KR20230107810A

KR20230107810A - Pd-l1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원

Info

Publication number: KR20230107810A
Application number: KR1020237015994A
Authority: KR
Inventors: 야네리스 모레라 디아즈; 자비엘 산체즈 라미레즈; 카밀라 가나안-하덴 아얄라; 모니카 베쿠엣 로메로; 마르타 아야라 아비라; 이자벨 곤잘레즈 모야; 소니아 곤자레즈 블란코; 밀라디스 리몬타 페르난데즈; 루이스 아리엘 에스피노사 로드리구에즈; 블라디미르 아르만도 베사다 페레즈; 조지 빅터 가비론도 코울리
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-07-18
Also published as: US20230390369A1; WO2022083805A1; CU20200075A7; MX2023004718A; CN116783221A; JP2023546485A; CU24705B1; EP4234029A1; CA3196460A1; AU2021363436A1

Abstract

천연 PD-L1 분자에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와 감소된 결합능을 갖는, 인간 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1, PD-L1)의 세포 외 도메인의 다량체 응집체를 포함하는 키메라 항원. 본 발명은 추가로 상기 키메라 항원 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 백신 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 상기 키메라 항원은 암 또는 그것의 전이를 치료하기 위한 약물의 제조에 쓰일 수 있다. 본 발명은 또한 필요로 하는 개체에서의 암 또는 그것의 전이를 치료하기 위한 방법을 개시하는데, 상기 방법은 여기 설명된 키메라 항원을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 특징으로 한다.

Description

PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원

본 발명은 생명공학 및 인간 건강 분야에 대한 것이다. 그것은 PD-L1 단백질의 세포 외 도메인의 200개를 넘는 아미노산을 포함하는 키메라 백신 항원에 대한 내용을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항원과 적어도 하나의 아쥬번트를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이 조성물은 PD-L1-매개 생물학적 효과에 대한 중화 활성을 가지는 PD-L1-특이적 면역 반응을 유도하고; 따라서 암 및 그것의 전이에 대한 치료에 쓰일 수 있다.

PD-L1이라 알려진, 계획사 리간드 1(Programmed death-ligand 1)는 40 kDa 유형 1 막통과(transmembrane) 단백질 수용체이고, B7 가족의 일원이다. PD-L1은, 계획 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 및 CD80으로 알려진 다른 막 수용체에 특이적이고 기능적으로 상호작용한다. PD-L1은 Cd274 유전자로 인코딩된 290개 아미노산 단백질이고, 인간 게놈의 염색체 9번에 자리잡았다. 정상 조직에서, PD-L1은 T 세포, B 세포, 골수세포, 수지상 세포, 비림프 기관 유래의 비-조혈세포에서 발현되는데, 또한 많은 종류의 종양에서도 발현된다 (Wang, et al., OncoTargets and Therapy, 2016: 9: 5023-39, Salmaninejad, et al., Journal of Cellular Physiology, 2019: 234: 16824-37).

PD-1/PD-L1 상호작용은 면역 시스템 공격을 회피하는 종양 유도 면역 억제 환경과 관련된 여러 기전에 연관되어 있다. T 세포 상의 PD-1과 종양 세포의 PD-L1 사이의 결합은 T 림프구의 증식과 분화를 줄임으로써 면역 반응의 억제를 유도한다. 또한, 이 상호작용은 T 세포의 아포토시스의 활성화, 아네르기 및 그것들의 기능적인 소진을 유도한다. PD-L1은 많은 악성 종양에서 과발현되고, 나쁜 예후와 연관있다.

그 분자와 그것의 천연 수용체와의 상호작용을 차단하는 항-PD-L1 단클론 항체와 같은 면역치료제를 사용하는 것이 암 치료에서 유망한 대안으로 여겨져 왔다. 항체의 이런 모둠 안에서, FDA가 아테졸리주맙(atezolizumab), 두르발루맙(durvalumab) 및 아벨루맙(avelumab)을 여러 암 유형의 환자의 치료에 대해, 특히 전이성 요로상피세포 암종, 머클세포 암종, 편평 비소세포폐암 및 신장세포 암종을 포함하는 진행 단계(advanced-stage)의 종양 치료에 대해 승인했다(Lee, et al., Molecules, 2019: 24: 1190).

항-PD-L1 단클론 항체로 치료하자 몇몇 임상적인 성공이 나타났지만, 잦은 투여 및 고용량의 치료제를 필요로 하고, 그로 인해 높은 비용과, 폐렴, 심근염, 결장염 등과 같은 부작용이 생긴다(Wang y Xu, JAMIA Open, 2018: 2: 173-8). 많은 경우, 이러한 독성의 심각함으로 인해 수동치료가 지연 또는 중단된다.

한편, 이 단백질 또는 그것의 펩타이드의 대부분을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하는 것과 같이, 항원으로서 PD-L1을 기반으로하는 능동 면역치료를 수행함으로써 이런 문제를 해결하려는 다른 전략들이 시도되고 있다. 무니르(Munir) 등은 두 개의 PD-L1 펩타이드로 in vitro 실험을 했고, DCvacc이라 불리는 백신으로 처치한, 진행된 흑색종 환자로부터 분리한 말초혈액의 단핵구를 그것들이 자극하는 능력을 평가했다. 이 백신은 종양 관련 항원 p53 및 텔로머라제를 인코딩하는 mRNA로 트랜스펙션된 수지상세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이 환자들로부터의 말초혈액 단핵구는 DCvacc에 대한 단지 제한적인 반응성을 가졌다. 그러나, 이 세포들을 in vitro 에서 PDLong1(여기서는 서열번호 23으로 확인됨) 및 PDLong2(여기서는 서열번호 24로 확인됨)이라 불리는 PD-L1-유래의 2개의 펩타이드로 자극하자, 백신에 대한 T 세포 반응성이 상당히 증가했다 (Munir, et al., Oncoimmunology, 2013: 2: e23991).

앞선 발견 및 다른 추가적인 자료에 기초하여, PDLong1 펩타이드를 항원으로 사용하는 PD-L1을 표적으로 하는 펩타이드 백신이 개발되었다. 임상 1상 연구에서 CD4+ 및 CD8+ T 림프구에 대한 에피토프를 포함하고 있는 이 펩타이드를 몬타나이드(Montanide™) 아쥬번트와 혼합하고 다발성골수종 환자에게 투여했다. 이 항원 제제는 인간에서 안전하고 면역원성이다. 백신접종한 암 환자의 피부 생검으로부터 얻어낸 림프구는 이 펩타이드의 존재 하에 활성화되었다. 그러나, PD-L1-특이적 항체 반응은 면역화된 환자에서 탐지되지 않았다 (Jørgensen, et al., HemaSphere, 2019: 3: 631-2). 이런 요소는 한계를 나타낼 수 있는데, 왜냐하면 항체 반응이 이런 유형의 치료에서 관련 요소임이 증명되었기 때문이다. 이 리간드에 대한 항체가 PD-L1과 그것의 수용체 간의 상호작용을 막을 수 있고, 또한 T-세포 매개 항암 면역을 증강시킨다.

또한 데옥시리보핵산(DNA) 백신을 기반으로 하는 능동 면역 치료 전략이 개발되었다. 이 DNA 백신은 PD-L1의 세포 외 도메인을 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 살아있는 약독화 박테리아(Salmonella typhimurium 종)를 이용하여 구강 경로로 투여한다. 이 전략은 특허출원 WO 2018/167290에 공개되었다. 박테리아 감염 기전을 활용하여, 세포 독성 CD8⁺ 림프구가 생성되고 주요 조직적합성 복합체(MHC) 모둠 I 연관 PD-L1 펩타이드를 나타내는 수지상 세포에 의해 활성화되었다. 이 세포 독성 림프구는 PD-L1 양성 종양 세포를 제거할 수 있었다. 면역 반응의 세포성 가지 활성에 더해, 이 백신은 또한 PD-L1에 특이적인 항체 반응을 유도했다. 그러나, 유도된 항체값이 상대적으로 낮았다 (Wieckowski, et al., Journal of Clinical Oncology, 2018: 36: 74). 이런 요소는 능동 면역 치료의 이 변형체의 성공에 호의적이지 않을 수 있다.

PD-L1의 세포 외 도메인 (Phe 19-Glu 228) 및 디프테리아 독소(DTT)를 기반으로 하는 융합 폴리펩타이드로 능동면역치료하는 것이 특허출원 WO 2014/183649에 설명되었다. 이 두 번째 폴리펩타이드 부분은 강력한 CD4+ T 세포 매개 면역 반응을 촉진하기 위해 포함되었다. PD-L1의 세포 외 도메인은 GST (글루타치온 S-트랜스퍼라제) 발현 시스템에서 생산되었다. 이 발현 시스템은 그것의 정확한 접힘과 3차원적 형성을 보증하고, 그것은 융합 단백질의 구조적인 완전성을 보장한다. 프로인드 아쥬번트와 혼합된 백신 항원(43.5 kDa)은 PD-L1-특이적 항체 반응 및 세포 독성 T 세포를 유도했다. 이 면역 반응의 효과기는 종양 성장 및 전이 이식을 억제한다 (Lin, et al., Molecular Therapy Oncolytics, 2019: 14: 222-32). 그러나, 현재 가장 강력한 아쥬번트라고 여겨지는 프로인드 아쥬번트의 사용을 고려한다면 유도된 항체값이 상대적으로 약하다고 여겨질 수 있다.

따라서, 더 높은 면역원성을 가질 뿐만 아니라 전-종양 활성을 무력화시키는 새로운 PD-L1-기반 백신 항원의 개발이 여전히 관심의 영역에 있다. 이러한 전략은 투여할 항원의 양을 증가시킬 필요 없이, 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 동시에 일으킬 수 있어야 한다.

본 발명은 천연 PD-L1 단백질에 비해 PD-1 및 CD80 수용체에 대해 낮은 결합능을 갖는 다량체 응집체를 형성하는 계획사 리간드 1(PD-L1)의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원을 제공함으로써 앞서 언급된 문제를 해결한다. 상기 키메라 항원은 구조적으로 응집되고, 그것이 이 폴리펩타이드 안에 존재하는 PD-L1의 세포 외 도메인의 형태가 천연 리간드 속의 상기 도메인의 형태와 비교했을 때 변형되도록 한다.

본 발명에서, 인간 PD-L1의 세포 외 도메인은 PD-L1의 아미노산 Phe 19 에서 Arg 238 사이의 구역을 가리킨다. 본 발명의 일 실시예에서, 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 상기 키메라 항원은 또한 세균에서의 그것의 발현을 증가시키기 위한 아미노산 말단 및 친화도 크로마토그래피에서 그것의 정제를 돕기 위한 카르복시 말단도 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 키메라 항원은 서열목록 1로 확인되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 서열목록 1과 적어도 95%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다.

서열목록에서 서열목록 1로 표시되는 항원은 수막구균(Neisseria meningitidis)으로부터의 LpdA 단백질의 아미노 말단의 첫 47개의 아미노산, PD-L1 분자의 세포 외 도메인(Phe 19부터 Arg 238까지)을 포함한다. 두 구역은 두 폴리펩타이드 사이에서 링커로 기능하는 13개의 아미노산으로 분리되어 있다. 본 발명의 관심 단백질은 18개의 부분적으로 겹쳐지는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 폴리머라제 연속 반응 기술로 유전자를 조립하는 것을 시작으로 얻어졌다. 발현 벡터에서 클로닝하기 위해서, 발현 벡터의 특성에 따라 디자인된 프라이머를 사용하였고, 거기에 DNA가 삽입되고 최종적으로 시퀀싱되었다. 서열을 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에 공개된, PD-L1의 세포 외 도메인에 대해 보고된 서열 중 하나인 인식번호 Q9NZQ7 (https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)로 확인되는 서열과 비교하였고 그것의 정체성이 확인되었다. 상기 설명된 방법으로 얻어진 폴리펩타이드는 바이러스, 박테리아, 효모, 파지, 식물 또는 포유류 세포 안의 발현 벡터로, 그에 따라 삽입부위를 바꿔서 클로닝될 수 있다. 일단 유전자 구성체가 얻어지면, 그것의 서열을 전통적인 자동 시퀀싱 방법을 사용하여 확인해야 한다.

특정 실시예에서, 키메라 폴리펩타이드를 얻기 위해, pM238 Escherichia coli 발현 벡터를 사용하였고, 그것은 다른 여러 요소들 중에서, 트립토판 프로모터, N. meningitidis의 LpdA 단백질의 아미노 말단에 해당하는 47개의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(특허 EP0816506B1), 6개의 히스티딘 및 T4 종결자 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이 발현 벡터는 또한 선택 마커로서 암피실린 저항성 유전자를 가지고 있다. 얻어진 융합 폴리펩타이드를 PKPD-L1이라 이름 붙였다.

우선 키메라 폴리펩타이드를 정제하고, 크기 배제 HPLC(size exclusion HPLC)에 의한 분석을 수행하자 칼럼의 빈 공간에 용리된 주요 정점을 나타냈는데, 칼럼에 할당된 것이 전체 단백질의 90%에 달했다. 이 주요 정점은 670 kDa를 초과하는 분자량의 응집된 단백질 PKPD-L1을 함유하며, 그것은 PD-L1 천연 단백질의 세포 외 도메인에 해당하는 분자량 26 kDa과는 다르다(실시예 2). 놀랍게도, 이 융합 폴리펩타이드는 높은 분자량 응집체를 형성하도록 하는 구조 변경을 가진다. 이러한 응집체의 안정적 형성을 통해 다음과 같은 특징을 가지는 PD-L1 변형체가 된다 : (1) 몇몇 PD-L1 분자의 공간적 배열이 천연 PD-1/PD-L1 또는 CD80/PD-L1 상호작용의 특정 화학양론을 변형시키고, 생물학적으로 활성인 천연 PD-L1 변형체와 비교해서 이 융합 폴리펩타이드가 상기 수용체에 덜 결합하게 한다; (2) 상기 응집의 결과로서 몇몇 PD-L1 분자의 결합이 에피토프의 반복된 노출을 만들어서, 그것이 다시, PD-L1이 원래의 3차원 구조를 가지는 단량체로 발견되는 때 얻어지는 것에 비해 면역원성의 증가를 일으킨다. 이러한 발견은 훨씬 효과적이고 더 안전한 새로운 치료법의 발전을 뒷받침하고, 그것이 암의 제어에 적용될 수 있을 것이다.

본 발명은 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원(이것은 천연 형태의 PD-L1에 비해 PD-1 및 CD80 수용체에 낮은 결합력을 갖는 다량체를 형성한다) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 백신 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 구조적으로 응집된 PKPD-L1 폴리펩타이드의 탁월한 특성과, 아쥬번트와 결합했을 때의 그것의 향상된 면역원성은, 다른 PD-L1 변형체와 비교할 때, 안전성 프로파일을 손상시키지 않으면서 이 폴리펩타이드에 면역학적 우위를 제공한다. 그것의 안전성은 또한, 특이적 항체를 이용한 수동 면역요법 전략과 비교해서, 반복해서 투여되는(만성적 치료 때문에) 백신의 일부로서 유리함을 나타낸다. 이러한 요소는 PKPD-L1을 PD-L1 발현이 증가되는 것과 연관 있는 질병을 치료하기 위한 높은 잠재성을 가진 항원으로 만든다. 본 발명은 아쥬번트와 조합된, 인간 PD-L1의 구조적으로 응집된 재조합 키메라 폴리펩타이드 발현체를 투여하는 것을 특징으로 하는 특이적인 능동 면역치료법을 기술한다.

본 발명의 일 실시예에서, 약학적 조성물에서 백신 아쥬번트는 유성 아쥬번트, 무기염, 프로테오리포좀 및 강글리오시드와 결합한 프로테오리포좀으로 구성된 모둠에서 선택된다. 면역 반응의 발달을 촉진시키기 위해서, 본 발명의 키메라 항원은 면역증강제 및/또는 아쥬번트와 조합될 수 있다. 이러한 화합물의 성격은 일반적으로 다양하며, 예를 들어 무기염 화합물(예를 들어, 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 인산칼슘); 가용성 사이토카인(즉, IL-2, IL-15, IL-12, GM-CSF, IFN-감마, IL-18); 막 수용체 (CD40, CD154, 주면역적합성 복합체(MHC) I의 불변 사슬, LFA3 등); 사포닌(QS21와 같은); CpG와 같은 올리고뉴클레오타이드; 리포폴리사카라이드와 같은 당지질; 유제(프로인드 아쥬번트, 합성 아쥬번트 제제(synthetic adjuvant formulation, SAF), MF59, 몬타나이드™ 등), 리포좀, 나노입자 및 비로솜(virosomes); 미립자 아쥬번트, 폴록사머, 바이러스 유래 아쥬번트(예: HBcAg, HCcAg, HBsAg) 및 세균 유래 아쥬번트(NAcGM3-VSSP, N-GliGM3-VSSP와 같은); 열 불안정성 내독소, 콜레라 독소 및 돌연변이 독소(예컨대 LTK63 및 LTR72)와 같은 점액 아쥬번트이다.

면역원은 독성이 없거나 부정적 치료 효과를 나타내지 않는, 당업자에게 알려진 약학적 용도로 허용되는 담체에 담겨 투여될 수 있다. 본 발명에 설명된 실시예는 특정 완충액 또는 완충액의 조합의 사용과 그것의 안정성을 증가시키는 데 기여하는 부형제의 사용을 어떤 식으로든 제한하지 않는다.

다른 구현예에서, 본 발명은 천연 형태의 PD-L1에 비해 PD-1 및 CD80 수용체에 낮은 결합능을 가지는 다량체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원의 암 또는 그것의 전이의 치료를 위한 약물 생산을 위한 용도를 제공한다. 그것은 PKPD-L1 융합 폴리펩타이드의 상당히 안정적인 구조 및 높은 분자량 덕인데, 그것은 PD-L1 펩타이드의 단백질 비융합 변형체 또는 혼합물에 비해 면역원성 특성을 증가시킨다. 인산 알루미늄 또는 VSSP (Very small size proteoliposomes, 특허 US6149921; 국제출원 WO201986056A1) 아쥬번트와 함께 투여하는 융합단백질 PKPD-L1은 자가 분자에 대한 면역 내성을 깨고 천연 PD-L1 특이적 체액 면역 및 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 백신의 기초가 된다. 이 면역 반응은 단클론 항체 수동 면역치료법과 비교할 때, 또는 천연 PD-L1 단백질 또는 PD-L1 펩타이드의 혼합물을 기초로 하는 항원으로부터 생성되는 면역 반응과 비교할 때 질적으로나 양적으로 뛰어나다. 이것은 항-종양 활성의 증가를 촉발하는 PKPD-L1 폴리펩타이드 면역원성을 증가시키고, 다른 평가된 전략에 의해 생성되는 것들에 비해 뛰어나다.

본 발명에서 설명되는 종양 성장에 대한 억제 효과는 그것들의 가능성 있는 조합을 배제함이 없이 여러 기전에 의거할 수 있다. 백신 접종으로 생성되는 다클론 항-PD-L1 항체 반응은, 종양세포 표면 상에 나타나는 PD-L1 리간드 및 세포 독성 CD8 + T 림프구의 막에 나타나는 PD-1 사이의 상호작용을, 그것들의 기능적인 불활성화를 피하면서 차단할 수 있다. 한편으로, 백신 접종에 의해 생성되는 항체는, 내부화 과정을 통해 종양 세포 표면 상의 PD-L1 수준을 낮출 수 있다. PD-L1의 감소는 악성 종양 세포가 세포 독성 CD8 + T 림프구 시스템을 불활성화 시키는 능력을 낮출 수 있을 것이다. 또한, 종양 세포에서 PD-L1 리간드가 낮게 발현되면 상피 세포가 유사한 표현형을 갖도록 촉진하고, 따라서, 그것의 전이 능력을 음으로 조절한다. 항체 반응의 다클론 특성은 상기 설명된 생물학적 사건들의 효율성에 중요한 인자이다.

더욱이, PKPD-L1로 면역화하면 1차 종양 세포와 그것의 전이에 대한 특정 세포 독성 림프구를 유도하고, 그것이 주면역적합성 복합체 분류 I의 관점에서 PD-L1 펩타이드를 강력하게 나타낸다. 엄청난 수의 림프구를 생성하는 PKPD-L1 융합 단백질의 능력에 더해, 그것이 CD4 + 및 CD8 + T 세포 모두를 활성화시킬 수 있고, 그로 인해 그것의 클론의 다양성을 얻을 수 있다는 것이 이 융합 단백질로 면역화하는 것의 장점이다. PD-L1 단백질의 세포 외 구역으로부터의 200개를 초과하는 아미노산을 포함하는 키메라 단백질로 면역화함으로써, 다음이 보장된다: (1) CD4+ 도움 림프구 및 세포 독성 CD8 + 림프구 모두를 활성화할 수 있는 선형 에피토프의 동시 제시로, 그것은 종양에 대한 더 효율적인 면역 반응을 보장한다; (2) CD4+ 도움 림프구 및 세포 독성 CD8+ 림프구를 위한 몇몇 제한된 에피토프의 제시로, 그것이 양 세포 유형에 대한 다양한 세포 클론이 나타나게 하는 것을 보장하고, 그것이 또한 종양에 대한 더 효율적인 면역 반응으로 번역될 수 있다; (3) MHC 분류 I 또는 II의 다른 대립 형질을 가지는 환자 개체군에서의 백신 접종의 맥락에서 몇몇 에피토프의 제시는 특이적인 항-PD-L1 체액성 및/또는 세포성 반응을 보이는 개체의 수를 늘어나게 한다. 이러한 요소는, 주면역적합성 복합체의 오직 하나의 대립형질에 제한되는 펩타이드를 포함하는 면역 접종을 했을 때는 존재하지 않거나 매우 제한되는 유익한 장점을 구성한다.

PKPD-L1 단백질로 면역 접종한 후에 생성되는 면역 반응의 이러한 모든 특성은 천연 PD-L1 분자로 하는 능동 면역 치료 전략과 비교했을 때 더 큰 적절성을 가지게 된다. 중요한 요소는 동일한 양의 항원으로 월등한 면역 반응을 얻는다는 것이다. 이 특성은 PKPD-L1과 관련된 인간의 면역치료 전략이 생산과 안전의 관점에서 장점을 가짐을 의미한다. PKPD-L1 폴리펩타이드는 그것의 천연 변형체에 비해 생물학적 활성을 덜 가지는 분자이고, 따라서 항원을 높은 용량으로 투여하는 것이 그것의 안전성 프로파일을 손상시키지 않는다.

본 발명은 또한 필요로 하는 개체의 암 또는 그것의 전이를 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 a) 천연 형태의 PD-L1에 비해 PD-1 및 CD80 수용체에 대한 낮은 결합능을 갖는 다량체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원, 및 b) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 백신 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 특징으로 한다. 앞서 설명된 키메라 항원으로 면역 접종하는 것을 포함하는 이 방법은 1차 종양의 발달을 더 효율적으로 줄이고 먼 전이의 발생을 예방할 수 있어서, 암 환자의 생존을 향상시키는 장점을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 키메라 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법은 수동 면역 치료 또는 표준 암 치료법과 동시에 또는 순차적으로 적용되도록 조합된다.

이 치료법은 다른 화학적, 방사선학적 또는 생물학적 항종양제와 조합하거나 조합하지 않고 1차 또는 2차 치료법으로 쓰일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 키메라 항원을 포함하는 백신은, 종양 성장 관련 항원 또는 종양 유도 면역 억제에 관련된 항원에 특이적인 단클론 항체 또는 그것의 단편의 일시 주입(bolus injection) 또는 조절 방출과 함께 조합되어 투여된다. 상기 키메라 항원을 포함하는 백신 제제는 치료적 유효량을 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하나, 그것의 수의학적 사용을 배제하지 않는다. 면역원이라고도 알려져 있는 항원-아쥬번트 혼합물은 피하, 근육 내, 점막, 복강 내, 림프 내, 경피, 또는 흡입을 포함하는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 키메라 PKPD-L1 항원을 포함하는 면역원의 투여 경로는 피하이다. 본 발명에 나타낸 실시예는 아쥬번트와의 항원의 사용 또는 투여의 특정 경로의 사용을 제한하지 않는다.

사용될 항원 용량은 여러가지 변수에 따라 결정될 수 있다. 이것은 투여 경로, 문제의 병리 및 치료 기간에 따른다. 본 발명의 실질에서 벗어나지 않으면서, PD-L1에 대한 더 나은 특이적 면역 반응을 얻기 위한 최적의 면역화 설계를 얻기 위해, 아래의 실시예에서 기술된 것과 다른, 1회 투여의 간격 또는 투여 경로에서의 변화가 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서, 키메라 항원 능동 면역 치료는 인간 PD-L1 리간드 또는 인간 PD-1 수용체에 대한 항체로 수행되는 수동 면역 치료와 조합해서 이루어진다.

도 1. ELISA로 측정한, PKPD-L1 폴리펩타이드를 아쥬번트 sNAcGM3-VSSP(A) 또는 인산 알루미늄(B)과 조합하여 면역 접종한 후 래트에서 생성된 항체 반응. 항체값은 혈청 희석액에 대해 450 nm에서의 흡광도 단위로 표현했다. 서로 다른 문자는 투키 검정법(Tukey test)에 따른 통계적 유의성을 나타낸다.
도 2. PKPD-L1 단백질을 아쥬번트 sNAcGM3-VSSP(A) 또는 인산 알루미늄(B)과 조합하여 면역 접종한 래트로부터의 혈청이 PD-1 수용체 및 그것의 PD-L1 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 효능; 경쟁 ELISA로 측정.

실시예 1. 재조합 단백질 PKPD-L1 및 변형체 PD-L1 ^CHO 의 클로닝 및 발현

UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 식별번호 Q9NZQ7 (https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7)의 서열을 따라 인간 PD-L1의 세포 외 도메인의 성숙 구역에 해당하는 DNA를 증폭했다. 18개의 부분적으로 겹치는 올리고뉴클레오타이드를 설계했다(서열번호 2 내지 서열번호 19). 폴리머라제 연속 반응 기술을 이용하고, KOD 핫 스타트 마스터 믹스™ 시약 세트(Novagen)를 사용하여 상기 유전자를 증폭하고 조립했다. PD-L1의 세포 외 도메인을 코딩하는 유전자의 조립 후에, 효소의 제한 부위를 이런 목적을 달성하도록 설계된 두 개의 프라이머를 사용하여 추가했다. 이 프라이머들은 각각 효소 NheI 및 BamH I에 대한 제한 부위를 포함한다. 그 다음, 결과로 만들어진 DNA를 pM238 발현 벡터로 클로닝했다(서열번호 20 및 21). PD-L1의 성숙 구역(아미노산 Phe 19부터 Arg 238까지)을 코딩하는 DNA 서열을 벡터 pM238에 삽입하고, 이 부분을 N. meningitidis의 LpdA 단백질(특허 EP0816506)의 아미노 말단으로부터의 47개의 아미노산을 코딩하는 서열에 융합시켰다. 이 구역들은 13개의 아미노산 링커를 코딩하는 DNA로 연결되었다. 정제를 용이하게 하기 위해 융합 폴리펩타이드의 카르복실 말단 방향으로 6개의 히스티딘 구역이 추가되었다. 클로닝의 결과로 만들어진 플라스미드를 pPKPD-L1라 이름 붙였다. 이 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열이 100% 확인되었다. 서열목록에서, 재조합 단백질 PKPD-L1를 코딩하는 구역의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 22로 표시했다. 융합 폴리펩타이드는 PKPD-L1라 부르고, 그것의 아미노산 서열은 서열목록에 서열목록 1로 나타냈다.

재조합 플라스미드 PKPD-L1를 E. coli BL21 균주로 형질전환 시켰다. 상기 세균을 5-L 생물 반응기에 10% 카세인 가수분해물, 포도당 40% 및 100 μg/mL 암피실린을 보충한 5L의 M9 배지에서 37 °C에서 3 시간 동안 배양했다. pH는 7.0으로 유지했다. PKPD-L1의 발현을 유도하기 위해, 3b-인돌-아크릴산을 최종 농도 40 ug/ml으로 첨가하고 배지를 28 ℃에서 16시간 동안 자라도록 두었다.

천연 PD-L1의 표본 폴리펩타이드를 얻기 위해서, 그것을 포유류 세포에서 발현시킬 유전자 구성체를 만들었다. 이 천연 PD-L1 변형체(PD-L1^CHO라 부름)는 pcDNA 3.1/myc-His C 벡터(Invitrogen)에 삽입된 이 리간드의 세포 외 도메인(Phe 19 내지 Glu 238)을 인코딩하는 DNA로 CHO 세포를 트랜스펙션함으로써 얻었다. 100% 군집(confluence)에 도달한 뒤 7일 후에 세포 배양 상층액을 수확했다. 단백질을 Ni-NTA 레진 상의 고정 금속 친화도 크로마토 그래피 (Qiagen)로 정제했다. .

실시예 2. PKPD-L1 폴리펩타이드 응집 상태의 획득, 정제 및 평가

세균 펠렛(실시예 1에 기술됨)을 초음파처리하여 인산염 완충액(50 mM NaH₂PO₄; 300 mM NaCl; pH 7.8) 내에서 세포 구조를 망가뜨렸다. 세포 파괴 후 불용성 분획을 6 M 요소의 변성 조건 하에서 인산염 완충액에 가용화시켰다. 가용성 분획은 Ni-NTA 매트릭스에서 금속 킬레이트 친화도 크로마토 그래피로 PKPD-L1 단백질을 정제하기 위해 사용하고 그 다음 겔 여과했다.

N- 및 C-말단 끝의 온전성을 확인하고 아미노산 서열을 밝히기 위해, 상기 단백질을 직교 하이브리드 QTOF-2TM 병렬 질량 분석계에서 정전분무 이온화 질량분석법으로 특성 분석했다. ESI-MS 및 MS/MS 스펙트럼으로 상기 단백질의 아미노산 서열이 cDNA로부터 유도될 것과 일치를 보임을 확인했다. 아미노산 서열의 94%를 확증했다. 단백질의 N- 및 C-말단 끝을 품은 Glu-C 펩타이드를 서열분석했고 그것의 서열이 예상서열과 일치했다.

PKPD-L1의 분자량을 가늠할 목적으로, 사전에 PBS로 평형화시킨 후에 Superdex™ 200 (GE Healthcare Life Sciences™) 칼럼에서 크기 배제 분석 HPLC를 이용했다. 정체 시간을 사용하여, 겔 여과 표준(BioRad^TM)과 비교하여 분자량을 측정했다(표 1).

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 PD-L1^CHO 및 PKPD-L1 폴리펩타이드의 분자량 측정

단백질	분자량 (kDa)	정체 시간 (분)
소의 티로글로불린^a	670.0	15.9
소의 γ 글로불린^a	158.0	23.1
닭의 난알부민^a	44.0	26.3
말의 미오글로빈^a	17.0	29.3
비타민 B12^a	1.35	36.4
PD-L1^CHO	32.0^b	27.0
PKPD-L1	1078.0^b	15.7

^a: 분자량이 알려진 겔 여과 표준 성분. ^b: 표준 곡선으로부터 추정한 분자량.

칼럼의 빈 공간에서 용출되고 적용 단백질 PKPD-L1의 90%에 해당하는 주 정점이 얻어졌다. 이 정점은 분자량이 670 kDa(표준에서 가장 높은 분자량)보다 큰 단백질 응집체를 포함한다. 정체 시간 및 표준 성분의 알려진 분자량을 이용하여 생성된 곡선으로부터의 내삽을 기반으로 하여 추정된 PKPD-L1 응집체의 분자량은 약 1078 kDa이다. 이 값은 PKPD-L1 폴리펩타이드 단량체의 이론적 분자량(31 kDa)과는 다르다. 따라서, 제조물이 융합 폴리펩타이드의 다량체로 구성되었음을 추론할 수 있다. PKPD-L1 응집체의 추정 분자량(1078 kDa)은 또한 리간드 PD-L1^CHO의 계산된 분자량(32 kDa)보다도 높은데, 그것은 그것의 천연의 형태로 얻어지고 생물학적으로 활성인 분자이다.

실시예 3. PKPD-L1 단백질의 PD-1 및 CD80 수용체로의 결합능 평가

키메라 단백질 PKPD-L1이 PD-1 및 CD80 수용체에 결합하는 능력을 간접 ELISA를 통해 이 분자의 생물학적으로 활성인 변형체를 Fc-융합 단백질로 이용하여 측정하였다. PD-1/Fc (RγD Systems™) 또는 CD80/Fc (RγD Systems™) 단백질을ELISA 플레이트에 고정했다. 이어서, PD-L1/Fc (RγD Systems™), PKPD-L1 및 PD-L1^CHO 단백질을 여러 농도로 첨가했다. 마지막으로 수용체가 그것들의 리간드에 결합하는지 확인하기 위해, 인간 PD-L1 비오티닐화 항체 (RγD Systems™)를 추가하고 그 다음 스트렙타비딘-퍼옥시다제 결합체(Sigma™)를 넣었다.

표 2는 PD-1/Fc 및 CD80/Fc의 PD-L1/Fc 및 PD-L1^CHO과의 결합이 유사함을 보여주는데, 포유동물 세포에서 발현된 PD-L1^CHO 단백질이, 상업적으로 이용가능한 생물학적으로 활성인 단백질과 필적하게 유사한 결합 특성을 가짐을 가리킨다. 그러나, PKPD-L1 폴리펩타이드가 PD-1 수용체에 결합하는 것은 PD-L1/Fc 분자와 PD-1 사이의 상호작용보다 1420배 약했다. 추가로, CD80 수용체에 대한 PKPD-L1의 결합은 동일한 분자에 대한 PD-L1/Fc의 동일한 결합에 비해 689배 낮았다.

PD-1/Fc 및 CD80/Fc의 PD-L1 변형체 분자와의 상호작용에 대한 반 최대 효과 농도(EC₅₀)

	PD-1/Fc	CD80/Fc
PD-L1/Fc	201 ng/mL	529 ng/mL
PD-L1 ^CHO PKPD-L1	231 ng/mL 284901 ng/mL	540 ng/mL 364452 ng/mL

이 결과는 PKPD-L1 폴리펩타이드가, 생물학적으로 활성인 천연 PD-L1 변형체에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와의 상호작용에 감소된 효능을 가지는 것을 보여준다. 아마도, 고분자량 응집체를 형성한 많은 PKPD-L1 단량체의 공간적 배열이 PD-1/PD-L1 또는 CD80/PD-L1 결합의 특이적 화학양론을 변경했을 것이다. 이러한 특성은 이로운데, 왜냐하면 높은 전-종양 활성을 가지는 단백질을 투여하는 것과 연관된 위험을 줄일 수 있기 때문이다.

실시예 4. PKPD-L1 단백질로 면역화 후 생성된 항체 반응

PKPD-L1 폴리펩타이드의 면역원성을 평가하기 위해, 암컷 위스타 래트를 두 개의 아쥬번트와 조합하여 이 폴리펩타이드로 피하에 면역접종했다. N. meningitides의 LpdA 단백질에 결합된 두 개의 PD-L1 합성 펩타이드(서열목록의 서열번호 23 및 24로 표현됨)의 혼합물도 역시 평가했다. 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 PD-L1^CHO를 추가로 이 실험에 포함시켰다. 모든 경우에, 각 래트에게 각 용량 당 200 μg의 폴리펩타이드 또는 결합체를 주입했다. 인산 알루미늄(Brenntag Biosector™) 및 sNAcGM3-VSSP (쿠바, 하바나, 분자생물학 센터에서 개발된 아쥬번트)를 아쥬번트로 사용했다. 음성 대조모둠으로, 한 모둠의 래트에게 각 아쥬번트와 조합하여 부형제(40 mM Tris pH 8.0)를 면역 접종했다.

sNAcGM3-VSSP 아쥬번트(200 μg/dose)을 이용하는 면역화 일정은 8주간 매주 백신 접종으로 구성되어 있고, 한편 인산 알루미늄(0.7 mg의 AL³⁺/dose)을 이용하는 일정은 4번의 격주 투여를 포함했다. 마지막 면역접종 1주 후에 혈청을 수집했다(각 아쥬번트에 따라).

인간 PD-L1에 대한 특이적 항체를 탐지하는 간접 ELISA가 개발되었다. PD-L1/Fc 단백질 (RγD Systems ™)이 ELISA 플레이트에 고정된 인간 IgG의 Fc 구역에 특이적인 다클론 양 항체에 포획됐다. 래트 혈청을 1:250 희석비율로 첨가했다. 마지막으로, PD-L1 특이적 항체를 탐지하기 위해서 래트 IgG-특이적 다클론 항체(Sigma™)를 사용했다.

도 1은 흡광도 단위로 나타낸 인간 PD-L1 특이적 IgG 항체값의 측정 결과를 보여준다. 앞서 언급된 아쥬번트와 조합하여, PKPD-L1 폴리펩타이드(고분자량 응집체를 형성함)를 투여하였을 때 PD-L1/Fc 생물학적 활성 단백질에 대한 특이적인 항체를 생성할 수 있었다. PKPD-L1 폴리펩타이드를 sNAcGM3-VSSP와 조합하여 면역 접종하였을 때 생성된 항체값은 PD-L1^CHO (투키스 검정, p <0.0001) 및 PD-L1 펩타이드 혼합물(투키스 검정, p <0.0001)을 투여하여 유도된 것에 비해 유의적으로 높았다. 인산 알루미늄 아쥬번트를 사용했을 때 유사한 결과가 얻어졌다; 폴리펩타이드 PKPD-L1에 의해 생성된 특이적 항체 역가가 다른 2개의 실험 변형체에 의해 유도된 것에 비해 높았다(투키스 검정, p <0.0001). 이 결과들은 PKPD-L1 폴리펩타이드가 PD-L1 합성 펩타이드의 혼합물 또는 PD-L1 천연 분자에 비해 높은 면역원성을 가진다는 것을 나타낸다. PKPD-L1 항원성의 증가는 융합 폴리펩타이드의 높은 응집으로 설명될 수 있다. 이런 응집이 있어서, 천연 PD-L1 단백질 안에서 발견될 수 있는 수에 비해 항원 결정부의 수가 늘어난다. 또한, 구조적인 변화가 생길 수 있다; 구조 안에서 덜 노출되던 결정부의 노출을 돕고, 이 에피토프에 대한 면역 시스템의 내성이 낮기 때문에 그것이 높은 수준의 면역 반응을 유도할 수 있다.

실시예 5. PKPD-L1로 면역 접종한 래트로부터의 혈청의 PD-1/PD-L1 결합에 대한 차단 활성 평가

PKPD-L1로 면역화한 래트로부터의 혈청이 PD-L1과 그것의 PD-1 수용체와의 상호작용을 차단하는 능력을 경쟁 ELISA 분석법으로 평가했다. 혈청은 실시예 4에서 설명된 바와 같이 채취했고, 1:100 희석하였으며,500 ng/mL의 PD-L1/Fc 단백질과 함께 37℃에서 2시간 동안 배양했다. 이 혼합물을 포획된 PD-1/Fc 단백질이 있는 ELISA 플레이트에 넣었다(실시예 4에서 PD-L1 단백질이 포획된 것과 유사한 조건을 사용함). 포획된 PD-1 분자에 결합한 PD-L1의 양을 특이적 항 PD-L1 비오티닐화 항체로 탐지하고, 이어서 스트렙타비딘-퍼옥시다제 결합체를 추가했다. 아무런 경쟁자 없이 PD-1과 PD-L1의 상호작용이 진행되도록 하는 조건에서 최대 결합 흡광도 값을 얻었다. 혈청에 의해 야기된 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용의 억제는 다음 식을 이용하여 %로 나타냈다:

% 억제 = 100% - [(혈청 시료의 A450nm/최대 결합 A450nm maximum) Х 100].

도 2는 PKPD-L1, PD-L1^CHO 및 PD-L1 펩타이드 혼합물로 면역화한 래트에서 유도된 혈청의 PD-1 수용체와 그것의 PD-L1 리간드와의 상호작용에 대한 차단 활성을 %로 표현한 결과를 보여준다. PKPD-L1을 sNAcGM3-VSSP 또는 인산 알루미늄과 조합하여 투여하자 PD-1 수용체와 그것의 PD-L1 리간드와의 결합을 차단하는 높은 효능을 가지는 항체 반응을 생성했다. 이 차단 활성은, 억제 퍼센티지의 면에서, PD-L1^CHO 변형체 또는 PD-L1 결합 펩타이드의 혼합물로 면역화하여 생성된 항체에서 얻어진 것에 비해 높았다(투키스 검정, p<0.0001). 이 결과는 앞서 언급된 아쥬번트들과 함께 얻어졌다.

실시예 6. PKPD-L1로 면역화한 래트로부터의 혈청이 PD-L1에 특이적인 단클론 항체와 상기 리간드의 상호작용을 차단하는 능력 평가

키메라 PKPD-L1 항원으로 면역 접종한 후에 유도되는 항체가 인간 PD-L1의 서로 다른 항원 결정부를 향하는지 평가하기 위해서, 경쟁 ELISA를 수행했다. 인간 PD-L1 상의 결합부를 통해, 단클론항체인 아테졸리주맙(MedChemExpress™), 두르발루맙(Selleckchem™) 및 아벨루맙(MedChemExpress™)과 경쟁하는 혈청의 능력(실시예 4의 실험으로부터)을 평가했다. 이 항-PD-L1 단클론항체들(mAbs)은 FDA가 서로 다른 종양의 치료에 대해 승인한 것들이고, PD-L1 분자의 서로 다른 에피토프를 인식한다(Tan, et al., Protein & cell, 2018: 9: 135-9). 경쟁 ELISA를 제작하기 위해서, 상기 단클론항체들을 비오틴에 결합시키고, PD-L1과 앞서 언급된 비오티닐화 mAbs의 상호작용의 EC₅₀을 측정했다. 키메라 PD-L1/Fc 단백질을 ELISA 플레이트에 고정했다. 이어서, 비오티닐화 mAbs를 여러 농도로 첨가하고, 항원-항체 결합을 스트렙타비딘-퍼옥시다제 결합체로 탐지했다. PD-L1의 비오티닐화 항체 아테졸리주맙, 두르발루맙 및 아벨루맙과의 상호작용에 대한 EC50은 각각 5.2 ng/mL, 5.8 ng/mL 및 3.1 ng/mL로 얻어졌다. 우선 조건이 확립되었고, 경쟁 ELISA가 만들어졌으며, 면역화 혈청(혈청 희석 1:25)을 인간 PD-L1 결합부위에 대해 mAb들(앞서 언급된 EC₅₀에서)과 경쟁시켰다. 래트 혈청이 없을 때 각 단클론 항체가 PD-L1과의 상호작용이 일어나는 조건을 이용하여 최대 결합에 대응하는 흡광도 값을 얻었다. 인산 알루미늄과 조합하여 PKPD-L1으로 면역 접종한 래트의 혈청에 의해 만들어지는 단클론 항체와 PD-L1의 상호작용에 대한 억제를 퍼센티지로 나타냈다(실시예 5에 기술한 식을 사용). 결과는 표 3에 표시했다. 40 mM Tris pH 8.0 (부형제) 및 인산 알루미늄으로 면역 접종한 래트로부터의 혈청을 음성 대조 모둠으로 사용하였다.

PKPD-L1로 면역 접종한 래트의 혈청이 PD-L1 및 항-PD-L1 단클론 항체 사이의 상호작용을 차단하는 능력

% 차단 활성 (중앙값 ± SD)
	아테졸리주맙	두르발루맙	아벨루맙
음성 대조모둠	3.49±2.34%	3.80±2.67%	1.67±1.30%
PKPD-L1	52.26±4.33%	57.09±4.84%	36.11±4.56%

SD: 표준편차

표 3은 PKPD-L1 폴리펩타이드(인산 알루미늄 아쥬번트와 조합하여)를 투여하면 PD-L1이 단클론 항체 아테졸리주맙, 두르발루맙 및 아벨루맙과 결합하는 것을 차단하는 특이적인 항체를 유도함을 보여준다. 차단 활성은 음성 대조 모둠으로부터의 것과 유의적으로 다르다(단일 스튜던트 t-검정법, p<0.0001). 아쥬번트와 조합하여 PKPD-L1 항원으로 면역 접종한 후에 다클론 항체 반응이 유도되었고, 서로 다른 인간 PD-L1 에피토프를 향한다. 면역 혈청은 서로 다른 에피토프를 인식하는 세 개의 항-PD-L1 단클론 항체의 결합을 방해했다. 또한, 면역 접종은, 서로 다른 종양의 치료에 대해 승인된 단클론 항체 아테졸리주맙, 두르발루맙 및 아벨루맙에 의해 차단되는 PD-L1의 관련 에피토프를 표적으로 하는 다클론 항체 반응을 유도했다.

실시예 7. PKPD-L1으로 면역 접종한 비인간 영장류의 혈청으로부터 정제한 IgG가 보이는 PD-1/PD-L1 상호작용 차단 능력 평가

이 실험의 목적은 PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역 접종한 후에 유도되는 항체가, 세포-기반 분석법에서 PD-1의 PD-L1와의 상호작용에 의해 매개되는 생물학적 효과를 차단할 수 있는지를 평가하는 것이었다. 이러한 목적을 위해, Promega™ J1250 분석을 이용하였는데, 그것은 이 두 분자 사이의 상호작용을 차단하는 생물제제의 작용 기전을 흉내내는 것이다. 이 분석법은 두 개의 유전적으로 변형된 세포주를 기반으로 한다. 첫 번째는 소위 효과기 세포로, 그것의 세포 막 상에 발광을 유도하는 신호를 변환하는 인간 PD-1 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현한다. 두 번째는 소위 항원-제시 세포로, 인간 PD-L1 및 TCR 활성자 단백질을 발현한다. 상기 두 유형의 세포가 함께 배양되면, PD-1/PD-L1 상호작용이 TCR 신호전달에 의해 매개되는 발광 유도를 억제한다. 그러나, PD-1/PD-L1 축의 생물학적 억제제의 존재는 반대의 효과를 유도한다.

인간 생물학에 가깝게 연관된 자가 비-인간 영장류 모델에서 PKPD-L1 폴리펩타이드가 면역 반응을 유도하는 능력을 시험하기 위해 사바나 원숭이(Chlorocebus aethiops sabaeus)에서의 면역원성을 평가했다. 영장류에게 인산 알루미늄을 아쥬번트로 쓴 200 μg의 키메라 폴리펩타이드를 피하 투여하여 면역화시켰다. 또한, 이 실험에서 인산 알루미늄 아쥬번트를 쓴, N. meningitidis의 LpdA 단백질과 결합한 두 개의 PD-L1 합성 펩타이드(서열목록에서 서열번호 23 및 24 부여)의 혼합물(용량 당 200 μg)도 평가했다. 아쥬번트 사용 혼합물(각 항원 용량을 0.7 mg Al3+과 조합하였다)을 매 2주마다 투여하였고, 총 4회 면역 접종했다. 4번째 면역 접종 1주 후에 혈청을 채취했다.

각 실험 모둠(n=5)에서 채취한 혈청을 모으고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피(GE Healthcare™)를 통해 IgG를 정제했다. 제조사의 설명서에 따라 세포 기반 분석을 실시하고, 아테졸리주맙을 PD-1/PD-L1 상호작용 차단에 대한 양성 대조 모둠으로 사용하였다. 또한, PD-1+ 효과기 세포/PD-L1+ 숙주 세포 시스템에서 평가한 각 조건을 PD-1+ 효과기 세포/PD-L1+ 숙주세포 음성 대조 모둠 및 최대 발광 대조 시스템에도 적용하였다. 각 경우, 6개의 복제물을 각 조건에 대해 평가했다. 양 세포주를 동시에 배양한지 30분 뒤에 발광을 읽었다. 이 분석에서, PD-1/PD-L1 상호작용의 차단 활성은 루시퍼라제 활성 증가로 확인된다. 결과적으로, 차단 활성은 발광값의 증가에 직접 비례한다.

비-인간 영장류 혈청으로부터의 PD-L1 분획 특이적 IgG의 생물학적 활성의 시험관 내(In vitro) 평가

	농도 (μg/mL)	발광 (RLU) 중앙값 ± SD
IgG 부형제/FA	500	375130 ± 1087
IgG PKPD-L1/FA	500	1335475 ± 46172
IgG MP/FA	500	525030 ± 1401
아테졸리주맙	0,1	240708 ± 1253
아테졸리주맙	20	1470587 ± 36617

- FA: 인산 알루미늄+ 부형제 Tris 40mM pH 8.0, MP: 결합 PD-L1 펩타이드 혼합물, RLU: 상대 발광 단위

표 4는 PKPD-L1 폴리펩타이드의 고분자량 응집체를 인산 알루미늄 아쥬번트와 조합하여 투여하였을 때, 음성 대조 모둠에 비해 인간 PD-L1에 대해 생물학적으로 활성인 IgG 항체를 생성할 수 있음을 보여준다(단일 스튜던트 t-검정법, p<0.0001). PD-L1 폴리펩타이드로 면역화한 영장류로부터 채취한 정제된 혈청 IgG 분획에 대해 탐지된 발광은 음성 대조 모둠에서 관찰된 값에 비해 3.56 배 높았다. PD-L1 펩타이드를 가지고 하는 능동 면역화 전략에 대해서는, 대응하는 음성 대조 모둠보다 이 비율이 1.4배 높았다(만-휘트니(Mann-Whitney) 검정법, p<0.0022). 이 결과는 PD-L1 펩타이드 혼합물에 의해 생성되는 항체에 비해 PKPD-L1 변형체에 의해 유도되는 특이 항체가 생물학적 활성이 월등함을 나타낸다. PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역화한 원숭이의 혈청으로부터 정제된 IgG 분획의 생물학적 활성은 20 μg/mL에서 아테졸리주맙 양성 대조 모둠과 유사했다.

실시예 8. PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역화한 마우스로부터의 림프구가 PD-L1-발현 종양 세포를 직접 분해하는 능력 평가

PKPD-L1 폴리펩타이드가 특이적인 세포 독성 T 림프구를 유도할 수 있는지 평가하기 위해서, 면역능력이 있는(immunocompetent) 마우스의 비장에서 분리한 림프구를 종양 세포와 함께 배양하는 분석법을 개발했다. 림프구의 세포 독성 활성은 종양세포의 분해 퍼센티지로 나타냈다. 각각 마우스 주인 C57Bl6 및 Balb/c와 동계인 종양세포주 MC38 및 CT26를 이 실험에서 사용했다. 이 세포들은 막 상에 PD-L1을 발현하고, 주요 I형 조직적합성 복합체와 연관 있는 이 단백질의 펩타이드를 나타낼 수 있다.

C57Bl6 및 Balb/c 마우스에게 100 μg의 여러 PD-L1 변형체를 sNAcGM3-VSSP (100 μg) 아쥬번트와 조합하여 피하로 면역 접종했다. 동물들(n=5)은 매주 PD-L1^CHO, PKPD-L1 또는 결합 펩타이드의 혼합물을 앞서 언급한 아쥬번트와 조합하여 2달 동안 투여받았다. 마지막 면역 접종 1주 후에, 비장을 수술적으로 떼어내고, 관류시킨 후에 적혈구를 분해시켰다. 이어서, 10% 우태혈청을 보충한 RPMI 배지에 림프구를 현탁시켰다. 이 림프구(효과기 세포)를 항-CD3 항체(eBioscience™)로 라벨링하고 유세포분석기로 수를 셌다. MC38 및 CT26 세포주를 형광 시약 카르복시플루오레신 숙시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)로 라벨링하고, RPMI 배지에 재현탁하여 표적 세포로 사용했다. CFSE-라벨링 세포를 유세포분석기로 수를 셌다.

C57Bl6 마우스로부터의 림프구(2x10⁶ CD3+)를 2x10⁴ MC38 세포와 즉시 혼합했다(100:1 비율). Balb/c 마우스의 비장에서 분리한 림프구를 먼저 30 μg/mL의 천연 PD-L1 단백질(PD-L1/Fc)로 시험관 내에서, 3일째에는 10 units/mL의 IL-2를 첨가하여 6일간 활성화시켰다. 활성화 후에 동일한 비율을 이용하여 효과기 세포를 CT26 표적 세포와 함께 공배양했다. 두 경우 모두, 음의 분해 대조모둠을 사용하였는데, 그것에서 효과기 세포를 넣는 대신 우태혈청을 보충한 RPMI 배지와 함께 표적 세포를 배양했다. 효과기 세포를 표적 세포와 함께 4시간 배양한 후에, 그 혼합물을 PBS에 재현탁하고 CFSE-양성 표적 세포를 유세포분석기(PARTEC cytometer, Germany)로 셌다. 결과는 표 5에 나타냈다. 세포 독성은 다음 식에 따라 표적 세포(종양 세포) 분해 퍼센티지로 나타냈다:

% 분해 = 100% - [(효과기 세포와 함께 배양한 CFSE 양성 표적 세포의 수) / (배지와 함께 배양한 CFSE 양성 표적 세포의 수)x100]

PD-L1의 여러 가지 변형체로 면역화시킨 마우스의 비장에서 분리한 림프구의 종양 세포에 대한 세포독성 활성

		표적 세포의 융해 비율
면역원		MC38		CT26
	중앙값 ± SD		중앙값 ± SD
부형제 + VSSP		4.72 ± 4.61%			1.56 ± 2.28%
PD-L1 ^CHO + VSSP		21.28 ± 7.30%			9.68 ± 2.60%
PKPD-L1 + VSSP		53.92 ± 12.09%			19.82 ± 4.84%
펩타이드 혼합물+ VSSP		16.62 ± 3.92%			3.52 ± 2.88%

부형제: Tris 40 mM pH 8.0. - VSSP: sNAcGM3-VSSP. SD: 표준편차.

표 5는 고분자량 응집체 형태로 뭉친 PD-L1 폴리펩타이드를 투여하면 세포성 면역에 긍정적인 효과를 가진다는 것을 보여준다. C57Bl6주를 이용한 실험에서, PD-L1^CHO 로 면역화한 모둠(투키스 검정, p=0.0169); PKPD-L1로 면역화한 모둠 (투키스 검정, p<0.0001) 및 펩타이드 혼합물로 면역화한 모둠 (투키스 검정, p=0.0332)으로부터의 비장에서 분리한 림프구와 함께 공-배양한 후에 MC38 종양 세포의 용해가 대조군의 것과 비교했을 때 상당히 증가했다. PKPD-L1 폴리펩타이드는 천연 변형체 PD-L1^CHO 로 얻어진 림프구(투키스 검정, p<0.0001) 또는 PD-L1 펩타이드 혼합물로 얻어진 림프구(투키스 검정, p<0.0001)에 비해 유의적으로 높은 세포 독성 활성을 가지는 림프구를 생성할 수 있었다.

Balb/c 주를 이용한 실험에서, PD-L1^CHO (투키스 검정, p=0.0065) 및 PKPD-L1 (투키스 검정, p<0.0001)로 면역화한 모둠의 비장에서 분리한 림프구에서 대조 모둠에 비해 CT26 종양 세포의 용해에서의 상당한 증가가 탐지되었다. 그러나, 펩타이드 혼합물로 면역화한 마우스로부터 분리된 림프구는 세포 독성 활성을 유도하지 않았다 (투키스 검정, p=0.7857). PKPD-L1 폴리펩타이드는 또한 다른 유전적 배경을 가지는 이 마우스 주에서도 면역원성에서 탁월함을 나타냈다. PKPD-L1로 면역화한 후에 분리된 림프구는 천연 변형체 PD-L1^CHO 로 면역화한 마우스로부터 얻은 림프구보다 높은 활성을 가졌다(투키스 검정, p=0.0009).

실시예 9. PD-L1 변형체로 면역화한 후 F3II 유방암 쥐 모델에서의 항-종양 및 항-전이 효과

여러 가지 PD-L1 변형체를 아쥬번트 sNAcGM3-VSSP와 조합하여 투여한 후의 항-종양 및 항-전이 활성을 F3II 유방암 쥐 모델을 이용하여 평가하였다. 암컷 Balb/c 마우스(모둠 당 9 마리)를 100 μg의 항원과 sNAcGM3-VSSP 아쥬번트와 함께 실시예 8에서와 같이 피하로 면역 접종 하였다. F3II 세포주는 자연적으로 폐로 전이되는 능력을 가진 BALB/c 이식가능 유방암의 클론 부차집단(subpopulation)으로부터 생성했다. 200개의 F3II 세포를 4번째 면역 접종 4일 후에 면역 접종 부위 반대쪽의 옆구리 등부위에 피하로 접종했다. 일단 종양 세포를 이식하고 측정가능한 성장을 탐지한 후에 종양 부피를 기록했다.

종양 세포 투여 후 35일에, 마우스를 안락사하고 이어서 폐를 떼어냈다. 거시적인 전이를 세기 위해서, 폐를 부인 용액(Bouin solution)(Sigma™)에 최소 48시간 동안 담궜다. 거시전이는 입체경(Zeiss™)을 이용하여 셌다. 결과를 표 6에 나타냈다.

PD-L1 변형체로 면역화되고 F3II 종양세포주를 투여받은 마우스에서의 종양 부피 및 거시전이의 수

처치 TV (mm ³ ) 전이 수
	중앙값 ± SD	중앙값 ± SD
부형제 + VSSP	362 ± 127	11.0 ± 4.0
PD-L1 ^CHO + VSSP	222 ± 68	2.22 ± 1.92
PKPD-L1 + VSSP	83 ± 18	0.67 ± 1.84
PM + VSSP	279 ± 73	8.78 ± 4.30

부형제: 40 mM Tris pH 8.0. VSSP: sNAcGM3-VSSP. PM: 인간 PD-L1 펩타이드 혼합물. TV: 종양 부피. SD: 표준편차.

표 6은 F3II 마우스 종양 세포를 감염시킨 후 18일째의 종양부피 측정을 보여준다. 아쥬번트 sNAcGM3-VSSP와 함께 PKPD-L1 폴리펩타이드를 투여하자, 음성 대조 모둠과 비교했을 때 종양의 성장이 상당히 감소했다(투키스 검정, p<0.0001), PD-L1^CHO 변형체를 투여했을 때도 종양 성장의 감소를 유도했지만 이 변수에 대한 영향은 더 적었다(투키스 검정, p=0.0052). 반면에, 결합 펩타이드의 혼합물로는 종양 성장의 감소가 확인되지 않았다(투키스 검정, p=0.1598). PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역 접종하자 PD-L1^CHO능동 면역치료에 의해 생성된 효과에 비해 종양 부피가 더 크게 감소하게 되었다(투키스 검정, p<0.0058).

표 6은 또한 여러 가지 PD-L1 변형체로 면역화한 동물에서의 자연스럽게 일어나는 폐전이의 수를 보여준다. 융합 단백질 PKPD-L1 또는 변형체 PD-L1^CHO를 아쥬번트 sNAcGM3-VSSP와 함께 투여하자, 아쥬번트와 부형제로 처치한 대조 모둠의 동물의 폐에서 발견된 전이에 비해 이식 조직의 폐로의 전이를 억제했다(투키스 검정, p<0.0001). 반면에, 결합 펩타이드 혼합물로 면역화했을 때는 이식 조직의 전이의 감소에 대한 효과가 확인되지 않았다(투키스 검정, p=0.4311). 종양 부피에 대해서는, PKPD-L1 폴리펩타이드에 의해 생성된 면역 반응이 천연 PD-L1 변형체(투키스 검정, p=0.0004) 또는 이 리간드로부터의 두 개의 펩타이드의 혼합물(투키스 검정, p<0.0001)로 능동 면역치료한 후에 생성된 면역 반응의 효과와 비교했을 때 전이의 수를 줄이는 데 월등한 효능을 가졌다.

실시예 10. 마우스 폐 전이 치료에서 PKPD-L1 폴리펩타이드 투여의 효능

폐 전이는 암 사망의 주요 원인이다. PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역화하면 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다. 이 융합 폴리펩타이드를 투여한 후에 생성되는 면역 반응 효과기의 항-전이 효능을 몇 가지 모델에서 평가했다. 12마리의 마우스 모둠에 100 μg의 이 폴리펩타이드를 100 μg의 sNAcGM3-VSSP와 조합하여 면역 접종하였다. 마우스에게 주 1회 2개월간 피하 투여로 면역 접종했다. 각 모델의 요구사항에 따라 종양 이식을 수행했다. 전이 부하의 분석은 폐 중량을 통해, 또는 해부 현미경 하에서 전이를 셈으로써 평가했다. 마우스 주 C57Bl/6에서의 연구를 위해 전이 폐 종양 세포 3LLD122 2.5 x 10⁵ 개를 4번째 면역 접종 3일 후에 발바닥 패드에 접종했다. 이식 후 20일에 1차 종양을 수술로 제거하고, 동물은 폐로의 자연적인 전이의 발달에 예측되는 기간인 수술 후 15일에 희생시켰다. 이 실험에서, 각 모둠에서의 폐 무게를 측정했다.

두 번째 실험에서, 실험 전이 모델을 사용하였다. C57Bl/6 마우스에 6번째 면역 접종 4일 뒤에 쥐의 MB16F10 흑색종 세포 (5x10⁴)를 꼬리정맥에 접종했다. 17일 뒤에, 동물들을 희생시키고, 폐에서 검게 착색된 군집을 셌다.

BALB/c 마우스 주에서, 네 번째 면역 접종 후 5일 뒤에 투여한 안와정맥총을 통한 5 x 10⁴개의CT26 결장직장암 세포의 정맥 주사 후 폐 전이를 평가했다. 마우스는 종양 접종 후 30일 뒤에 희생시켰고, 폐 내의 군집을 셌다. 이 실험의 결과를 표 7에 요약했다.

PKPD-L1 및 아쥬번트로 면역 접종 후 생성된 면역 반응의 폐 전이에 대한 효과

종양 모델	처치	폐 질량 (g) 평균 ± SD	거시 전이의 수 평균 ± SD
3LLD122	부형제/VSSP	0.2898±0.06256	nd
3LLD122	PKPD-L1/ VSSP	0.1632±0.03861	nd
MB16F10	부형제/VSSP	nd	61±24
MB16F10	PKPD-L1/ VSSP	nd	42±23
CT26	부형제/VSSP	nd	30 ± 14
CT26	PKPD-L1/VSSP	nd	15 ± 9

SD: 표준편차. VSSP: sNAcGM3-VSSP. nd: 측정되지 않음.

각 PKPD-L1 처치 모둠의 그것의 대조 모둠에 대한 결과를 각 실험 모델에 대해 독립적으로 비교했다. 표 7에서 볼 수 있다시피, 모든 실험 모델에서, PD-L1로 면역화한 마우스로부터의 폐의 전이 부하는 그것의 대조 모둠에 비해 유의적으로 낮았다(스튜던츠 t-검정: 3LLD122, p<0.0001; MB16F10, p=0.0475; CT26 p=0.0046).

실시예 11. PD-L1 특이적 수동 및 능동 면역 치료법의 조합

PD-L1에 특이적인 수동 및 능동 면역치료의 조합의 항-종양 활성을 CT26 쥐 종양 모델에서 평가했다. 암컷 Balb/c 마우스(모둠 당 n= 9)에게 실시예 4에 설명된 스킴을 이용하여 0.7 mg의 인산 알루미늄 아쥬번트와 함께 200 μg의 PKPD-L1 폴리펩타이드를 피하 면역 접종했다. 두 번째 면역 접종 12일 후에, 2x10⁴개의 CT26 세포를 면역 접종 부위 반대쪽의 등부위에 피하 접종했다. 종양 주입 1일 후에, PD-L1-차단 항체(래트 IgG2b 이소타입; 클론 10F.9G2; BIOXCELL)를 1주에 한 번 투여하여 4회 용량 치료기간을 완성했다. 항체는 복강 내 경로로 12.5 mg/kg의 용량으로 투여했다. 각 유형의 면역 치료에 대해, 음성 대조 모둠을 사용했다. 수동 면역 치료에 대해서는 대조 항체로 래트 IgG2b 이소타입(BioXCell™, BE0090)을 투여했고, 한편 능동 면역 치료에 대해서는 PBS 및 인산 알루미늄 아쥬번트를 투여받은 모둠을 음성 대조 모둠으로 사용했다. 종양 세포를 이식한 후에 측정가능한 종양을 탐지했고 종양의 부피를 기록했다.

표 8은 CT26 마우스 종양 세포를 주입하고 30일 뒤의 종양 부피 측정을 보여주는데, 평균 ± 표준편차로 나타냈다.

CT26 결장암 모델에서의 PD-L1를 표적으로 하는 수동 및 능동 면역 치료 조합의 항-종양 효과

처치	종양 부피 (mm ³ )
이소타입 대조 항체	2764 ± 789
마우스 항-PD-L1	1178 ± 988
마우스 항-PD-L1 /PKPD-L1 + FA	247 ± 134
PBS + FA	2717 ± 832
PKPD-L1 + FA	1046 ± 593

FA: 인산 알루미늄.

래트 항-마우스 PD-L1 항체를 투여하자 이소타입 대조 항체로 처치한 모둠에 비해 종양 부피가 상당히 줄어들었다(던넷 검정, p=0.003). PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역 접종하였을 때 또한 부형제 플러스 아쥬번트로 처치한 모둠에 비해 종양 부피가 줄어드는 데 상당한 효과를 보였다(던넷 검정, p=0.0001). 조합 치료는 PD-L1-기반 능동 면역치료에 비해(던넷 검정, p=0.0233), 그리고 항-PD-L1 항체 수동 면역 치료에 비해(던넷 검정, p=0.0332) 종양 위축에 뛰어난 결과를 보였다. 이 결과는 둘 다 PD-L1을 표적으로 하는 수동 및 능동 면역 치료 조합의 가능성을 암시한다.

실시예 12. 배액 림프절 세포 부차집단 및 종양 침투 림프구에 대한 PKPD-L1 투여의 효과

항-PD-L1 치료법이 PD-L1-유도 면역 억제의 반전에 효과가 있는지 평가하기 위해서, 림프절 및 종양 내의 세포 집단의 비율을 연구했다. 이 실험에서, Balb/c 마우스(n= 9)는 14일 일정 동안 2번의 피하 면역 접종을 받았는데, 200 μg의 키메라 PKPD-L1 폴리펩타이드 및 아쥬번트로서 0.7 mg의 인산 알루미늄의 혼합물을 포함하고 있었다. 첫 번째 면역 접종 3일 후에, 마우스에 2x10⁴ 개의 결장암 세포 CT26을, 면역 접종한 반대편에 피하로 주입하여 감염시켰다. 두 번째 면역 접종 7일 후에, 마우스를 희생시켜서 종양 및 배액림프절을 채취했다. CD4+ 및 CD8+ T 림프구에서 평균 형광 강도로 측정한 막 PD-1 값을 시료에서 평가했다.

종양 덩어리 1그램을 효소(eBioscience™) 및 물리적 분해했다. 시약 키트(eBioscience™)로 종양 현탁액으로부터 죽은 세포를 제거하였다. 살아있는 세포 현탁액을 선택 마커 CD45를 가지고, 그리고 자석비즈를 이용하여 양성 백혈구 선택을 수행했다(eBioscience™). CD45+ 세포 현탁액을 용리한 후에, 림프구를 항-CD3, 항-CD4 또는 항-CD8 및 항-PD-1 항체로 다중 면역 염색했다(eBioscience™). 배액림프절을 RPMI 배양 배지에서 불리고, 세포 현탁액은 30 μM 필터를 통과시키고 앞의 시료에 대해 설명한 대로 다중 라벨링하였다. 배액 림프절에 있던, 그리고 종양 내에 있던 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 서브세트의 막에 PD-1가 있는지 확인은 유세포 분석기를 이용하여 수행했다.

림프절로부터, 그리고 종양 내 있는 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 PD-1 발현 분석

시료	염색	형광 강도 평균± SD
시료	염색	Exc + FA	PKPD-L1 + FA
배액림프절	CD3+, CD4+, PD-1+ ^high	7.946 ± 0.628	6.662 ± 1.064
배액림프절	CD3+, CD8+, PD-1+ ^high	10.140 ± 1.546	7.513 ± 1.436
종양	CD45+, CD3+, CD4+, PD-1+	4.024 ± 0.281	3.586 ± 0.348
종양	CD45+, CD3+, CD8+, PD-1+	4.555 ± 0.658	3.780 ± 0.559

Exc: 부형제(Tris 40 mM pH 8.0). FA: 인산 알루미늄.

표 9에서 볼 수 있다시피, 아쥬번트화한 PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역 접종한 마우스로부터의 배액 림프절 안의 CD4+ T 림프구 군집은 음성 대조 모둠의 마우스로부터의 림프구에서 발견되는 값에 비해 유의적으로 낮은 PD-1 막 값을 가진다(단일 스튜던츠 t-검정법, p=0.0056). 유사한 결과가 CD8+ T 림프구 군집을 분석했을 때도 얻어졌다 (단일 스튜던츠 t-검정법, p=0.0014). 이 실험 증거는 CD4+ (단일 스튜던츠 t-검정법, p=0.0156) 및 CD8+ (단일 스튜던츠 t-검정법, p=0.0240) 종양 침투 림프구에서도 얻어졌다. 따라서, 키메라 폴리펩타이드 PKPD-L1을 백신 항원으로 하는 PD-L1-특이적 능동 면역치료법은 활성화된 림프구의 뚜렷한 표현형을 가지는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를, 특히 종양과 배액림프절과 같은 관련 면역 부위에서 생성한다.

실시예 13. PKPD-L1 폴리펩타이드와, 인산 알루미늄 또는 sNAcGM3-VSSP 아쥬번트를 투여한 후의 안전성 프로파일 평가

암컷 Balb/c 마우스(n=5) 및 암컷 뉴질랜드 토끼(n=4)를 200 μg의 PKPD-L1 키메라 폴리펩타이드로 피하 면역 접종 했다. VSSP를 아쥬번트로 하는 면역 접종 설계는 8주간의 매주 백신 투여로 구성되었다. 마우스에서는 키메라 폴리펩타이드에 100 μg의 sNAcGM3-VSSP를 아쥬번트로 사용했고, 토끼에서는 200 μg의 sNAcGM3-VSSP를 아쥬번트로 사용했다.

인산 알루미늄과 PKPD-L1의 조합의 경우에는 200 μg의 키메라 폴리펩타이드를 0.7 mg의 인산 알루미늄으로 아쥬번트화했고, 약물은 매 14일마다, 총 4번의 면역 접종으로 투여되었다. 각 항원과 아쥬번트의 조합에 대해, 각 항원 제제의 부형제 및 그것의 각 아쥬번트로 음성 대조 모둠을 면역 접종했다.

마우스 실험에서, 두 개의 추가적인 수동 면역치료 모둠을 포함시켰다. 한 모둠은 마우스 PD-L1 특이적 래트 항원 (BioXCell™, clone 10F.9G2, 12.5 mg/Kg)을 매주 총 4번 복강으로 투여받았다. 다른 모둠은 동일한 이소타입의 무관한 항체(BioXCell™, clone BE0090)로, 동일 용량과 스케쥴을 이용하여 처치했다.

두 연구에서, 면역 접종하는 동안 다른 시간에 매주 체중 측정을 수행했다. 일단 면역 접종이 완료된 후에 생물학적 시료를 채취했는데, 그것은 양 동물 종에서 100% 수행될 수 있었다.

마우스에 대해서, 면역 접종 설계의 끝에, 심장, 폐, 비장 및 다른 10개의 장기를 조직병리학을 위해 처리했다. 장기들은 육안 및 현미경으로 양적 평가를 거쳤다. 현미경 검사 및 조직학적 진단을 위해, 시료를 각각 적절한 방법으로 가공했다. 능동 또는 수동 면역화 모둠에서는 변형이 발견되었으나 대응 위약 모둠에서는 탐지되지 않았을 때 치료-관련 부작용으로 여겼다.

토끼에서, 2개의 혈액 시료를, 하나는 면역화 시작 전, 그리고 다른 하나는 마지막 면역화 1주 후에 채취했다. 각 혈액 채취물은 혈장(혈액학적 검사) 및 혈청(임상 생화학 검사)을 얻기 위해 사용했다. 혈액학적 검사는, 여러 다른 변수 중에서, 여러 가지 세포 유형의 계수 및/또는 퍼센티지를 포함했다. 혈액 생화학 측정은 여러 것들 중 헤모글로빈 농도, 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 효소 농도, 아스파르트산염 아미노트랜스퍼라제 효소 농도, 크레아티닌 농도를 포함했다. 각 변수에 대해서, 면역화 전 및 후에 얻어진 값 사이를 비교하고, 처치 모둠과 대응 위약 모둠 사이를 비교했고, 그 종에 대해 보고된 참고 생리학적 범위와도 비교했다. PKPD-L1 폴리펩타이드로 면역화한 모둠에서, 대응하는 위약 모둠에서 관찰되지 않는 변화가 발견되었을 때 치료-관련 부작용이 일어난 것으로 여겼다.

제거한 장기의 육안 분석을 통해 마우스 PD-L1에 특이적인 래트 항체로 수동 면역처치를 받은 5마리 마우스 중 2마리의 폐에서 출혈이 존재함을 확인했다. 이 두 마리의 마우스 중 하나에서는 흉선 출혈도 있었다. 실험 모둠의 나머지에서는 장기에 육안으로 보이는 변화는 존재하지 않았다. 한편, 현미경 분석에서, 앞서 언급한 두 마우스에서 육안으로 탐지된 폐와 흉선에서 관찰된 출혈 사건이 확인되었다. 이 모둠의 다른 세 마리의 마우스는 기관지 수준에서 그들의 폐에 염증 세포의 침윤을 가지는 특징을 보였다. 마우스 PD-L1에 특이적인 항체로 처치한 5마리의 마우스에서, 모두 직장 수준에서 점막염을 나타냈다. 이 모둠에 속하는 장기의 나머지에서는 어떠한 현미경적 변화도 보이지 않았다. 대조적으로, 서로 다른 위약 모둠 또는 PKPD-L1 폴리펩타이드를 두 개의 아쥬번트와 조합하여 면역 접종한 모둠에 속하는 마우스의 장기에서는 어떠한 현미경적 변화도 보이지 않았다.

혈액학 및 임상 생화학의 결과는 PKPD-L1 폴리펩타이드로 토끼를 면역화하기 전 및 후에 수행된 측정 사이의 유의적인 변화가 없음을 나타냈다. 면역화 모둠 및 그 대응하는 위약 모둠 사이에 유의적인 차이가 없었다. 전체적으로, 면역화 및 위약 모둠의 모든 혈액학적 및 생화학적 변수들은 생리학적 범위 내였다. 서로 다른 시점에 측정했음에도 마우스와 토끼 둘 다에서, 대응하는 위약 모둠에서 발견된 것에 비해 면역화 모둠의 체중에서 유의적인 영향이 탐지되지 않았다.

이러한 결과들은 키메라 PKPD-L1 폴리펩타이드를 sNAcGM3-VSSP 또는 인산 알루미늄 아쥬번트를 사용하여 면역화하는 것이 안전한 면역 반응을 일으킨다는 것을 나타낸다. 이 능동 면역치료 전략은, 부작용이 없어서, 특이적 단클론 항체를 가지고 하는 수동 면역치료 전략 대비 장점을 제공한다.

<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> CHIMERIC ANTIGEN COMPRISING THE EXTRACELLULAR DOMAIN OF PD-L1 <130> QUIMERIC ANTIGEN PD-L1 <140> CU 2020-0075 <141> 2020-10-22 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Quimeric antigen PKPD-L1 <400> 1 Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile 1 5 10 15 Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly 20 25 30 Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp His 35 40 45 Asp Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Phe Thr Val Thr 50 55 60 Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile 65 70 75 80 Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile 85 90 95 Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly 100 105 110 Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg 115 120 125 Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr 130 135 140 Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr 165 170 175 Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val Thr Ser Glu 180 185 190 His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Val Ile 195 200 205 Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr Thr Thr Thr 210 215 220 Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg 225 230 235 240 Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu 245 250 255 Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro 260 265 270 Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Gly Ser Arg Ala His His His His 275 280 285 His His 290 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gatctgctag cctttaccgt taccgtcccg a 31 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aatggtcata ttgctgccat attctaccac atacaaatct ttcgggacgg taacggtaaa 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aatatggcag caatatgacc attgaatgca aatttccggt ggaaaaacag ctggatctgg 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tattcttatc ttccatttcc caatacacaa ttaacgccgc cagatccagc tgtttttcca 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgtattggga aatggaagat aagaatatca ttcagtttgt gcatggcgaa gaagatctga 60 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agcagacgag cacgctgacg atagctgcta tgctgcactt tcagatcttc ttcgccatgc 60 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agcgtgctcg tctgctgaaa gatcaactga gcctgggcaa tgcggcgctg cagattaccg 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ctaatcatgc aacgatacac gcccgcatcc tgcagtttca cgtcggtaat ctgcagcgcc 60 60 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcgtgtatcg ttgcatgatt agctatggcg gagcggacta taaacgtatt accgtgaagg 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aatccgctgg ttaatcttat tgtacggcgc attcaccttc acggtaatac gtttatagtc 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gtacaataag attaaccagc ggattctggt ggtggacccg gtgaccagcg aacatgaact 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aatcacttcc gctttcggat agccttccgc ctggcaggtc agttcatgtt cgctggtcac 60 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tatccgaaag cggaagtgat ttggaccagc agcgatcatc aggtgctgtc aggcaagacc 60 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gacgttaaaa agcttctcct cgcgtttgct gttggtggta gtggtcttgc ctgacagcac 60 60 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cgaggagaag ctttttaacg tcaccagcac cctgcgtatt aacactacta ccaacgaaa 59 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ttccggatct aaacgacgaa aggtgcaata gaaaatttcg ttggtagtag tgttaatacg 60 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tttcgtcgtt tagatccgga agaaaatcat accgccgaac tggtgattcc ggagctgccg 60 60 <210> 19 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggatccacgt tcattcggtg gatgcgccag cggcagctcc ggaatca 47 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide for cloning pM238 <400> 20 gatctgctag cctttaccgt taccgtcccg a 31 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide for cloning pM238 <400> 21 gggggatcca cgttcattcg gtggatgcgc cagcggcagc tccggaatca 50 <210> 22 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Nucleotide sequence of the coding region for the recombinant protein PKPD-L1 <400> 22 atggtagata aaagaatggc tttagttgaa ttgaaagtgc ccgacattgg cggacacgaa 60 aatgtagata ttatcgcggt tgaagtaaac gtgggcgaca ctattgctgt ggacgatacc 120 ctgattactt tggatctaga tcacgatgac gatgacgata aagcttcaga tctgctagcc 180 tttaccgtta ccgtcccgaa agatttgtat gtggtagaat atggcagcaa tatgaccatt 240 gaatgcaaat ttccggtgga aaaacagctg gatctggcgg cgttaattgt gtattgggaa 300 atggaagata agaatatcat tcagtttgtg catggcgaag aagatctgaa agtgcagcat 360 agcagctatc gtcagcgtgc tcgtctgctg aaagatcaac tgagcctggg caatgcggcg 420 ctgcagatta ccgacgtgaa actgcaggat gcgggcgtgt atcgttgcat gattagctat 480 ggcggagcgg actataaacg tattaccgtg aaggtgaatg cgccgtacaa taagattaac 540 cagcggattc tggtggtgga cccggtgacc agcgaacatg aactgacctg ccaggcggaa 600 ggctatccga aagcggaagt gatttggacc agcagcgatc atcaggtgct gtcaggcaag 660 accactacca ccaacagcaa acgcgaggag aagcttttta acgtcaccag caccctgcgt 720 attaacacta ctaccaacga aattttctat tgcacctttc gtcgtttaga tccggaagaa 780 aatcataccg ccgaactggt gattccggag ctgccgctgg cgcatccacc gaatgaacgt 840 ggatcccggg cacaccatca ccatcaccat 870 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro 1 5 10 15 Lys Asp Leu <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe 1 5 10 15 Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly 20

Claims

천연 형태의 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1, PD-L1)에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와 감소된 결합능을 갖는 다량체 응집체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원.
제 1 항에 있어서, 세균에서 항원의 발현을 증가시키기 위한 아미노말단부 및 친화도 크로마토그래피에 의한 항원의 정제를 용이하게 하는 카르복시말단부를 포함하는 것인 키메라 항원.
제 2 항에 있어서, 서열목록 1로 표현되는 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 것인 키메라 항원.
a) 천연 형태의 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1, PD-L1)에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와 감소된 결합능을 갖는 다량체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원 및 b) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 백신 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 백신 아쥬번트는 유성 아쥬번트, 무기염, 프로테오리포좀, 및 강글리오시드에 결합한 프로테오리포좀으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 백신 아쥬번트는 알루미늄염인 것인 약학적 조성물.
천연 형태의 예정사 리간드 1(programmed death ligand 1, PD-L1)에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와 감소된 결합능을 갖는 다량체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원의, 암 또는 그것의 전이의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 용도.
제 7 항에 있어서, 상기 암의 치료를 위한 약물은 능동 면역치료법용 백신인 것인 키메라 항원의 용도.
필요로 하는 개체에서 암 또는 그것의 전이를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은: a) 천연 형태의 예정사 리간드 1(PD-L1)에 비해 PD-1 및 CD80 수용체와 감소된 결합능을 갖는 다량체를 형성하는 인간 PD-L1의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 항원 및, b) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 백신 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 키메라 항원을 포함하는 약학적 조성물의 투여는 수동 면역치료법 또는 표준 암 치료법과 동시에 또는 순차적으로 조합되는 것인 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 수동 면역치료법은 인간 PD-L1 또는 인간 예정 세포사 단백질 수용체 1(PD-1)에 대한 항체를 가지고 수행되는 것인 방법.