KR101861416B1 - 세포 관통 펩티드 - Google Patents

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레스 오삐또 유니베르시테르 드 제네브
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Abstract

본 발명은 ZEBRA 유래의 짧은 세포 관통 펩티드에 관한 것으로 선택적으로 화물 분자에 연결된다. 이것은 또한 상기 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체뿐만 아니라 상기 복합체가 탑재된 세포 및 이들의 치료 및 진단에서의 용도에 관한 것이다.

Description

세포 관통 펩티드{CELL PENETRATING PEPTIDES}
본 발명은 생물학적 및 의학적 응용 분야에서 세포 전달제로서 새로운 세포 관통 펩티드에 관한 것이다.
진핵 세포의 원형질 막은 생활성 분자의 제어되지 않은 유입으로부터 세포를 보호하는 단단하게 제어된 배리어(barrier)이다. 소분자 및 단백질 또는 세포에 대해 내생적이지 않은 다른 고분자계 약물에 대해, 원형질 막을 횡단하는 것은 자연 운송 시스템을 사용하거나 지질 이중층을 통한 직접적인 확산을 성공하는 것과 관련이 있을 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 두 가지 형태의 진입은 외인성 분자에 대해 비효율적이다.
과거 십여년 동안, 세포 관통 펩티드들(cell penetrating peptides, CPPs)는, 단백질을 포함하여 다른 치료제를, 그들의 타겟에 송달하는 유망한 벡터로 출현했다. CPPs는 운반체(transporter) 또는 특정 수용체와 무관하게 생체막(biological membrane)을 횡단하는 단백질 전좌(protein translocation)를 효율적이게 하는 펩티드 시퀀스이다. CPPs는 또한 비용 효율적 생산이라는 장점을 제공한다. 인간면역결핍 바이러스 전사촉진 조절 단백질(human immunodeficiency virus transactivating regulatory protein, HIV TAT)의 막 전좌 성질의 20년 전 발견 이래로, 몇가지 CPPs가 페너트라틴(penetratin)(Antennapedia homeodomain), VP22 (Herpes simplex virus) 및 합성 폴리아르기닌(polyR)를 포함하는 것으로 확인되었다. 다른 화물들(cargoes)이 새로운 백신 디자인 관점으로 CPPs와 연결되어 있다.
최근에, 엡스타인-바바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 베이직 류신 지퍼 전사활성인자(Epstein-Barr virus basic leucine zipper transcriptional activator, ZEBRA)는 간세포의 외막을 가로지르고 림프구의 세포핵 내에 축적되는 것으로 나타났다. 보다 특별하게는, 엡스타인-바바이러스 ZEBRA 전사 활성인자의 세포-관통 능력에 필요한 ZEBRA의 최소 영역은 ZEBRA의 잔기 170 내지 잔기 220에 걸쳐있고, 상기 영역 내에 포함된 DNA 결합 도메인 및 이합체화 도메인(dimerization domain) 모두 세포-관통 성질에 필요하다는 것이 밝혀졌다(Rothe et al. 2010, J. Biological Chemistry 285(26): 20224-20232).
많은 CPPs는 화물 분자들을 세포 내로 송달하기 위한 비이클로서 그들을 사용하려고 할 때 단점이 있다. 예를 들어, 이들은 막 붕괴(membrane disruption) 또는 막 단백질의 정상적인 기능화에 간섭으로 인하여 세포질 누출(cytoplasmic leakage)과 같은 세포 내에서 심각한 부작용을 일으키거나, 세포성 독성 효과 및/또는 면역원성 효과(immunogenic effect)를 일으킬 수 있다. 또한, 일부 CPPs는 세포질 내에서 빠르게 붕괴하거나 엔도솜(endosome) 내에 포획되어 리소좀으로 붕괴될 수도 있다. 게다가, 일부 CPPs는 화물 분자를 방출할 수 없거나, 또는 화물 분자를 보내거나 방출하는 것에 대하여 폭넓은 범위를 가지지 않는다.
그러므로, 광범위하게 다양한 화물 분자를 세포 내로 송달할 수 있는 개선된 비이클이 여전히 필요하며, 이것으로 낮은 독성뿐만 아니라 화물 분자의 효율적인 흡수를 나타낸다. 백신과 관련해서, 만약 송달 비이클이 화물 분자의 내재화(internalization)를 위한 단지 하나의 경로로 제한되지 않고 항원 출현에 대해 시토졸(cytosol)과 엔도솜 모두에게 송달될 수 있다면 매우 유리할 것이다.
본 발명은 CPPs를 제공하여 이 문제를 해결하며, 이 CPPs는 예를 들어 항원 제시 세포(antigen presenting cell)의 세포 표면에 항원결정기(항원 결정기)의 효율적 송달 및 출현(presentation)을 가능하게 한다. 그러므로 본 발명의 CPPs는 폴리펩디드 및 단백질, 다당류, 지질 또는 이들의 조합과 같은 다양한 화물 분자뿐만 아니라 핵산, 소분자 약품, 및 영상화제(imaging agent)의 송달을 위한 비이클로서 유용하다.
본 발명의 제1 양상은 다음을 특징으로 하는 세포 관통 펩티드를 제공하는 것이다:
a) 상기 펩티드의 아미노산 시퀀스의 길이가 총 12 내지 30 아미노산 사이로 포함되고; 및
b) 상기 펩티드가 ZEBRA의 잔기 170 내지 220으로 연장하는 영역의 단편을 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖고, 여기서 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산은 상기 펩티드의 세포 관통 능력을 제거하지 않고 치환, 삭제 및/또는 추가되었고;
또는 상기 펩티드의 변종은 상기 펩티드의 아미노산 시퀀스에 비하여 적어도 하나 보전적으로 치환된 아미노산을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 제2양상은 상기 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양상은 상기 세포 관통 펩티드 또는 상기 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 관련이 있다.
본 발명의 제4양상은 상기 정의된 세포 관통 펩티드 또는 복합체를 발현하는 호스트 세포뿐만 아니라 그러한 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제5양상은 상기 정의된 복합체를 탑재한 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제6양상은 다음을 포함하는 조성물에 관한 것이다: (i) 본 발명의 세포 관통 펩티드, (ii) 본 발명의 복합체, (iii) 본 발명의 핵산, (iv) 본 발명의 벡터, (v)본 발명의 호스트 세포, 또는 (vi)본 발명에 따른 복합체를 탑재한 세포.
본 발명의 제7양상은 약제로서 또는 영상화 또는 진단 조성물로서 사용되기 위한 상기 언급된 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제8 양상은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 키트오브파트(kit-of-part)에 관한 것이다:
(a) 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드;
(b) 본 발명에 따른 복합체;
(c) 본 발명에 따른 핵산;
(d) 본 발명에 따른 벡터;
(e) 본 발명에 따른 호스트 세포;
(f) 본 발명에 따른 복합체 탑재된 세포.
본 발명의 제9 양상은, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 상기 화물 분자를 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인비트로(in vitro)에서 세포 내로 화물 분자를 송달하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 특징과 장점은 다음 상세한 설명으로부터 명확하게 될 것이다.
도 1a 및 도 1b는 CPP1-OVA 및 CPP2-OVA 융합 폴리펩티드의 수지상 세포(dendritic cell) 내로 탑재한 후 MHC Class I 제한된 출현의 결과를 나타낸다. 골수 유래 수지상 세포에 4h 동안 0.3μM의 각 CPPs-OVA 융합 폴리펩티드들을 탑재시키고 LPS로 밤새 성숙시켰다. TCR 유전변형 마우스 OT1의 지라세포(splenocyte)로 공동배양 5일 후, OVA 에피토프(epitope)의 정확한 MHC class I 제한된 출현은 증식 OVA-특이성 T 세포(proliferating OVA-specific T cells)의 CFSE 희석으로 평가되었다. T-세포 단독(A), 또는 융합 폴리 펩티드로 활성화되지 않는 성숙된 골수 수지상 세포(bone marrow dendritic cell)와 공동 배양된 T-세포(B)를 갖는 음성 대조군; 펩티드로 배양된 T-세포(C) 또는 펩티드로 활성화된 성숙된 골수 수지상 세포로 배양된 T-세포(D)를 갖는 양성 대조군; CPP1-OVA(E); CPP2-OVA(F).
도 2는 CPP1 또는 CPP2 및 난백알부민 펩티드 화물를 포함하는 융합 폴리펩티드로 마우스를 백신접종한 후 다중클론성 면역 반응을 나타낸다. 각각 20㎍의 CPPs-OVA 융합 폴리펩티드 및 100㎍ 항-CD40으로 14일 간격으로 피하로 2번 백신 접종하고, 육성 된 10일 후, 50㎍ 폴리-IC를 근육내로 주사하고, 마우스를 희생시키고 자라세포를 멀티머(multimer) 및 항-CD8로 염색했다. PBS (A) ; CPP1-OVA (B) ; CPP2-OVA (C)을 갖는 음성 대조군.
용어 "세포 관통 펩티드"("CPPs")는 일반적으로 원형질막을 횡단하여 다른 타입의 화물(cargo) 분자를 이동시킬 수 있고, 따라서 다양한 분자성 화물(나노사이즈 입자로부터 화학적 소분자, 매크로분자 및 DNA의 커다란 단편까지)의 세포성 흡입을 용이하게할 수 있는 짧은 펩티드를 정의하는데 사용된다. "화물" 분자는 공유 결합을 통한 화학적 다리를 통해 또는 비공유적 상호작용을 통해 세포 관통 펩티드와 관련이 있다. 세포 관통 펩티드는 전형적으로 리신 또는 아르기닌과 같은 양전하 아미노산을상대적으로 풍부하게 포함하는 아미노산 조성물을 갖거나 극성/전하된 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산이 교대하는 패턴을 갖는 시퀀스를 갖는다. 이들 2가지 타입의 구조들은 각각 다발성양이온성(polycationic) 또는 양친매성(amphipathic)이라 한다. 세포 관통 펩티드들은 사이즈, 아미노산 시퀀스 및 전하들이 다르지만 모든 CPPs는 원형질 막을 전좌하는 능력이고 세포질 또는 세포 기관으로 다양한 분자 화물를 송달하는 것을 용이하게 하는 공통 특성을 갖는다. 현재, CPP 전좌 원리는 3개의 주요 진입 메커니즘으로 구별한다: 막 내에 직접적인 관통, 엔토시토시스-매개 진입(endocytosis-mediated entry), 및 일시적인 구조의 형성을 통한 전좌. CPP 형질도입(transduction)은 진행중인 연구 영역이다. 세포-관통 펩티드는, 암 및 바이러스 저해제를 포함하는 다른 질병들의 치료에 있어서 약물 잔달제뿐만 아니라 세포 표지 및 영상화를 위한 조영제(contrast agent)로서 의학에서 수많은 응용분야를 발견하였다.
"화물 분자"는 여기서 공유 또는 비공유 결합에 의해 세포 관통 펩티드에 연결된, 분자를 정의하며, 이들의 세포성 내재화는 상기 세포 관통 펩티드의 존재로 인하여 용이하게 되거나 가능하게 된다. 본 발명에서, "화물 분자들"은 펩티드, 단백질, 다당류, 지질, 리포 단백질 및 글리코리피드을 포함하는 이들의 조합, 핵산(e.g. DNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 디코이 DNA, 플라스미드), 소분자 약물(e.g. 사이클로스포린 A, 파크릴탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트(methotrexate), 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid)), 영상화제(e.g. 형광단, 양자점 (QDs), 방사성 추적자, 메탈킬레이트, 예를 들어 가돌리늄 (Gd3+) 저분자량 킬레이트, 초상자성 산화철 (SPIO))를 포함한다. 화물 분자가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질일 때, 이것은 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 서로 연결된 단백질을 포함할 수 있다는 것이 명백하다. 또한, 화물 분자가 핵산일 때, 상기 핵산은 하나 이상의 핵산을 포함하며, 각각은 하나의 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 화물 분자는 리포단백질 및 글리코리피드를 포함하는, 단백질, 지질, 및/또는 다당류의 조합일 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질" 및 이들 용어의 변형은 펩티드, 올리고펩티드, 올리고머 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질 각각을 의미하며, 예를 들어 아이소스테릭 펩티드의 경우에서처럼 정상 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함한다. 이들 용어는 또한 여기서 비-펩티드 구조적 요소를 포함하는 펩티드 유사체로서 정의된 "펩티도미메틱(peptidomimetic)"를 포함하며, 이 펩티드는 자연 모펩티드의 생물학적 활동을 흉내내거나 길항작용할 수 있다. 페티도미메틱은 효소적으로 분리되기 쉬운 펩티드 결합과 같은 전통적인 특성이 결핍되어 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 유전자 코드로 규정된 20 아미노산이외 아미노산으로 구성될 수 있다. L-아미노산 및/또는 D-아미노산으로 구성될 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 번역 후 성숙 가공과 같은 자연 가공 또는 당해 기술분야의 통상의 전문가에게 잘 알려진 화학적 가공에 의해 변형된 아미노산으로 동등하게 구성될 수 있다. 그러한 변형들은 문헌에 완전히 상세히 설명되어 있다. 이들 변형은 폴리펩티드 내 어디든 일어날 수 있다: 펩티드 골격 내, 아미노산 사슬 내 또는 카르복시 또는 아미노-말단에서 조차 일어날 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)를 따라 분지화되거나 가지와 함께 고리화 또는 가지 없이 고리화될 수 있다. 이런 타입의 변형은 당해 기술분야의 통상의 전문가에게 잘 알려진 자연 또는 합성 번역 후 가공의 결과일 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오 유도체의 공유적 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 고정, 포스파티딜리노시톨의 공유적 고정, 공유 또는 비공유 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 페그화를 포함하는 글리코실화, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해성 가공(proteolytic processe), 인산화, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 세네오일화(seneloylation), 황산화, 아르기닐화와 같은 아미노산 부가 또는 유비퀴틴화를 포함할 수 있다. 그러한 변형은 문헌에 상세히 설명되어 있다(Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) protein Synthesis: Post-translational Modifications 및 Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62).
세포 관통 펩티드에 결합된 화물 분자의 "세포성 내재화" 용어는 일반적으로 원형질막을 횡단하는 화물분자의 이동 및 이로 인한 화물 분자의 세포내 진입을 의미한다. 특정 경우에 따라, 화물 분자는 세포질 내에 방출되고 내세포성 세포기관을 향하거나 또는 세포 표면에 출현될 수 있다.
용어 "ZEBRA" (또한 Zta, Z, EB1, 또는 BZLF1로 알려짐)은 엡스타인-바바이러스(Epstein - Barr virus, EBV)의 베이직-류신 지퍼(basic-leucine zipper, bZIP) 전사 활성인자를 의미한다. 세포 관통 성질을 나타내는, ZEBRA의 최소 도메인은 ZEBRA의 잔기 170 내지 잔기 220 구간으로 확인되었다. ZEBRA의 아미노산 시퀀스는 NCBI 접근 번호 YP_401673로 알려지며 SEQ ID NO:23으로 대표되는 245 아미노산을 포함하다.
용어 "에피토프"는 또한 "항원 결정기"로 알려져 있고, 면역 시스템, 구체적으로 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 항원의 일부이다. 본 출원에서, 용어 "에피토프"는 주로 T 세포 에피토프를 지정하기 위해 사용되며, 이는 항원 제시 세포의 표면에 출현되며, 여기서 이들은 주조직 적합성복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC)에 결합된다. MHC class I 분자에 의해 출현된 T 세포 에피토프는 전형적으로, 그러나 이에 한정적이지 않게, 8 내지 11 아미노산 길이의 펩티드이고, 반면에 MHC class II 분자는 일반적으로 보다 긴 펩티드, 이에 한정되지 않으나, 12 내지 25 아미노산 길이를 나타낸다.
용어 "CD4+ 에피토프" 또는 "CD4+-제한 에피토프"는, 여기서 CD4+ T 세포에 의해 인식된 에피토프를 규정하며, 상기 에피토프는 MHC class II 분자의 홈에 누여진 항원 단편으로 이루어진다.
상기 용어 "CD8+ 에피토프" 또는 "CD8+-제한 에피토프"는 여기서 CD8+ T 세포에 의해 인식된 에피토프를 규정하며, 상기 에피토프는 MHC class I 분자의 홈에 누여진 항원 단편으로 이루어진다.
용어 "MHC class I 컨텍스트(context) 내의 에피토프 출현"은 세포 표면에서 MHC class I 분자의 홈에 누여진 CD8+ 에피토프를 의미한다.
용어 "MHC class II 컨텍스트 내의 에피토프 출현"은 세포 표면에서 MHC class II 분자의 홈에 누여진 CD4+ 에피토프를 의미한다.
용어 "CDI 컨텍스트 내 에피토프 출현"은 세포 표면에서 분화(differentiation) 1 분자의 클러스터의 홈에 누여진 지질 에피토프를 의미한다.
"MHC class I"은 2개의 주요 분류의 주조직 적합성 복합체 분자들 중 하나를 지정한다. MHC class I (또한 "MHC I"로 표시) 분자들은 신체의 모든 핵 있는 세포에서 발견된다. MHC class I의 기능은 세포독성 세포(CTLs)에 대하여 에피토프를 나타내는 것이다. 인간에서, MHC class I 분자는 2개의 폴리펩티드 사슬, α- 및 β2-마이크로글로불린 (b2m)으로 이루어진다. 단지 α사슬이 폴리모픽(polymorphic)하고 HLA 유전자에 의해 암호화되는, 반면에 b2m 서브유니트는 폴리모픽이 아니고 Beta-2 마이크로글로불린 유전자에 의해 암호화된다.
"MHC class II"는 다른 주요 분류의 주조직 적합성 복합체 분자를 나타낸다. MHC class II (또한 "MHC II"라 함) 분자들은 마이크로파아지, 수지상 세포 및 B세포를 포함하여 몇 개의 특성화된 세포 타입에서만 발견되고, 이들 모두는 전용 항원 제시 세포(APCs)이다.
"종양(tumor) 에피토프"는 여기서, 종양-관련 항원의 에피토프 또는 종양-특이적 항원의 에피토프를 의미한다. 예를 들어, 종양 에피토프는 신경교종(glioma) 에피토프를 포함한다.
"병원체(pathogen) 에피토프"는 여기서 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원충(protozoa) 및 다세포성 기생출을 포함하는 병원체로부터의 항원 단백질, 항원 다당류, 항원 지질, 항원 리포단백질 또는 항원 글리코리피드의 에피토프를 의미한다.
병원체로부터의 항원 단백질, 다당류, 지질, 리포단백질 또는 글리코리피드는 여기서 각각 백신 접종의 표적이 될 수 있는 질병에 원인이 되는 병원체로부터의 단백질, 다당류, 지질, 리포단백질 및 글리코리피드를 포함하며, 상기 질병들은 예를 들어 아메바증(Amoebiasis), 탄저병(Anthrax), 부룰리 궤양(Buruli Ulcer)[미코박테리움 울서란스 (Mycobacterium ulcerans)], 칼리시바이러스 관련 설사(Caliciviruses associated diarrhoea), 캄필로박터(Campylobacter) 설사, 자궁경부 암 (사람유두종바이러스, human papillomavirus), 트라코마 클라미디아 관련 생식기 질병(Chlamydia trachomatis associated genital diseases), 콜레라, 크림-콩고출혈열(Crimean-Congo haemorrhagic fever), 뎅기열(Dengue Fever), 디프테리아, 에볼라출혈열(Ebola haemorrhagic fever), 독소원성대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 설사, 위 암 (헬리코박터 파일로리), 임질(Gonorrhea), A군 연쇄상구균 관련 질병(Group A Streptococcus associated diseases), B군 연쇄상구균 관련 질병(Group B Streptococcus associated diseases), 헤모필루스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae) B 페렴 및 전염성 질병, 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E 설사, 단순포진(Herpes simplex) 타입 2 생식기 궤양, HIV/AIDS, 십이지장충 질병(Hookworm Disease), 인플루엔자, 일본뇌염, 라사열(Lassa Fever), 리슈마니어증(Leishmaniasis), 렙토스피라증(Leptospirosis), 간암 (Hepatitis B), 간암 (Hepatitis C), 라임병(Lyme Disease), 말라리아, 마버그 출혈열(Marburg haemorrhagic fever), 홍역, 볼거리(Mumps), 비인두 암 (Epstein-Barr virus), 수막염균 뇌수막염(Neisseria meningitidis Meningitis), 파라인플루엔자 관련 페렴, 백일해(Pertussis), 흑사병(Plague), 소아마비(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 호흡기세포융합바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV) 페렴, 리프트밸리열(Rift Valley fever), 로타바이러스(Rotavirus) 설사, 풍진(Rubella), 주혈흡충병(Schistosomiasis), 중증 급성 호흡기 증후군 (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 세균성 이질(Shigellosis), 천연두(Smallpox), 포도상구균 관련 질병(Staphylococcus aureus associated diseases), 위 암 (헬리코박터 파일로리), 연쇄상구균 페렴 및 전염성 질병, 파상풍(Tetanus), 진드기 매개 뇌염(Tick-borne encephalitis), 트라코마(Trachoma), 결핵(Tuberculosis), 야생토끼병, 장티푸스, 웨스트-나일 바이러스(West-Nile virus) 관련 질병, 황열(Yellow fever)을 포함하는 백신접종을 위한 표적일 수 있다.
용어 "소분자 저해성 핵산(siNAs)"는 mRNA 인식 및 그들의 항원 작용을 기초로 한 하향조절(downregulation)을 목표로 한 전략에 사용된 짧은 핵산을 의미한다. 상기 용어는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 데옥시리보자임과 같은 촉매성 핵산뿐만 아니라 소분자 간섭 RNAs(siRNAs)를 포함한다.
용어 "si RNA"는 표적 유전자의 표적된 mRNA를 넉다운시키거나 침묵시킬 수 있는 단일 또는 이중가닥 RNA(약 19-23 뉴클레오티드)인 소분자 간섭 RNA를 의미한다. 인공 siRNAs는 올리고뉴클레오티드로 화학적으로 합성되거나, 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs)로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터(아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스) 안으로 클론되어 어떠한 세포 타입에서도 일시적 또는 안정된 감염을 일으킬 수 있다 (Martin et al., 2007, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet., 8:81-108; Kolfschoten et al., 2007, Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab., 3(12):827-34; Huang et al., 2008, Expert. Opin. Ther. Targets, 12(5), 637-645).
여기서 사용된 "치료" 및 "치료하는" 및 이와 같은 것들은 일반적으로 원하는 약물학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 질병, 증후군 또는 이들의 상태를 예방하거나 부분적으로 예방하는 형태로 예방적 효과 및/또는 질병, 상태, 증후 및 이 질병으로 인한 이상 반응의 부분적 또는 완전한 치료 형태의 치료적 효과일 수 있다. 여기서 사용된 용어 "치료"는 포유류, 특히 인간의 질병 치료 어떠한 것도 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 예방적 초기 증상이 없는 간섭과 같이 질병에 취약하나 아직 그 질병으로 진단되지 않은 대상에서 발생하는 질병의 예방; (b) 질병의 저해, 즉 질병 진행을 방지; 또는 질병의 완화, 즉 손상의 개선 또는 치료와 같이 질병 및/또는 이들의 증후 또는 상태의 완화를 일으키는 것. 특히 본 발명에 따른 방법, 용도, 제형 및 조성물은 암 또는 감염성 질병의 치료 및/또는 초기 단계 암을 갖는 환자에서 진행 또는 전이 단계로 암이 진화하는 것을 예방하여, 암의 진행을 개선한다. 암에 적용될 때, 질병 또는 질환의 예방은, 예를 들어 상기 개인의 친척 집단에서 상기 암의 과거 발현으로 인하여 상기 암이 발전할 위험으로 확인된 개인의 암의 출현 또는 발달을 방지하는 것, 및 종양 자극 병원체로 감염되는 것을 방지하는 것을 포함하며, 그러한 병원체는 예를 들어, 엡스테인-바 바이러스 (EBV), 사람유두종바이러스 (HPV), 간염 B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 인간 헤르페스 바이러스 8 (인간 Herpes virus, HHV8), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입 1 (leukemia virus type 1, HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyomavirus, MCV) 및 헬리코박터 파일로리가 있다. 또한, 암의 "예방/치료" 용어에 의해 포함되는 것은 개인의 이미 진단된 암의 안정화이다. "안정화"에 의해, 암이 초기 단계 암을 갖는 환자에서 암이 진행 또는 전이 단계로 진화하는 것을 방지하는 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "대상"은 포유류를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 고려되는 표유류는 인간, 영장류, 소, 양, 돼지, 말과 같은 가축, 실험실 설치류등을 포함한다.
여기서 사용된 "효과적인 함량"은 적어도 하나의 세포 관통 펩티드, 상기 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체, 상기 복합체가 탑재된 세포, 본 발명에 따른 이들의 조성물 또는 약제학적 제형의 함량으로, 조사되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 함량을 의미한다. 일 실시예에서, 효과적인 함량은 치료되는 질병의 증후 또는 상태의 완화를 위한 "치료학적으로 효과적인 함량"이다. 다른 실시예에서 효과적인 함량은 예방되는 질병 또는 상태의 증후의 예방을 위한 "예방적으로 효과적인 함량"이다. 상기 용어는 또한 여기서는 질병 진행을 감소시키기에 충분한 활성 폴리 펩티드 함량, 바람직하게는 종양 성장 또는 감염을 줄이거나 방지하여, 찾고자 하는 반응을 이끌어내는데 충분한 활성 폴리 펩티드 함량을 포함하며, 특히 그러한 반응은 화물 분자 내에 포함된 에피토프에 대하여 직접적인 면역 반응일 수 있다(즉, "저해 효과적 함량").
본 발명에 따른 치료의 "효능" 용어는 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 대한 반응으로 질병 과정에서 변화를 기초로 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 치료의 효능은 종양 크기의 감소, 및/또는 무진행 생존 시간(progression free survival time)의 증가, 및/또는 원발성암(primary cancer)의 절제술 후 재발 위험의 감소로 측정될 수 있다. 면역 치료법에 의해 치료된 암에 대하여 보다 구체적으로, 효능 평가는 새로운 면역 관련 반응 기준(ir RC)을 통해 면역 치료제에 대한 항종양 반응의 임상 패턴의 스팩트럼에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST) 및 세계 보건 기구(WHO) 기준으로부터 채택된다(J. Natl. 암 Inst. 2010, 102(18): 1388 1397). 감염성 질병의 예방 효능은 궁극적으로 인간 집단에서의 유행병학적 연구에 의해 평가되며, 이는 때때로 혈청 내 항체를 중성화하는 적정농도(titre), 및 다기능성 병원체 특이적 T 세포 반응의 유도와 관련이 있다. 임상전 평가는 감염성 병원체로 접종 후 감염에 대한 저항성을 포함할 수 있다. 감염성 질병의 치료는 병원체의 성장 저해 또는 병원체의 제거(및 이로 인하여 병원체 검출 부재)로 측정될 수 있으며 병원체 특이적 항체 및/또는 T 세포 면역 반응과 관련이 있다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생리학적 활성이 명확하게 효과적이 되도록 된 일정 형태인 것으로 상기 제형이 투여되는 대상에 독성이 되는 추가적인 성분을 포함하지 않는 제제를 의미한다.
본 발명에 따른 세포 관통 펩티드들 및 복합체들
본 발명의 제1 양상은 다음으로 특징된 세포 관통 펩티드에 관한 것이다:
a) 상기 펩티드의 아미노산 시퀀스의 길이가 총 15 및 30 아미노산 사이로 포함되고, 예를 들어 총 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 아미노산; 및
b) 상기 펩티드는 ZEBRA의 최소 도메인 단편을 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖고, 상기 최소 도메인은 ZEBRA(SEQ ID NO: 23)의 잔기 170 내지 220으로 연장하고, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산은 펩티드의 세포 관통 능력이 제거되지 않고 치환, 삭제 및/또는 추가되고;
또는 상기 펩티드의 변이체는 상기 펩티드의 아미노산 시퀀스에 비하여 적어도 하나의 보수적으로 치환된 아미노산을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함한다.
본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 또는 상기 세포 관통 펩티드를 포함하는 복합체의 세포 관통 능력, 또는 내재화는 당해 기술분야의 통상의 전문가에게 알려진 표준 방법으로 체크될 수 있으며, 여기에는 살아있고 고정된 세포의 유동세포 계수법(flow cytometry) 또는 현광 현미경 검사(fluorescence microscopy), 펩티드 또는 복합체가 도입된 세포의 면역세포화학(, immunocytochemistry), 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함한다.
유리한 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드의 변이체 또는 단편은, MHC class I 및/또는 MHC class II 분자의 문맥에서, 세포, 예를 들어 항원 제시 세포의 표면에서 에피토프와 같은 단백질성 화물 분자를 출현시키는 상기 펩티드의 능력을 더 보유한다.
MHC class I 및/또는 MHC class II 분자들의 문맥에서 세포의 표면에서 에피토프와 같은 단백질성 화물 분자를 출현시키는 세포 관통 펩티드 또는 상기 세포 관통 펩티드를 포함하는 복합체의 능력은 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 알려진 표준 방법으로 체크될 수 있으며, 이는 MHC-제한 CD4+ 또는 CD8+ T세포의 증식 및/또는 기능을 이들의 에피토프에 대한 특이성으로 자극하는 능력을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 13이 아니다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 14이 아니다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 23의 ZEBRA 아미노산 시퀀스에 대하여 189 등가 위치에서 Ser(S)로 치환된 Cys(C)를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명은 다음으로 특징된 세포 관통 펩티드에 관한 것이다:
a) 상기 펩티드는 적어도 15, 및 많아야 30 아미노산 길이의 아미노산 시퀀스를 갖고; 및
b) 상기 펩티드는 다음을 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖고:
(i) SEQ ID NO: 1, 또는
(ii) 상기 펩티드의 세포 관통 능력이 중단되는 것 없이, 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가되는 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1과 동일한 아미노산 시퀀스;
또는 상기 펩티드의 변이체는 상기 펩티드의 아미노산 시퀀스에 비하여 적어도 하나의 보전적으로 치환된 아미노산을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함한다.
본 발명에 따른 제1 양상에 따라, 상기 세포 관통 펩티드는 참조 시퀀스에 비하여 적어도 하나 보전적으로 치환된 아미노산을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하며, 이는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기에 의해 대체되는 것을 의미한다.
일반적으로, 참조 아미노산 시퀀스에 나타난 하나 이상의 아미노산의 치환은 보전적으로 이루어져야만 한다. 보전적 치환들의 예는 다른 하나에 대해, 예를 들어 Ile, VaI, Leu, 또는 Ala와 같은 지방족 잔기의 치환, 또는 다른 하나에 대해 하나의 극성 잔기, 예를 들어 Lys 및 Arg; Glu 및 Asp; 또는 Gln 및 Asn 사이에서 치환을 포함한다. 다른 보전적 치환은, 예를 들어, 유사한 소수성 성질을 갖는 전체 영역의 치환은 공지되어 있다(Kyte 및 Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157(1):105- 132). 하나 이상의 D-아미노산으로 하나 이상의 L-아미노산 치환은 본 발명의 문맥에서 보전적 치환으로 간주된다. 예시적 아미노산 치환은 하기 표 1에 제시된다:
원래 잔기 치환의 예
Ala (A) Val, Leu, Ile, Gly
원래 잔기 치환의 예
Arg (R) His, Lys
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Pro, Ala
His (H) Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, His
Met (M) Leu, Ile, Phe
Phe (F) Leu, Val, Ile, Tyr, Trp, Met
Pro (P) Ala, Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr, Phe
Tyr (Y) Trp, Phe
Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala
그러므로, 다른 양상에서 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 다음으로 특징된다:
a) 상기 펩티드는 적어도 15, 및 많아야 30 아미노산 길이를 갖는 아미노산 시퀀스를 갖고; 및
b) 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 6를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖고, 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산은 상기 펩티드의 세포 관통 능력이 중단되지 않으면서 치환, 삭제, 및/또는 추가되고,
여기서
X1는 K, R, 또는 H이고,
X2는 R, K, 또는 H이고,
X3는 Y, W, 또는 F이고,
X4는 K, R, 또는 H이고,
X5는 N 또는 Q이고,
X6는 R, K, 또는 H이고,
X7는 V, I, M, L, F, 또는 A이고,
X8는 A, V, L, I, 또는 G이고,
X9는 S 또는 T이고,
X10는 R, K, 또는 H이고,
X11는 K, R, 또는 H이고,
X13는 R, K, 또는 H이고,
X14는 A, V, L, I, 또는 G이고,
X15는 K, R, 또는 H이고,
X16는 F, L, V, I, Y, W, 또는 M이고,
X17는 K, R, 또는 H이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X1는 K이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X2 는 R이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X3 는 Y이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X4 는K이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X5는 N이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X6 는 R이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X7 는V이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X8 는A이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X9 는S이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X10 는 R이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X11 는 K이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X13 는 R이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X14는 A이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X15는 K이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X16는 F이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 X17는 K이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 6으로 참조되는 상기와 같이 유전적으로 정의된 것이고, 여기서 SEQ ID NO: 6에 대해 12 등가 위치에서 아미노산이 Ser(S)이다.
보다 특정 양상에서, 상기 세포 관통 펩티드는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 아미노산 시퀀스를 포함하고, 여기서
X1는 K 또는 R이고,
X2는 R 또는 K이고,
X3는 Y, W, 또는 F이고,
X4는 K 또는 R이고,
X5는 N 또는 Q이고,
X6는 R 또는 K이고,
X7는 V, I, M 또는 L이고,
X8는 A 또는 G이고,
X9는 S 또는 T이고,
X10는 R 또는 K이고,
X11는 K 또는 R이고,
X13는 R 또는 K이고,
X14는 A 또는 G이고,
X15는 K 또는 R이고,
X16는 F, Y, 또는 W이고,
X17는 K 또는 R이다.
특히, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2로 이루어지거나 이들을 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 1로 이루어지거나 이를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 8로 이루어지거나 이를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 9로 이루어지거나 이를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 10으로 이루어지거나 이를 포함하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 본 발명의 세포 관통 펩티드의 1차 아미노산 시퀀스가 번역 후에 더 변형, 예를 들어 글리코실화 또는 인산화에 의해 더 변형될 수 있다는 것을 당해 기술분야의 전문가는 잘 이해할 것이다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 상술된 아미노산 시퀀스 외에, 다음 중 하나 또는 이들의 조합을 선택적으로 더 포함한다:
(i) 핵위치신호 (nuclear localization signal, NLS). 그러한 신호는 전문가에게 잘 알려져 있으며, Nair et al. (2003, Nucleic acids Res. 31 (1) : 397-399)에 기술되어 있다.
(ii) Kapoor et al. (2012, PLoS ONE 7(4): e35187)에 기술되고 http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php에 목록화되어 있는 것들과 같은 종양 귀소 펩티드(tumor homing peptides)를 포함하는 표적 펩티드.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드는 화물 분자에 연결되고 상기 화물 분자의 세포성 내재화를 용이하게 한다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
상기 화물 분자는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드의 C-말단부 또는 N-말단부에 연결될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드에 연결 또는 본 발명에 따른 복합체에 포함된 화물 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, (ii) 다당류, (iii) 지질, (iv) 리포단백질, (v) 글리코리피드, (vi) 핵산, (vii) 소분자 약물(small molecular drug) 또는 독소(toxin), 및 (viii) 영상화제 또는 조영제.
화물 분자는 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질, 하나 이상의 다당류, 하나 이상의 지질, 하나 이상의 리포단백질, 하나 이상의 글리코리피드, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 소분자 약물 또는 독소, 하나 이상의 영상화제 또는 조영제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 것이 명백하다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드에 연결되거나 또는 본 발명에 따른 복합체에 포함된 화물 분자는 병원체 에피토프 및/또는 종양 에피토프들 중에서 선택된다.
한 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이고, 여기서 상기 화물 분자는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질이다.
본 발명에서 유용한 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 본성의 화물 분자의 예로는 에피토프, 항체, 항체 단편, 치료 단백질, 전사 인자, 전사 촉진자 및 디코이 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 화물 분자는 병원체로부터의 종양-관련 항원, 종양-특이적 항원, 또는 항원 단백질의 항원 결정기(들)에 대응하는 CD4+ 에피토프(들) 및/또는 CD8+ 에피토프를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에 포함된 CD4+ 에피토프는 일반적으로, 및 바람적하게는 약 12-25 아미노산으로 이루어진다. 이들은 또한 약 8-25 아미노산 또는 약 6-100 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 포함된 CD8+ 에피토프는 일반적으로, 및 바람직하게는 약 8-11 아미노산으로 이루어진다. 이들은 또한 약 8-15 아미노산 또는 약 6-100 아미노산으로 이루어질 수도 있다.
구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는 에피토프, 항체, 항체 단편, 치료 단백질, 전사 인자, 전사 촉진자 및 디코이 펩티드로부터 선택된 화물 분자를 포함한다.
보다 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 화물 분자를 포함하며, 이는 여기 정의된 것처럼 종양 에피토프 및/또는 병원체 에피토프일 수 있다.
구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원충 및/ 다세포성 기생충 항원 단백질을 포함하는, 병원체로부터의 종양-관련 항원, 종양-특이적 항원, 및/또는 항원 단백질의 에피토프를 포함하는 화물 분자를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 에피토프는 MHC class I 및/또는 MHC class II 콘텍스트에서 세포 표면에 출현될 것이다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 카테고리 내 화물 분자의 예로는 Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54(3):187-207), Vigneron et al. (2013, Cancer Immun .13:15)에 설명된 것들과 같은 다수의 신경교종 에피토프의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 모든 상기 신경교종 에피토프는 본 발명에 따른 단일 복합체를 형성할 동일한 세포 관통 펩티드에 연결되지 않고, 개별적으로 또는 적어도 2 에피토프의 집단에 의해 본 발명에 따른 독립된 세포 관통 펩티드에 연결되어, 적어도 2개 별개의 복합체를 형성한다.
유리한 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는 세포 관통 펩티드 및 에피토프를 포함하고, MHC class I 및 MHC class II context 에서 항원 제시 세포의 표면에 상기 에피토프가 이동 및 출현하게 하고, 이에 따라서 백신 접종 및 면역 치료에 유용하게 된다.
특정 양상에서, 본 발명에 따른 복합체는 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 연결, 및/또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질성 카르고 분자 내에 포함된 연속적인 에피토프 연결, 및/또는 연속적인 화물 분자의 연결, 및/또는 화물 분자의 C-말단부에 놓여지는 비면역학적 분열 모이어티인 스페이서 또는 링커를 포함한다.
상기 스페이서는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있으며, 본 발명에 따른 복합체의 2개의 구성분들 사이의 결합이 공유적 결합 또는 비공유적 결합일 수도 있다.
펩티드 스페이서는 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산으로 이루어진다. 상기 펩티드 스페이서의 아미노산 시퀀스는 화물 분자의 N-말단 또는 C-말단 플랭킹 영역(flanking region) 또는 상기 화물 분자의 에피토프의 것과 동일할 수도 있다. 대안적으로, 펩티드 스페이서는 상기 자연 플랭킹 영역의 보전적 아미노산 치환의 결과인 아미노산 시퀀스와 같은 비자연 아미노산 시퀀스, 또는 엔테로키나아제 표적 사이트(아미노산 시퀀스 DDDK, SEQ ID NO: 15), 인자 Xa 표적 사이트 (아미노산 시퀀스 IEDGR, SEQ ID NO: 16), 트롬빈 표적 사이트 (아미노산 시퀀스 LVPRGS, SEQ ID NO: 17), 프로테아제 TEV 표적 사이트 (아미노산 시퀀스 ENLYFQG, SEQ ID NO: 18), PreScission 프로테아제 표적 사이트 (아미노산 시퀀스 LEVLFQGP, SEQ ID NO: 19), 다발성양이온 아미노산, e.g. 폴리 K, 푸린 표적 사이트 (아미노산 시퀀스 RX(R/K)R, SEQ ID NO: 20)와 같은 프로테아제를 위한 알려진 절단 사이트의 시퀀스로 이루어질 수 있다.
특정 실시예에서, 펩티드 스페이서는 어떠한 Cys (C) 잔기도 포함하지 않는다.
비펩티드 스페이서는 에스테르, 티오에스테르 또는 디설파이드를 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명에 따른 복합체는 스페이서 또는 링커를 포함하고, 특히 세포 관통 펩티드 시퀀스 및 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 화물 사이에 놓여진 펩티드 스페이서를 포함한다. 이 펩티드 스페이서는, 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체가 내재화되면, 세포 기계에 의해 절단되어, 세포, 세포기관 또는 세포 표면 내 세포 관통 펩티드에서는 화물이 없도록, 당해 기술분야의 전문가에 의해 선택될 수 있다.
보다 구체적인 양상에서, 상기 세포 관통 펩티드와, 펩티드, 폴펩티드, 또는 단백질성 화물 분자를 연결하는 상기 스페이서, 또는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질성 화물 분자의 인접 에피토프는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산로 이루어지고, 이는 상기 화물 분자 또는 인접 에피토프를 플랭킹하는 영역의 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산에 대응한다.
상기 화물 분자가 몇 가지 에피토프를 포함할 때, 본 발명의 복합체 내 포함된 에피토프 각각은 서로 직접적으로 연결되거나 또는 몇 가지 아미노산으로 이루어진 펩티드 스페이서와 같은 스페이서 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 대안적으로, 상기 화물 분자가 몇 가지 에피토프를 포함할 때, 본 발명의 복합체에 포함된 일부 에피토프는 서로 직접적으로 연결되거나 또는 일부 다른 에피토프는 몇 가지 아미노산들로 이루어진 펩티드 스페이서와 같은 스페이서 또는 링커를 통해 연결되는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 구체적 양상에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 화물 분자 내에 포함된 2개의 연속적인 에피토프는 상기 에피토프들의 자연 플랭킹 영역들로 이루어지는 스페이서에 의해 서로 연결된다. 일 실시예에 따라, 제1 에피토프를 제2 에피토프로 연결하는데 사용된 상기 스페이서는, 제1 에피토프의 N-말단 또는 C-말단 플랭킹 영역의 약 4 아미노산 이하, 이어서 제2 에피토프의 N-말단 또는 C-말단 플랭킹 영역의 약 4 아미노산 이하에 대응하여 약 8아미노산 이하로 이루어진다. 본 발명의 설명에서, 제1 에피토프("에피토프 1")을 제2 에피토프("에피토프 2")로 연결하는데 사용된 스페이서는 다음으로 변화하는 어떠한 가능한 조합에 대응하여 약 8 아미노산으로 이루어진다: 에피토프 1의 0 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 8플랭킹 아미노산으로부터 에피토프 1의 8 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 0 플랭킹 아미노산까지, 즉 에피토프 1의 1 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 7 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 2 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 6 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 3 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 5 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 4 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 4 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 5 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 3 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 6 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 2 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 7 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 1 플랭킹 아미노산, 에피토프 1의 8 플랭킹 아미노산 및 에피토프 2의 0 플랭킹 아미노산을 포함한다. 2개 연속적인 에피토프들을 연결하는 스페이서를 구성하는 총 8 아미노산이 절대적인 값은 아니며 상기 스페이서는 또한 총, 예를 들어 3 아미노산, 4 아미노산, 5 아미노산, 6 아미노산, 7 아미노산, 9 아미노산 또는 10 아미노산으로 구성될 수 있다. 유사하게, 상기 언급된 동등 조합이 또한 스페이서가 8 아미노산보다 적거나 많은 경우에 본 발명의 설명이다.
본 발명의 또 다른 설명에서, 제1 에피토프("에피토프 1")을 제2 에피토프("에피토프 2")로 연결하는데 사용된 스페이서는 약 4 아미노산, e.g. 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산으로 이루어진다. 특히, 상기 스페이서의 시퀀스는 에피토프 1 또는 에피토프 2의 N-말단 또는 C-말단 플랭킹 영역의 4 아미노산에 대응할 수 있다.
상술된 것과 같은 스페이서는 화물 분자 내에 포함된 마지막 에피토프의 C-말단에 놓여질 수 있다.
펩티드 스페이서의 예로는 아미노산 시퀀스 예를 들어 EQLE (SEQ ID NO: 11) 또는 TEWT (SEQ ID NO: 12), 또는 이들의 보전적 치환을 포함한다.
또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 화물 분자는 다당류, 지질, 리포단백질, 및/또는 글리코리피드이며, 특히 다당류, 지질, 리포단백질, 및/또는 글리코리피드 에피토프이고, 이는 여기 정의된 병원체 에피토프일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원충 및 다세포성 기생충 항원을 포함하는 병원체로부터의 항원의 다당류, 지질, 리포단백질 및/또는 글리코리피드 에피토프를 포함하는 화물 분자를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 에피토프는 MHC class I 및/또는 MHC class II context에서 세포 표면에 출현될 것이다.
본 발명의 또 다른 설명에서, 상기 지질 에피토프는 CD1 (분화 1의 클러스터, cluster of differentiation 1) context 에서 세포 표면에 제시될 것이다.
또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체를 제공하고, 여기서 화물 분자는 소분자 약물 또는 독소이다.
본 발명에 유용한 소분자 약물 또는 독소의 카테고리 내의 화물 분자 예로는 사이클로스포린 A, 파크릴탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트, 5-아미노레불린산, 디프테리아 독소, 슈니티니브(sunitinib) 및 De wit Amer (2010, Neuro Oncol, 12(3): 304 -16)에서 검토된 이들 분자들을 포함한다.
또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체를 제공하고, 여기서 상기 화물 분자는 영상화제 또는 조영제이다.
본 발명에서 유용한 영상화제 또는 조영제의 카테고리 내의 화물 분자 예로는 형광단, 양자점(QDs), 가돌리늄(Gd3+) 저분자량 킬레이트 및 초상자성 산화철 (SPIO)과 같은 메탈킬레이트, 방사성 추적자를 포함한다.
또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체를 제공하고, 상기 화물 분자는 핵산이다.
본 발명에 유용한 핵산 화물 분자의 예로는 DNA, RNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 디코이 DNA, 플라스미드, 마이크로RNAs를 포함한다.
또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 포함하는 복합체를 제공하고, 여기서 상기 화물 분자는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화, 특히 에피토프를 함유하는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화하는 핵산이다.
핵산 카테고리 내의 화물 분자의 예로는 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질성 화물 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특정 예로는 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 화물 분자 내에 포함된 에피토프를 암호화하는 핵산이다. 다른 예는 Reardon et al (2013, Expert Rev Vaccines, 12(6): 597-615)에 설명된 것과 같은 다중 신경교종 에피토프의 조합을 암화화하는 핵산이다.
또 다른 유리한 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체는 세포 관통 펩티드 및 에피토프를 암화화하는 핵산을 포함하여, 세포 내로 상기 핵산의 이송을 가능하게 한다. 형질 도입된 핵산은 이후 전사 및 번역되어 상기 세포 내로 상기 에피토프를 생산하고, 이들은 이어서 MHC class I 및 MHC class II context 내에서 항원 제시 세포의 세포 표면에 출현된다. 그러한 복합체는 그러므로 백신 접종 및 면역 치료에 유용하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화물는, 여기 설명된 것처럼 펩티드 스페이서에 의하는 것을 포함하여, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드에 공유적 또는 비공유적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 연결하는 기술은 문헌에 잘 알려져 있으며 화물 분자의 본성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 화물 분자 및 세포 관통 펩티드 사이의 결합은 총 단계적 진행의 고체-상 합성 또는 용액-상 또는 고체상 단편 결합, 안정한 아미드, 티아졸리딘, 옥심 및 히드라진 결합, 디설파이드 결합, 안정한 티오말레이미드 결합, 펩티드 결합(융합 단백질의 아미노산들 사이의 펩티드 결합들 포함), 또는 정전기적 또는 소수성 상호작용을 통해 절단가능한 디설파이드 결합을 통해 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드 및 단백질 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자를 포함하는 세포 관통 펩티드 또는 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드를 암호화 하는 핵산, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자가, 가능하다면 여기 설명된 펩티드 스페이서(들)을 가지고 공유적으로 연결된 세포 관통 펩티드를 포함하는 복합체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
추가 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자가, 가능하다면 여기 설명된 펩티드 스페이서(들)을 가지고 공유적으로 연결된 세포 관통 펩티드를 포함하는 복합체를 암화화하는 핵산에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 복합체의 제조 및 정제
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
수 많은 발현 시스템이 사용될 수 있으며, 여기에는 제한없이 염색체, 에피솜 및 유래된 바이러스를 포함한다. 보다 특별하게는 사용된 재조합 벡터는 박테리아 플라스미드, 트랜스포손, 이스트 에피솜, 삽입 인자(insertion elements), 이스트 염색체 인자, 바큘로바이러스(baculovirus)와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종 바이러스(papilloma viruses), 우두 바이러스(vaccinia viruses), 아데노바이러스, 여우 수두 바이러스(fox pox viruses), 가성광견병바이러스(pseudorabies viruses), 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.
이들 재조합 벡터는 동등하게 코스미드 또는 파아지미드 유도체들일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 시퀀스는 당해 기술분야의 전문가에게 잘 알려진 방법으로 재조합 발현 백터에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 이 방법들은 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001에 설명되어 있다.
재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 발현의 조절을 제어하는 뉴클레오티드 시퀀스뿐만 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오펩티드의 발현 및 전사 및 본 발명의 폴리펩티드의 번역을 허락하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있으며, 이들 시퀀스는 사용된 호스트 세포들에 따라 선택된다.
그러므로, 예를 들어 적당한 분비 신호가 재조합 벡터 내에 통합되어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 소포체(endoplasmic reticulum)의 루멘, 주변 세포질 공간, 막 위 또는 외세포성 환경 쪽으로 향하도록 할수 있다. 적당한 분비 신호의 선택은 이어지는 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 호스트 세포가 제공된다.
호스트 세포 내 재조합 벡터의 도입은 당해 기술분야의 전문가에게 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 이러한 방법들은 BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, AND MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL에 설명되어 있고, 위에 설명한 바와 같이, 예를 들어 칼슘 포스페이트에 의한 형질 주입, DEAE 덱스트란에 의한 형질 주입, 형질 주입, 현미주입법(microinjection), 양이온성 지질에 의한 형질 주입, 전기천공법(electroporation), 형질 도입 또는 감염이 있다.
호스트 세포는 예를 들어 E. coli 와 같은 박테리아 세포, 이스트 세포와 같은 곰팡이 세포, Aspergillus, Streptomyces의 세포, 곤충 세포, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary Cell, CHO), C127 마우스 세포주, 시리아 햄스터 세포(Syrian hamster cells)의 BHK 세포주, 인간 배아 신장 293 (Human Embryonic Kidney, HEK 293) 세포일 수 있다.
호스트 세포는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 표준 방법에 의해 정제한 후, 본 발명의 폴리펩티드는 이후 설명된 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 또는 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자에 공유적으로 연결된 세포 관통 펩티드를 포함하는 복합체를 제조하는 방법을 제공하며, 이는 배양 배지에 상기 언급된 호스트 세포를 배양하고 상기 배양 배지로부터 상기 세포 관통 펩티드 또는 복합체를 분리하거나 또는 호스트 세포 용해 후 호스트 세포 용해물로부터 상기 세포 관통 펩티드 또는 복합체를 분리하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 복합체는 합성적 화학 방법으로 제조될 수 있으며, 예를 들어 고체-상 펩티드 합성이 있다. 이들 펩티드들의 정제는 단백질/펩티드 정제에 대한 기술분야에 알려진 어떠한 기술 수단에 의해서도 수행될 수 있다. 예시적 기술로는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 면역친화 방법을 포함한다.
본 발명의 추가 실시예는 상기 펩티드를 화학적으로 합성 및 정제하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 여기 정의된 것처럼 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자에 공유적으로 연결된 세포 관통 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 복합체를 제조하는 방법을 제공하며, 화학적으로 폴리펩티드를 합성 및 정제하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산 시퀀스는 상기 세포 관통 펩티드의 아미노산 시퀀스, 및 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자의 아미노산 시퀀스를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 세포 관통 펩티드 및 화물 분자를 별도로 합성하는 단계, 및 정제된 펩티드 및 화물 분자를 혼합하거나 또는 상기 펩티드 및 화물 분자를 공유적으로 연결하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 세포들은 치료할 환자들로부터 나온다.
추가 실시예에서 상기 세포들은 항원 제시 세포 또는 신경 줄기 세포와 같은 줄기 세포와 같은 면역계의 세포이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 항원 제시 세포가 제공된다.
특정 실시예에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포, 마이크로파아지 및 B-세포로부터 선택된다. 수지상 세포, 특히 치료될 환자의 수지상 세포(재래식 및 플라스마시토이드)가 바람직하다.
항원 제시 세포, 특히 환자의 수지상 세포를 추출하는 방법들이 당업자에게 알려져 있다. 이 방법들은 골수의 단핵구(monocytes) 또는 조혈모 세포, 제대혈, 또는 말초 혈액을 수확하는 단계를 포함한다. 이 방법들은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem iPS)의 사용을 포함한다. 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 또는 그들의 전구체들은 정화(elutriation) 및 마그네틱 비드 기초 분리를 포함하는 방법에 의해 농축될 것이며, 이는 CD14+ 전구체 세포에 대한 농축과 관련이 있을 수 있다.
본 발명의 복합체를 세포, 특히 상기 언급된 항원 제시 세포 내로 탑재하고 환자에 투여 전에 그러한 세포를 더 제조하는 방법은 당해 기술 분야의 전문가에게 알려져 있다. 수지상 세포의 제조는 GM-CSF 및 IL-4를 포함할 수 있는 시토카인을 사용하여 그들의 배양하거나 또는 분화하는 것을 포함할 수 있다. 수지상 세포주가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 복합체를 세포, 특히 수지상 세포 내로 탑재하는 것은, 배양시 상기 세포와 본 발명의 복합체를 공동 배양하는 것과 관련이 있으며, 본 발명의 세포 관통 펩티드의 본래 성질 (i.e. 이것의 내재화 능력)을 이용하는 것과 관련이 있다. 효율적인 성숙을 유도하기 위해 탑재된 수지상 세포의 추가 배양은 IL-1β, IL-6, TNFα, PGE2을 포함하는 시토카인, 및 폴리-IC, 폴리-ICLC [i.e. 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아이노시닉-폴리시티딜 산(polyinosinic-polycytidylic acid) 및 폴리-L-리신 이중 가닥 RNA의 합성 복합체]를 포함하는 아주반트, 및 다른 TLR(toll-like receptors) 및 NLR(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors) 아고니스트(agonist)를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
추가 양상은 세포 치료에 사용된 영상화 세포, 예를 들어 줄기 세포, 수지상 세포, T 세포 또는 자연 킬러 세포(nature killer cell)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복합체가 탑재되어 있고, 여기서 화물 분자는 영상화제이다.
본 발명의 목적은 세포 제조 방법, 특히 항원 제시 세포 제조 방법에 관한 것으로 상기 언급한 것처럼 본 발명에 따른 복합체가 탑재되어 있으며, 상기 세포에 본 발명의 복합체로 형질도입하고, 배양 배지에서 상기 세포를 배양하고 상기 배양 배지로부터 상기 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 세포는 화물 분자를 포함하는 복합체가 탑재되며, 상기 화물 분자는 (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 (ii) 핵산 들 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 복합체가 탑재된 세포는 MHC class I 및 MHC class II context에 상기 세포 표면에서 상기 에피토프를 출현시킨다.
본 발명에 따른 조성물 및 키트
본 발명은 다음으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) 본 발명의 세포 관통 펩티드,
(ii) 본 발명의 복합체,
(iii) 본 발명의 핵산,
(iv) 본 발명의 벡터,
(v) 본 발명의 호스트 세포, 및
(vi) 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상의 성분을 포함한다.
본 발명의 설명에서, 조성물은 (i) 적어도 2개의 다른 펩티드, (ii) 적어도 2개의 다른 복합체, (iii)적어도 2개의 다른 핵산, (iv) 적어도 2개의 다른 벡터, (v) 적어도 2개의 다른 호스트 세포, 및/또는 (vi) 적어도 2개의 다른 세포를 포함한다.
또 다른 설명에서, 본 발명의 조성물은 본 발명에 따른 적어도 2개의 다른 복합체 및/또는 적어도 2개의 다른 핵산을 포함한다.
특히, 본 발명의 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 복합체, 예를 들어 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체가 하나 이상의 화물 분자를 포함하고 상기 화물 분자는 복합체들 사이에서 차이가 있다.
설명에서, 본 발명의 조성물은 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체가 하나 이상의 에피토프를 포함하고 상기 에피토프가 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체는 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 복합체들 사이에서 차이가 있다.
본 발명은 또한 여기 설명된 것처럼 약제, 특히 백신으로서 사용되는 상기 복합체가 탑재된 복합체 또는 세포를 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 여기 설명된 것처럼 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부(transplant rejection)를 포함하는 질병 또는 질환의 치료를 위한, 상기 복합체가 탑재된 복합체 또는 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 영상화 또는 진단 조성물로서 사용되기 위한 여기 설명된 것과 같은 복합체가 탑재된 복합체 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 여기 설명된 것처럼 본 발명에 따른 복합체 또는 상기 복합체가 탑재된 세포를 포함하는 영상화 조성물 또는 진단 조성물을 제공한다.
본 발명은 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물, 및 대상, 특히 포유류 대상, 가장 바람직하게는 의학적 질환, 및 특히 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같은 면역치료법에 의해 치료될 수 있는 질환에 민감하거나 또는 이것으로부터 고통받는 인간 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 제형은 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 또는 복합체를 포함할 수 있는 약제학적 제형으로 여기 설명된 어떠한 형태로든 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 제형은 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 항원 제시 세포를 포함할 수 있는 약제학적 제형으로 여기 설명된 어떠한 형태로든 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 종래 사용된 아주반트, 면역 조절 물질, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물의 형태 및 그의 단위 복용 형태(unit dosage)로 놓여질 수 있으며, 그러한 형태에서 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐, 또는 액체, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 엘릭시르, 또는 동일한 것으로 충진된 캡슐, 경구용 모든 형태, 또는 주사 또는 지속 주입법(continuous infusion )에 의한 비경구적 멸균 주사가능 용액 형태(피하 및 피내)로 놓여질 수 있다. 주사가능한 조성물은 전형적으로 주사가능한 멸균 식염수 또는 인산 완충 식염수 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 주사가능한 담체를 기초로 한다. 그러한 약제학적 조성물 및 이들의 단위 복용 형태는 종래 비율로 성분들을 포함할 수 있으며 추가적인 활성 화합물 또는 원칙을 함께 넣거나 이들 없이 포함할 수 있으며, 이러한 단위 복용 형태는 사용되는 의도한 매일 복용 범위와 어울리는 활성 성분의 어떠한 적당한 효과적인 함량이라도 포함할 수 있다.
적당한 아주반트 및/또는 면역 조절 물질의 예로는 MPL®(Corixa), 알루미늄 화합물을 포함하는 알루미늄-계 미네랄(일반적으로Alum이라 함), ASO1-4, MF59, 칼슘포스페이트, 리포솜, Iscom, 폴리이노시닉: 폴리시티딜산 (poly-IC)를 포함하고, 이것의 안정화된 형태 폴리-ICLC (Hiltonol), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 지질다당류 (LPS), 몬타나이드(Montanide), 폴리락타이드콜글리코라이드(polylactide co-glycolide, PLG), Flagellin, Soap Bark tree 사포닌(QS21), 아미노 알킬 글루코사미드 화합물(e.g. RC529), 합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 갖는 2개 성분 항박테리아 펩티드(e.g. IC31), 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 면역자극 생산 시퀀스(Immunostimulatory sequences, ISS), 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 섬유아세포-자극 지질펩티드 (FSL1), 및 항-CD40 항체를 포함한다.
본 발명의 조성물은, 이에 한정되지는 않지만, 수성 또는 오일성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 및 엘릭시르를 포함하는 액상 제형일 수 있다. 상기 조성물은 또한 사용 전에 물 또는 다른 적당한 운반체와 함께 재구성되는 건식 제품으로 제형될 수도 있다. 그러한 액상 제제는 이에 한정되지는 않지만 현탄제, 에멀젼화제, 비수성 운반체 및 방부제를 포함할 수 있다. 현탄제는, 이에 한정되지는 않지만, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스, 글루코오스/설탕 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방을 포함할 수 있다. 에멀젼화제는, 이에 한정되지 않지만, 레시틴, 소르비탄 모노올레이트, 및 아카시아를 포함한다. 방부제는, 이에 한정되지는 않지만, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르빈산을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는, 이에 한정되지는 않지만, 폴리(에틸렌 글리콜), 글리세롤, 소 혈청 알부민, Tween®, Span®을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 데포제(depot preparation)로서 제형될 수 있고, 이는 이식 또는 근육 내 주사로 투여될 수도 있다.
본 발명의 고형 조성물은 종래 방법으로 제형된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은, 이에 한정되지는 않지만, 결합제, 필러, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 포함하는 종래 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 한정되지는 않지만, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스 고무, 전분 및 폴리비닐피롤리돈의 점질물을 포함한다. 필러는, 이에 한정되지는 않지만, 락토오스, 설탕, 마이크로결정성 셀룰로오스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 및 소르비톨을 포함한다. 윤활제는, 이에 한정되지는 않지만, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 및 실리카를 포함한다. 붕해제는, 이에 한정되지는 않지만, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트(sodium starch glycollate)를 포함한다. 습윤제는, 이에 한정되지 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
본 발명의 화합물은 지효성 형태(sustained release form)로 또는 지효성 약물 전달 시스템으로부터 투여될 수 있다.
특정 실시예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 피하 사용을 위한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 반복된 투여에 의한 송달을 위해 맞춰진다.
물질들뿐만 아니라 제형 가공 기술 및 이와 유사한 것들은 Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22 nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins에 기술되어 있고, 참조로서 여기에 통합된다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 또는 복합체, 또는 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포들, 특히 항원 제시 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 복합체, 세포, 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포, 특히 항원 제시 세포, 본 발명에 따른 조성물, 이들의 제형 또는 본 발명에 따른 방법은 질병 또는 질환, 특히 암 및 감염성 질병과 같은 면역 치료법에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질병의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 영상화 또는 진단 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 영상화제를 송달하는 방법 및 대상, 특히 포유류 대상, 및 가장 바람직하게는 인간 환자로서 의학 질환, 특히 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 고통받는 것으로 의심되는 대상에서 질병 또는 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
약제학적 조성물에 대한 여기 설명된 투여의 제형 및 모드는 또한 본 발명에 따른 영상화 또는 진단 조성물에 적당할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 또한 다음 중 적어도 하나를 포함하는 키트오브파트(kit of parts)에 관한 것이다:
(a) 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드;
(b) 본 발명에 따른 복합체;
(c) 본 발명에 따른 핵산;
(d) 본 발명에 따른 벡터;
(e) 본 발명에 따른 호스트 세포;
(f) 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
특정 실시예에서, 본 발명의 키트오브파트는 (a) 내지 (f)의 하나 이상의 구성을 포함한다.
본 발명의 설명에서, 상기 키트오브파트는 (a) 적어도 2개의 다른 펩티드, (b) 적어도 2개의 다른 복합체, (c) 적어도 2개의 다른 핵산, (d) 적어도 2개의 다른 벡터, (e) 적어도 2개의 다른 호스트 세포, 및/또는 (f)적어도 2개의 다른 세포를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 키트오브파트는 본 발명에 따른 적어도 2개의 다른 복합체 및/또는 적어도 2개의 다른 핵산을 포함한다.
특히, 본 발명의 키트오브파트는 본 발명에 따른 하나 이상의 복합체, 예를 들어 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체가 하나 이상의 화물 분자를 포함하고, 상기 화물 분자가 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
일 설명에서, 본 발명의 키트오브파트는 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체가 하나 이상의 에피토프를 포함하고 상기 에피토프가 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 키트오프파트는 적어도 2개 이상의 복합체를 포함하며, 여기서 각 복합체가 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하고 상기 핵산들이 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
키트오브파트의 여러 가지 성분들은 하나 이상의 컨테이너에 포장될 수 있다. 상기 성분들은 동결건조 또는 건식 형태로 제공되거나 또는 적당한 완충액에 용해되어 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 추가적인 시약, 예를 들어 방부제, 증식 배지, 및/또는 상기 성분들의 저장 및/또는 재구성 완충액, 세척용액 및 이와 같은 것들을 포함하는 추가적인 시약을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 키트오브파트는 사용 지시서를 또한 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 암 또는 감염성 질환의 치료, 예방 또는 안정화를 위한 백신 접종 키트이고, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물의 사용 지시서를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 조성물 및/또는 키트오브파트는 영상화 기술에 사용된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물 및/또는 키트오브파트는 본 출원에 따라 언급된 것처럼 질병 또는 질환의 진단에 사용된다.
본 발명에 따른 용도 및 방법
본 발명의 일 태양은 인비트로(in vitro)로 화물 분자를 세포 내로 송달하는 방법을 제공하며, 이는 상기 세포를 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 상기 화물 분자에 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 태양에서, 인비트로로 화물 분자를 세포 내로 전달하기 위한 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 송달될 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 화물 분자 사이에 복합체를 형성하는 단계, 및
b) 상기 세포를 단계(a)에서 형성된 복합체와 접촉시키는 단계.
본 발명의 또 다른 양상은 MHC class I 및/또는 MHC class II context 에서 세포 표면에서 화물 분자로부터 에피토프를 송달 및 출현시키는 인비트로 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 세포 관통 펩티드 및 상기 화물 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 질병 또는 질환, 예를 들어 암, 감염성 질병, 자가 면역 질환 및 이식 거부를 포함하여 면역 치료법에 의해 치료될 수 있는 것들의 예방, 치료 또는 안정화를 위한 약제의 제조를 위해 사용되는 다음 중 어느 하나의 용도를 제공한다: (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 항원 제시 세포.
본 발명이 유리한 실시예에서, 세포 관통 펩티드 및 에피토프를 포함하는 본 발명에 따른 복합체가 제공되며, 이로 인하여 MHC class I 및/또는 MHC class II context 내에 항원 제시 세포의 세포 표면에서 상기 에피토프의 이송 및 출현이 가능해져 백신접종 및/또는 면역 치료법에 사용된다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명은 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는, 면역 치료법에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 질환의 예방, 치료 또는 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음 중 하나를 대상에 투여하는 단계를 포함한다: (i) 본 발명의 복합체, (ii)본 발명의 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약제학적 제형.
또 다른 실시예에 따라, 대상에서 하나 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유도 또는 개선하는 방법을 제공하고, 상기 면역 반응은 CD4+ 헬퍼 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 종속되고, 여기서 상기 방법은 다음을 대상에 투여하는 단계를 포함한다: (i) 하나 또는 다중 에피토프(들)을 포함하는 화물 분자를 포함하는 본 발명의 복합체, (ii) 상기 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약제학적 제형.
CD4+ 및/또는 CD8+ 반응에 종속되는 면역 반응은 염증성 반응, 염증전 시토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있으며, 이는 본 발명의 화합물 투여 전 준위에 대하여 하나 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현이 증가되는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물 투여 후에 항원-특이적 T 세포의 빈도 또는 절대 수의 증가에 의해 측정될 수 있으며, 이는 HLA-펩티드 멀티머 염색(staining), ELISPOT 분석, 및 지연성 과민반응 시험(delayed type hypersensitivity tests)에 의해 측정될 수 있다. 이것은 또한 항원-특이적 T 헬프 세포에 종속된 항원-특이적 혈청 항체의 증가에 의해 간접적으로 측정될 수 있다.
또 다른 실시예에 따라, 대상에 하나 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유도 또는 개선하는 방법을 제공하고, 면역 반응은 다중 MHC class I 분자 및/또는 다중 MHC class II 분자에 의해 제한되며, 상기 방법은 다음 중 하나를 대상에 투여하는 단계를 포함한다: (i) 하나 또는 다중 에피토프(들)을 포함하는 화물 분자를 포함하는 본 발명의 복합체, (ii) 상기 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약제학적 제형.
다중 MHC class I 분자 및/또는 다중 MHC class II 분자에 의해 제어된 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 대상에서 유도 또는 개선하는 방법은 시토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있으며, 이는 항원 제시 세포 위에서 별개의 MHC class I 및 class II 분자에 결합하는 개별 펩티드로 T 세포의 인비트로 자극 후, 본 발명의 화합물 투여 전 준위에 대하여 하나 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현 증가를 포함한다. 다른 MHC 분자에 대한 제한은 또한 다른 MHC 분자를 발현하는 항원 제시 세포를 사용 또는 MHC 블록킹 항체를 사용하여 인증될 수 있다. 본 발명의 화합물의 투여 후 항원-특이적 T 세포의 빈도 또는 절대 수의 증가로 측정될 수 있으며, 이는 HLA-펩티드 멀티머 염색에 의해 측정되며, 이는 별개의 MHC 분자들로 조립된 멀티머를 사용한다.
본 발명에 따른 하나 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유도 또는 개선하는 방법의 바람직한 태양에서, 상기 면역 반응은 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원, 예를 들어 신경교종 에피토프에 대한 것이며, 이들은 예를 들어 Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54(3):187-207) and Vigneron et al. (2013, 암 Immun .13:15) 에 설명되어 있다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 면역 반응은 병원체의 항원 단백질의 다중 에피토프에 대한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 특정 태양에서, 상기 방법은 MHC class I 분자 및/또는 MHC class II 분자에 의해 제한된 하나 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 대상에서 유도 또는 개선하는 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 영상화 기술용 영상화 조성물의 제조 또는 질병 또는 질환의 진단을 위한 진단 조성물의 제조용인 다음 중 하나의 사용을 제공한다: (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포. 본 발명으로 진단될 수 있는 질병 또는 질환은 면역 치료법에 의해 치료될 수 있는 것들, 예를 들어 암, 감염성 질병, 자가 면역 질환 및 이식 거부를 포함한다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명은 영상화 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 인비트로, 엑소비보 또는 인비보에서 다음 중 하나를 사용하는 단계를 포함한다: (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약제학적 제형.
또 다른 양상에 따라, 본 발명은 대상에서 질병 또는 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음 중 하나를 대상 또는 대상의 샘플에 엑소비보로 투여하는 단계를 포함한다: (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 항원 제시 세포와 같은 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약제학적 제형.
특정 실시예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 본 발명에 따른 복합체의 투여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 용도 및 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 복합체, 세포 또는 약제학적 제형의 투여를 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법의 설명에서, 적어도 2개의 복합체가 사용 또는 투여되며, 여기서 각 복합체는 하나 이상의 화물 분자를 포함하고 상기 화물 분자는 복합체들 사이에서 차이가 있다.
본 발명의 용도 및 방법의 또 다른 설명에서, 적어도 2개의 복합체가 사용 또는 투여되고, 여기서 각 복합체는 하나 이상의 에피토프를 포함하고, 상기 에피토프는 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
본 발명의 용도 및 방법의 추가 설명에서, 적어도 2개의 복합체들이 사용 또는 투여되며, 여기서 각 복합체는 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 상기 복합체들 사이에서 차이가 있다.
본 발명의 용도 및 방법에 대한 암의 예는, 뇌암, 전립선암, 유방암, 난소암, 식도암, 폐암, 간암, 신장암, 흑색종, 내장 암종(gut carcinoma), 폐암종(lung carcinoma), 머리 및 목 편형 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myleloid leukemia), 결직장암(colorectal carcinoma), 위 암종, 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 골수성 백혈병(myeloid leukemia), 폐 편평 세포암종(lung squamous cell carcinoma), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 방광 종양, 전골수성 백혈병(promyelocytic leukemia), 비소세포성 폐암(non-small cell lung carcinoma), 육종(sarcoma)을 포함한다.
상기 암은 고형 종양, 혈액암 또는 림프액 암일 수 있다. 상기 암은 양성 또는 전이성일 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법에 대한 감염성 질병의 예는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원충 및 다중 세포성 기생충에 의해 야기된 질병들을 포함한다. 이들은 예를 들어, 아메바증, 탄저병, 부룰리 궤양 (미코박테리움 울서란스), 칼리시바이러스 관련 설사, 캄필로박터 설사, 자궁경부 암 (사람유두종바이러스), 트라코마 클라미디아 관련 생식기 질병, 콜레라, 크림-콩고출혈열, 뎅기열, 디프테리아, 에볼라출혈열, 독소원성대장균(ETEC) 설사, 위 암 (헬리코박터 파일로리), 임질, A군 연쇄상구균 관련 질병, B군 연쇄상구균관련 질병, 헤모필루스 인플루엔자균 B 페렴 및 침습성 질병(invasive disease), 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E 설사, 단순포진 타입 2 생식기 궤양, HIV/AIDS, 십이지장충 질병, 인플루엔자, 일본뇌염, 라사열, 리슈마니어증, 렙토스피라증, 간암 (간염 B), 간암 (간염 C), 라임병, 말라리아, 마버그 출혈열, 홍역, 볼거리, 비인두 암 (Epstein-Barr virus), 수막염균 뇌수막염, 파라인플루엔자 관련 페렴, 백일해, 흑사병, 소아마비, 광견병, 호흡기세포융합바이러스 (RSV) 페렴, 리프트밸리열, 로타바이러스 설사, 풍진, 주혈흡충병, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 세균성 이질, 천연두, 포도상구균 관련 질병, 위암 (헬리코박터 파일로리), 연쇄상구균 페렴 및 침윤성 질병, 파상풍, 진드기 매개 뇌염, 트라코마, 결핵, 야생토끼병, 장티푸스, 웨스트-나일 바이러스 관련 질병, 황열을 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법의 또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 보다 바람직하게는 치료될 대상의 수지상 세포이다.
전형적으로, 암 치료를 위해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 치료학적으로 효과적인 복용량은 약 0.1 mg 내지 2mg/주사 또는 약 μmol 내지 1mmol/주사이다.
전형적으로 암 치료를 위해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 탑재된 항원 제시 세포의 치료학적으로 효과적인 복용량은 0.2 내지 2백만 세포/주사이다.
개인에게 단일 또는 다중 복용으로 투여되는 복용량은, 약동학적 성질, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증후의 정도, 병행 치료, 치료의 빈도 및 원하는 효과를 포함하여 여러가지 인자에 따라 변할 것이다.
투여의 방식
본 발명에 따른 화합물, 조성물, 특히 백신 조성물 및 이들의 제형은 경구적으로, 비경구적으로, 정맥으로, 직장으로, 또는 이들의 조합을 포함하여, 어떠한 방법으로도 투여될 수 있다. 비경구적 투여는, 이에 한정되지는 않지만, 정맥, 동맥, 복강내, 피하, 피내 및 근육 내의 투여를 포함한다. 본 발명의 조성은, 국부, 종양내, 비강내, 또는 노드내(intranodal) 루트를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 임플란트 형태로 투여될 수도 있으며, 이는 조성물의 느린 방출뿐만 아니라 느리게 제어된 정맥점적(i.v. infusion)을 가능하게 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물, 조성물, 특히 백신 조성물 및 이들의 제형은 피하로 투여된다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 복합체, 항원 제시 세포 및 조성물의 투여는 다중 연속적인 주사를 필요로 한다. 그러므로, 투여는 적어도 2번 반복될 수 있으며, 1차 면역 주사로서 한번, 이후 촉진 주사로서 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 백신 조성물은 반복적으로 또는 연속적으로 투여될 수도 있다. 백신 조성물은 반복적으로 또는 연속적으로 적어도 1, 2, 3 또는 4주의 기간 동안; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 또는 12개월; 또는 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 복합체를 구성하는 화물 분자 및 세포 관통 펩티드는 별도의 조성물에 포함되고 이들은 투여 바로 전에 혼합되거나 또는 필요한 대상에게 동시에 투여된다.
조합
추가 실시예에 따라, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 약제학적 조성물의 투여는 단독 또는 치료 또는 완화시키고자 하는 질병 또는 질환을 치료 및/또는 안정화시키는데 유용한 협력제(co-agent)와 조합하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 암의 치료, 예방 또는 안정화의 경우에, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 약제학적 조성물의 투여는 고형 종양에 대한 종래의 화학치료 및 전이 제어를 위해 사용된 물질 또는 프로그램된 세포 죽음에 의해 작용하는 다른 분자, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, Fas Ligand 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis factor, TNF)-관련 아포토시스 유도 (TRAIL) 리간드를 포함하는 종양 괴사류 구성원들(Tumor Necrosis Family Members)로부터 선택된 협력제와 조합하여 수행될 수 있다. 추가 실시예에 따라, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 약제학적 조성물의 투여는 방사선 치료와 병행하여 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 복합체, 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 또는 본 발명에 따른 이들의 약제학적 조성물을 포함하며, 여기서 치료적으로 효과적인 함량으로, 암의 치료 및/또는 안정화 및/또는 암 재발 방지에 유용한 다른 치료적 식이요법 또는 협력제 (예를 들어 다중 약물 식이요법)와 동시에 또는 연속해서 대상에 투여된다. 상기 협력제와 동시에 투여되는 상기 복합체, 세포 또는 약제학적 조성물은 동일 또는 다른 조성물로 투여될 수 있으며 동일 또는 다른 투여 루트에 의해 투여될 수 있다.
상기 다른 치료적 식이요법 또는 협력제는 방사선 치료법, 화학치료법, 수술, 표적치료법(소분자, 펩티드 및 모노클론 항체를 포함함) 및 항혈관신생 치료법(anti-angiogenic therapy)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 항혈관신생 치료법은 여기서 종양-관련 맥관구조(vasculature)를 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는 시약의 투여로 정의된다.
일 실시예에 따라, 암 치료 및/또는 안정화 및/또는 암 재발 방지에 유용한 적어도 하나의 협력제와 결합된, 본 발명의 복합체 또는 본 발명의 세포, 특히 본 발명의 항원 제시 세포, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형이 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 본 발명에 따른 화합물 및 이들의 약제학적 제형이, 재발 및/또는 전이의 예방으로서 고형 종양을 제거한 수술 후에 투여될 수 있다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 영상화 또는 진단 조성물의 투여는 단독 또는 의심된 질병 또는 질환을 영상화 및/또는 진단하는데 유용한 협력제와 함께 수행될 수 있다.
환자
화물 분자의 치료적 효과에 따라, 본 발명은 상기 화물 분자의 작용에 의해 예방, 치료 또는 축소될 수 있는 질병 또는 질환 중 어떠한 것에 민감 또는 고통받는 환자 누구한테라도 적용될 수 있다. 화물 분자가 에피토프를 포함할 때, 상기 화물 분자의 치료적 효과는 상기 에피토프에 대한 직접적인 면역 반응, 특히 CD4+ 헬퍼 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 종속적이고 및/또는 MHC class I 분자 및/또는 MHC class II 분자에 의해 제한된 반응을 이끌어 낼 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은 암, 예를 들어 뇌암, 대장암, 두부암(head cancer), 경부암(neck cancer), 또는 자궁경부암에 민감하거나 이 암들로 고통받는 환자들이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은 신경교종을 포함하는 뇌암으로 고통받는 환자들이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은 종양을 수술적으로 제거한 대상자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은 감염성 질환에 민감 또는 고통받는 환자들이다.
여기 인용된 문헌들은 전체로서 본 명세서에 참조로서 통합된다. 본 발명은 여기 설명된 특정 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 개별적 양상들의 단일 설명으로서 의도된 것이고 기능적으로 등가 방법 및 성분들은 본 발명의 범위 내에 있다. 실로, 여기 도시되고 설명된 것들 외에 다양한 본 발명의 변형들이 여기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 기술분야의 전문가들에게 명백할 것이다. 그러한 변형들은 첨부된 청구범위에 속하도록 의도된 것이다.
여기 설명된 본 발명 및 다음 실시예들은 설명을 위해 제시된 것이며 제한을 의미하지 않는다.
실시예
다음 실시예는 펩티드 및 단백질을 세포 내로 송달 및 인비보에서의 면역 반응의 유도를 위한 세포 관통 펩티드로서 ZEBRA의 일부 단편의 효과를 뒷받침하기 위해 수행되었다.
다음 약어는 각각 하기 정의로 한다:
aa (아미노산), h (시간), ㎕(마이크로리터), μM(마이크로몰), mM (밀리몰), mg (밀리그램), min (분), CFSE (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르), DC (수지상 세포).
실시예 1: 본 발명의 CPP1 또는 CPP2 및 난백알부민 펩티드 화물를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조
구성물 1 및 2에 대응하는 2개의 CPP 및 2개의 융합 폴리펩티드가 각각 포함되며, 2개의 CPP 중 하나는 ZEBRA로부터 유래된 것이고 면역우성(immunodominant) CD8+ T 세포 에피토프는 난백알부민으로부터 유래된 것이 화학적으로 합성되었다.
이들 CPP 및 융합 폴리펩티드의 아미노산 시퀀스는 다음과 같다:
CPP1: (총 17 아미노산)
SEQ ID NO: 1: KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2: (총 30 아미노산)
SEQ ID NO: 2: KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
난백알부민 CD8 에피토프 (총 8 아미노산)
SEQ ID NO: 3: SIINFEKL
복합체 1: 구성물 1: 난백알부민 CD8 에피토프에 융합된 CPP1 포함(총 33 아미노산)
SEQ ID NO: 4: KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
복합체 2: 구성물 2: 난백알부민 CD8 에피토프에 융합된 CPP2를 포함(총46 아미노산)
SEQ ID NO: 5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
실시예 2: 본 발명에 다른 CPP1-OVA 또는 CPP2-OVA 융합 폴리펩티드의 수지상 세포로의 탑재 후 송달 및 MHC CLASS 1 제한된 출현
난백알부민 에피토프의 가공 및 출현과 함께, 항원 제시 세포에 의해 포획되는 CPP1 및 CPP2의 용량은 인비트로에서 1차적으로 시험되었다. 구성물 1 및 2 각각은 골수 유래 수지상 세포의 배양액에 첨가되고, 이어서 지질 다당류(LPS)와 함께 밤새 숙성되었다. MHC class I 분자 위에서 난백알부민 에피토프의 가공 및 출현이 기능 분석법으로 검출되었으며, 이는 OT1 유전자 이식 마우스의 지라(spleen)으로부터 유래된 난백알부민-특이적 CD8+T 세포와 수지상 세포를 공동배양하여 이루어진다. OD8+T 세포는 사전에 형광 염료 CFSE로 표지되고, 이는 세포 분열로 희석되기 때문에 항원-특이적 증식의 지표로서 기능한다. CD8+ OT1 T 세포 및 구성물 1 및 2 각각이 탑재된 세포의 공동 배양 5일 후, 유동세포 계수법에 의해 증식을 평가하였다(도 1a, 도1b).
구성물 1 및 2에 대응하는 폴리펩티드는 OT1 T 세포 (93-96%의T 세포가 증식됨, CFSE 희석을 기초로 함)의 상당한 증식을 유도할 수 있었다. 게다가, 배양액에서 세포의 생존력은 또한 유사하였다(69-75%). 최소 T 세포 에피토프 (SIINFEKL)에 대응하는 합성 펩티드가 추가된 양성 대조군에 비하여 증식은 유사하고 생존력은 우수하였다(도 1a의 C, 1a의 D). 단독 배양 또는 항원 없는 수지상 세포와 공동 배양 후 적은 수의 OT1 T 세포가 검출되었기 때문에 증식은 또한 난백알부민-특이적이다(도 1a의 A, 도 1a의 B).
실시예 3: 본 발명의 CPP1-OVA 또는 CPP2-OVA 융합 폴리펩티드로 마우스 백신접종
보다 엄격한 조건에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 자극하는 구성물 1 및 2에 대응하는 폴리펩티드의 용량을 시험하기 위하여, 이들을 백신접종 프로토콜에서 인비보로 시험하였다(도 2). 인비보 반응을 유도하기 위하여, 폴리펩티드 백신은 주사된 동물의 자연적으로 존재하는 항원 제시 세포에 의해 포획되어야만 하며, 폴리클론 T 세포의 자극은 난백알부민-특이적 T 세포가 엑소비보로 검출된다면 매우 효과적일 것이다. 이들 실험의 판독은 난백알부민-특이적 CD8+ T 세포를 검출하는 MHC-펩티드 멀티머를 사용하는, 지라세포(splenocyte)의 유동세포 계수법이다.
단지 2번 백신접종 후, 난백알부민-특이적 CD8+ T 세포의 증가된 비율이 2개 백신접종 그룹[0.37~1.14%의 CD8+T 세포는, PBS(음성 대조군)으로 백신 접종된 0.18%의 마우스에 비하여 양성적 멀티머였다]에 대해 검출되었다. 구성물 2에 대응하는 펩티드는 난백알부민-특이적 CD8+ T 세포를 1% 이상 유도하기 때문에 인비보에서 특히 효능적이다.
결론: 이들 이들 데이터는 세포 관통 펩티드로서 CPP 1 및 2의 기능성을 확인한다. 이들은 또한 구성물 1 및 2에 대응하는 폴리펩티드가 이들 2개의 CPP 각각, 난백알부민 T 세포 에피토프를 포함하며, 수지상 세포에 의해 포획될 수 있고, 화물 분자(즉, 구성물에 포함된 T 세포 에피토프)가 인비트로 및 인비보 백신접종 상황에서 CD8+ T 세포에 대해 교차-출현된다는 것을 확인한다.
실시예 4: 본 발명의 다른 CPP-OVA 융합 폴리펩티드를 가지고 인비트로 형질도입 실험
세포 내로 형질도입은 CPP1, CPP2, CPP8, 또는 CPP10을 포함하는 다른 CPP-OVA 융합 폴리펩티드를 사용하여 모니터링되었다. 난백알부민의 면역우성 CD8+ T 세포 에피토프로 융합된 이들 CPP 각각은 화학적으로 합성되고 플루오레센으로 표지되었다. 5.105 세포가 37℃에서 2h 동안 0.9μM의 다른 융합 폴리펩티드로 배양되었다. 시험된 세포들은 인간 림프구 세포 K562, 쥐과 림프구 세포 EL4, 인간 성상세포종 세포(astrocytoma) U251 및 쥐과 성상세포종 세포 GL26이었다. 상기 세포들은 산완충액에서 세척되어 모든 막 결합 펩티드를 제거하고 생존력을 위하여 라이브-데드 엘로우(Live-Dead Yellow)로 염색하였다. 유동세포 계수법으로 분석하였다. 형광의 지수는 세포의 자연 자가-형광 이상의 형광 준위를 나타낸다. 이것은 유동세포 계수법으로 측정된 세포 단독 및 CPP-OVA 융합 폴리펩티드가 탑재된 세포 사이의 평균 형광 지수이다.
결과는 표 2에 나타내었다.
K562 EL4 U251 GL261
CPP1
(SEQ ID NO: 1)		 3 4.8 4.5 2.4
CPP2
(SEQ ID NO: 2)		 15 57.7 25.1 20.8
CPP8
(SEQ ID NO: 8)		 1.9 2.5 2 1.4
CPP10
(SEQ ID NO: 9)		 3.7 4 4 1.9
대체로, CPP-OVA 융합 폴리펩티드의 독성 효과가 관찰되지 않았다. 게다가 이들 결과들은 모든 시험된 CPP가 인간 또는 쥐과의 세포를 유사 효율로 관통할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 본 발명의 다른 CPP-OVA 융합 폴리펩티드로 마우스 인비보 백신접종
실시예 3에 설명된 것처럼 실험을 수행하였다.
그룹당 4 내지 8 마우스를 14일 간격을 두고 10nmol의 융합 폴리펩티드로 2번 피하로 백신접종하였으며, 상기 융합 폴리펩티드는 CD8+ 에피토프의 N-말단 및 C-말단 각각에서 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12의 스페이서에 의해 플랭킹된 난백알부민 CD8+ 에피토프 (SEQ ID NO: 3)에 융합된 표 2에 표시된 CPP들 중 하나를 포함한다. 각 CPP-OVA 융합 폴리펩티드가 PBS에서 100㎍ anti-CD40으로 주사되었다. 50㎍ 폴리-IC가 제2차 백신접종 후 7일에 근육내로 주사되었다. 면역 반응은 오량체(Pentamer staining) 염색과 이어지는 유동세포 계수법 분석으로 혈액 내에서 모니터링되었다.
결과를 표 3에 나타내었으며 SEQ ID NO: 22의 CPP14를 포함하는 비교군의 CPP-OVA 융합 폴리펩티드에 비하여 4배 증가를 나타내었다. 표2로부터 알 수 있는 것처럼, 시험된 모든 CPP-OVA 융합 폴리펩티드는 CPP14를 포함하는 비교군 융합 폴리펩티드에 비하여 보다 높은 면역 잠재성을 가지나, 다만 음성 대조군을 구성하고 CPP14를 포함하는 비교군 융합 폴리펩티드에 비하여 보다 낮은 면역 잠재성을 갖는 SEQ ID NO: 22의 CPP7을 포함하는 또 다른 비교군 융합 폴리펩티드는 제외한다.
CPP-OVA 융합 폴리펩티드, 여기서 CPP는 다음과 같다 CPP14에 비하여 증가된 증식의 배수
CPP7 (SEQ ID NO: 21) 0.65
CPP1 (SEQ ID NO: 1) 1.74
CPP2 (SEQ ID NO: 2) 1.41
CPP8 (SEQ ID NO: 8) 1.28
CPP10 (SEQ ID NO: 9) 2.17
CPP7는 Zebra의 위치 178 내지 185로 연장하는 8-아미노산-길이 단편의 Zebra이다.
CPP14는 Zebra의 위치 178 내지 219로 연장하는 42-아미노산-길이 단편의 Zebra이다.
결론: 실시예 4 및 5의 결과들을 함께 고려하면 본 발명의 다른 CPP들은 인간 또는 쥐과 유래의 세포를 관통할 수 있고 그러한 CPP에 의해 수송된 화물 분자는 CD8+ T 세포에 가교 출현되고, 즉 이송된 화물 분자에 특이적인 면역 반응을 유도하고, 따라서 백신접종 및 면역치료법에서 유용성을 발견한다.
시퀀스 목록
CPP1: (총 17 아미노산)
SEQ ID NO: 1: KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2: (총 30 아미노산)
SEQ ID NO: 2: KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
난백알부민 CD8 에피토프 (총 8 아미노산)
SEQ ID NO: 3: SIINFEKL
CPPs-OVA 융합 폴리펩티드:
구성물 1: 난백알부민 CD8 에피토프에 융합된 CPP1을 포함(총 33 아미노산)
SEQ ID NO: 4: KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
구성물 2: 난백알부민 CD8 에피토프에 융합된 CPP2을 포함(총 46 아미노산)
SEQ ID NO: 5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
인공 시퀀스
SEQ ID NO: 6: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
X1 는 K, R, 또는 H이다.
X2 는 R, K, 또는 H이다.
X3 는 Y, W, 또는 F이다.
X4 는 K, R, 또는 H 이다.
X5 는 N 또는 Q이다.
X6 는 R, K, 또는 H이다.
X7 는 V, I, M, L, F, 또는 A이다.
X8 는 A, V, L, I, 또는 G이다.
X9 는 S 또는 T 이다.
X10 는 R, K, 또는 H 이다.
X11 는 K, R, 또는 H이다.
X13 는 R, K, 또는 H이다.
X14 는 A, V, L, I, 또는 G이다.
X15 는 K, R, 또는 H 이다.
X16 는 F, L, V, I, Y, W, 또는 M이다.
X17 는 K, R, 또는 H이다.
인공 시퀀스
SEQ ID NO: 7: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
X1 는 K 또는 R이다.
X2 는 R 또는 K이다.
X3 는 Y, W, 또는 F이다.
X4 는 K 또는 R 이다.
X5 는 N 또는 Q 이다.
X6 는 R 또는 K 이다.
X7 는 V, I, M 또는 L 이다.
X8 는 A 또는 G 이다.
X9 는 S 또는 T 이다.
X10 는 R 또는 K 이다.
X11 는 K 또는 R 이다.
X13 는 R 또는 K 이다.
X14 는 A 또는 G 이다.
X15 는 K 또는 R 이다.
X16 는 F, Y, 또는 W 이다.
X17 는 K 또는 R 이다.
CPP8: (총 15 아미노산)
SEQ ID NO: 8: QHYREVAAAKSSEND
CPP10: (총19 아미노산)
SEQ ID NO: 9: REVAAAKSSENDRLRLLLK
CPP11: (총25 아미노산)
SEQ ID NO: 10: QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
스페이서 (인공 시퀀스)
SEQ ID NO: 11: EQLE
SEQ ID NO: 12: TEWT
인공 시퀀스 (총21 아미노산)
SEQ ID NO: 13: LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQ
인공 시퀀스 (총 21 아미노산)
SEQ ID NO: 14: SELEIKRYKNRVASRKCRAKF
엔테로키나아제 표적 사이트
SEQ ID NO: 15: DDDK
인자 Xa 표적 사이트
SEQ ID NO: 16: IEDGR
트롬빈 표적 사이트
SEQ ID NO: 17: LVPRGS
프로테아제 TEV 표적 사이트
SEQ ID NO: 18: ENLYFQG
PreScission 프로테아제 표적 사이트
SEQ ID NO: 19: LEVLFQGP
푸린 표적 사이트
SEQ ID NO: 20: RX2X3R
X2 는 아미노산이다.
X3 는 R 또는 K이다.
CPP7 (총 8 아미노산)
SEQ ID NO: 21: KRYKNRVA
CPP14 (총42 아미노산)
SEQ ID NO: 22:
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
ZEBRA 아미노산 시퀀스 (엡스타인바 바이러스(EBV)의 자연 시퀀스)
(YP_401673)
SEQ ID NO: 23:
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
<110> UNIVERSITE DE GENEVE LES HOPITAUX UNIVERSITAIRES DE GENEVE <120> CELL PENETRATING PEPTIDES <130> IP995CH <140> 10-2015-7007460 <141> 2015-03-24 <150> EP 12184311.4 <151> 2012-09-13 <150> US 61/700,432 <151> 2012-09-13 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP1 <400> 1 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP2 <400> 2 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ovalbumine CD8 epitope <400> 3 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP1-OVA fusion polypeptide <400> 4 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Glu Glu Lys Leu Thr Glu Trp 20 25 30 Thr <210> 5 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP2-OVA fusion polypeptide <400> 5 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Glu Gln 20 25 30 Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr 35 40 45 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is K, R, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is R, K, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Y, W, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa is K, R, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is N or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is R, K or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is V, I, M, L, F, or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is A, V, L, I, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is R, K, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is K, R, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) <223> Xaa is R, K, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is A, V, L, I or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> Xaa is K, R, or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is F, L, V, I, Y, W, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is K, R, or H <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Y, W, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is N or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is V, I, M or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> Xaa is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is F, Y, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is K or R <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP8 <400> 8 Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp 1 5 10 15 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP10 <400> 9 Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Leu Lys <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP11 <400> 10 Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu 1 5 10 15 Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys 20 25 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <400> 11 Glu Gln Leu Glu 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <400> 12 Thr Glu Trp Thr 1 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of Zebra <400> 13 Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg 1 5 10 15 Ala Lys Phe Lys Gln 20 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of Zebra <400> 14 Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys 1 5 10 15 Cys Arg Ala Lys Phe 20 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterokinase target site <400> 15 Asp Asp Asp Lys 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa target site <400> 16 Ile Glu Asp Gly Arg 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin target site <400> 17 Leu Val Pro Ala Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease TEV target site <400> 18 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreScission protease target site <400> 19 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin target site <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa si any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is R or K <400> 20 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP6 <400> 21 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala 1 5 <210> 22 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP14 <400> 22 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser 20 25 30 Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys 35 40 <210> 23 <211> 245 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Organism: Epstein-Barr virus <400> 23 Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val 20 25 30 Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu 35 40 45 Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr 50 55 60 His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro 65 70 75 80 Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro 85 90 95 Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu 100 105 110 Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val 115 120 125 Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile 130 135 140 Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg 145 150 155 160 Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu 165 170 175 Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys 180 185 190 Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser 210 215 220 Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu 225 230 235 240 Asp Leu Leu Asn Phe 245

Claims (26)

  1. SEQ ID NO: 23의 잔기 170 내지 잔기 220으로 연장하는 도메인의 15-30 아미노산 단편으로 이루어지는 세포 관통 펩티드로서,
    여기서 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 23 위치 189의 등가에 Ser(S)를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 관통 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 것과 같은 아미노산 시퀀스를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 관통 펩티드.
  3. 다음을 포함하는 복합체:
    (1) SEQ ID NO: 23의 잔기 170 내지 잔기 220으로 연장하는 도메인의 15-30 아미노산 단편으로 이루어지는 세포 관통 펩티드로서,
    여기서 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 23 위치 189의 등가에 Ser(S)를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 관통 펩티드; 및
    (2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 화물 분자: (i) 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질, (ii) 다당류, (iii)지질, (iv)리포단백질, (v) 글리코리피드, (vi)핵산, 여기서 (i)에 따른 화물 분자는 병원체 에피토프 및 종양 에피토프로부터 선택된 적어도 어느 하나를 포함한다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포 관통 펩티드는 MHC class I 및 MHC class II context 중 적어도 어느 하나의 세포 표면에서 상기 화물 분자의 에피토프 출현을 용이하게 하는 복합체.
  5. 다음을 암호화하는 핵산:
    (1) SEQ ID NO: 23의 잔기 170 내지 잔기 220으로 연장하는 도메인의 15-30 아미노산 단편으로 이루어지는 세포 관통 펩티드로서,
    여기서 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 23 위치 189의 등가에 Ser(S)를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 관통 펩티드; 및
    (2) 병원체 에피토프 및 종양 에피토프로부터 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자에 공유적으로 연결된 상기 세포 관통 펩티드를 포함하는 아미노산 복합체.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 따른 벡터를 포함하는 호스트 세포.
  8. 제1항에 따른 세포 관통 펩티드를 제조하는 방법으로서,
    상기 세포 관통 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 호스트 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및
    상기 배양 배지로부터 또는 호스트 용해 후 호스트 용해물로부터 상기 펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 제조방법.
  9. 제3항에 따른 복합체가 탑재된 분리된 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 항원 제시 세포인 세포.
  11. 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 23의 잔기 170 내지 잔기 220으로 연장하는 도메인의 15-30 아미노산 단편으로 이루어지는 세포 관통 펩티드로서,
    여기서 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 23 위치 189의 등가에 Ser(S)를 갖는 세포 관통 펩티드;
    (b) 다음을 포함하는 복합체:
    (1) SEQ ID NO: 23의 잔기 170 내지 잔기 220으로 연장하는 도메인의 15-30 아미노산 단편으로 이루어지는 세포 관통 펩티드로서,
    여기서 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 23 위치 189의 등가에 Ser(S)를 갖는 세포 관통 펩티드; 및
    (2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 화물 분자: (i) 펩티드, 폴리 펩티드, 또는 단백질, (ii) 다당류, (iii)지질, (iv)리포단백질, (v) 글리코리피드, (vi)핵산, 여기서 (i)에 따른 화물 분자는 병원체 에 피토프 및 종양 에피토프로부터 선택된 적어도 어느 하나를 포함하 며;
    (c) (a)의 세포 관통 펩티드를 암호화하거나, 또는 (b)의 복합체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서 (b) (2)의 화물 분자는 (b) (1)의 상기 세포 관통 펩티드에 공유적으로 연결된 병원체 에피토프 및 종양 에피토프로부터 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자인, 핵산;
    (d) (c)의 핵산을 포함하는 벡터;
    (e) (d)의 벡터를 포함하는 분리된 호스트 세포;
    (f) (b)의 복합체가 탑재된 분리된 세포.
  12. 다음을 포함하는 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물:
    (a) 제1항에 따른 적어도 하나의 세포 관통 펩티드, 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
  13. 다음을 포함하는 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물:
    (a) 제3항에 따른 적어도 하나의 복합체, 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조성물이 적어도 2개의 다른 복합체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제3항에 있어서, 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 복합체.
  16. 제9항에 있어서, 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 세포.
  17. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화물 분자를 세포 내로 인비트로로 송달하는 방법:
    a) 제1항에 따른 세포 관통 펩티드와 세포로 송달될 화물 분자 사이에 복합체를 형성하는 단계, 및
    b) 상기 세포를 단계 a)에서 형성된 복합체와 접촉시키는 단계.
  18. 제8항에 있어서,
    상기 분리된 세포 관통 펩티드가 병원체 에피토프 및 종양 에피토프로부터 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 화물 분자에 공유적으로 연결된, 방법.
  19. 다음을 포함하는 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물:
    (a) 제7항에 따른 적어도 하나의 호스트 세포, 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
  20. 다음을 포함하는 암, 감염성 질병, 자가면역 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물:
    (a) 제3항에 따른 복합체를 포함하는 적어도 하나의 호스트 세포, 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
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