗原特異的な応答を
劇的に増大させる。同系の動物で成長する腫瘍細胞に対
する溶解性の応答を検査する場合にも同様の効果が得ら
れた。同系のマウスへのEL4、RDM4またはP815腫瘍細胞
のI.p.接種は結果として腫瘍を成長させ、かつ最終的に
マウスの死をもたらした。腫瘍細胞から分離されたプラ
ズマ膜の形でのLMI保有腫瘍抗原が注入の際に投与され
ると、強い溶解性の応答が10日ないし12日以内に進展す
る。その上、LMI治療による動物における腹膜の腫瘍重
量は、対照に比べた場合劇的に減少する（または消失す
る：＞99％の減少）。
原（LMI）と呼ばれる抗原保有人工膜を投与することの
生体内の効果を探求するために実験が行なわれてきた。
LMI保有アロ抗原は、i.p.投与されたとき、CTL応答の形
成を刺激しない。しかしながら、それらは同種異系の腫
瘍細胞とともに投与されたときアロ抗原特異的な応答を
劇的に増大させる。同系の動物で成長する腫瘍細胞に対
する溶解性の応答を検査する場合にも同様の効果が得ら
れた。同系のマウスへのEL4、RDM4またはP815腫瘍細胞
のI.p.接種は結果として腫瘍を成長させ、かつ最終的に
マウスの死をもたらした。腫瘍細胞から分離されたプラ
ズマ膜の形でのLMI保有腫瘍抗原が注入の際に投与され
ると、強い溶解性の応答が10日ないし12日以内に進展す
る。その上、LMI治療による動物における腹膜の腫瘍重
量は、対照に比べた場合劇的に減少する（または消失す
る：＞99％の減少）。
腫瘍保有宿主を治療するためにLMIとシクロホスファ
ミド（CY）が組合されて使用されるとき、独自かつ顕著
な相乗効果が得られる。したがって、この発明の一面
は、腫瘍の治療にLMIおよびCYを併せて使用することに
おいて具体化される。
ミド（CY）が組合されて使用されるとき、独自かつ顕著
な相乗効果が得られる。したがって、この発明の一面
は、腫瘍の治療にLMIおよびCYを併せて使用することに
おいて具体化される。
この発明は、細胞の応答を活性化させるために腫瘍を
有する哺乳類を治療する方法において具体化される。こ
の方法は、0.2μより大きい主要直径を有する大型粒子
上に支持された多価リガンド配列から本質的になる大型
多価免疫原の生体内投与により実行される。好ましい方
法では、大型多価免疫原は約5.0μの直径を有する。大
型多価免疫原は、はるかに大きい直径を有してもよい
が、より大きい直径により顕著な利点は知られていな
い。細胞の活性化は、抗原特異的Ｔ細胞、マクロファー
ジ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を構成し
得る。
有する哺乳類を治療する方法において具体化される。こ
の方法は、0.2μより大きい主要直径を有する大型粒子
上に支持された多価リガンド配列から本質的になる大型
多価免疫原の生体内投与により実行される。好ましい方
法では、大型多価免疫原は約5.0μの直径を有する。大
型多価免疫原は、はるかに大きい直径を有してもよい
が、より大きい直径により顕著な利点は知られていな
い。細胞の活性化は、抗原特異的Ｔ細胞、マクロファー
ジ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を構成し
得る。
この発明は、細胞の応答を活性化させかつそれにより
哺乳類における腫瘍の成長を抑止または妨げるために、
腫瘍を有することが知られていないかまたは有すると疑
われる哺乳類を治療する方法において具体化される。こ
の方法は、0.2μより大きい主要な直径を有する大型の
粒子上に支持された多価リガンドの配列から本質的にな
る大型多価免疫原の生体内投与により実行される。好ま
しい方法では、大型多価免疫原は約5.0μの直径を有す
る。細胞の活性化は抗原特異的Ｔ細胞、マクロファー
ジ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を構成し
得る。
哺乳類における腫瘍の成長を抑止または妨げるために、
腫瘍を有することが知られていないかまたは有すると疑
われる哺乳類を治療する方法において具体化される。こ
の方法は、0.2μより大きい主要な直径を有する大型の
粒子上に支持された多価リガンドの配列から本質的にな
る大型多価免疫原の生体内投与により実行される。好ま
しい方法では、大型多価免疫原は約5.0μの直径を有す
る。細胞の活性化は抗原特異的Ｔ細胞、マクロファー
ジ、単球またはナチュラルキラー細胞の活性化を構成し
得る。
個々のＴ細胞はそれらの抗原特異的受容体（TCR）の
特異性に関しては異なるが、それ以外は共通の活性化要
件を提示している。同種異系（移植）および腫瘍モデル
に関するLMIの生体内効力を示すデータが提示される。
これらの発見において示唆されることは、ウイルス、細
菌、寄生虫、移植片対宿主および自己免疫による疾患を
含む、Ｔ細胞応答を伴う他の疾患の免疫化または治療に
LMIを適用することである。すべての場合において本質
的方法は同じであり、かつ使用はLMIに組込まれる抗原
（リガンド）の選択に関してのみ異なると考えられる。
特異性に関しては異なるが、それ以外は共通の活性化要
件を提示している。同種異系（移植）および腫瘍モデル
に関するLMIの生体内効力を示すデータが提示される。
これらの発見において示唆されることは、ウイルス、細
菌、寄生虫、移植片対宿主および自己免疫による疾患を
含む、Ｔ細胞応答を伴う他の疾患の免疫化または治療に
LMIを適用することである。すべての場合において本質
的方法は同じであり、かつ使用はLMIに組込まれる抗原
（リガンド）の選択に関してのみ異なると考えられる。
哺乳類の疾患の治療または予防のいずれかのために、
上記の材料の組成物を用いて、大型多価免疫原とは異な
る物理的形態のリガンドを付加するかまたはこれを付加
せずにこの方法は実行され得る。リガンドの成分は、細
胞表面、抗原、ハプテンもしくは他の免疫原種、または
種々のリガンドの混合物に特異的な抗体から本質的に形
成され得る。ここで使用される「リガンド」という用語
は一般的な免疫化学的意味の用語であり、すなわちもう
１つの分子とともに複合体を形成し、あるいは細胞の表
面または分子上などにある特定の決定基に結合するかま
たはこれを含むいかなる分子をも意味し、そのより一般
的な例としては抗体および抗原がある（たとえばStite
s,D.P.,Stobo,J.D.およびWells,J.V.の「基本的かつ臨
床的な疫学」（BASIC ＆ CLINCAL IMMUNOLOGY）Applet
on ＆ Lange,Norwalk,CT.,1987年を参照）。
上記の材料の組成物を用いて、大型多価免疫原とは異な
る物理的形態のリガンドを付加するかまたはこれを付加
せずにこの方法は実行され得る。リガンドの成分は、細
胞表面、抗原、ハプテンもしくは他の免疫原種、または
種々のリガンドの混合物に特異的な抗体から本質的に形
成され得る。ここで使用される「リガンド」という用語
は一般的な免疫化学的意味の用語であり、すなわちもう
１つの分子とともに複合体を形成し、あるいは細胞の表
面または分子上などにある特定の決定基に結合するかま
たはこれを含むいかなる分子をも意味し、そのより一般
的な例としては抗体および抗原がある（たとえばStite
s,D.P.,Stobo,J.D.およびWells,J.V.の「基本的かつ臨
床的な疫学」（BASIC ＆ CLINCAL IMMUNOLOGY）Applet
on ＆ Lange,Norwalk,CT.,1987年を参照）。
図面の簡単な説明 第１図は生体内CTL応答がLMI表面上の抗原に特異的な
ものであることを示すデータを図示する。
ものであることを示すデータを図示する。
CD2F1のマウスは示された刺激因子をi.p.注入され
た。腫瘍の細胞およびビーズは107のビーズで使用され
た。Ｈ−2KbはEL4腫瘍細胞から精製されかつＨ−2KkはR
DM4腫瘍の細胞から精製された。注入の後10日目に、腹
膜細胞は取出され、かつ示されたエフェクタ：標的の割
合で４時間の検定で51CrラベルRDM4およびEL4標的を使
用して、細胞溶解活性のために検定された。結果はパー
センテージでの特異的なクロム解離として示される。RD
M4刺激因子（単独またはビーズで）を受けとったマウス
からの細胞はEL4標的を死滅させず、かつEL4刺激因子
（単独またはビーズで）を受けとった細胞はRDM4標的
（グラフには図示せず）を死滅させなかった。
た。腫瘍の細胞およびビーズは107のビーズで使用され
た。Ｈ−2KbはEL4腫瘍細胞から精製されかつＨ−2KkはR
DM4腫瘍の細胞から精製された。注入の後10日目に、腹
膜細胞は取出され、かつ示されたエフェクタ：標的の割
合で４時間の検定で51CrラベルRDM4およびEL4標的を使
用して、細胞溶解活性のために検定された。結果はパー
センテージでの特異的なクロム解離として示される。RD
M4刺激因子（単独またはビーズで）を受けとったマウス
からの細胞はEL4標的を死滅させず、かつEL4刺激因子
（単独またはビーズで）を受けとった細胞はRDM4標的
（グラフには図示せず）を死滅させなかった。
第２図は、生体内CTL活性化の特異的増大がLMI表面上
の抗原の密度に依存していることを示すデータを図示す
る。
の抗原の密度に依存していることを示すデータを図示す
る。
C57BL/6マウスは示された刺激因子をi.p.注入され
た。RDM4腫瘍細胞およびLMIが１動物当たり107で使用さ
れた。高密度の抗原を保持するLMIが107ビーズ当たり10
μｇのＨ−２を使用して作られかつ低密度のLMIが107当
たり３μｇを使用して作られた。Ｈ−2Kkの抗原はRDM4
細胞から精製されかつＨ−2d抗原はP815腫瘍細胞から精
製されている。注入の後10日後、腹膜細胞は取出され、
かつ51Cr−ラベルのRDM4（Ｈ−2k）およびP815（Ｈ−
2d）標的を使用して、細胞溶解活性のために検定され
る。１群当たり２匹のマウスからのPELが検定のために
プールされた。
た。RDM4腫瘍細胞およびLMIが１動物当たり107で使用さ
れた。高密度の抗原を保持するLMIが107ビーズ当たり10
μｇのＨ−２を使用して作られかつ低密度のLMIが107当
たり３μｇを使用して作られた。Ｈ−2Kkの抗原はRDM4
細胞から精製されかつＨ−2d抗原はP815腫瘍細胞から精
製されている。注入の後10日後、腹膜細胞は取出され、
かつ51Cr−ラベルのRDM4（Ｈ−2k）およびP815（Ｈ−
2d）標的を使用して、細胞溶解活性のために検定され
る。１群当たり２匹のマウスからのPELが検定のために
プールされた。
第３図はLMIの投与により腹腔腫瘍の重量が減少する
ことを示すデータを図示する。
ことを示すデータを図示する。
治療を受けたマウス（＋）は同時に腫瘍抗原（プラズ
マ膜）を保持する107のLMIを受けている。９日（EL4お
よびRDM4）または11日（P815）の後、腹膜の細胞が採取
されかつ数えられた。示された値は各グループにおける
２匹のマウスに対して得られた平均値である。治療の受
けていない（−）対照に対する治療を受けた動物の腫瘍
の重量のパーセントでの減少が示される。
マ膜）を保持する107のLMIを受けている。９日（EL4お
よびRDM4）または11日（P815）の後、腹膜の細胞が採取
されかつ数えられた。示された値は各グループにおける
２匹のマウスに対して得られた平均値である。治療の受
けていない（−）対照に対する治療を受けた動物の腫瘍
の重量のパーセントでの減少が示される。
第４図は、腫瘍の減少のためには、腫瘍の抗原（プラ
ズマ膜）が遊離したプラズマ膜の小胞としてではなくLM
I上で投与される必要があることを示すデータを示す。
ズマ膜）が遊離したプラズマ膜の小胞としてではなくLM
I上で投与される必要があることを示すデータを示す。
C57BL/6マウスは106の生きたEL4細胞をi.p.接種され
た。同時にEL4プラズマ膜を保持する107LMIまたは懸濁
液でのEL4プラズマ膜が投与された。膜はLMI上のもの
（１×プラズマ膜）に等しい量または10倍多い投与量
（10×プラズマ膜）で使用された。腹膜細胞は13日目に
採取されかつ数えられた。値は各グループの２匹のマウ
スに関して得られた平均値であり、かつその対に対して
得られた範囲が示される。
た。同時にEL4プラズマ膜を保持する107LMIまたは懸濁
液でのEL4プラズマ膜が投与された。膜はLMI上のもの
（１×プラズマ膜）に等しい量または10倍多い投与量
（10×プラズマ膜）で使用された。腹膜細胞は13日目に
採取されかつ数えられた。値は各グループの２匹のマウ
スに関して得られた平均値であり、かつその対に対して
得られた範囲が示される。
第５図は、腫瘍の成長を低減させるためのLMI投与の
３つの経路の効果を比較するデータを示す。
３つの経路の効果を比較するデータを示す。
CD2F1のマウスは105のP815細胞をi.p.接種された。同
時にP815プラズマ膜または正常なマウスの血清タンパク
質（MNS）のいずれかを有するLMIがすべての場合につい
て１匹のマウス当たり107LMIを使用して、示された経路
により投与された。腹膜細胞は接種の後11日後に採取さ
れかつ数えられた。LMIを保有する腫瘍抗原で治療され
たグループは４匹のマウスから各々構成され、かつ示さ
れた値は示された標準偏差での平均値である。対照群
（腫瘍のみおよびNMS−LMI治療による）は各々２匹のマ
ウスからなりかつ平均値が示される。腫瘍の接種または
LMIのいずれをも受けていない正常なマウスからの腹腔
のウォッシュアウト細胞の回収が６匹のマウス（底部の
バー）に関して測定され、かつその標準偏差が示され
る。
時にP815プラズマ膜または正常なマウスの血清タンパク
質（MNS）のいずれかを有するLMIがすべての場合につい
て１匹のマウス当たり107LMIを使用して、示された経路
により投与された。腹膜細胞は接種の後11日後に採取さ
れかつ数えられた。LMIを保有する腫瘍抗原で治療され
たグループは４匹のマウスから各々構成され、かつ示さ
れた値は示された標準偏差での平均値である。対照群
（腫瘍のみおよびNMS−LMI治療による）は各々２匹のマ
ウスからなりかつ平均値が示される。腫瘍の接種または
LMIのいずれをも受けていない正常なマウスからの腹腔
のウォッシュアウト細胞の回収が６匹のマウス（底部の
バー）に関して測定され、かつその標準偏差が示され
る。
第６図は、LMIで治療されたマウスからの腹膜滲出リ
ンパ球の腫瘍特異的細胞溶解活性を示すデータを示す。
ンパ球の腫瘍特異的細胞溶解活性を示すデータを示す。
LMIで治療を受けたマウスからの腹膜滲出リンパ球の
腫瘍特異的細胞溶解活性では、C57BL/6のマウスが106の
生きたEL4細胞を接種された。治療を受けたマウスは同
時にEL4膜を保有する107LMIを受けた（EL4＋LMI）。生
きた腫瘍を持たない対照マウスもまたEL4膜を保有する1
07LMIを注入された（LMIのみ）。12日後、腹膜細胞が採
取され、１時間プラスチックに付着されかつ付着しない
細胞はEL4およびRDM4標的を使用して４時間のCr解離検
定で溶解活性に関して検定された。LMIで治療されたマ
ウスは、腫瘍の重量がLMI治療により＞99％減少した第
４図に示されたものと同じであった。個々のマウスから
の細胞が検定されかつ結果が各グループの双方の動物に
関して示された。死滅はパーセンテージでの特異的解離
として示される。自然に起こる解離はEL4に関しては195
cpmでありかつ248cpmであり、全体的に解離可能なもの
はEL4に関しては2549でありかつRDM4に関しては2938で
あった。
腫瘍特異的細胞溶解活性では、C57BL/6のマウスが106の
生きたEL4細胞を接種された。治療を受けたマウスは同
時にEL4膜を保有する107LMIを受けた（EL4＋LMI）。生
きた腫瘍を持たない対照マウスもまたEL4膜を保有する1
07LMIを注入された（LMIのみ）。12日後、腹膜細胞が採
取され、１時間プラスチックに付着されかつ付着しない
細胞はEL4およびRDM4標的を使用して４時間のCr解離検
定で溶解活性に関して検定された。LMIで治療されたマ
ウスは、腫瘍の重量がLMI治療により＞99％減少した第
４図に示されたものと同じであった。個々のマウスから
の細胞が検定されかつ結果が各グループの双方の動物に
関して示された。死滅はパーセンテージでの特異的解離
として示される。自然に起こる解離はEL4に関しては195
cpmでありかつ248cpmであり、全体的に解離可能なもの
はEL4に関しては2549でありかつRDM4に関しては2938で
あった。
第７図はLMIで治療を受けたマウスからの脾臓の細胞
による腫瘍特異的CTL応答の再刺激を示すデータを示
す。
による腫瘍特異的CTL応答の再刺激を示すデータを示
す。
第7A図にグラフ化されたデータを得るために、C57BL/
6マウスは106の生きたEL4細胞をi.p.接種され、同時に1
07のLMI保有EL4抗原が投与された。12日の後、脾臓（２
匹のマウス）が取出され、プールされ、かつ放射線照射
されたEL4細胞とともにまたはその細胞なしで培養中に
置かれた。生体外での６日間の培養の後、細胞は、EL4
およびRDM4標的を用いる４時間のCr解離検定によって溶
解活性を検定された。放射線照射されたEL4とともに培
養された細胞に対する結果が示されている。刺激因子な
しで培養された細胞は、どちらの標的に対しても溶解活
性を示さなかった。
6マウスは106の生きたEL4細胞をi.p.接種され、同時に1
07のLMI保有EL4抗原が投与された。12日の後、脾臓（２
匹のマウス）が取出され、プールされ、かつ放射線照射
されたEL4細胞とともにまたはその細胞なしで培養中に
置かれた。生体外での６日間の培養の後、細胞は、EL4
およびRDM4標的を用いる４時間のCr解離検定によって溶
解活性を検定された。放射線照射されたEL4とともに培
養された細胞に対する結果が示されている。刺激因子な
しで培養された細胞は、どちらの標的に対しても溶解活
性を示さなかった。
第7B図にグラフとして示されるデータを得るために、
CD2F1マウスは106の生きたP815細胞を接種され、同時
に、何もなし（無）か、107のLMI保有P815抗原（LMI−P
815）または107のLMI保有正常マウスの血清（LMI−NM
S）を用いて治療された。７日後、脾臓が取出され（１
群につき２匹のマウス）単独かまたは放射線照射された
P815細胞とともに培養中に移された。生体外での６日間
の培養の後、P815およびRDM4標的に対する溶解活性が検
定された。P815標的に対して再刺激された細胞について
得られた結果が示されている。RDM4標的の殺生は見られ
なかった。生体外で再刺激されなかった細胞は、P815ま
たはRDM4標的とも溶解しなかった。
CD2F1マウスは106の生きたP815細胞を接種され、同時
に、何もなし（無）か、107のLMI保有P815抗原（LMI−P
815）または107のLMI保有正常マウスの血清（LMI−NM
S）を用いて治療された。７日後、脾臓が取出され（１
群につき２匹のマウス）単独かまたは放射線照射された
P815細胞とともに培養中に移された。生体外での６日間
の培養の後、P815およびRDM4標的に対する溶解活性が検
定された。P815標的に対して再刺激された細胞について
得られた結果が示されている。RDM4標的の殺生は見られ
なかった。生体外で再刺激されなかった細胞は、P815ま
たはRDM4標的とも溶解しなかった。
第８図は、LMI単独、CY単独、およびLMIとCYの併用で
治療されたマウスの生存期間をデータとして示してお
り、腫瘍接種の日から始める治療は、LMIとCYを併用し
た場合、両者の間に相乗性を示している。
治療されたマウスの生存期間をデータとして示してお
り、腫瘍接種の日から始める治療は、LMIとCYを併用し
た場合、両者の間に相乗性を示している。
第9A図は、LMI単独、CY単独、およびLMIとCYの併用で
治療されたマウスにおける腫瘍の範囲の相対的平均をデ
ータとして図示している。腫瘍の接種の日より10日の
後、マウス中に腫瘍が確立したとき、始められる治療
は、LMIとCYを併用した場合、腫瘍の治療において両者
の間に相乗性が示される。
治療されたマウスにおける腫瘍の範囲の相対的平均をデ
ータとして図示している。腫瘍の接種の日より10日の
後、マウス中に腫瘍が確立したとき、始められる治療
は、LMIとCYを併用した場合、腫瘍の治療において両者
の間に相乗性が示される。
第9B図はLMI単独、CY単独、およびLMIとCYの併用で治
療されたマウスの生存期間をデータとして図示してお
り、腫瘍の接種の日より10日の後、マウス中に腫瘍が確
立されるときに始められる治療は、LMIおよびCYを併用
した場合、腫瘍の治療において両者の間の相乗性がある
ことを示している。
療されたマウスの生存期間をデータとして図示してお
り、腫瘍の接種の日より10日の後、マウス中に腫瘍が確
立されるときに始められる治療は、LMIおよびCYを併用
した場合、腫瘍の治療において両者の間の相乗性がある
ことを示している。
好ましい具体例の記載 生体外での研究の中心となる発見は、CTLの結合およ
び膜間のシグナル発生が、CTL表面の測定できる範囲を
越えて高度に多価な相互作用を必要とするということで
ある。LMIはこれらの必須の要件を満たしており、しか
も生体外応答を刺激するための抗原保有細胞として定量
的な効果を有している。抗原保有LMIの生体内での効果
は、同種異系の応答を試験する実験において規定されて
きており、しかも免疫治療におけるLMIの潜在的な適用
は、３つのネズミ腫瘍モデル系を用いることにより評価
されてきた。
び膜間のシグナル発生が、CTL表面の測定できる範囲を
越えて高度に多価な相互作用を必要とするということで
ある。LMIはこれらの必須の要件を満たしており、しか
も生体外応答を刺激するための抗原保有細胞として定量
的な効果を有している。抗原保有LMIの生体内での効果
は、同種異系の応答を試験する実験において規定されて
きており、しかも免疫治療におけるLMIの潜在的な適用
は、３つのネズミ腫瘍モデル系を用いることにより評価
されてきた。
LMIを保有し、アフィニティ精製されたアロ抗原は、
i.p.投与された場合、CTL応答の生成を刺激しない。し
かし、LMIが投与された場合、放射線照射された同種異
系の細胞に対する生体内での応答は、大きく増大させら
れる（10ないし50倍）。この予期せずかつ劇的な増大
は、抗原特異的であり、かつLMI上のアロ抗原密度に依
存している。
i.p.投与された場合、CTL応答の生成を刺激しない。し
かし、LMIが投与された場合、放射線照射された同種異
系の細胞に対する生体内での応答は、大きく増大させら
れる（10ないし50倍）。この予期せずかつ劇的な増大
は、抗原特異的であり、かつLMI上のアロ抗原密度に依
存している。
同系の腫瘍に対するCTL応答は、腫瘍細胞から分離さ
れた、LMI保有精製プラズマ膜を用いることにより試験
されてきた。試験された腫瘍細胞は、P815（肥満細胞
腫）、EL4（胸腺腫）およびRDM4（リンパ腫）を含んで
いた。そのすべては、同系のマウスの腹膜において速や
かに増殖し、かつ２ないし４週間のうちにマウスを殺し
た。LMI保有腫瘍膜の生体内への投与は、いくつかの場
合、12日目の対照に比較して、腹腔の腫瘍重量が99％以
上と劇的に減少した。同種異系の応答の場合のように、
単独で投与された場合には、LMI保有腫瘍抗原は、CTL応
答を誘発しない。しかしながら、腫瘍を接種されかつLM
Iで治療された動物からの腹膜リンパ球は、高いレベル
で腫瘍−特異的細胞溶解活性を発現する。さらにまた、
その腫瘍重量が減少させられたか、または消失させられ
た動物からの脾臓細胞は、生体外で再刺激された場合、
強く腫瘍特異的応答を開始する。一方、治療されず、腫
瘍を保有する動物からの脾臓細胞は、応答があっても僅
かしか示さない。このように、適切な形態での腫瘍抗原
の投与が、腫瘍の増殖を劇的に減少させ得る。この効果
は、見たところ、少なくとも部分的には、腫瘍−特異的
CTLに、よりよく媒介されているように見える。
れた、LMI保有精製プラズマ膜を用いることにより試験
されてきた。試験された腫瘍細胞は、P815（肥満細胞
腫）、EL4（胸腺腫）およびRDM4（リンパ腫）を含んで
いた。そのすべては、同系のマウスの腹膜において速や
かに増殖し、かつ２ないし４週間のうちにマウスを殺し
た。LMI保有腫瘍膜の生体内への投与は、いくつかの場
合、12日目の対照に比較して、腹腔の腫瘍重量が99％以
上と劇的に減少した。同種異系の応答の場合のように、
単独で投与された場合には、LMI保有腫瘍抗原は、CTL応
答を誘発しない。しかしながら、腫瘍を接種されかつLM
Iで治療された動物からの腹膜リンパ球は、高いレベル
で腫瘍−特異的細胞溶解活性を発現する。さらにまた、
その腫瘍重量が減少させられたか、または消失させられ
た動物からの脾臓細胞は、生体外で再刺激された場合、
強く腫瘍特異的応答を開始する。一方、治療されず、腫
瘍を保有する動物からの脾臓細胞は、応答があっても僅
かしか示さない。このように、適切な形態での腫瘍抗原
の投与が、腫瘍の増殖を劇的に減少させ得る。この効果
は、見たところ、少なくとも部分的には、腫瘍−特異的
CTLに、よりよく媒介されているように見える。
これらの発見および方法の動物およびヒトのがんの免
疫治療への適用は、ただちに明らかであり、また、その
他の疾患に対する適用も、この発明の残りの部分が一般
的でありかつ腫瘍およびそれと同様のものに対して唯一
のものでないような免疫化学的背景のもとにある限り
は、当業者において明らかである。
疫治療への適用は、ただちに明らかであり、また、その
他の疾患に対する適用も、この発明の残りの部分が一般
的でありかつ腫瘍およびそれと同様のものに対して唯一
のものでないような免疫化学的背景のもとにある限り
は、当業者において明らかである。
この発明は、ウイルス、細菌、寄生虫、移植片対宿主
および自己免疫による疾患、ならびに上述した特定のク
ラスの疾患を予防または治療するために哺乳動物を処置
する方法を包含し、該方法は、細胞応答を活性化すべき
哺乳動物において、0.2ミクロン以上の主要な直径を有
する大きな粒子上に支持された多価リガンド配列から本
質的になる大型多価免疫原組成物を生体内投与すること
を備え、好ましくは、大型多価免疫原が約５ミクロンま
たはそれ以上の主要な直径を有し、必要に応じて大型多
価免疫原と異なる物理的形態のリガンドを含むことがで
き、注入可能な溶液の形態である、組成物を使用する。
したがって、本発明により、0.2ミクロン以上の主要な
直径を有する大きな粒子上に支持された多価リガンド配
列を含む、細胞活性化のための組成物が提供される。
および自己免疫による疾患、ならびに上述した特定のク
ラスの疾患を予防または治療するために哺乳動物を処置
する方法を包含し、該方法は、細胞応答を活性化すべき
哺乳動物において、0.2ミクロン以上の主要な直径を有
する大きな粒子上に支持された多価リガンド配列から本
質的になる大型多価免疫原組成物を生体内投与すること
を備え、好ましくは、大型多価免疫原が約５ミクロンま
たはそれ以上の主要な直径を有し、必要に応じて大型多
価免疫原と異なる物理的形態のリガンドを含むことがで
き、注入可能な溶液の形態である、組成物を使用する。
したがって、本発明により、0.2ミクロン以上の主要な
直径を有する大きな粒子上に支持された多価リガンド配
列を含む、細胞活性化のための組成物が提供される。
材料および方法 MHCクラスＩおよびクラスII抗原をアフィニティクロ
マトグラフィにより精製した。デオキシコール酸緩衝液
中のタンパク質をスフェリソルブ（Spherisorb）ODS1
（５ミクロン）ビーズ（Phase Sep,Norwalk,CT）およ
び添加された脂質の懸濁液に混合した。使用された成分
の典型的な比率は、Ｈ−２タンパク質６μｇ、脂質5nmo
le、ビーズ107であった。その後、懸濁液は、デオキシ
コール酸を除去するために、48時間、透析された。この
期間の最終時点において、すべてのタンパク質および脂
質はビーズに結合された。そしてタンパク質の約50％が
ビーズの表面に露出していた。（Goldstein,S.A.N. お
よび M.F.Mescher.1986.細胞サイズの支持された人工
膜（偽細胞）：前駆細胞障害性Ｔリンパ球のクラスIMHC
タンパク質への応答。J.Immunol.137.3383.）透析の
後、ビーズは、適当な緩衝液中での数回の洗浄、低速遠
心分離によるペレット化によって、使用のため調製され
る。
マトグラフィにより精製した。デオキシコール酸緩衝液
中のタンパク質をスフェリソルブ（Spherisorb）ODS1
（５ミクロン）ビーズ（Phase Sep,Norwalk,CT）およ
び添加された脂質の懸濁液に混合した。使用された成分
の典型的な比率は、Ｈ−２タンパク質６μｇ、脂質5nmo
le、ビーズ107であった。その後、懸濁液は、デオキシ
コール酸を除去するために、48時間、透析された。この
期間の最終時点において、すべてのタンパク質および脂
質はビーズに結合された。そしてタンパク質の約50％が
ビーズの表面に露出していた。（Goldstein,S.A.N. お
よび M.F.Mescher.1986.細胞サイズの支持された人工
膜（偽細胞）：前駆細胞障害性Ｔリンパ球のクラスIMHC
タンパク質への応答。J.Immunol.137.3383.）透析の
後、ビーズは、適当な緩衝液中での数回の洗浄、低速遠
心分離によるペレット化によって、使用のため調製され
る。
CTL表面の構成成分に特異的な抗体は、希釈工程によ
りビーズ上に組込まれた。スフェリゾルブODS1（５ミク
ロン）ビーズ（Phase Sep,Norwalk,CT）を、ジメチル
スルホキシド（典型的には、ジメチルスルホキシド0.02
ml中に乾燥ビーズ1.5mg）中に懸濁した。次に、ジメチ
ルスルホキシドの大量希釈となった条件のもとで、この
懸濁物を抗体の溶液に添加した。その後、タンパク質ビ
ーズの懸濁液を１時間、４段階で攪拌し、次にビーズを
採集した後、緩衝液によって３回洗浄した。
りビーズ上に組込まれた。スフェリゾルブODS1（５ミク
ロン）ビーズ（Phase Sep,Norwalk,CT）を、ジメチル
スルホキシド（典型的には、ジメチルスルホキシド0.02
ml中に乾燥ビーズ1.5mg）中に懸濁した。次に、ジメチ
ルスルホキシドの大量希釈となった条件のもとで、この
懸濁物を抗体の溶液に添加した。その後、タンパク質ビ
ーズの懸濁液を１時間、４段階で攪拌し、次にビーズを
採集した後、緩衝液によって３回洗浄した。
腫瘍細胞から分離されたプラズマ膜は、腫瘍に特異的
な抗原を保有していた。分離されたプラズマ膜を上述し
たと同様の方法によって、スフェリゾルブODS1ビーズ上
に被覆した。ジメチルスルホキシド中に懸濁されたビー
ズは、硫酸塩緩衝塩水中の腫瘍細胞プラズマ膜の懸濁液
に添加され、４℃で１時間インキュベートされた。そし
て、ビーズは結合しなかった膜の小片を除去するため
に、低速遠心分離によって２回洗浄された。
な抗原を保有していた。分離されたプラズマ膜を上述し
たと同様の方法によって、スフェリゾルブODS1ビーズ上
に被覆した。ジメチルスルホキシド中に懸濁されたビー
ズは、硫酸塩緩衝塩水中の腫瘍細胞プラズマ膜の懸濁液
に添加され、４℃で１時間インキュベートされた。そし
て、ビーズは結合しなかった膜の小片を除去するため
に、低速遠心分離によって２回洗浄された。
生体外において、CTL活性を２つの方法のうち１つに
よって評価した。まず最初に、培養中のマウス脾臓細胞
による細胞溶解応答の誘導について測定した。この方法
の詳細は公表されている。（Burakoff,S.J. および
M.F.Mescher 1982.リンパ球相互作用の研究における再
構築された膜およびリポソーム。Poste,G.,Nicholson,
B.,編集によるセル サーフィス レビュー（Cell Sur
face Reviews.）North Holland,Elsevier.Goldstein,
S.A.N. および M.F.Mescher 1986. 細胞サイズの支
持された人工膜（偽細胞）：前駆細胞障害性Ｔリンパ球
のクラスIMHCタンパク質への応答。J.Immunol. 137,33
83.）第２に、クローン化されたエフェクタCTL活性化を
刺激によって培養中に放出されるセリンエステラーゼ活
性の測定により確定した。（Pasternak,M.,C.R.Verret,
M.A.Liu および H.N.Eisen 1986. 細胞溶解性Ｔリ
ンパ球におけるセリンエステラーゼ。Nature 322,74
0.） C57BL/6および（CBA×DBA/2）F1（CD2F1）マウスをジ
ャクソン研究室、Bar Harbor、MAより購入した。Ｈ−2
Kk、Ｈ−2KbおよびＫ−2dクラスＩネズミMHC抗原を上述
したようにして精製した。（Mescher,M.F.,K.C.Stallcu
p,C.P.Sullivan,A.P.Turkewitz および S.H.Herrmann
1983. モノクロナル抗体アフェニティクロマトグラ
フィによるネズミMHC抗原の精製。Langone,J.J.,Van V
unakis,H.,編集による。酵素学の方法。New York:Acad
emic Press.92:86.）抗原を上述した透析方法を用い
て、５ミクロンビーズ上に組込んだ。得られたLMIをリ
ン酸塩緩衝塩水中に懸濁し、107ビーズ／マウスで、単
独または107の同種異系の腫瘍細胞とともにマウスへi.
p.注入した。使用した腫瘍の細胞系は、AKRマウス由来
のRDM4（Ｈ−2k）リンパ腫C57BL/6由来のEL−４（Ｈ−2
b）胸腺腫であった。注入後、10日目のマウスを殺し、
腹膜の細胞を採取して洗浄した後、数えた。いくつかの
場合においては、樹脂皿への付着の１サイクルで、付着
細胞を取出した。腹膜細胞群の細胞溶解活性は、いくつ
かの異なるエフェクタ（Ｅ）対標的（Ｄ）の比率で、標
準的な４時間クロム解離検定において、Cr51ラベル標的
細胞を使用して、同種異系の腫瘍細胞の標的を殺生する
能力を測定することによって検定した。結果は、それぞ
れのE:T比率に対する特異的な溶解の100分率または溶解
ユニット数として表している。１溶解ユニットは、４時
間の検定において、標的細胞の50％を溶解するために必
要なエフェクタ（腹膜の）細胞の数として定義してい
る。
よって評価した。まず最初に、培養中のマウス脾臓細胞
による細胞溶解応答の誘導について測定した。この方法
の詳細は公表されている。（Burakoff,S.J. および
M.F.Mescher 1982.リンパ球相互作用の研究における再
構築された膜およびリポソーム。Poste,G.,Nicholson,
B.,編集によるセル サーフィス レビュー（Cell Sur
face Reviews.）North Holland,Elsevier.Goldstein,
S.A.N. および M.F.Mescher 1986. 細胞サイズの支
持された人工膜（偽細胞）：前駆細胞障害性Ｔリンパ球
のクラスIMHCタンパク質への応答。J.Immunol. 137,33
83.）第２に、クローン化されたエフェクタCTL活性化を
刺激によって培養中に放出されるセリンエステラーゼ活
性の測定により確定した。（Pasternak,M.,C.R.Verret,
M.A.Liu および H.N.Eisen 1986. 細胞溶解性Ｔリ
ンパ球におけるセリンエステラーゼ。Nature 322,74
0.） C57BL/6および（CBA×DBA/2）F1（CD2F1）マウスをジ
ャクソン研究室、Bar Harbor、MAより購入した。Ｈ−2
Kk、Ｈ−2KbおよびＫ−2dクラスＩネズミMHC抗原を上述
したようにして精製した。（Mescher,M.F.,K.C.Stallcu
p,C.P.Sullivan,A.P.Turkewitz および S.H.Herrmann
1983. モノクロナル抗体アフェニティクロマトグラ
フィによるネズミMHC抗原の精製。Langone,J.J.,Van V
unakis,H.,編集による。酵素学の方法。New York:Acad
emic Press.92:86.）抗原を上述した透析方法を用い
て、５ミクロンビーズ上に組込んだ。得られたLMIをリ
ン酸塩緩衝塩水中に懸濁し、107ビーズ／マウスで、単
独または107の同種異系の腫瘍細胞とともにマウスへi.
p.注入した。使用した腫瘍の細胞系は、AKRマウス由来
のRDM4（Ｈ−2k）リンパ腫C57BL/6由来のEL−４（Ｈ−2
b）胸腺腫であった。注入後、10日目のマウスを殺し、
腹膜の細胞を採取して洗浄した後、数えた。いくつかの
場合においては、樹脂皿への付着の１サイクルで、付着
細胞を取出した。腹膜細胞群の細胞溶解活性は、いくつ
かの異なるエフェクタ（Ｅ）対標的（Ｄ）の比率で、標
準的な４時間クロム解離検定において、Cr51ラベル標的
細胞を使用して、同種異系の腫瘍細胞の標的を殺生する
能力を測定することによって検定した。結果は、それぞ
れのE:T比率に対する特異的な溶解の100分率または溶解
ユニット数として表している。１溶解ユニットは、４時
間の検定において、標的細胞の50％を溶解するために必
要なエフェクタ（腹膜の）細胞の数として定義してい
る。
結果および考察 ２つのマウスモデルを使用した生体内実験の結果は、
LMIが細胞性の応答を誘導することができ、かつ腫瘍の
増殖を減少させることができることを示してきた。決定
的な発見についてここにまとめて議論し、データの詳細
および対照実験について次の章で述べる。
LMIが細胞性の応答を誘導することができ、かつ腫瘍の
増殖を減少させることができることを示してきた。決定
的な発見についてここにまとめて議論し、データの詳細
および対照実験について次の章で述べる。
使用された最初のモデルは、同種異系のCTL誘導のも
ので、そのモデルにおいて、外来細胞上のクラスIMHC抗
原に特異的なCTLは活性化される。動物への同種異系腫
瘍の誘導は、特異的なCTL応答の誘導と腫瘍の排除をも
たらす。生体内でこの応答を誘導するため、リポソーム
上の抗原を用いる我々の研究室での以前の試みは、体液
性の（抗体）応答の形成をもたらしたが、この形の抗原
が生体外でCTL応答を誘導することができる事実にもか
かわらず、細胞性免疫の誘導のための証拠は何も得られ
なかった。リポソームは粒子状でありかつ多価性の形態
の抗原を提供しているが、それは小さく、0.1ミクロン
以下の直径を有している。
ので、そのモデルにおいて、外来細胞上のクラスIMHC抗
原に特異的なCTLは活性化される。動物への同種異系腫
瘍の誘導は、特異的なCTL応答の誘導と腫瘍の排除をも
たらす。生体内でこの応答を誘導するため、リポソーム
上の抗原を用いる我々の研究室での以前の試みは、体液
性の（抗体）応答の形成をもたらしたが、この形の抗原
が生体外でCTL応答を誘導することができる事実にもか
かわらず、細胞性免疫の誘導のための証拠は何も得られ
なかった。リポソームは粒子状でありかつ多価性の形態
の抗原を提供しているが、それは小さく、0.1ミクロン
以下の直径を有している。
LMI上のMHC抗原の生体内投与は生きた腫瘍細胞ととも
に投与されるとき、同種異系のCTL応答の劇的な増大を
もたらす。
に投与されるとき、同種異系のCTL応答の劇的な増大を
もたらす。
LMI上のアロ抗原は、生体内において、アロ抗原保有
腫瘍細胞に対するCTL応答の活性化を特異的に増大させ
る。腫瘍細胞および／またはLMIは、CD2F1マウス中にi.
p.注入された。細胞およびLMIは、動物１個体当たり107
で用いた。LMIは、ビーズ107個当たりＨ−2Kk10μｇを
使用して調製した。注入してから10日間の後、腹腔細胞
を取出し、３つのE:T比率において、クロムでラベルさ
れたRDM4およびEL4標的細胞を使用することによって、
細胞溶解活性を検定した。細胞溶解活性は、方法の項で
記載したと同様に算出された溶解ユニットとして示して
いる。
腫瘍細胞に対するCTL応答の活性化を特異的に増大させ
る。腫瘍細胞および／またはLMIは、CD2F1マウス中にi.
p.注入された。細胞およびLMIは、動物１個体当たり107
で用いた。LMIは、ビーズ107個当たりＨ−2Kk10μｇを
使用して調製した。注入してから10日間の後、腹腔細胞
を取出し、３つのE:T比率において、クロムでラベルさ
れたRDM4およびEL4標的細胞を使用することによって、
細胞溶解活性を検定した。細胞溶解活性は、方法の項で
記載したと同様に算出された溶解ユニットとして示して
いる。
表１に示されるように、RDM4（Ｈ−2k）細胞は、６溶
解ユニットの応答を刺激した。Ｈ−2Kkを保有するLMI
は、単独で投与された場合、何も応答を刺激しなかった
が、腫瘍細胞と一緒に投与された場合、応答は625溶解
ユニットまで約100倍に増大された。この増大された応
答は特異性を維持しており、エフェクタ細胞はＨ−2k抗
原を保有する標的を効果的に殺す一方、異なる抗原を保
有するEL−４（Ｈ−2b）標的に対してはわずかな殺生の
活性しか有さなかった。
解ユニットの応答を刺激した。Ｈ−2Kkを保有するLMI
は、単独で投与された場合、何も応答を刺激しなかった
が、腫瘍細胞と一緒に投与された場合、応答は625溶解
ユニットまで約100倍に増大された。この増大された応
答は特異性を維持しており、エフェクタ細胞はＨ−2k抗
原を保有する標的を効果的に殺す一方、異なる抗原を保
有するEL−４（Ｈ−2b）標的に対してはわずかな殺生の
活性しか有さなかった。
さらなる実験は、LMI治療によって、20ないし100倍の
増大を一貫してもたらし、さらに効果の抗原特異性が確
かめられた（第１図）。増大の倍率は、LMI上の抗原の
表面密度に依存している（第２図）。この増大は、抗原
を保有する粒子の大きさにも依存している一方、リポソ
ーム（直径0.2μ＞）上に同じ精製された抗原を付着し
て注入しても応答を増大させなかった。
増大を一貫してもたらし、さらに効果の抗原特異性が確
かめられた（第１図）。増大の倍率は、LMI上の抗原の
表面密度に依存している（第２図）。この増大は、抗原
を保有する粒子の大きさにも依存している一方、リポソ
ーム（直径0.2μ＞）上に同じ精製された抗原を付着し
て注入しても応答を増大させなかった。
LMIによる同種異系の細胞溶解活性の誘導の増大は、
防御性のCTL応答を増大させ、その結果、ウイルスの感
染およびがんを含む種々の疾患の治療を提供するための
LMI使用の可能性を示している。適切な抗原を運ぶLMIに
よる弱い細胞溶解性応答の増大は、病気を引起こすよう
なウイルスの感染またはがん性の細胞を効果的に排除す
ることができるCTL群の生産をもたらすことができた。
防御性のCTL応答を増大させ、その結果、ウイルスの感
染およびがんを含む種々の疾患の治療を提供するための
LMI使用の可能性を示している。適切な抗原を運ぶLMIに
よる弱い細胞溶解性応答の増大は、病気を引起こすよう
なウイルスの感染またはがん性の細胞を効果的に排除す
ることができるCTL群の生産をもたらすことができた。
このことをテストするために、３つの異なるネズミの
腫瘍モデルが試験された。RDM4、P815およびEL4腫瘍細
胞から分離されたプラズマ膜の小片を用いてビーズをコ
ーティングすることによりLMIが調製された。RDM4はAKR
マウスに由来するリンパ腫であり、T815は、DBA2マウス
に由来する肥満細胞腫であり、EL4はC57BL/6に由来する
胸腺腫である。腫瘍は、同系のマウス（すなわち起源と
なる血統のマウス）中にi.p.注入された場合、急速に増
殖し、かつ10ないし20日間の間にマウスを殺す。プラズ
マ膜は、腫瘍細胞から精製されて、ジメチルスルホキシ
ドからの希釈を含む方法を用いることによって、LMI上
に組込まれた膜小片とともに抗原として用いられた。３
つの腫瘍のすべてに対して、適切な抗原保有LMIの投与
は、接種の後、９日間で、腫瘍細胞数の劇的な減少をも
たらした（第３図）。腫瘍の重量におけるこの劇的な減
少は、多くの実験において再現性よく認められ、かつ多
くの場合、LMIで治療された動物から回収された細胞の
数は、腫瘍を接種していない対照の動物から回収された
細胞の数とほとんど変わらなかった。すなわち、LMI治
療は、完全に腫瘍を排除したと考えられる。
腫瘍モデルが試験された。RDM4、P815およびEL4腫瘍細
胞から分離されたプラズマ膜の小片を用いてビーズをコ
ーティングすることによりLMIが調製された。RDM4はAKR
マウスに由来するリンパ腫であり、T815は、DBA2マウス
に由来する肥満細胞腫であり、EL4はC57BL/6に由来する
胸腺腫である。腫瘍は、同系のマウス（すなわち起源と
なる血統のマウス）中にi.p.注入された場合、急速に増
殖し、かつ10ないし20日間の間にマウスを殺す。プラズ
マ膜は、腫瘍細胞から精製されて、ジメチルスルホキシ
ドからの希釈を含む方法を用いることによって、LMI上
に組込まれた膜小片とともに抗原として用いられた。３
つの腫瘍のすべてに対して、適切な抗原保有LMIの投与
は、接種の後、９日間で、腫瘍細胞数の劇的な減少をも
たらした（第３図）。腫瘍の重量におけるこの劇的な減
少は、多くの実験において再現性よく認められ、かつ多
くの場合、LMIで治療された動物から回収された細胞の
数は、腫瘍を接種していない対照の動物から回収された
細胞の数とほとんど変わらなかった。すなわち、LMI治
療は、完全に腫瘍を排除したと考えられる。
腫瘍重量の減少は、主に抗原保有粒子の物理的大きさ
に依存している。0.2μ以下の直径を有する分離された
プラズマ膜小片の投与は、腫瘍の増殖に対して顕著な効
果を示さなかった一方、LMI上に組込まれた同じ小片
は、腫瘍の増殖を効果的に減少（または消失）させた
（第４図）。以上の実験においてLMIは、腹腔内すなわ
ち腫瘍の増殖部位に投与された。LMIは、皮下または静
脈内に投与された場合でも、腹腔内の腫瘍の増殖を減少
させるのに効果がある（第５図）。最近のデータは、i.
v.投与が最も効果的な経路となり得ることを示している
が、この発明は、i.v.投与に依存しない。これらの結果
は、免疫治療においてLMI使用のための可能性を広げて
おり、その中でこれらは効果的であるために、LMIは腫
瘍増殖部位に必ずしも投与する必要がないことを示して
いる。
に依存している。0.2μ以下の直径を有する分離された
プラズマ膜小片の投与は、腫瘍の増殖に対して顕著な効
果を示さなかった一方、LMI上に組込まれた同じ小片
は、腫瘍の増殖を効果的に減少（または消失）させた
（第４図）。以上の実験においてLMIは、腹腔内すなわ
ち腫瘍の増殖部位に投与された。LMIは、皮下または静
脈内に投与された場合でも、腹腔内の腫瘍の増殖を減少
させるのに効果がある（第５図）。最近のデータは、i.
v.投与が最も効果的な経路となり得ることを示している
が、この発明は、i.v.投与に依存しない。これらの結果
は、免疫治療においてLMI使用のための可能性を広げて
おり、その中でこれらは効果的であるために、LMIは腫
瘍増殖部位に必ずしも投与する必要がないことを示して
いる。
マウスは、ここに採用された同系の腫瘍の接種に対し
て、少ししかまたはまったく腫瘍特異的なCTLの応答を
示さない。そして、腫瘍は増殖しその動物を殺す。対照
的に、腫瘍を接種されかつLMIで治療されたマウスにお
いては、強い腫瘍特異的な細胞溶解活性が見られた。腫
瘍が接種され、LMIで治療された動物から（接種の７な
いし10日後）の腹膜滲出リンパ球は、接種に使用された
腫瘍に対して強い溶解活性を示したが、関係のない腫瘍
の標的に対してはまったく溶解活性を示さなかった（第
６図）。治療された動物における腫瘍特異的な細胞溶解
活性は、これらの動物からの脾臓細胞が、生体外におけ
る再刺激に対して強く、腫瘍特異的な応答を示した実験
からも示された（第7A図およびＢ図）。対照的に、腫瘍
を有し、LMIによる治療を受けなかった動物からの脾臓
細胞は、応答をまったく示さなかった（第7B図）。
て、少ししかまたはまったく腫瘍特異的なCTLの応答を
示さない。そして、腫瘍は増殖しその動物を殺す。対照
的に、腫瘍を接種されかつLMIで治療されたマウスにお
いては、強い腫瘍特異的な細胞溶解活性が見られた。腫
瘍が接種され、LMIで治療された動物から（接種の７な
いし10日後）の腹膜滲出リンパ球は、接種に使用された
腫瘍に対して強い溶解活性を示したが、関係のない腫瘍
の標的に対してはまったく溶解活性を示さなかった（第
６図）。治療された動物における腫瘍特異的な細胞溶解
活性は、これらの動物からの脾臓細胞が、生体外におけ
る再刺激に対して強く、腫瘍特異的な応答を示した実験
からも示された（第7A図およびＢ図）。対照的に、腫瘍
を有し、LMIによる治療を受けなかった動物からの脾臓
細胞は、応答をまったく示さなかった（第7B図）。
したがって、同種異系間の応答の場合のように、LMI
を保有する抗原は、腫瘍特異的な細胞溶解活性を（検出
不可能なレベルから）増大させる。この溶解応答の活性
化に付随した効果は、動物における腫瘍の増殖の劇的な
減少または消失である。未だに立証はされていないが、
活性化された細胞溶解性Ｔリンパ球が腫瘍の増殖の消失
を媒介していることがかなり確からしい。LMI治療の作
用機構に関係なく、はっきり得られた結果は、哺乳類の
がんの免疫治療におけるこの発明の価値を示している。
さらに、別々の２つのモデル系で同時に得られた発見
は、適切な抗原を有するLMIを用いた治療が、ウイル
ス、細菌および寄生虫の感染、移植片対宿主の疾患なら
びに自己免疫疾患を含む、Ｔリンパ球が防御的な役割を
果たし得るような疾患に対する免疫処置および／または
治療において有用であろうという結論を強く支持してい
る。
を保有する抗原は、腫瘍特異的な細胞溶解活性を（検出
不可能なレベルから）増大させる。この溶解応答の活性
化に付随した効果は、動物における腫瘍の増殖の劇的な
減少または消失である。未だに立証はされていないが、
活性化された細胞溶解性Ｔリンパ球が腫瘍の増殖の消失
を媒介していることがかなり確からしい。LMI治療の作
用機構に関係なく、はっきり得られた結果は、哺乳類の
がんの免疫治療におけるこの発明の価値を示している。
さらに、別々の２つのモデル系で同時に得られた発見
は、適切な抗原を有するLMIを用いた治療が、ウイル
ス、細菌および寄生虫の感染、移植片対宿主の疾患なら
びに自己免疫疾患を含む、Ｔリンパ球が防御的な役割を
果たし得るような疾患に対する免疫処置および／または
治療において有用であろうという結論を強く支持してい
る。
上述した生体内実験における発見は、Ｔ細胞の活性化
においてLMIの生体内活性と生体外活性が密接に相関し
ていることを示していた。このことに基づいて、生体外
のさらなる実験が、生体内の活性を促進するようなLMI
の構築に対して、いくつかの可能性があり便利な方法を
示してきた。たとえば、名目上の抗原（nominal antige
n）のみ（すなわちMHCクラスＩまたはクラスIIタンパク
質がないもの）を有するLMIは、生体外においてCTL応答
を活性化する。そのような名目上の抗原の例は、ウイル
スのタンパク質または腫瘍に特異的な抗原に存在する配
列に相当するペプチドを含む。適当なウイルスのペプチ
ドは、クローン化されたウイルス特異的CTLによりセリ
ンエステラーゼの放出を活性化し得、しかも、この名目
上の抗原がLMI上に組込まれるならば、クローン化され
たハプテン特異的CTLを刺激し得る。
においてLMIの生体内活性と生体外活性が密接に相関し
ていることを示していた。このことに基づいて、生体外
のさらなる実験が、生体内の活性を促進するようなLMI
の構築に対して、いくつかの可能性があり便利な方法を
示してきた。たとえば、名目上の抗原（nominal antige
n）のみ（すなわちMHCクラスＩまたはクラスIIタンパク
質がないもの）を有するLMIは、生体外においてCTL応答
を活性化する。そのような名目上の抗原の例は、ウイル
スのタンパク質または腫瘍に特異的な抗原に存在する配
列に相当するペプチドを含む。適当なウイルスのペプチ
ドは、クローン化されたウイルス特異的CTLによりセリ
ンエステラーゼの放出を活性化し得、しかも、この名目
上の抗原がLMI上に組込まれるならば、クローン化され
たハプテン特異的CTLを刺激し得る。
LMIの保有抗原とＴ細胞表面上の成分と結合する付加
的分子は、特異的な相互作用を促進する。アロ抗原およ
び付加的なリガンドの協力的な相互作用は、LMI上のア
ロ抗原のみを用いて得られたものに比べ、生体外のより
大きなCTL応答をもたらす。抗原特異的な誘発の促進が
見られる付加的なLMIリガンドは、CTL表面タンパク質
（Ｈ−２、thetaおよびLyt−２を含む）に特異的な抗体
および無関係なクラスＩ（しかしクラスIIでない）タン
パク質を含む。生体外で得られた効果に基づいて、これ
らの方法は、特異的な応答を誘発するための最適な生体
内活性を有するLMIのデザインに適用されるであろう。
的分子は、特異的な相互作用を促進する。アロ抗原およ
び付加的なリガンドの協力的な相互作用は、LMI上のア
ロ抗原のみを用いて得られたものに比べ、生体外のより
大きなCTL応答をもたらす。抗原特異的な誘発の促進が
見られる付加的なLMIリガンドは、CTL表面タンパク質
（Ｈ−２、thetaおよびLyt−２を含む）に特異的な抗体
および無関係なクラスＩ（しかしクラスIIでない）タン
パク質を含む。生体外で得られた効果に基づいて、これ
らの方法は、特異的な応答を誘発するための最適な生体
内活性を有するLMIのデザインに適用されるであろう。
要約すれば、生体内でのリポソーム上のアロ抗原の投
与が、生体内のCTL応答を刺激または増大させることが
できるかどうかを決定するための以前の努力では、アロ
抗原に対する良好な抗体応答は得られたが、CTL応答の
形成に関してまったく効果は見られなかった。
与が、生体内のCTL応答を刺激または増大させることが
できるかどうかを決定するための以前の努力では、アロ
抗原に対する良好な抗体応答は得られたが、CTL応答の
形成に関してまったく効果は見られなかった。
同じアロ抗原が、大型多価免疫原を生産するために５
μビーズ上に組込まれたとき、抗原保有細胞に対する生
体内のCTL応答が劇的に増大させられることがここに見
いだされてきた。この方法の医療への可能性は、適切な
腫瘍抗原保有LMIがマウスにおいて、腫瘍の生体内増殖
を抑制するか（または完全に抑える）という発見により
立証されてきた。効果的なLMIの生産に対して重要なパ
ラメータは、粒子の大きさ（＞0.2μたとえば直径５
μ）および粒子上の抗原の密度である。２つの別々のモ
デル系におけるLMI処置の効果の立証により、この方法
が、Ｔ細胞応答を含む他の疾患における免疫処置および
／または治療のために潜在的な有用性を有しているとい
うことが結論づけられる。
μビーズ上に組込まれたとき、抗原保有細胞に対する生
体内のCTL応答が劇的に増大させられることがここに見
いだされてきた。この方法の医療への可能性は、適切な
腫瘍抗原保有LMIがマウスにおいて、腫瘍の生体内増殖
を抑制するか（または完全に抑える）という発見により
立証されてきた。効果的なLMIの生産に対して重要なパ
ラメータは、粒子の大きさ（＞0.2μたとえば直径５
μ）および粒子上の抗原の密度である。２つの別々のモ
デル系におけるLMI処置の効果の立証により、この方法
が、Ｔ細胞応答を含む他の疾患における免疫処置および
／または治療のために潜在的な有用性を有しているとい
うことが結論づけられる。
データの詳細 同種異系の腫瘍細胞のI.p.注入は、腹膜滲出物におい
てアロ抗原特異的CTL活性を有するリンパ球群を結果と
してもたらしかつ、107刺激細胞を用いることにより、
最適応答が得られる。107のアロ抗原保有LMIが刺激細胞
とともにi.p.注入された場合、10日後に採集されたPEL
の細胞溶解活性は、刺激細胞のみを注入された動物から
のPELの活性を越えて、劇的に増大される。第１図は、L
MIが、もし刺激細胞と、同じアロ抗原を保有する場合に
は応答を増大させ、単独で注入された場合には応答を刺
激しないことを示す２連の相互的な実験の結果を示して
いる。CD2（Ｈ−2d）応答体は、RDM4（Ｈ−2k）またはE
L4（Ｈ−2b）細胞ならびにLMI−保有Ｈ−2KkまたはＨ−
2Kbを種々の組合せでi.p.注入された。Kb−LMIはEL4刺
激細胞とともに投与された場合、EL4−特異的応答の生
成を増大させ、一方、Kk−LMIは増大させなかった（左
のパネル）。単独で投与されたKb−LMIは、応答をもた
らさなかった。この相互的な結果（右のパネル）は、RD
M4刺激細胞を用いることにより得られた。Kk−LIMは、R
DM4とともに注入された場合、応答を増大させ、Kb−LMI
は応答を増大させなかった。単独で注入されたKk−LMI
は応答をもたらさなかった。この実験においてエフェク
タ群のすべては、EL4およびRDM4の双方の標的を殺すか
どうか試験された。
てアロ抗原特異的CTL活性を有するリンパ球群を結果と
してもたらしかつ、107刺激細胞を用いることにより、
最適応答が得られる。107のアロ抗原保有LMIが刺激細胞
とともにi.p.注入された場合、10日後に採集されたPEL
の細胞溶解活性は、刺激細胞のみを注入された動物から
のPELの活性を越えて、劇的に増大される。第１図は、L
MIが、もし刺激細胞と、同じアロ抗原を保有する場合に
は応答を増大させ、単独で注入された場合には応答を刺
激しないことを示す２連の相互的な実験の結果を示して
いる。CD2（Ｈ−2d）応答体は、RDM4（Ｈ−2k）またはE
L4（Ｈ−2b）細胞ならびにLMI−保有Ｈ−2KkまたはＨ−
2Kbを種々の組合せでi.p.注入された。Kb−LMIはEL4刺
激細胞とともに投与された場合、EL4−特異的応答の生
成を増大させ、一方、Kk−LMIは増大させなかった（左
のパネル）。単独で投与されたKb−LMIは、応答をもた
らさなかった。この相互的な結果（右のパネル）は、RD
M4刺激細胞を用いることにより得られた。Kk−LIMは、R
DM4とともに注入された場合、応答を増大させ、Kb−LMI
は応答を増大させなかった。単独で注入されたKk−LMI
は応答をもたらさなかった。この実験においてエフェク
タ群のすべては、EL4およびRDM4の双方の標的を殺すか
どうか試験された。
第１図に示すように、生体内CTL応答の増大は、LMI表
面上の抗原に対して特異的である。CD2F1マウスは、表
示された刺激因子をi.p.注入された。腫瘍細胞およびビ
ーズは、動物１個体当たり107で使用された。LMIは、ビ
ーズ107個当たりＨ−２タンパク質10μｇを用いること
により調製された。Ｈ−2KbはEL4腫瘍細胞から精製さ
れ、Ｈ−2KkはRDM4腫瘍細胞より精製された。注入から1
0日間の後、腹膜細胞は取出され、図に示されたエフェ
クタ対標的の比率において、４時間の検定においてCR51
ラベルされたRDM4およびEL4標的を用いることにより細
胞溶解活性が検定された。結果は特異的クロム解離パー
セントとして示される。RDM4刺激因子（単独またはビー
ズとともに）を接種したマウスからの細胞は、EL4標的
を殺さなかった。また、EL4刺激因子（単独またはビー
ズとともに）を接種した細胞はRDM4標的を殺さなかっ
た。
面上の抗原に対して特異的である。CD2F1マウスは、表
示された刺激因子をi.p.注入された。腫瘍細胞およびビ
ーズは、動物１個体当たり107で使用された。LMIは、ビ
ーズ107個当たりＨ−２タンパク質10μｇを用いること
により調製された。Ｈ−2KbはEL4腫瘍細胞から精製さ
れ、Ｈ−2KkはRDM4腫瘍細胞より精製された。注入から1
0日間の後、腹膜細胞は取出され、図に示されたエフェ
クタ対標的の比率において、４時間の検定においてCR51
ラベルされたRDM4およびEL4標的を用いることにより細
胞溶解活性が検定された。結果は特異的クロム解離パー
セントとして示される。RDM4刺激因子（単独またはビー
ズとともに）を接種したマウスからの細胞は、EL4標的
を殺さなかった。また、EL4刺激因子（単独またはビー
ズとともに）を接種した細胞はRDM4標的を殺さなかっ
た。
増大された応答は、刺激している抗原に対して完全に
特異的なままであり、第３の共通する効果は見られなか
った。すなわち、RDM4刺激因子とともにKb−LMIを注入
した結果より得られる効果は、EL4標的に対する溶解活
性を何も示さなかった。
特異的なままであり、第３の共通する効果は見られなか
った。すなわち、RDM4刺激因子とともにKb−LMIを注入
した結果より得られる効果は、EL4標的に対する溶解活
性を何も示さなかった。
増大の特異性は、多数の独立した抗原からのＨ−2
Kk、Ｈ−2KbおよびＨ−2dならびにLMIの調製物を用いる
ことによって立証されてきた。与えられたレベルまで標
的を溶解するのに必要なＥ対Ｔの比率または溶解ユニッ
トの血を比較することに基づいて、これらの実験におけ
る増大は、刺激細胞のみが注入された場合に得られる応
答の10から100倍の範囲にあった。CTL応答に対して予期
されるように、付着細胞の除去（樹脂への付着の１サイ
クルごと）は、同種異系細胞のみで刺激された動物およ
びLMI−治療された動物からのPEL群において溶解活性の
増加をもたらした。LMIにより増大されたPEL群に存在す
るエフェクタ細胞は、Ｔ細胞であることが、標的細胞の
添加に先立って抗−thy1抗体および補体によって細胞を
処理するならば溶解活性が消失するという実証により確
かめられた。
Kk、Ｈ−2KbおよびＨ−2dならびにLMIの調製物を用いる
ことによって立証されてきた。与えられたレベルまで標
的を溶解するのに必要なＥ対Ｔの比率または溶解ユニッ
トの血を比較することに基づいて、これらの実験におけ
る増大は、刺激細胞のみが注入された場合に得られる応
答の10から100倍の範囲にあった。CTL応答に対して予期
されるように、付着細胞の除去（樹脂への付着の１サイ
クルごと）は、同種異系細胞のみで刺激された動物およ
びLMI−治療された動物からのPEL群において溶解活性の
増加をもたらした。LMIにより増大されたPEL群に存在す
るエフェクタ細胞は、Ｔ細胞であることが、標的細胞の
添加に先立って抗−thy1抗体および補体によって細胞を
処理するならば溶解活性が消失するという実証により確
かめられた。
指摘されたように、精製されたアロ抗原が投与される
ときの物理的形態は重要である。LMI上の抗原は応答を
増大させるが、リポソームに組込まれ、かつ同じかまた
は高い投与量で投与された抗原は増大効果をまったく示
さない。LMI上の密度もまた、それが生体外でのCTL活性
のためである場合、重要である。第２図に示すように、
生体内CTL活性化の特異的な増大は、LMI表面上の抗原の
密度に依存している。C57BL/6マウスは、図に示された
刺激因子をi.p.注入された。RDM4腫瘍細胞およびLMI
は、動物個体当たり107で用いられた。高い密度で抗原
を保持するLMIは、ビーズ107個当たりＨ−２を10μｇ使
用して形成され、低い密度のLMIは107個当たり３μｇ使
用することにより調製された。Ｈ−2Kk抗原は、RDM4細
胞から精製され、Ｈ−2d抗原はP815腫瘍細胞から精製さ
れた。注入から10日間の後、腹膜細胞を取出し、Cr51で
ラベルされたRDM4（Ｈ−2k）およびP815（Ｈ−2d）標的
を用いて細胞溶解活性を検定した。２マウス／群からの
PELは検定のためにプールされた。低い密度のLMIによっ
て治療された動物に比べ、高い密度のLMIによって治療
された動物において、より大きな溶解活性が認められた
（第２図）。
ときの物理的形態は重要である。LMI上の抗原は応答を
増大させるが、リポソームに組込まれ、かつ同じかまた
は高い投与量で投与された抗原は増大効果をまったく示
さない。LMI上の密度もまた、それが生体外でのCTL活性
のためである場合、重要である。第２図に示すように、
生体内CTL活性化の特異的な増大は、LMI表面上の抗原の
密度に依存している。C57BL/6マウスは、図に示された
刺激因子をi.p.注入された。RDM4腫瘍細胞およびLMI
は、動物個体当たり107で用いられた。高い密度で抗原
を保持するLMIは、ビーズ107個当たりＨ−２を10μｇ使
用して形成され、低い密度のLMIは107個当たり３μｇ使
用することにより調製された。Ｈ−2Kk抗原は、RDM4細
胞から精製され、Ｈ−2d抗原はP815腫瘍細胞から精製さ
れた。注入から10日間の後、腹膜細胞を取出し、Cr51で
ラベルされたRDM4（Ｈ−2k）およびP815（Ｈ−2d）標的
を用いて細胞溶解活性を検定した。２マウス／群からの
PELは検定のためにプールされた。低い密度のLMIによっ
て治療された動物に比べ、高い密度のLMIによって治療
された動物において、より大きな溶解活性が認められた
（第２図）。
このように、LMI上のアロ抗原は、さもなくば無傷で
同種異系の刺激因子に対して最適の生体内応答となるも
のを特異的に増大させ、生じるエフェクタCTLは、刺激
するアロ抗原に対してその特異性を維持している。生体
内のLMIは、応答の補助因子に作用するというよりむし
ろ、明らかにPCTL活性化のレベルにおいて作用してい
る。生体外においては、LMIはPCTLを誘発するに当たっ
て非常に効果的であるが、取込み、加工およびTH細胞へ
の提示のための抗原を提供することにおいては効果的で
ない。生体内で増大の効果がないリポソーム上のアロ抗
原は、生体外においてTH細胞活性化のための抗原を提供
するが、PCTLを直接活性化することにおいてはあまり効
果的ではない。
同種異系の刺激因子に対して最適の生体内応答となるも
のを特異的に増大させ、生じるエフェクタCTLは、刺激
するアロ抗原に対してその特異性を維持している。生体
内のLMIは、応答の補助因子に作用するというよりむし
ろ、明らかにPCTL活性化のレベルにおいて作用してい
る。生体外においては、LMIはPCTLを誘発するに当たっ
て非常に効果的であるが、取込み、加工およびTH細胞へ
の提示のための抗原を提供することにおいては効果的で
ない。生体内で増大の効果がないリポソーム上のアロ抗
原は、生体外においてTH細胞活性化のための抗原を提供
するが、PCTLを直接活性化することにおいてはあまり効
果的ではない。
LMIは、もしかするとIL−２依存性の自己分泌機構に
より、PCTL群の増大を刺激するかもしれない。TH細胞の
活性化がない場合（すなわち全体の細胞共同刺激因子な
しで）、増殖する前駆体は遅れて作用する分化因子が存
在しないため、エフェクタとならないかもしれない。こ
のため、LMI単独では溶解応答を生成しないであろう
（しかし準備はするであろう）。なぜLMIは、無傷の抗
原保有細胞よりもより効果的にPCTLの増大を刺激するで
あろうかは知られていない。このことは、たとえば、よ
り長い時間でのPCTLとのそれらの相互作用から結果とし
てもたらされるかもしれないし、したがってIL−２生産
の持続された刺激をもたらすかもしれない。
より、PCTL群の増大を刺激するかもしれない。TH細胞の
活性化がない場合（すなわち全体の細胞共同刺激因子な
しで）、増殖する前駆体は遅れて作用する分化因子が存
在しないため、エフェクタとならないかもしれない。こ
のため、LMI単独では溶解応答を生成しないであろう
（しかし準備はするであろう）。なぜLMIは、無傷の抗
原保有細胞よりもより効果的にPCTLの増大を刺激するで
あろうかは知られていない。このことは、たとえば、よ
り長い時間でのPCTLとのそれらの相互作用から結果とし
てもたらされるかもしれないし、したがってIL−２生産
の持続された刺激をもたらすかもしれない。
同種異系のCTL生成に関するLMIの効果を試験して得ら
れた結果に基づき、まず、同系の腫瘍特異的応答に関す
る抗原保有LMIの効果について試験するため実験を行な
った。我々は、EL4、C57BL/6血統の胸腺腫、RDM4、AKR
血統のリンパ腫およびP815、DBA−２血統の肥満細胞種
について試験を行なった。これらはすべて、同系マウス
の腹膜中で増殖し、最終的にその宿主を殺した。CTLの
認識に関連した腫瘍抗原は明らかにされていない。しか
しながら、プラズマ膜は腫瘍細胞から分離することがで
き、しかもおそらく無傷の腫瘍細胞と同じ配列の表面タ
ンパク質を有しているであろう。これが腫瘍特異的なCT
Lにより認識される抗原を含むことは、腫瘍細胞から分
離された膜が、生体外での２次的な腫瘍特異的応答の誘
導を特異的に刺激することができるということを立証し
ている研究により示されている。
れた結果に基づき、まず、同系の腫瘍特異的応答に関す
る抗原保有LMIの効果について試験するため実験を行な
った。我々は、EL4、C57BL/6血統の胸腺腫、RDM4、AKR
血統のリンパ腫およびP815、DBA−２血統の肥満細胞種
について試験を行なった。これらはすべて、同系マウス
の腹膜中で増殖し、最終的にその宿主を殺した。CTLの
認識に関連した腫瘍抗原は明らかにされていない。しか
しながら、プラズマ膜は腫瘍細胞から分離することがで
き、しかもおそらく無傷の腫瘍細胞と同じ配列の表面タ
ンパク質を有しているであろう。これが腫瘍特異的なCT
Lにより認識される抗原を含むことは、腫瘍細胞から分
離された膜が、生体外での２次的な腫瘍特異的応答の誘
導を特異的に刺激することができるということを立証し
ている研究により示されている。
LMIを保有する膜形態の腫瘍抗原は、PBSにおいて精製
されたプラズマ膜小片の懸濁液中にビーズ（DMSO中に懸
濁された）を単に希釈するだけで速やかに調製すること
ができる。抗原保有LMIを同系のマウス中に腫瘍細胞と
ともにi.p.注入した場合、９日ないし11日で腫瘍の重量
が劇的に減少することが見いだされた。このことは試験
された３つのすべての腫瘍に対してあてはまり、しかも
腫瘍の重量における減少は、腫瘍接種の範囲が105ない
し107細胞にわたって起こった（第３図）。さらに実質
的であるが、重量の減少はRDM4の場合において最も少な
く、接種レベルが107のRDM4のLMI治療では減少がほとん
どなかったかまたはまったく効果がなかった。RDM4は試
験された３つの腫瘍のうち増殖が最も早いものである。
LMIが腫瘍プラズマ膜を有していないならば、腫瘍の減
少は起らない。正常なマウスの血清タンパク質でおおわ
れたLMIは、試験された腫瘍のどれに対しても腫瘍重量
に関する効果はない（図示せず）。
されたプラズマ膜小片の懸濁液中にビーズ（DMSO中に懸
濁された）を単に希釈するだけで速やかに調製すること
ができる。抗原保有LMIを同系のマウス中に腫瘍細胞と
ともにi.p.注入した場合、９日ないし11日で腫瘍の重量
が劇的に減少することが見いだされた。このことは試験
された３つのすべての腫瘍に対してあてはまり、しかも
腫瘍の重量における減少は、腫瘍接種の範囲が105ない
し107細胞にわたって起こった（第３図）。さらに実質
的であるが、重量の減少はRDM4の場合において最も少な
く、接種レベルが107のRDM4のLMI治療では減少がほとん
どなかったかまたはまったく効果がなかった。RDM4は試
験された３つの腫瘍のうち増殖が最も早いものである。
LMIが腫瘍プラズマ膜を有していないならば、腫瘍の減
少は起らない。正常なマウスの血清タンパク質でおおわ
れたLMIは、試験された腫瘍のどれに対しても腫瘍重量
に関する効果はない（図示せず）。
同種異系の応答に関する限りでは、抗原の物理的形態
は腫瘍の重量の効果的な減少に対して重要である。懸濁
液中に遊離した膜の小片（直径＜0.2μ）としてプラズ
マ膜を注入した場合、腫瘍の重量に対してほとんど効果
を示さないかまたはまったく効果を示さない一方、LMI
上の同じ膜の注入は非常に効果的である。第４図に示す
ように、腫瘍の減少は、腫瘍の抗原（プラズマ膜）が、
遊離したプラズマ膜としてではなく、LMI上で投与され
ることを必要とする。C57BL/6マウスは、106の生きたEL
4細胞をi.p.接種された。同時に、107のLMI保有EL4プラ
ズマ膜またはEL4プラズマ膜が懸濁液中で投与された。
膜はLMI上のそれと等量（１×プラズマ膜）または10倍
の用量（10×プラズマ膜）で使用された。腹膜細胞は13
日で採集されかつ数えられた。その値は、それぞれのグ
ループにおいて２匹のマウスで得られた値の平均であ
り、かつその２匹で得られた範囲を示している。
は腫瘍の重量の効果的な減少に対して重要である。懸濁
液中に遊離した膜の小片（直径＜0.2μ）としてプラズ
マ膜を注入した場合、腫瘍の重量に対してほとんど効果
を示さないかまたはまったく効果を示さない一方、LMI
上の同じ膜の注入は非常に効果的である。第４図に示す
ように、腫瘍の減少は、腫瘍の抗原（プラズマ膜）が、
遊離したプラズマ膜としてではなく、LMI上で投与され
ることを必要とする。C57BL/6マウスは、106の生きたEL
4細胞をi.p.接種された。同時に、107のLMI保有EL4プラ
ズマ膜またはEL4プラズマ膜が懸濁液中で投与された。
膜はLMI上のそれと等量（１×プラズマ膜）または10倍
の用量（10×プラズマ膜）で使用された。腹膜細胞は13
日で採集されかつ数えられた。その値は、それぞれのグ
ループにおいて２匹のマウスで得られた値の平均であ
り、かつその２匹で得られた範囲を示している。
第４図に示す実験は２匹のマウスのグループで試験さ
れたものであり、見いだされた範囲を示している。ここ
に示される予備実験のほとんどは、第４図に示されるも
のと同様の値の範囲にある２匹のマウス群を用いたもの
である。そのデータは、ここに示されるLMIの治療の劇
的な効果を立証するために適切であると考えられる。
れたものであり、見いだされた範囲を示している。ここ
に示される予備実験のほとんどは、第４図に示されるも
のと同様の値の範囲にある２匹のマウス群を用いたもの
である。そのデータは、ここに示されるLMIの治療の劇
的な効果を立証するために適切であると考えられる。
このようにして得られた限られた投与量の応答に関す
る情報は、少なくとも106マウス（図示せず）、すなわ
ちここに示される実験よりも10分の１の投与量まで下げ
ても、LMIは腫瘍を減少させる効果を維持していること
を示している。P815腫瘍の増殖の動態およびLMIの効果
を１つの実験で試験した。マウスは、LMIの投与または
無投与のもとで、105個の腫瘍細胞が接種された。５日
間で、両方の対照において腫瘍の増殖が起こり、マウス
は治療され約20×106/マウスの腹膜細胞が回収された。
このときを過ぎて、対照のマウスでは増殖が続いたが、
治療されたマウスにおいては、腫瘍の重量は減少した。
９日間で、対照は161×106/マウスの細胞を有していた
が、治療されたマウスは1.4×106であった。
る情報は、少なくとも106マウス（図示せず）、すなわ
ちここに示される実験よりも10分の１の投与量まで下げ
ても、LMIは腫瘍を減少させる効果を維持していること
を示している。P815腫瘍の増殖の動態およびLMIの効果
を１つの実験で試験した。マウスは、LMIの投与または
無投与のもとで、105個の腫瘍細胞が接種された。５日
間で、両方の対照において腫瘍の増殖が起こり、マウス
は治療され約20×106/マウスの腹膜細胞が回収された。
このときを過ぎて、対照のマウスでは増殖が続いたが、
治療されたマウスにおいては、腫瘍の重量は減少した。
９日間で、対照は161×106/マウスの細胞を有していた
が、治療されたマウスは1.4×106であった。
いくつかの実験において、抗原保有LMIを単に投与し
たものは、対照に比べて回収された腹膜細胞の数が、99
％以上減少した（第４図および上述した動力学的実
験）。この水準では、治療された動物から回収される細
胞の数は、腫瘍を接種していない正常な動物から回収さ
れたものとそれほど大きく異なっていない。
たものは、対照に比べて回収された腹膜細胞の数が、99
％以上減少した（第４図および上述した動力学的実
験）。この水準では、治療された動物から回収される細
胞の数は、腫瘍を接種していない正常な動物から回収さ
れたものとそれほど大きく異なっていない。
LMI投与の効果的な経路が満足のいく程度に試験され
た結果、効果的な投与経路が確立された。マウスは105
のP815をi.p.接種され、かつLMIをi.p.、i.v.（尻尾の
静脈）または皮下より投与された。９日の後、マウスは
殺され、腹膜細胞が取出され、カウントされた。LMI保
有P815膜抗原は、i.p.または皮下より投与されたとき、
60ないし70％で腫瘍の重量を減少させた。相当するデー
タは第５図のグラフに示されている。CD2F1マウスは105
のP815v細胞をi.p.接種された。同時に、P815プラズマ
膜または正常なマウスの血清タンパク質（NMS）を有す
るLMIが、すべての場合において107LMI/マウスで、図示
された経路により投与された。接種から11日の後、腹膜
細胞は採集され数えられた。腫瘍−抗原保有LMIで治療
された群は、それぞれ４匹のマウスからなり、値は標準
偏差とともに平均値で示されている。対照群（腫瘍のみ
およびNMS−LMIで処置）は、それぞれ２匹のマウスで構
成され、その平均値が示されている。腫瘍およびLMIを
ともに接種していない正常なマウスから取出された腹膜
細胞の回収は、６匹のマウスで測定され（底のバー）、
その標準偏差が示されている。
た結果、効果的な投与経路が確立された。マウスは105
のP815をi.p.接種され、かつLMIをi.p.、i.v.（尻尾の
静脈）または皮下より投与された。９日の後、マウスは
殺され、腹膜細胞が取出され、カウントされた。LMI保
有P815膜抗原は、i.p.または皮下より投与されたとき、
60ないし70％で腫瘍の重量を減少させた。相当するデー
タは第５図のグラフに示されている。CD2F1マウスは105
のP815v細胞をi.p.接種された。同時に、P815プラズマ
膜または正常なマウスの血清タンパク質（NMS）を有す
るLMIが、すべての場合において107LMI/マウスで、図示
された経路により投与された。接種から11日の後、腹膜
細胞は採集され数えられた。腫瘍−抗原保有LMIで治療
された群は、それぞれ４匹のマウスからなり、値は標準
偏差とともに平均値で示されている。対照群（腫瘍のみ
およびNMS−LMIで処置）は、それぞれ２匹のマウスで構
成され、その平均値が示されている。腫瘍およびLMIを
ともに接種していない正常なマウスから取出された腹膜
細胞の回収は、６匹のマウスで測定され（底のバー）、
その標準偏差が示されている。
I.v.投与は、i.p.およびs.c.投与よりもより効果的で
あり、かつこれらのマウスから回収された細胞の数は、
腫瘍を接種しなかった正常のマウスより回収された数よ
りも大きくなかった。投与のすべての経路において、正
常なマウスの血清タンパク質で被覆された対照LMIは、
腫瘍重量の顕著な減少が起こらなかった。最近のデータ
は、i.v.投与が最も効果的な経路であり得ることを示し
ているが、この発明はi.v.投与に依存しない。これらの
結果もまた、免疫治療におけるLMIの使用の可能性を広
げるものであり、そのことにおいて、LMIが効果的であ
るために必ずしも腫瘍の増殖部位に投与される必要がな
いことを立証している。
あり、かつこれらのマウスから回収された細胞の数は、
腫瘍を接種しなかった正常のマウスより回収された数よ
りも大きくなかった。投与のすべての経路において、正
常なマウスの血清タンパク質で被覆された対照LMIは、
腫瘍重量の顕著な減少が起こらなかった。最近のデータ
は、i.v.投与が最も効果的な経路であり得ることを示し
ているが、この発明はi.v.投与に依存しない。これらの
結果もまた、免疫治療におけるLMIの使用の可能性を広
げるものであり、そのことにおいて、LMIが効果的であ
るために必ずしも腫瘍の増殖部位に投与される必要がな
いことを立証している。
同種異系のCTL応答に関して抗原保有LMIの効果から、
腫瘍特異的CTL応答の活性化の結果として、LMIの投与は
生体内で腫瘍に作用することが考えられる。マウスから
の非接着PEL細胞がEL4腫瘍細胞とともに注入され、かつ
LMI保有EL4プラズマ膜が４時間のCr51解離検定において
試験された場合、EL4標的に対する細胞溶解活性が第６
図に示すように存在した。第６図のデータは、LMIで治
療されたマウスからの腹膜滲出リンパ球の腫瘍特異的な
細胞溶解活性を示している。C57BL/6マウスは106の生き
たEL4細胞を接種された。同時に治療されたマウスは、1
07のLMI保有EL4膜が注入された（EL4＋LMI）。生きた腫
瘍のない対照マウスもまた、107のLMI保有EL4膜を注入
された（LMIのみ）。12日の後、腹膜細胞は採集され、
１時間、プラスチックに付着させられたのち、付着しな
い細胞はEL4およびRTM4標的を用いる４時間のCr解離検
定において、溶解活性が検定された。LMIで治療された
マウスは第４図に示されるものと同じものであり、その
腫瘍重量は、LMI処置により99％＜減少させられた。そ
れぞれのマウスからの細胞は検定され、それぞれの群の
両方のマウスに対して結果が示された。死亡率は、特異
的解離％として表されている。自発的な解離はEL4に対
して195cpmであり、RDM4に対しては248cpmであった。ま
た、解離し得る全体は、EL4に対し2549であり、RDM4に
対し2938であった。
腫瘍特異的CTL応答の活性化の結果として、LMIの投与は
生体内で腫瘍に作用することが考えられる。マウスから
の非接着PEL細胞がEL4腫瘍細胞とともに注入され、かつ
LMI保有EL4プラズマ膜が４時間のCr51解離検定において
試験された場合、EL4標的に対する細胞溶解活性が第６
図に示すように存在した。第６図のデータは、LMIで治
療されたマウスからの腹膜滲出リンパ球の腫瘍特異的な
細胞溶解活性を示している。C57BL/6マウスは106の生き
たEL4細胞を接種された。同時に治療されたマウスは、1
07のLMI保有EL4膜が注入された（EL4＋LMI）。生きた腫
瘍のない対照マウスもまた、107のLMI保有EL4膜を注入
された（LMIのみ）。12日の後、腹膜細胞は採集され、
１時間、プラスチックに付着させられたのち、付着しな
い細胞はEL4およびRTM4標的を用いる４時間のCr解離検
定において、溶解活性が検定された。LMIで治療された
マウスは第４図に示されるものと同じものであり、その
腫瘍重量は、LMI処置により99％＜減少させられた。そ
れぞれのマウスからの細胞は検定され、それぞれの群の
両方のマウスに対して結果が示された。死亡率は、特異
的解離％として表されている。自発的な解離はEL4に対
して195cpmであり、RDM4に対しては248cpmであった。ま
た、解離し得る全体は、EL4に対し2549であり、RDM4に
対し2938であった。
データは、活性が特異的であり、それにおいてRDM4標
的に対しては活性が検出されなかったことを示してい
る。LMIを注入される一方、生きた腫瘍細胞を注入され
なかったマウスからのPELは、どの標的に対しても溶解
活性を示さなかった。腫瘍を注入される一方、LMIで治
療されなかったマウスからのPELもまた、殺生活性を有
さなかった（図示せず）。しかし、この群に存在する多
大な数の腫瘍細胞は、これらが活性のない標的ブロッカ
ーとして作用し得るという限定的な解釈を排除するもの
である。
的に対しては活性が検出されなかったことを示してい
る。LMIを注入される一方、生きた腫瘍細胞を注入され
なかったマウスからのPELは、どの標的に対しても溶解
活性を示さなかった。腫瘍を注入される一方、LMIで治
療されなかったマウスからのPELもまた、殺生活性を有
さなかった（図示せず）。しかし、この群に存在する多
大な数の腫瘍細胞は、これらが活性のない標的ブロッカ
ーとして作用し得るという限定的な解釈を排除するもの
である。
腫瘍保有動物は、さらに細胞溶解活性を試験するため
に、６日培養物における放射線照射細胞での生体外再刺
激が行なわれた脾臓細胞群の細胞溶解活性について、LM
I治療動物と比較された。それらのデータは第７図に示
されている。第7A図は、LMI処置されたEL4−腫瘍保有C5
7BL/6マウスの再刺激された脾臓細胞からのCTLの特異性
を示し、第7B図は、P815−腫瘍保有CD2F1マウスからの
脾臓細胞の再刺激に関して、治療の効果を示している。
に、６日培養物における放射線照射細胞での生体外再刺
激が行なわれた脾臓細胞群の細胞溶解活性について、LM
I治療動物と比較された。それらのデータは第７図に示
されている。第7A図は、LMI処置されたEL4−腫瘍保有C5
7BL/6マウスの再刺激された脾臓細胞からのCTLの特異性
を示し、第7B図は、P815−腫瘍保有CD2F1マウスからの
脾臓細胞の再刺激に関して、治療の効果を示している。
C57BL/6マウスは、106の生きたEL4細胞がi.p.接種さ
れ、かつ同時に107のLMI保有EL4抗原が投与された（第7
A図）。12日の後、脾臓（２匹のマウス）が取出され、
プールされかつ放射線照射されたEL4細胞とともにまた
はその細胞なしで培養中に置かれた。生体外培養の６日
の後、細胞は、EL4およびRDM4標的を用いる４時間Cr解
離検定において溶解活性が検定された。放射線照射され
たEL4とともに培養された細胞に対する結果が示されて
いる。刺激因子なしで培養された細胞は、どちらの標的
に対しても溶解活性がなかった。
れ、かつ同時に107のLMI保有EL4抗原が投与された（第7
A図）。12日の後、脾臓（２匹のマウス）が取出され、
プールされかつ放射線照射されたEL4細胞とともにまた
はその細胞なしで培養中に置かれた。生体外培養の６日
の後、細胞は、EL4およびRDM4標的を用いる４時間Cr解
離検定において溶解活性が検定された。放射線照射され
たEL4とともに培養された細胞に対する結果が示されて
いる。刺激因子なしで培養された細胞は、どちらの標的
に対しても溶解活性がなかった。
CD2F1マウスは、106の生きたP815細胞を接種され、同
時に、何もなしか、107のLMI保有P815抗原（LMI−P81
5）または107のLMI保有正常マウス血清（LMI−NMS）で
治療された（第7B図）。７日の後、脾臓は取出され（１
グループに対し２匹のマウス）、かつ単独または放射線
照射されたP815細胞とともに培養中に置かれた。６日間
の生体外培養の後、溶解活性がP815およびRDM4標的に対
して検定された。再刺激された細胞のP815標的に対して
得られた結果が示されている。RDM4標的の殺生は見られ
なかった。生体外で再刺激されなかった細胞は、P815お
よびRDM4標的とも溶解しなかった。
時に、何もなしか、107のLMI保有P815抗原（LMI−P81
5）または107のLMI保有正常マウス血清（LMI−NMS）で
治療された（第7B図）。７日の後、脾臓は取出され（１
グループに対し２匹のマウス）、かつ単独または放射線
照射されたP815細胞とともに培養中に置かれた。６日間
の生体外培養の後、溶解活性がP815およびRDM4標的に対
して検定された。再刺激された細胞のP815標的に対して
得られた結果が示されている。RDM4標的の殺生は見られ
なかった。生体外で再刺激されなかった細胞は、P815お
よびRDM4標的とも溶解しなかった。
第7A図は、EL4腫瘍およびLMIを注入されたマウスから
12日間の後、取出された脾臓細胞が、EL4標的に対して
は強い細胞溶解応答を生成させることができ、しかし、
RDM4標的に対しては生成させることができなかったこと
を示している。この応答は、放射線照射されたEL4刺激
因子が添加された培養中のみにおいて起こった。その他
に何も添加しないか、抗原保有LMIまたは正常なマウス
の血清で被覆されたLMIとともにP815腫瘍細胞が注入さ
れたマウスからの脾臓細胞が試験された場合、同様の結
果が得られた。放射線照射されたP815による再刺激は、
腫瘍および抗原−保有LMIで治療されたマウスから、強
い抗−P815応答の形成を結果としてもたらした（第7B
図）。対照的に、腫瘍のみ、または腫瘍および正常なマ
ウスの血清で被覆されたLMIを接種したマウスの細胞か
らは、応答がほとんど得られなかったかまたはまったく
得られなかった。すべての場合において、放射線照射さ
れたP815刺激細胞なしでは、何も応答が得られなかっ
た。
12日間の後、取出された脾臓細胞が、EL4標的に対して
は強い細胞溶解応答を生成させることができ、しかし、
RDM4標的に対しては生成させることができなかったこと
を示している。この応答は、放射線照射されたEL4刺激
因子が添加された培養中のみにおいて起こった。その他
に何も添加しないか、抗原保有LMIまたは正常なマウス
の血清で被覆されたLMIとともにP815腫瘍細胞が注入さ
れたマウスからの脾臓細胞が試験された場合、同様の結
果が得られた。放射線照射されたP815による再刺激は、
腫瘍および抗原−保有LMIで治療されたマウスから、強
い抗−P815応答の形成を結果としてもたらした（第7B
図）。対照的に、腫瘍のみ、または腫瘍および正常なマ
ウスの血清で被覆されたLMIを接種したマウスの細胞か
らは、応答がほとんど得られなかったかまたはまったく
得られなかった。すべての場合において、放射線照射さ
れたP815刺激細胞なしでは、何も応答が得られなかっ
た。
AKRマウスでRDM4腫瘍を試験する同種の実験におい
て、本質的に同一な効果が得られた。RDM4および抗原−
保存LMIを用いた注入の後、12日間経たマウスから取出
された脾臓細胞は、放射線照射された刺激因子による再
刺激に依存し、かつRDM4標的に対して特異的な強い応答
（Ｅ対Ｔが２対１において61％溶解）を生成した。腫瘍
のみ与えられたマウスからの細胞は、腫瘍細胞およびLM
Iをともに接種しなかった正常なマウスからの脾臓細胞
と同様に、再刺激に対して余り応答を形成しなかった
（２対１において８％）。したがって、PEL活性または
生体外での再刺激に対する活性をもたらすLMI治療もま
た、対照と比較して、腹膜腫瘍重量の減少を結果として
もたらす。
て、本質的に同一な効果が得られた。RDM4および抗原−
保存LMIを用いた注入の後、12日間経たマウスから取出
された脾臓細胞は、放射線照射された刺激因子による再
刺激に依存し、かつRDM4標的に対して特異的な強い応答
（Ｅ対Ｔが２対１において61％溶解）を生成した。腫瘍
のみ与えられたマウスからの細胞は、腫瘍細胞およびLM
Iをともに接種しなかった正常なマウスからの脾臓細胞
と同様に、再刺激に対して余り応答を形成しなかった
（２対１において８％）。したがって、PEL活性または
生体外での再刺激に対する活性をもたらすLMI治療もま
た、対照と比較して、腹膜腫瘍重量の減少を結果として
もたらす。
LMIと化学療法が組合された治療を用いる腫瘍の治療 腫瘍を保有する宿主を治療するために、組合せで用い
られた場合、LMIおよびシクロホスファミド（CY）は、
腫瘍の増殖および宿主の生存に対して、高い相乗効果を
有する。腫瘍の増殖は同系のP815腫瘍細胞を105/マウス
で注入することによりマウス中に誘導される。腹腔内に
増殖する同系のP815腫瘍を保有するマウスは、０日目
（腫瘍接種の日）、LMI、107i.v.で、かつ３日目にCY3m
g、i.p.で治療された。CY単独またはLMI単独では、宿主
の生存を顕著に延ばすことはなかった。しかしながら、
LMIおよびCYの両方で治療されたマウスは、非常に顕著
に生存期間が長くなり、第８図に示すように、40％のマ
ウスが180日以上生存している。
られた場合、LMIおよびシクロホスファミド（CY）は、
腫瘍の増殖および宿主の生存に対して、高い相乗効果を
有する。腫瘍の増殖は同系のP815腫瘍細胞を105/マウス
で注入することによりマウス中に誘導される。腹腔内に
増殖する同系のP815腫瘍を保有するマウスは、０日目
（腫瘍接種の日）、LMI、107i.v.で、かつ３日目にCY3m
g、i.p.で治療された。CY単独またはLMI単独では、宿主
の生存を顕著に延ばすことはなかった。しかしながら、
LMIおよびCYの両方で治療されたマウスは、非常に顕著
に生存期間が長くなり、第８図に示すように、40％のマ
ウスが180日以上生存している。
P815肥満細胞腫細胞が、同系の宿主中に皮下より注入
された場合、それらは固い皮下腫瘍として増殖する。ま
た、その腫瘍はリンパ節、脾臓および肺に転移し、宿主
を殺す。LMIおよびCY、が形成された腫瘍の増殖に作用
し得るかどうか決定するために、マウスは皮下より105
のP815細胞が接種され、さらに10日間細胞は増殖させら
れた。このとき、すべてのマウスは目に見えはっきりと
した固い腫瘍を有していた。次に、マウスの群はCY3mg
をi.p.で（10日目）、LMI107をi.v.で（13日目）または
両方で治療された。腫瘍の増殖は、その範囲を測定する
ことにより決められ、かつ生存期間が測定された。第9B
図に示すように、CYおよびLMIが併用された治療は、宿
主の生存期間を非常に顕著に延ばした（治療されないも
の対CY＋LMIで治療されたものにおいてｐ＜0.002）。一
方、単独で治療したものはともに、顕著な効果を有さな
かった。固い腫瘍の増殖は、第9A図においてグラフ化さ
れたデータにより示されるように、CY＋LMI治療によっ
て劇的に減少させられた。CY単独による治療では生存期
間に効果がなかったが、腫瘍の増殖を確かに減少させ
た。この結果は、化学療法単独では最初の腫瘍の量を減
少させることができるが、転移に対してはほとんど効果
がないかまたはまったく効果がないことを示唆してい
る。
された場合、それらは固い皮下腫瘍として増殖する。ま
た、その腫瘍はリンパ節、脾臓および肺に転移し、宿主
を殺す。LMIおよびCY、が形成された腫瘍の増殖に作用
し得るかどうか決定するために、マウスは皮下より105
のP815細胞が接種され、さらに10日間細胞は増殖させら
れた。このとき、すべてのマウスは目に見えはっきりと
した固い腫瘍を有していた。次に、マウスの群はCY3mg
をi.p.で（10日目）、LMI107をi.v.で（13日目）または
両方で治療された。腫瘍の増殖は、その範囲を測定する
ことにより決められ、かつ生存期間が測定された。第9B
図に示すように、CYおよびLMIが併用された治療は、宿
主の生存期間を非常に顕著に延ばした（治療されないも
の対CY＋LMIで治療されたものにおいてｐ＜0.002）。一
方、単独で治療したものはともに、顕著な効果を有さな
かった。固い腫瘍の増殖は、第9A図においてグラフ化さ
れたデータにより示されるように、CY＋LMI治療によっ
て劇的に減少させられた。CY単独による治療では生存期
間に効果がなかったが、腫瘍の増殖を確かに減少させ
た。この結果は、化学療法単独では最初の腫瘍の量を減
少させることができるが、転移に対してはほとんど効果
がないかまたはまったく効果がないことを示唆してい
る。
上述した結果は、次に示す２つの事項において、LMI
治療の効果を証明している。
治療の効果を証明している。
１）LMIおよび化学療法を用いる治療は、腫瘍の増殖お
よび宿主の生存に対して高い相乗効果を有することがで
きる。
よび宿主の生存に対して高い相乗効果を有することがで
きる。
２）LMIと化学療法が組合された治療は、腫瘍が確立さ
れるようになってから後にのみ治療が開始された場合、
宿主の生存を顕著に引き延ばすことができる。
れるようになってから後にのみ治療が開始された場合、
宿主の生存を顕著に引き延ばすことができる。
要約 このように、腫瘍−保有動物のLMI治療は、腫瘍重量
の劇的な減少および強い腫瘍特異的な細胞溶解活性の発
現をともにもたらす。溶解活性および脾臓細胞による応
答の抗原−依存性再刺激の強さおよび特異性は、すべて
が、このことが細胞溶解性Ｔリンパ球により媒介されて
いることを非常に強く立証している。LMI治療の作用機
構に関係なく、このようにして得られた結果は、哺乳動
物におけるがんの免疫治療においてこの発明が価値ある
ことを示している。
の劇的な減少および強い腫瘍特異的な細胞溶解活性の発
現をともにもたらす。溶解活性および脾臓細胞による応
答の抗原−依存性再刺激の強さおよび特異性は、すべて
が、このことが細胞溶解性Ｔリンパ球により媒介されて
いることを非常に強く立証している。LMI治療の作用機
構に関係なく、このようにして得られた結果は、哺乳動
物におけるがんの免疫治療においてこの発明が価値ある
ことを示している。
LMIの治療への利用は、疾患に対抗する免疫化または
進行する疾患に対する治療として、生体内への単独投与
またはその他の試薬と組合せた投与を含む。LMIが意図
した効果を生ずるような疾患は、ウイルス、細菌および
寄生虫による疾患、がん、移植片対宿主の疾患ならびに
自己免疫疾患を含む。LMI上に使用されるリガンドは、
限定されるものではないが、MHC分子、天然または合成
のペプチド抗原、タンパク質抗原、分離されたプラズマ
膜、抗体ならびに細胞表面の構成物により結合されるそ
の他のリガンドを含む。
進行する疾患に対する治療として、生体内への単独投与
またはその他の試薬と組合せた投与を含む。LMIが意図
した効果を生ずるような疾患は、ウイルス、細菌および
寄生虫による疾患、がん、移植片対宿主の疾患ならびに
自己免疫疾患を含む。LMI上に使用されるリガンドは、
限定されるものではないが、MHC分子、天然または合成
のペプチド抗原、タンパク質抗原、分離されたプラズマ
膜、抗体ならびに細胞表面の構成物により結合されるそ
の他のリガンドを含む。
LMIおよび化学療法を用いた治療は、腫瘍の増殖およ
び宿主の生存に関して、高い相乗的な効果を有し得、し
かもLMIと化学療法が組合された治療は、腫瘍が確立さ
れてから後にのみ治療が開始された場合、宿主の寿命を
顕著に引延ばし得る。
び宿主の生存に関して、高い相乗的な効果を有し得、し
かもLMIと化学療法が組合された治療は、腫瘍が確立さ
れてから後にのみ治療が開始された場合、宿主の寿命を
顕著に引延ばし得る。
LMIが生体内でCTL応答の生成を増大し得るような作用
機構の完全な特定化において重要な仕事が残っており、
しかもLMIの免疫治療が開始される間に充分に増殖した
腫瘍の劇的な減少または排除を細胞溶解性応答が媒介し
ているかどうかは未だに知られていない。しかし、ここ
に示されるデータおよび結果は、疾患の治療および予防
において、重要な進歩を示唆している。
機構の完全な特定化において重要な仕事が残っており、
しかもLMIの免疫治療が開始される間に充分に増殖した
腫瘍の劇的な減少または排除を細胞溶解性応答が媒介し
ているかどうかは未だに知られていない。しかし、ここ
に示されるデータおよび結果は、疾患の治療および予防
において、重要な進歩を示唆している。
産業への利用 この発明は、研究および免疫処置および／または腫瘍
および哺乳類のその他の細胞が媒介された疾患に対する
免疫治療、たとえば家畜の治療および人のがんへの免疫
治療処置において、その利用が見出だされる。
および哺乳類のその他の細胞が媒介された疾患に対する
免疫治療、たとえば家畜の治療および人のがんへの免疫
治療処置において、その利用が見出だされる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 45/00 A61P 35/00 A61P 37/04 A61P 43/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】直径が0.2ミクロンから８ミクロンの表面
を有するビーズ上に支持された多価リガンド配列を含
む、細胞を活性化するための医薬組成物。 - 【請求項２】前記ビーズの表面に結合されていないリン
ホカイン、抗原、リポソーム、またはリンホカインと抗
原の混合物をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成
物。 - 【請求項３】前記リンホカイン、前記抗原、または前記
リンホカインと抗原の混合物が、リポソームに組込まれ
ている、請求項２に記載の医薬組成物。 - 【請求項４】前記細胞がＴ細胞である、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項５】前記Ｔ細胞が細胞溶解性Ｔリンパ球であ
る、請求項４に記載の医薬組成物。 - 【請求項６】前記細胞がマクロファージ、単球またはナ
チュラルキラー細胞である、請求項１に記載の医薬組成
物。 - 【請求項７】腫瘍を治療するために使用されるものであ
る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項８】化学療法剤をさらに含む、請求項１〜７の
いずれか１項に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US327,822 | 1989-03-23 | ||
| US07/327,822 US5045320A (en) | 1989-03-23 | 1989-03-23 | Large multivalent immunogen |
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|---|---|
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Family
ID=23278220
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2505845A Expired - Fee Related JP3059482B2 (ja) | 1989-03-23 | 1990-03-19 | 大型多価免疫原 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0422164B1 (ja) |
| JP (1) | JP3059482B2 (ja) |
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| US5292513A (en) * | 1992-05-18 | 1994-03-08 | Anthony G. Gristina | Method for nonspecific cellular immune stimulation |
| JPH08505625A (ja) * | 1993-01-11 | 1996-06-18 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート | 細胞毒性ｔリンパ球応答の誘導 |
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| US5951975A (en) * | 1996-06-28 | 1999-09-14 | University Of Pittsburgh | Induction of CTLs specific for natural antigens by cross priming immunization |
| EP0929318B1 (en) | 1996-08-16 | 2004-11-24 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Melanoma cell lines expressing shared immunodominant melanoma antigens and methods of using same |
| US20020151690A1 (en) * | 1997-08-12 | 2002-10-17 | Luxemburg Alain T | Purification of antigen-specific t cells |
| ES2277358T3 (es) * | 1996-09-06 | 2007-07-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Purificacion de celulas t especificas de antigeno. |
| US6087174A (en) * | 1996-12-26 | 2000-07-11 | Johns Hopkins University, School Of Medicine | Growth medium for primary pancreatic tumor cell culture |
| US6387888B1 (en) | 1998-09-30 | 2002-05-14 | American Foundation For Biological Research, Inc. | Immunotherapy of cancer through expression of truncated tumor or tumor-associated antigen |
| JP4688254B2 (ja) * | 1999-02-09 | 2011-05-25 | 独立行政法人理化学研究所 | 腫瘍ワクチン |
| WO2000047226A1 (fr) * | 1999-02-09 | 2000-08-17 | Riken | Vaccins anti-tumeurs |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4861589A (en) * | 1987-03-23 | 1989-08-29 | Trustees Of Boston University | Method for therapeutically treating abnormal cells expressing a major histocompatibility complex class II antigen using cytolytic inducer T4 cells |
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1989
- 1989-03-23 US US07/327,822 patent/US5045320A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-19 JP JP2505845A patent/JP3059482B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-19 WO PCT/US1990/001474 patent/WO1990011085A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-19 DE DE69014543T patent/DE69014543T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-19 EP EP90905955A patent/EP0422164B1/en not_active Expired - Lifetime
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| DE69014543T2 (de) | 1995-06-22 |
| DE69014543D1 (de) | 1995-01-12 |
| WO1990011085A1 (en) | 1990-10-04 |
| JPH04501853A (ja) | 1992-04-02 |
| EP0422164B1 (en) | 1994-11-30 |
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|---|---|---|---|
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