MX2007005808A - Formulaciones inmunoterapeuticas para la induccion de autoanticuerpos bloqueadores de la union de interleucina-2 a su receptor, su uso en el tratamiento del cancer. - Google Patents
Formulaciones inmunoterapeuticas para la induccion de autoanticuerpos bloqueadores de la union de interleucina-2 a su receptor, su uso en el tratamiento del cancer.Info
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Abstract
La presente invencion se relaciona con formulaciones farmaceuticas utiles en el cancer mediante el bloqueo de la union de la Interleucina 2 (IL-2) a su receptor. Mas particularmente la presente invencion se relaciona con formulaciones terapeuticas capaces de incrementar la inmunogenicidad de la IL-2 por su acoplamiento a la proteina transportadora P64k de la Neisseria Meningitidis en adyuvante Montanide ISA 51 para la induccion de autoanticuerpos bloqueadores de la IL-2 a su receptor y metodos efectivos para el tratamiento de tumores, incluyendo el cancer de mama. En otro aspecto la presente invencion se refiere la combinacion terapeutica de la vacuna basada en IL-2 con otras vacunas de cancer basadas en antigenos especificos de tumores o factores de crecimiento tumoral, asi como medicamentos quimioterapeuticos o radioterapia de uso convencional en la practica oncologica.
Description
FORMULACIONES INMUNOTERAPEUTICAS PARA LA INDUCCIÓN DE
AUTOANTICUERPOS BLOQUEADORES DE LA UNIÓN DE INTERLEUCINA-2 A
SU RECEPTOR. SU USO EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER.
Sector Técnico : La presente invención se relaciona con formulaciones terapéuticas capaces de incrementar la inmunogenicidad de la Interleucina-2 (IL-2) para la inducción de autoanticuerpos bloqueadores de la IL-2 a su receptor, útiles en el tratamiento de tumores .
Técnica Anterior: El descubrimiento de la capacidad del Sistema Inmune y específicamente de las células T de reconocer antigenos tumorales ha constituido uno de los pilares fundamentales para el desarrollo de estrategias de manipulación del sistema inmune para el tratamiento de pacientes con cáncer. A partir del desarrollo de metodologías para la obtención de células T específicas que infiltran el estroma de los tumores, conocidos como Linfocitos Infiltrantes de Tumores (LIT), o provenientes de sangre periférica provenientes de individuos vírgenes de tratamiento o luego de recibir tratamiento con vacunas de cáncer, el esfuerzo principal ha estado dirigido a la estimulación de dichas células para el incremento de su capacidad efectora antitumoral in vivo. Consecuentemente, las estrategias principales han estado
dirigidas al incremento de su actividad citotóxica específica contra una variedad de Antígenos Asociados a Tumores. Fundamentalmente, la línea terapéutica principal ha estado concentrada en el crecimiento in vitro de los LIT en medio que contiene IL-2 (Rosenberg, S. A. et al. (1986) Science 233, 1318-1321; Kawakami, Y. et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 6458-6462; Kawakami, Y. et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 3515-3519). Tales intervenciones han resultado en muy limitados resultados clínicos a pesar de lograrse la estimulación de la respuesta inmune celular in vitro . Esto ha conducido a evaluar modalidades terapéuticas basadas en la inmunización activa con vacunas de cáncer con diseño de vectores vacunales que contienen antígenos tumorales e IL-2 con el interés de facilitar la inducción de la respuesta inmune celular efectiva in vivo, aunque sin lograrse los resultados esperados (Rosenberg, S. A., et al. (1998) Nat. Med. 4, 321-327) . Alternativamente, en la actualidad las estrategias clínicas principales han transitado al desarrollo de una modalidad basada en la transferencia adoptiva de células T reactivas contra antígenos tumorales provenientes de los propios pacientes las que se estimulan y expanden ín vitro por su tratamiento con Anticuerpos Monoclonales (AcM) anti-CD3 e IL-2 y posteriormente se les re-inoculan al paciente, seguido de la administración parenteral de IL-2. Esta aproximación
constituye una de las intervenciones actuales principales para el tratamiento de pacientes con cáncer, aunque los resultados terapéuticos continúan siendo discretos (Dudley, M. E., et al. (2002) Science 298, 850-854; Rosenberg, S. A. et al. (2004) Proc Nati Acad Sci U S A. 101 Suppl 2, 14639-45) . El diseño racional de toda esta estrategia terapéutica se basa en el uso de la Interleucina-2 como molécula imprescindible en la activación celular de la respuesta inmune antitumoral (US 6,060,068 y US 5,830,452). La base conceptual de la función de la IL-2 en la inmunidad esta basada por experimentos in vitro. Desde su descubrimiento la IL-2 se reconoció por su capacidad de estimular el crecimiento de células T (de ahí su acrónimo de Factor de Crecimiento de Células T), así como la demostración de que la proliferación y función in vitro de células T puede inhibirse por AcM anti-IL-2 o su receptor anti-IL-2R (Smith, KA. Immunol Rev 51:337-357, 1980). Recientemente ha sido demostrado experimentalmente que los tumores humanos pueden influir en la reducción de la capacidad de respuesta del Sistema Inmune facilitando la generación de células T con capacidad supresora de la inmunidad antitumoral. Estas células han sido caracterizadas en modelos animales y pacientes, y constan de múltiples marcadores de diferenciación, aunque su relevancia varía acorde al modelo en estudio (Bach, J.F. (2003) Nat Rev
Immunol 3, 189-198; Chakraborty, N.G., et al. (2004) Hum Immunol 65, 794-802; Markus, Y.M. y Sykes, M. (2004) J Clin Oncol 22, 1136-1151) . El cluster de diferenciación 25 (CD25) constituye la cadena a del receptor de Interleucina 2. Adicionalmente, las cadenas ß (CD122) y y (CD132) conforman estructuralmente el receptor de esa citocina y se expresan constitutivamente en los linfocitos T en reposo y la activación de éstas células induce la síntesis de la cadena OÍ, la formación del receptor heterotrimérico de alta afinidad y la secreción de IL-2. El CD25 se expresa constitutivamente en el 5 - 10 % de los linfocitos T CD4 + y en menos del 1 % de los linfocitos CD8+ periféricos. Estas células son anérgicas y presentan actividad supresora in vitro (Shevach, E.M. (2002) Nat Rev Immunol 2, 389-400) . Recientemente ha sido demostrado que la administración pasiva de anticuerpos monoclonales anti-CD25 inducen respuesta antitumoral en algunos tumores experimentales, aunque otros se muestran refractarios a tal terapia (Onizuka, S. et al. (1999) Cáncer Res 59, 3128-3133) . La capacidad del Sistema Inmune para la inducción de respuesta contra moléculas propias resulta limitada, específicamente para moléculas solubles como los factores de crecimiento. Sin embargo la inmunización activa con estos factores acoplado a una proteína transportadora y emulsionado en adyuvantes permite la inducción de respuesta inmune contra
estas moléculas (US 5,984,018). Los autoanticuerpos específicos generados contra la molécula autóloga o heteróloga inhiben la unión a su receptor, bloqueando los mecanismos de proliferación desencadenados por esta unión. De los resultados anteriores, se acepta como estado del arte que la respuesta antitumoral es dependiente de la presencia de IL-2. Consecuentemente, decidimos caracterizar in vivo el impacto sobre la evolución tumoral de autoanticuerpos anti-IL-2 inducidos por la inmunización activa con IL-2 acoplada a una molécula transportadora en adyuvante. Sorprendentemente, la inducción de autoanticuerpos bloqueadores de la unión de Interleucina-2 a su receptor promueve la reducción del crecimiento tumoral, incluso en tumores insensibles al efecto antitumoral que se induce por la administración pasiva de anticuerpos monoclonales anti-CD25. Adicionalmente, la presencia de tales autoanticuerpos no afecta la respuesta inmune a vacunas de cáncer en los mismos individuos.
Descripción detallada de la invención: La presente invención se relaciona con formulaciones terapéuticas que tienen un efecto en el tratamiento de tumores, para lo cual el papel del Sistema Inmune del individuo es importante. Más particularmente la presente invención comprende la generación de formulaciones inmunoterapéuticas para la inducción de autoanticuerpos
bloqueadores de la unión de la Interleucina-2 a su receptor, capaces de inhibir el crecimiento de tumores. Es objeto de la presente invención una formulación terapéutica que inhiba la unión de la IL-2 a su receptor, útil en el tratamiento de individuos con cáncer y caracterizada porque dicha formulación comprende IL-2 o péptidos derivados de esta molécula y acoplados a una proteína transportadora, adicionalmente contiene un adyuvante apropiado. Particularmente la formulación terapéutica de la presente invención comprende la proteína transportadora P64k derivada de Nisseria Meningitidis y el adyuvante es seleccionado del grupo que comprende hidróxido de alúmina y Montanide ISA 51. En una representación de la presente invención la formulación terapéutica comprende un conjugado químico entre la IL-2 y la P64k. En otra representación dicha formulación comprende una proteína de fusión entre la IL-2 o péptidos derivados de la misma y la P64k. También forma parte de la presente invención una formulación terapéutica que inhiba la unión de la IL-2 a su receptor, útil en el tratamiento de individuos con cáncer y que comprende un anticuerpo monoclonal específico contra la IL-2 humana (hIL-2 ) . Es también objeto de la invención un método de tratamiento de un paciente de cáncer que requiere del bloqueo de la unión de la IL-2 a su receptor para desencadenar una respuesta inmune
adecuada contra el tumor, que comprende la administración de una composición vacunal que contiene IL-2 o anticuerpos contra IL-2. En otro aspecto la presente invención se refiere a la combinación terapéutica de la vacuna basada en IL-2 con otras vacunas de cáncer basadas en antígenos específicos de tumores o factores de crecimiento tumoral, así como medicamentos quimioterapéuticos o radioterapia de uso convencional en la práctica oncológica. El termino "combinación terapéutica" se refiere tanto a una combinación física (ej en forma de mezcla) como a la asociación de dos compuestos como entidades diferentes y separadas (ejemplo en forma de juegos de reactivos) y cuando son usadas en combinación para tratar a un paciente. Así, combinaciones farmacéuticas son aquellas combinaciones útiles en el esquema de tratamiento que involucra la administración de dos compuestos, ya sea tanto por asociación física como por dosis independientes administradas al mismo paciente en el curso de la terapia. El termino "vacunas de cáncer" se refiere a un agente útil en la inmunoterapia activa de forma tal que provoque en el sujeto sometido a tratamiento una respuesta inmune que reconozca el antígeno utilizado en la vacuna y que pueda ser medida .
1.- Obtención de una composición inmunogénica.
La composición vacunal de la presente invención contiene como principio activo la interleucina 2 humana recombinante (hlL-2r) acoplada a una proteína transportadora, preferiblemente la proteína derivada del complejo de membrana externa de Nisseria Meningitidis P64k (EP 0474313 A2 y US 5,286,484). Adicionalmente esta composición vacunal contiene un adyuvante apropiado . La composición vacunal de la presente invención utiliza como adyuvante preferiblemente Montanide ISA 51. El acoplamiento entre la hIL-2r y la proteína transportadora puede ser por conjugación química o por construcción de una proteína de fusión obtenida por técnicas de ingeniería genética .
- Obtención de una composición vacunal que contiene hIL-2r acoplada a la proteína P64k por conjugación química. Para la obtención de la proteína conjugada entre la hIL-2r y la proteína P64k se mezclan ambos componentes en una proporción que puede variar desde 20:1 hasta 5:1 (moles de hIL-2r por mol de la proteína P64k), preferiblemente 10:1
(moles de hIL-2r por mol de la proteína P64k) . A dicha mezcla se le añade glutaraldehído hasta una concentración final que puede estar en el rango entre 0.02 y 0.1 % , preferiblemente
0.5% y se incuba a temperatura ambiente (TA) entre 1-5 horas. Por último se somete a diálisis extensiva contra solución salina tamponada con fosfato (SSTF) .
La comprobación de la reacción de conjugación se realiza mediante una electroforesis en geles de poliacrilamida usando SDS al 10% (Laemmli UK (1970) Nature 277,680-685).
- Obtención de una composición vacunal que contiene hIL-2r acoplada a la proteína P64k en forma de proteína de fusión. El gen que codifica para la IL-2 humana (447 pb) se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos. El fragmento de ADN resultante es digerido y ligado en un sitio de unión específico a un vector de expresión en el cual se encuentra clonado el gen que codifica para la proteína transportadora, de manera que la proteína resultante incluye una copia o mas de las dos moléculas. Se puede utilizar cualquier vector de expresión tanto de células superiores (mamíferos) como inferiores (bacterias o levaduras) . El vector también puede incluir seis histidinas en el extremo N-Terminal de la proteína transportadora. El plásmido resultante es verificado por análisis de restricción en geles de agarosa, análisis de la secuencia de ADN usando la enzima secuenasa 2.0 (Amersham-USB) , y finalmente, análisis de la producción de la proteína de fusión en cualquier cepa de expresión de Eschericia coli, mediante la técnica de "Western Blotting", usando un anticuerpo monoclonal específico contra hIL-2. Para obtener la proteína se rompen las paredes bacterianas usando un método de ruptura fuerte y luego se purifica la proteína por
una combinación de métodos de precipitación diferencial con sulfato de amonio y métodos cromatográficos . Finalmente, la proteína es filtrada en condición estéril y conservada a -20°C o liofilizada y conservada a 4°C hasta su uso posterior.
- Obtención de composiciones vacunales que contienen péptidos derivados de la hIL-2r conjugados químicamente a la proteína P64k o acoplados a la misma en forma de proteína de fusión. Péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos de la IL-2 obtenidos por síntesis química se pueden acoplar por conjugación química a la proteína P64k, como se describe en US 5,984,018. Alternativamente, la proteína de fusión de péptidos derivados de la hIL-2r y la proteína P64k, se obtiene esencialmente por el mismo método que el descrito en el epígrafe anterior. Ejemplos de estos, son péptidos que estén comprendidos en las regiones señaladas a continuación:
1 ) Pépt ido N33-A50 Total de aa : 18 Secuencia: NPKLTRMLTFKFYMPKKA
2) Péptido t113_t133 Total de aa : 21 Secuencia: TIVEFLNRWITFCQSIISTLT
- Electroforesis del conjugado químico hIL-2r-P64k.
Se realiza mediante una electroforesis en geles de poliacrilamida usando SDS al 10% (Laemmli U.K. (1970) Nature 277,680-685) . Se aplican 15 µg de muestra por pozo y se tiñe con Coomassie azul.
2. - Caracterización del efecto producido por la composición vacunal que contiene hIL-2r y la proteína P64k. Estudios preclínicos .
- Inmunogenicidad de la composición vacunal. Para estudiar la inmunogenicidad en animales de la preparación vacunal de la presente invención se utilizan ratones BALB/c entre 8 y 12 semanas de edad, hembras, de 18-20 g de peso. Durante la realización de los experimentos los animales se mantienen bajo condiciones de alimentación y manipulación establecidas en los Procedimientos Normalizados de operación (PNO), según la Buenas Prácticas de Cuidado y uso de los Animales de Experimentación (ICLAS) .
Se pueden seguir diferentes esquemas de inmunización:
- Esquema A se inmuniza con la vacuna hIL-2r-P64 k/Montanide ISA 51 cuatro dosis de 4 µg equivalentes de hIL-2r conjugada en el preparado vacunal en un volumen de 0.1 mL, administradas por vía intramuscular cada dos semanas, alternando la zona de administración por las cuatro patas.
- Esquema B se inmuniza con la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 cuatro dosis de 10 µg equivalentes de hIL-2r conjugada en el preparado vacunal en un volumen de 0.1 mL, por vía intramuscular, las dos primeras dosis se administran el mismo día alternado la zona de administración en las patas posteriores y a las dos semanas se administran dos dosis alternando la zona de administración en las patas anteriores.
- Medición de la respuesta de anticuerpos contra la hIL-2r inducidos por la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51. Los títulos de autoanticuerpos bloqueadores pueden ser detectados en suero por cualquiera de los métodos disponibles en el estado del arte para la medición de autoanticuerpos o por detección de la respuesta inmune específica en sangre periférica, tanto por medición de anticuerpos específicos como por medición de células B específicas. Los anticuerpos contra la hIL-2r inducidos por la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 se pueden determinar empleando la técnica de ELISA (Ensayos Inmunoenzimáticos indirectos en fase sólida) indirecto utilizando los sueros procedentes de los animales sometidos a inmunización. Según se describe: las placas de microtitulación de 96 pozos de fondo plano (Costar, High Binding, USA) se recubren con 50 µL/pozo del hIL-2r, preparado a una concentración de 10 µg/mL en solución tampón carbonato-bicarbonato 0.1M, pH 9.6. Las placas se incuban
toda la noche a 4°C, y luego se lavan 2 veces con 200 µL/pozo de PBS (Solución salina tamponada de fosfato) conteniendo 0.05 % de Tween 20 (SSFT-Tween 20). Después de incubar 1 hora a 37°C con 100 µL/pozo conteniendo 1 % de seroalbúmina bovina (SSFT-SAB 1 %), se lavan las placas con 200 µL/pozo de SSFT-Tween 20 y luego se les añaden a las placas 50 µL/pozo de las muestras de suero a diferentes diluciones en SSFT-SAB 1 %. Las placas se incuban 1 hora a 37 °C, posteriormente se lavan con SSFT-Tween 20 y se les añaden 50 µL/pozo de un suero de carnero anti-inmunoglobulina de ratón conjugado a fosfatasa alcalina (Jackson Immunoresearch Laboratories) diluido 1/5000 en SSFT-SAB, incubándose 1 hora a 37°C. Luego de un nuevo lavado, se adicionan 50 µL/pozo de la solución sustrato, consistente en 1 mg/mL de p-nitrofenilfosfato (Sigma) en solución tampón dietanolamina, pH 9.8. La absorbancia del producto de la reacción se mide después de incubar las placas 30 minutos a temperatura ambiente (TA) , en un lector de ELISA (Organon Teknika, Austria) a 405 nm.
- Medición de la respuesta de anticuerpos contra la hEGF inducidos por una vacuna basada en EGF. Los títulos de autoanticuerpos bloqueadores pueden ser detectados en suero por cualquiera de los métodos disponibles en el estado del arte para la medición de autoanticuerpos o por detección de la respuesta inmune específica en sangre periférica, tanto por medición de anticuerpos específicos
como por medición de células B específicas. Los anticuerpos contra la hEGF inducidos por una vacuna basada en EGF se pueden determinar empleando la técnica de ELISA (Ensayos Inmunoenzimáticos indirectos en fase sólida) indirecto utilizando los sueros procedentes de los animales sometidos a inmunización, según se describe en González, G., et al. (2002) Vaccine Research 5, 233-244.
- Efecto sobre la proliferación de la línea CTLL-2 tratada con suero de animales vacunados con hIL-2-P64k/Montanide ISA 51 o con un Anticuerpo Monoclonal (AcM) específico a la hlL-2r. Las células CTLL-2 dependientes de IL-2 se mantienen en continua proliferación en RPMI-1640 conteniendo lU/mL de hlL-2h. El cultivo de la línea CTLL-2 se realiza en frascos de 75 cm2 en 25 mL de RPMI-1640 con Suero Fetal de Ternera (SFT) del 8 al 20 %, a una densidad entre 0.5x105 -106 células por mililitro en suspensión. Las células son usadas dos días después de expandidas. Para realizar el ensayo se extraen las células, se lavan no menos de cuatro veces con RPMI-1640 o SSFT. Se agregan 5x103 células en cada pozo de la placa de micro titulación de 96 pozos de fondo plano (Costar, High Binding, USA) . Estas células son tratadas con suero de animales que han sido inmunizados con la vacuna hIL-2-P64k/Montanide ISA 51 y cuyos títulos sean de 1:10 000 contra la IL-2, o con un AcM
específico contra IL-2. Además se añade lU/mL de hIL-2r. La placa se incuba por 24 horas en un ambiente húmedo a 37 °C en una incubadora de C02 al 5 % . Posteriormente se agregan 1 µL de timidina por pozo y se incuba de 18 a 24 horas. Luego se lleva a cabo la medición de la incorporación de timidina con un contador de centelleo líquido. Toda la manipulación se realiza en un ambiente estéril.
3- Efecto antitumoral de la composición vacunal hIL-2-P64k/Montanide ISA 51. Estudios pre-clínicos . Para estudiar el efecto antitumoral en animales de la preparación vacunal de la presente invención se utilizan ratones BALB/c entre 8 y 12 semanas de edad, hembras, de 18-20 g de peso. Los animales pueden ser vacunados con la vacuna hIL-2-P6 k/Montanide ISA 51 según los esquemas A y B detallados anteriormente y una semana después de la inmunización se les inoculan 5x104 células del tumor F3II por vía subcutánea en la mama. Se miden periódicamente los diámetros mayor y menor de los tumores. Sorprendente e inesperadamente los autores de la presente invención han encontrado que el bloqueo de la unión de la IL-2 a su receptor en sujetos portadores de tumores malignos, la respuesta inmune contra dicho tumor es mayor, provocando una disminución del tamaño tumoral. El estado de la técnica anterior indicaba que tal acción provocaría una inhibición de la respuesta del sistema inmune del individuo contra el
tumor . Los autores han encontrado que este efecto sobre el crecimiento del tumor se obtiene cuando los niveles de IL-2 circulante disminuyen considerablemente tanto cuando el sujeto es sometido a terapia activa con la composición vacunal de la presente invención como cuando dicha disminución se logra aplicando terapia pasiva con anticuerpos monoclonales que reconocen la IL-2. De ahí que la presente invención resulte de innegables ventajas para el tratamiento de pacientes que sufren de tumores malignos y proporciona un método de vacunación con IL-2 eficaz, sencillo y mucho menos molesto y agresivo para los pacientes que los tratamientos convencionales usados en estos casos. Los siguientes ejemplos incluyen los detalles experimentales y permiten ilustrar la eficacia inmunológica de las composiciones vacunales objeto de la invención.
EJEMPLOS : La IL-2 humana recombinante (hIL-2r) se obtuvo comercialmente (US 5,614,185) para preparar la composición vacunal de la presente invención. La proteína de membrana P64k, de Neisseria Meningitidis usada en el preparado vacunal se obtuvo por vía recombinante y esta descrita en EP 0474313 A2 y US 5,286,484).
EJEMPLO 1 : Respuesta de anticuerpos inducidos por la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51. Para promover la inmunogenicidad de la Interleucina-2 humana se puede conjugar químicamente a la proteína P64k de la Neisseria Meningitidis, que actúa como proteína transportadora. Esta conjugación se puede realizar por el método de Glutaraldehído (US 5,984,018). Por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% se verifica la eficiencia de la conjugación al aplicar muestras de cada uno de los componentes por separado (hIL-2r, P64k) comparado contra el conjugado químico hIL-2r-P64k y un patrón estándar de peso molecular. Se puede comprobar que se forma un conjugado debido a la aparición de un continuo en la banda en la que se aplicó la hIL-2r-P64k (Figura 1) . Para evaluar la respuesta de anticuerpos contra la hIL-2r inducida por la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 se inmunizaron ratones de la cepa BALB/c, con los esquemas de inmunización A y B. Se utilizó como control positivo un suero hiperinmune de animales respondedores a la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 y como control negativo un suero pre-inmune. Se definió como título de anticuerpos en los animales inmunizados, la mayor dilución a la cual la densidad óptica de los sueros fue mayor que el valor medio de la densidad óptica del suero preinmune más cinco veces la desviación estándar. Para definir el título en los animales controles se utilizó el mismo
criterio anterior excepto que se utilizó SSFT-SAB 1% en lugar de un suero pre-inmune como control negativo. Se indujo respuesta de Acs llegándose alcanzar títulos desde 1:100 hasta 1:50000. Este protocolo de inmunización dura alrededor de 52 días, por lo que era necesario hacer modificaciones para lograr los mismos o superiores resultados de títulos de Acs en el menor tiempo posible, así que utilizamos el esquema de inmunización B y obtuvimos similares resultados según se muestra en la Figura 2.
EJEMPLO 2 : Ensayo de proliferación de la línea CTLL-2 tratada con sueros de animales vacunados con hIL-2-P64k/Montanide ISA
51. Se evaluó si los anticuerpos presentes en los sueros de los animales vacunados con hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 eran capaces de unirse a la hIL-2r, para ello se realizó un ensayo de proliferación in vitro utilizando la línea CTLL-2, la cual es una línea dependiente de IL-2. Estas células se cultivaron en placas de cultivo con una dosis de hIL-2r necesaria para que estas proliferaran y fueron tratadas con diferentes diluciones de los sueros de animales que tuvieron títulos de Acs de alrededor de 1:10000 contra hIL-2r. Se observó que a medida que la concentración de anticuerpos en los pozos con las células CTLL-2 era mayor (dígase muestras de suero menos diluidas) entonces mayor era la inhibición de la proliferación de la línea CTLL-2 (Figura 3) . Demostrando de
esta manera que los Acs presentes en los sueros de animales vacunados eran capaces de inhibir la actividad biológica de la hIL-2r.
EJEMPLO 3 : Experimentos antitumorales en animales tratados con la vacuna hIL-2-P64k/Montanide ISA 51. Los animales fueron vacunados con la vacuna hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 según el esquema B, y una semana después de la segunda inmunización fueron retados con 5x104 células del tumor F3II. Los tumores en los animales vacunados con hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 tuvieron una cinética de crecimiento más lenta que el grupo control, que fue inmunizado con SSFT-P64k/Montanide ISA 51 (Figura 4). Observándose diferencias significativas en el tamaño tumoral entre los dos grupos de animales analizados.
EJEMPLO 4 : Ensayo de proliferación de la línea CTLL-2 tratada con un AcM específico anti IL-2. Se evaluó si los anticuerpos específicos contra hIL-2r producidos a partir del hibridoma S4B6 (ATCC # HB-8794) eran capaces de unirse a la IL-2, para ello se realizó un ensayo de proliferación in vitro utilizando la línea CTLL-2. Estas células se cultivaron en placas de cultivo con una dosis de hIL-2r necesaria para que estas proliferaran y fueron tratadas con diferentes diluciones de los anticuerpos contra IL-2. Se observó que a medida que la concentración de
anticuerpos en los pozos con las células CTLL-2 era mayor (dígase muestras de suero menos diluidas) entonces mayor era la inhibición de la proliferación de la línea CTLL-2 (Figura 5) . Se puede observar que con una dilución de los Acs de 1:100 se logra una inhibición de la proliferación de la línea CTLL-2 de más de un 80%. Demostrando de esta manera que los Acs eran capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-2.
EJEMPLO 5: Experimentos antitumorales en animales tratados con anticuerpos monoclonales específicos contra IL-2 y contra CD25 (ATCC - PC61) . Modelo experimental, tumor de mama 3FII.
Los animales fueron tratados con el anticuerpo monoclonal específico (contra hIL-2r o contra CD25 según el caso) por cinco días y dos días después fueron retados con 5x104 células del tumor F3II por vía subcutánea en la mama. Se midieron periódicamente los diámetros mayor y menor del tumor. Los tumores en los animales tratados con el AcM contra IL-2 tuvieron una cinética de crecimiento más lenta que el grupo control, que fue inmunizado con SSFT (Figura 6) . Observándose diferencias significativas en el tamaño tumoral entre los dos grupos de animales analizados. Los tumores en los animales tratados con el AcM contra CD25 (ATCC - PC61) tuvieron una cinética de crecimiento similar que el grupo control, que fue inmunizado con SSFT (Figura 6) . No observándose diferencias significativas en el tamaño
tumoral entre los dos grupos de animales analizados. Estos resultados muestran que aún en tumores donde no resultan eficaces procedimientos capaces de eliminar o disminuir la población celular CD25 positiva, la presencia de anticuerpos bloqueadores de la unión de la IL-2 a su receptor promueve un potente efecto antitumoral.
EJEMPLO 6: Experimentos antitumorales en animales tratados con anticuerpos monoclonales específicos contra IL-2 y contra CD25 (ATCC - PC61) . Modelo experimental, Linfoma EL4. A animales C57BL/6 fueron inoculados subcutáneamente con
5x104 células/ratón del linfoma EL4. Los animales fueron tratados por vía intravenosa con una dosis de 1 mg del anticuerpo monoclonal específico anti-CD25 (PC61) dos días antes de inocular las células tumorales, o con una dosis diaria de 1 mg del anticuerpo monoclonal anti- IL-2 (S4B6) durante 5 días consecutivos, iniciando seis días antes la inoculación del tumor. A otro grupo se le administró simultáneamente los dos anticuerpos monoclonales anti-CD25 y anti-IL-2 en un esquema similar al previamente descrito. El crecimiento de los tumores fue registrado por medición periódica de los diámetros mayor y menor de los tumores. Las mediciones se realizaron dos veces por semana. Las diferencias estadísticas para el tumor EL4 fueron
(*p=0.0232, **p=0.0039, ***p<0.0001 ) .
La Figura 7 muestra que la combinación de ambos anticuerpos tuvo un efecto dramático sobre el crecimiento de los tumores.
EJEMPLO 7: La inducción de autoanticuerpos anti-IL-2 no afecta la respuesta a la vacuna de cáncer EGF Para evaluar si la respuesta de anticuerpos contra la hEGF inducida por la vacuna hEGF-P64 k/Montanide ISA 51, se afectaba por la previa vacunación con hIL-2r, lo que conlleva a la inducción de autoanticuerpos, se inmunizaron animales BALB/c con el preparado vacunal hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 según el esquema A y 9 días después se inmunizaron los animales con el preparado vacunal hEGF-P64k/Montanide ISA 51 o con hEGF/Montanide ISA 51. En todos los experimentos donde se inmunizó con la vacuna de hEGF, se utilizó una dosis de 4 µg equivalentes de hEGF conjugado en el preparado vacunal en un volumen de 0.1 ml, administrada por vía intramuscular. Se utilizó como control positivo un suero hiperinmune de animales respondedores a la vacuna hEGF-P64k/Montanide ISA 51 y como control negativo un suero pre-inmune. Se definió como título de anticuerpos en los animales inmunizados, la mayor dilución a la cual la densidad óptica de los sueros fue mayor que el valor medio de la densidad óptica del suero pre-inmune más cinco veces la desviación estándar. Para definir el título en los animales controles se utilizó el mismo criterio anterior excepto que se utilizó SSFT-SAB 1% en lugar de un suero pre-inmune como control negativo.
Se obtuvo que los títulos de anticuerpos contra EGF inducidos por la vacunación con EGF/Montanide ISA 51 o con hEGF-P64k/Montanide ISA 51 no se afecta por la inducción de autoanticuerpos contra hIL-2r como se muestra en la Figura 8.
EJEMPLO 8 : Neutralización de Interleucina-2 in vivo restaura la actividad citolítica de células de los nodulos linfáticos en sujetos portadores de tumor. El efecto de la neutralización de IL-2 sobre la respuesta inmune a antígenos nominales en un individuo con tumor fue evaluado. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con Ovolbumina
(OVA) (OVA grado VII (Sigma, St. Louis, MO) y poly I:C
( Polyinosinic : polycytidylic acid, (PIC) (Sigma, St. Louis,
MO) , posteriormente se evaluó la actividad citolítica de las células de nodulos linfáticos a un péptido de la OVA. Esta evaluación se realizó in vivo, obteniéndose un máximo de respuesta . La administración de una dosis diaria por 5 días consecutivos de lmg del anticuerpo monoclonal anti-IL-2 por vía intravenosa no afecta la respuesta citolítica en estos animales . Ratones C57BL/6 desafiados con el tumor MB16F10 se convierten en inmunosuprimidos, con una reducida actividad citolítica a células cargadas con el péptido de OVA (péptido OVA275-264 (SIINFEKL) ) . Sin embargo, la administración in vivo de un anticuerpo monoclonal capaz de neutralizar la IL-2 restaura
la respuesta inmune de las células de los nodulos linfáticos (Figura 9) .
EXAMPLE 9: Neutralización de Interleucina-2 in vivo restaura la actividad citolítica de células de los bazos en sujetos portadores de tumor . El efecto de la neutralización de IL-2 sobre la respuesta inmune a antígenos nominales en un individuo con tumor fue evaluado. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con OVA y Poly I:C, la actividad citolítica de las células de bazo a un péptido de la OVA fue evaluado in vivo obteniéndose un máximo de respuesta. Administración de una dosis diaria por 5 días consecutivos de lmg del anticuerpo monoclonal anti-IL-2 por vía intravenosa no afecta la respuesta citolítica en estos animales. Ratones C57BL/6 desafiados con el tumor MB16F10 se convierten en inmunosuprimidos con una reducida actividad citolítica a OVA. Sin embargo, la administración in vivo de un anticuerpo monoclonal capaz de neutralizar la IL-2 restaura la respuesta inmune de las células del bazo (Figura 10) .
EJEMPLO 10 : Conteo de células sanguíneas en animales inmunizados con el preparado vacunal hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51. Con el objetivo de evaluar si la inmunización con el preparado vacunal hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 inducía
cambios en el número de células de la sangre se hizo un conteo de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, tanto de animales inmunizados con el preparado vacunal (según el esquema A) o animales sin vacunar, a los 100 días después de la primera inmunización. Como se muestra en la Figura 11, no se obtuvo diferencias en los conteos celulares entre los grupos analizados.
Breve descripción de las figuras .
Figura 1: Electroforesis del conjugado químico hIL-2r-P64k. Las bandas de izquierda a derecha se corresponden a la P64k, hIL-2r, hIL-2r-P64k y un patrón estándar de peso molecular, respectivamente .
Figura 2 : Títulos de anticuerpos contra hIL-2r inducidos por la vacunación hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 utilizando los dos esquemas de inmunización explicados anteriormente. El eje de las y representa la media geométrica de los títulos de anticuerpos contra IL-2. El eje de las x los grupos que corresponden a animales inmunizados con : Control : P64k/Montanide ISA 51. Esq A IL-2: hIL-2r-P64 k/Montanide ISA 51 según esquema A. Esq B IL-2: hIL-2r-P64 k/Montanide ISA 51 según esquema B.
Figura 3: Proliferación de la línea CTLL-2 en presencia de
hIL-2r y diferentes diluciones de sueros de animales inmunizados con la vacuna hIL-2r-P64 k/Montanide ISA 51 y que tuvieron títulos del orden de 1:1000 hasta 1:50 000.
Figura 4 : Cinética tumoral de animales vacunados con la vacuna de hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 o con P64 k/Montanide ISA 51 (grupo control) y posteriormente retados con el tumor F3II. El eje de las y representa el área tumoral definida como diámetro mayor x diámetro menor escogidos perpendicularmente.
Figura 5: Proliferación de la línea CTLL-2 en presencia de hIL-2r y diferentes diluciones de anticuerpos contra IL-2.
Figura 6: Cinética tumoral de animales tratados con el AcM aIL-2, con el AcM aCD25 o con PBS (grupo control) y posteriormente retados con el tumor F3II. El eje de las y representa el área tumoral definida como diámetro mayor x diámetro menor escogidos perpendicularmente.
Figura 7 : Cinética tumoral de animales tratados con el AcM aIL-2, con el AcM aCD25 o con PBS (grupo control) y posteriormente retados con el tumor EL4. El eje de las y representa el área tumoral definida como diámetro mayor x diámetro menor escogidos perpendicularmente (* significación estadística) .
Figura 8: Títulos de anticuerpos contra EGF inducidos por la vacunación con hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 y con hEGF-P64k/Montanide ISA 51. El eje de las y representa la media geométrica de los títulos de anticuerpos contra EGF. El eje de las x los grupos que corresponden a animales inmunizados con : hIL-2r: hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51. hEGF: hEGF/Montanide ISA 51 hIL-2r+hEGF: hIL-2r-P64k/Montanide + hEGF/Montanide. hEGF/P64k: hIL-2r-P64k/Montanide + hEGF/Montanide. hIL-2r+hEGF/P64k: hIL-2r-P64k/Montanide + hEGF/P64 k/Montanide.
Figura 9: Anticuerpos inducidos a IL-2 restaura la actividad citolítica evaluada en células de nodulos linfáticos en individuos portadores con tumor. Todos los ratones fueron inmunizados subcutáneamente el día 0 con 1 mg de OVA y 100 µg por ratón de Poly I:C y los siguientes dos días fue administrado sólo Poly I:C. El ensayo de actividad citolítica in vivo fue determinada usando células de bazo de animales vírgenes diferencialmente marcadas con el colorante fluorescentes CFSE. Las células con CFSEhigh fueron usadas como blanco y cargadas con
SIINFEKL, mientras que las marcadas CFSElow sin pulsar
sirvieron como control interno y entonces fueron coinyectadas por vía intravenosa en una proporción 1:1 a los animales previamente inmunizados. La actividad citolítica fue evaluada en células de nodulos linfáticos. Control -animales tratados con PBS, aIL-2 -animales tratados con un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-2, MB16F10 -animales igual al control, pero además desafiados con MB16F10, aIL-2+MB16F10 -animales portadores del tumor MB16F10 tratados con un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-2.
Figura 10: Anticuerpos inducidos a IL-2 restaura la actividad citolítica evaluada en células de bazo en individuos portadores con tumor. Todos los ratones fueron inmunizados subcutáneamente el día 0 con 1 mg de OVA y 100 µg por ratón de Poly I:C y los siguientes dos días fue administrado sólo Poly I:C. El ensayo de actividad citolítica in vivo fue determinada usando células de bazo de animales vírgenes diferencialmente marcadas con el colorante fluorescentes CFSE. Las células con CFSEhigh fueron usadas como blanco y cargadas con SIINFEKL, mientras que las marcadas CFSElow sin pulsar sirvieron como control interno y entonces fueron coinyectadas por vía intravenosa en una proporción 1:1 a los animales previamente inmunizados. La actividad citolítica fue evaluada en células de bazo. Control -animales tratados con PBS, aIL-2 -animales tratados
con un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-2, MB16F10 -animales igual al control, pero además desafiados con MB16F10, (XIL-2+MB16F10 -animales portadores del tumor MB16F10 tratados con un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-2.
Figura 11: Conteo de células sanguíneas (leucocitos (G blancos), eritrocitos (G rojos), Plaquetas en animales inmunizados con el preparado vacunal hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51 (IL-2) o con P6 k/Montanide ISA 51.
Claims (17)
- REIVINDICACIONES 1. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, útil en el tratamiento de individuos con cáncer, caracterizada porque dicha formulación comprende al menos uno de: A.- IL-2 o cualquier derivado de esta acoplada a una proteína transportadora genéticamente o por conjugación química y un adyuvante apropiado. B.- Un anticuerpo monoclonal anti-IL-2. C- Una vacuna de cáncer basada en antígenos específicos de tumores o factores de crecimiento. D.- Un anticuerpo monoclonal anti-CD25.
- 2. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1 caracterizada porque dicha formulación comprende la administración simultánea o secuencial de; A más C o A más D o B más C o B más D.
- 3. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1 caracterizada porque dicha formulación comprende IL-2 o cualquier derivado acoplada a una proteína transportadora y un adyuvante apropiado.
- Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 3 caracterizada porque dicha formulación comprende IL-2 acoplada a una proteína transportadora y un adyuvante apropiado .
- 5. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 4, caracterizada porque la proteína transportadora es la proteína P64k derivada de Nisseria Meningitidis.
- 6. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 5, caracterizada porque el adyuvante apropiado es seleccionado del grupo que comprende hidróxido de alúmina y Montanide ISA 51.
- 7. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 6, caracterizada porque comprende Montanide ISA 51 como adyuvante .
- 8. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1, caracterizada porque comprende el conjugado químico entre la IL-2 y la P64k.
- 9. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1, caracterizada porque comprende una proteína de fusión entre la IL-2 y la P64k.
- 10. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1, caracterizada porque comprende una proteína de fusión entre péptidos derivados de la IL-2 y la P64k.
- 11. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 1 caracterizada porque dicha formulación comprende un anticuerpo monoclonal específico contra la IL-2 humana.
- 12. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 2 caracterizada porque dicha formulación comprende la administración de IL-2 o cualquier derivado acoplada a una proteína transportadora y un adyuvante apropiado en combinación con una vacuna de cáncer basada en antígenos específicos de tumores o factores de crecimiento.
- 13. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 12, caracterizada por que la vacuna de cáncer contiene EGF.
- 14. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 2 caracterizada porque dicha formulación comprende la administración de IL-2 o cualquier derivado acoplada a una proteína transportadora y un adyuvante apropiado en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CD25.
- 15. Una formulación terapéutica capaz de producir una respuesta inmune contra la IL-2, según reivindicación 13 caracterizada porque además comprende un anticuerpo monoclonal anti-CD25.
- 16. Las formulaciones terapéuticas de las reivindicaciones 1 a 15, para la manufactura de un medicamento que induzca una respuesta inmune contra la IL-2, capaz de inhibir el crecimiento de los tumores en pacientes de cáncer.
- 17. Uso de la formulación terapéutica de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizada porque inhibe el crecimiento de los tumores.
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