KR101799805B1 - 세포 투과 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 투과 효율이 현저히 우수하며, 세럼이나 혈청이 존재하는 환경에서도 1시간 안에 100%의 모든 세포 안으로 투과하는 특성이 있으며, 안정된 구조를 가지고 있어, 카고를 손상 없이 그 기능을 유지한 상태로 세포 내로 운반할 수 있는 세포 투과 펩티드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물 유래의 단백질 내에서 발견한 세포 투과 펩티드에 관한 것이다.
세포막을 투과할 수 있는 성질을 가진 펩티드인 세포막 투과 능력이 있는 펩티드(cell-penetrating peptide; CPP)는 대개 30개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이중 지질막을 자유롭게 통과하는 성질을 가진 것으로 알려져 있다. CPP는 PTD (protein-transduction domains), MTS (membrane-translocating sequences) 이라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내로 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다.
고등동물의 세포막은 인지질 이중층(phospholipid bilayer)으로 구성되어 있으며, 이들 지질 이중층(lipid bilayer)이 가지고 있는 소수성으로 인하여 대부분의 펩티드, 단백질, 뉴클리오타이드, 리포좀 등이 세포 내로 이동하는 것은 거의 불가능하다. 따라서, 세포막은 펩티드나 단백질, 혹은 화합믈 제제 약물이나 유전자 치료제를 세포 내로 이동시키는데 있어서 장애물 역할을 한다고 할 수 있다. 이를 극복하기 위하여, 양이온성 지질(cationic lipid) 혹은 PEI(polyethyleneimine)을 사용하거나, 바이러스성 벡터(viral vector) 또는 전기천공법(electroporation)을 사용하는 방법 등이 많이 사용되고 있다.
그러나, 이들 방법은 낮은 효율, 적용 가능한 세포의 제한, 세포 내의 독성 등으로 그 한계가 있다고 할 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 세포-투과 펩티드를 사용하는 시도가 최근 들어 많이 이루어지고 있다.
CPP는 세포막에 반응하여 엔도사이토시스(endocytosis)나 또는 직접 세포막을 투과할 수 있는 성질을 갖고 있는 올리고펩티드로 세포막을 투과할 수 있는 전기화학 및 물리화학적 특성을 갖는다.
CPP는 translocatory protein의 일부분인데 대표적으로 손꼽히는 것이 인간 섬유아세포 성장인자(human fibroblast growth factor) 4의 signal sequence에 존재하는 소수성 부분(hydrophobic region)인 MTS(membrane translocating sequence)와 HIV의 viral protein 중의 하나인 Tat 단백질의 Tat-PTD(basic amino acid domain)를 들 수 있다.
이 외에도 현재까지 많은 CPP가 보고되고 상업화되고 있으나 세포막을 통과하여 물질을 세포 내로 이동하는 정도가 세포 특이적인 것들이 많고, 그 효과 또한 높지 않다. 특히 세럼(serum)이나 혈청이 존재하는 환경에서는 세포막을 통과하는 투과 효율이 그보다 반 정도로 감소한다. 따라서, 기능성 단백질이나 DNA, RNA를 세포 내로 운송하는 데 있어서 세포 특이성이 없고, 세럼 존재 하에서도 그 효율이 높은 CPP의 개발이 요구되어 왔다.
CPP 개발에 따른 장점은 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 세포 내로 유입시킬 수 있다는 것이다. 특히 활성기간이 매우 제한적인 단백질을 쉽게 세포 내로 이동시킴으로써 소기의 목적을 예상되는 위해성 없이 처치할 수 있는 매우 유용한 매개물이다. 다른 한편 재조합 형태, 또는 대상물과 혼합된 형태로 세포 내로 대상물을 트랜스펙션(transfection)할 수 있는 장점이 있다. 그러나 이론적으로 또는 일부 실험에서 증명되고 있으나 위에서 언급되었듯이 기존 CPP들이 가지는 한계성이 있는데 이것이 문제점이다. 즉 세포 특이적으로 물질 이동 효율이 다름과 유전자 변형에 사용되고 있는 다른 방법들에 비하여 효율이 떨어진다는 것이다. 현시점에서 기존의 문제점을 극복할 수 있고 부작용이 없는 전달매개물을 찾는 작업이 활발히 진행되고 있다.
따라서, 기존에 알려진 세포 투과 펩티드보다 그 효율이 뛰어난 세포 투과 능력이 좋은 후보를 확보하고 융합단백질로의 적용 및 그 아미노산 서열에 대해 배타적인 기술적 우위를 확보하는 것은 매우 중요한 부분이라 하겠다.
본 발명자는 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 전달할 수 있는 전달매개물을 탐색하고자 신규한 CPP를 탐색하고 이를 통해 종래 전달물질이 갖는 문제점을 극복할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 세포 투과 효율이 우수한 세포 투과 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포 투과 펩티드를 포함하는 재조합 카고를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 재조합 카고를 포함하는 세포 투과용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포 투과 펩티드 또는 재조합 카고를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과성 펩티드.
2. 위 1에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
3. 위 1에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
4. 위 1에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 세포 투과 펩티드; 및 그 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는 재조합 카고.
6. 위 5에 있어서, 상기 카고는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p53C 펩티드인 재조합 카고.
7. 위 6에 있어서, 상기 재조합 카고는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 카고.
8. 위 5에 있어서, 상기 카고는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 재조합 카고.
9. 위 5에 있어서, 상기 재조합 카고는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 카고.
10. 위 5의 재조합 카고를 포함하는 세포 투과용 조성물.
11. 위 5의 재조합 카고를 포함하는 재조합 발현벡터.
본 발명에 따른 세포 투과 펩티드는 혈액 같이 세럼이나 혈청이 존재하는 환경에서도 1시간 안에 100%의 모든 세포 안으로 투과하는 특성이 있으며 SDS 같은 계면활성제를 첨가했을 때에도 그 구조가 변성되지 않을 정도로 안정한 구조를 가지고 있어, 기능성 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 그 기능을 유지한 상태로 세포질 또는 핵질 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있고, 혈관 내 투여 외에도 국부적인 신체부위에 적용하여 부작용을 최소한으로 줄일 수 있다.
본 발명의 세포 투과 펩티드와 융합된 카고를 포함하는 재조합 카고는 세포 내 전달 효율이 매우 우수하다. 이에, 카고의 종류를 다양하게 선택하여 다양한 약물 전달 등에 활용할 수 있다.
도 1은 인체 유래 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)에서 Ara-27 세포 투과 펩티드가 농도에 비례하여 세포막 투과 효율이 증가하고 있음을 보여주고 있다. 그래프에서 Y 축은 형광강도(Fluorescence intensity)를 나타내고 있는데 단위세포당 들어가는 펩티드의 양을 알 수 있는 지표로, 지표가 대조군(No treatment)보다 높은 값을 가질수록 단위세포당 더 많은 수의 펩티드가 세포 내로 유입될 수 있다는 것을 나타낸다. 대조군이나 Tat-PTD에 비해 Ara-27이 농도에 비례하여 세포 내로의 펩티드 유입 양이 증가하고 있음을 보여주고 있다.
도 2는 인체 유래 MSC에서 Ara-27 세포 투과 펩티드가 1시간 이내에 형광 현미경에 의해 육안으로 확인할 수 있을 정도로 많은 양의 펩티드가 세포막을 투과하여 세포 내로 들어가 있음을 보여주고 있다. 실험은 10% Serum이 포함된 배지에서, 1μM 의 농도로 30분 동안 처리한 후에 Heparin washing method를 이용하여 세포 표면에 붙어 있는 형광 펩티드를 제거하고 Trypsin을 처리하여 세포를 떼어낸 후 형광 현미경을 찍은 사진이다. Tat-PTD는 세포 내로 들어가 있는 것이 매우 드물게 보이는 것에 비해, Ara-29의 경우 모든 세포에 들어가 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 Ara-27(5μM)이 세포 투과되어 18 시간이 지난 후 세포 내의 전위(translocation)를 보여주는 공초점 형광현미경(confocal microscope) 사진이다. 하루가 지나도 세포 투과된 펩티드가 안정적으로 세포 내에 존재하고 있음을 알 수 있다. 실험은 세포 내에 존재함을 더 확실하게 보여주기 위해 트립신(trypsin)으로 바닥에 부착된 세포를 떼어내고 추가로 membrane marker와 함께 면역형광 실험을 한 것이다. 보는 바와 같이, membrane marker 안쪽에 FITC 형광이 보이는 것으로 보아 세포 내에 존재하고 있음을 알 수 있고 세포질 뿐만 아니라 핵 내부에도 일부 존재하고 있음을 알 수 있다.
도 4 및 5는 GFP 형광 단백질을 reporter protein으로 사용하여, Tat(도 4 우)와 Tat-Ara-27(도 4 좌)의 세포 안으로의 이동 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 섬유아세포인 NIH3T3에서의 Ara-27, Ara-20, R8-Ara-19, Ara-8의 세포 투과 펩티드들의 세포 투과 효율을 비교한 결과이다.
도 7은 p53C, Tat-ara-19 및 ICT-53 펩티드의 세포 투과 효율을 비교한 결과이다.
도 8은 ICT-53 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 이루어짐을 확인한 결과이다.
도 9 및 10은 ICT-53 펩티드의 항암 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 ICT-Myc 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 이루어짐을 확인한 결과이다.
도 12는 ICT-Myc 펩티드를 처리한 세포군에서 정제한 ICT-Myc 펩티드의 성장 촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 인체 유래 MSC에서 Ara-27 세포 투과 펩티드가 1시간 이내에 형광 현미경에 의해 육안으로 확인할 수 있을 정도로 많은 양의 펩티드가 세포막을 투과하여 세포 내로 들어가 있음을 보여주고 있다. 실험은 10% Serum이 포함된 배지에서, 1μM 의 농도로 30분 동안 처리한 후에 Heparin washing method를 이용하여 세포 표면에 붙어 있는 형광 펩티드를 제거하고 Trypsin을 처리하여 세포를 떼어낸 후 형광 현미경을 찍은 사진이다. Tat-PTD는 세포 내로 들어가 있는 것이 매우 드물게 보이는 것에 비해, Ara-29의 경우 모든 세포에 들어가 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 Ara-27(5μM)이 세포 투과되어 18 시간이 지난 후 세포 내의 전위(translocation)를 보여주는 공초점 형광현미경(confocal microscope) 사진이다. 하루가 지나도 세포 투과된 펩티드가 안정적으로 세포 내에 존재하고 있음을 알 수 있다. 실험은 세포 내에 존재함을 더 확실하게 보여주기 위해 트립신(trypsin)으로 바닥에 부착된 세포를 떼어내고 추가로 membrane marker와 함께 면역형광 실험을 한 것이다. 보는 바와 같이, membrane marker 안쪽에 FITC 형광이 보이는 것으로 보아 세포 내에 존재하고 있음을 알 수 있고 세포질 뿐만 아니라 핵 내부에도 일부 존재하고 있음을 알 수 있다.
도 4 및 5는 GFP 형광 단백질을 reporter protein으로 사용하여, Tat(도 4 우)와 Tat-Ara-27(도 4 좌)의 세포 안으로의 이동 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 섬유아세포인 NIH3T3에서의 Ara-27, Ara-20, R8-Ara-19, Ara-8의 세포 투과 펩티드들의 세포 투과 효율을 비교한 결과이다.
도 7은 p53C, Tat-ara-19 및 ICT-53 펩티드의 세포 투과 효율을 비교한 결과이다.
도 8은 ICT-53 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 이루어짐을 확인한 결과이다.
도 9 및 10은 ICT-53 펩티드의 항암 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 ICT-Myc 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 이루어짐을 확인한 결과이다.
도 12는 ICT-Myc 펩티드를 처리한 세포군에서 정제한 ICT-Myc 펩티드의 성장 촉진 효과를 확인한 결과이다.
단백질이나 펩티드는 세포막을 투과하여 세포 내로 전달되기 어려워서, 단백질이나 펩티드는 유전자의 형태로서 줄기세포에 도입되어 세포 치료제로서의 역할을 수행하여 왔다.
그러나, 본 발명자는 별도로 줄기세포에 도입되지 않고, 펩티드 자체로서도 우수한 세포 투과능을 갖는 신규한 펩티드를 발견한 것에 본 발명을 착안하였다.
본 발명의 세포 투과 펩티드는 애기장대(Arabidopsis) 유래 펩티드로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptide, CPP)"는 인비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 카고(cargo)를 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩티드를 의미한다.
본 발명자들은 애기장대 유래의 여러 펩티드를 분리하였고, 그 중, 일부 펩티드가 세럼이나 혈청이 존재하는 환경에서도 우수한 세포 투과능을 갖는 것을 확인하였으며, 이들 펩티드가 공통적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열이 세포 투과능에 영향을 미치는 부분에 해당하는 것으로 판단된다.
이에, 본 발명의 세포 투과 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이라면 그 구체적인 서열은 특별히 한정되지 않으며, 서열번호 1의 아미노산 서열만으로 이루어진 것일 수도 있고, N-말단, C-말단 또는 양 말단에 일부 서열이 추가된 것일 수도 있다.
일부 서열이 추가된 경우의 구체적인 예를 들면, N-말단에 일부 서열이 추가된 서열번호 2의 아미노산 서열, N-말단에 일부 서열이 추가된 서열번호 3의 아미노산 서열, N-말단에 일부 서열이 추가된 서열번호 4의 아미노산 서열 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 투과 펩티드는 상기 서열 외에도 당 분야에 공지된 타단백질 또는 타단백질 전달 도메인과 결합될 수도 있다. 예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1)에서 유래한 TAT(trans-activating transcriptional activator); 초파리의 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia Homeodomain)인 Antp(Antennapedia 또는 penetratin) 펩티드; 쥐의 전사인자의 Mph-1(Mutator phenotype protein 1), HSV-1(Herpes simplex virus)의 VP22(viral protein 22); 청어 프로타민의 HP4(human protamine P4); 트랜스포탄(Transportan), MAP(Model amphipathic peptide), TP10(Transportan-10), CTP(Cardiac targeting peptide), K5-FGF(K5-fibroblast growth factor, AAVALLPAVLLALLP), HAP-1(Huntingtin-associated protein 1, SFHQFARATLAS), 293P-1(SNNNVRPIHIWP), CADY(cysteamidation PTD, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cya), PF6(PepFect6, Stearyl-AGYLLGK(εNH)INLKALAALAKKIL-NH2), RXR(arginine rich peptide), 폴리아르기닌(poly-arginine, Rn(n = 6~12)), 폴리라이신(poly-lysine), 또는 이들의 변형 펩티드(예를 들면, TAT 단백질의 47-57 아미노산 잔기를 변형한 펩티드 등) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 투과 펩티드는 우수한 세포 투과능을 나타내므로, 카고와 결합하여 카고를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
이에, 본 발명은 상기 세포 투과 펩티드를 포함하는 재조합 카고를 제공한다.
본 발명의 재조합 카고는 전술한 세포 투과 펩티드 및 상기 세포 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "카고(cargo)"는 본 발명의 세포 투과 펩티드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하는 것으로, 예를 들면 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, 핵산, 펩티드, 미네랄, 포도당을 포함하는 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 바이러스, 조영 물질 또는 기타 화학 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약물"은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 상기 구현예에 있어서, 세포 투과성 펩티드에 의해 세포 내로 전달되는 약물은 리포좀, 미셀, 나노 입자, 자성 입자 또는 콴텀 도트와 같은 약물 전달체를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "펩티드"는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호 전달 단백질(또는 펩티드), 항체 또는 백신을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 핵산은 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예를 들면, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "조영물질"은 의학적 영상 촬영(imaging)에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 의미한다. 상기 조영물질은 방사선비투과 조영물질(radiopaque contrast agent), 상자성 조영물질(paramagnetic contrast agent), 초상자성 조영물질(superparamagnetic contrast agent), CT (computed tomography) 조영물질 또는 기타 조영물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 방사선비투과 조영물질(X-레이 영상용)은 무기 요오드 화합물 및 유기 요오드 화합물(예를 들면, 디아트리조아트), 방사선비투과 금속 및 그의 염(예를 들면, 은, 금, 백금 등) 및 기타 방사선비투과 화합물(예를 들면, 칼슘염, 황산바륨과 같은 바륨염, 탄탈룸 및 산화 탄탈룸)을 포함할 수 있다. 상자성 조영물질(MR 영상용)은 가돌리늄 디에틸렌 트리아민펜타아세트산(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid, Gd-DTPA) 및 그의 유도체, 및 기타 가돌리늄, 망간, 철, 디스프로시움(dysprosium), 구리, 유로피움(europium), 에르비움(erbium), 크롬, 니켈 및 코발트 복합체, 예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,-N',N"-트리아세트산(D03A), 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 1,4,8,10-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA), 히드록시벤질에틸렌-디아민 디아세트산(HBED)을 포함할 수 있다. 초상자성 조영물질(MR 영상용)은 자철석(magnetite), 초상자성 산화철 (super-paramagnetic iron oxide, SPIO), 초소 초상자성 산화철(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO) 및 단결정성(monocrystailine) 산화철을 포함할 수 있다. 다른 적합한 조영물질은 요오드화 및 비요오드화(non-iodinated), 이온성 및 비이온성 CT 조영물질, 및 스핀-표지(spin-label)와 같은 조영물질, 또는 기타 진단 활성제(diagnostically effective agent)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조영물질은 β-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 또는 루시페라아제를 포함할 수 있다. 세포에서 발현되는 경우, 용이하게 검출가능한 단백질을 코딩하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 방사선핵종(radionuclide), 형광물질(fluor), 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제 등과 같은 다양한 표지들이 이용될 수 있다.
카고가 펩티드인 경우의 구체적인 예를 들면, 카고는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 항암 단백질 p53C일 수 있으며, 재조합 카고는 상기 p53C가 전술한 세포투과 펩티드 서열들의 N-말단 또는 C-말단에 결합한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단에 p53C가 결합한 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 본 명세서에서 이는 ICT-53이라 칭한다. 또한, ICT-53에는 정제의 용이성을 위해 N-말단 또는 C-말단에 His tag이 부착될 수 있는데, His tag이 부착된 N-말단에 부착된 펩티드의 예를 들면 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
카고가 펩티드인 경우의 또다른 구체적인 예를 들면, 카고는 c-Myc 단백질의 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 일부 서열일 수 있으며, 재조합 카고는 상기 서열이 전술한 세포투과 펩티드 서열들의 N-말단 또는 C-말단에 결합한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 4의 아미노산 서열의 C-말단에 서열번호 8의 아미노산 서열이 결합한 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 본 명세서에서 이는 ICT-Myc라 칭한다. 또한, ICT-Myc에는 정제의 용이성을 위해 N-말단 또는 C-말단에 His tag이 부착될 수 있는데, His tag이 부착된 N-말단에 부착된 펩티드의 예를 들면 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 카고는 생체 내에서 보다 우수한 특이성을 나타낼 수 있도록, 특정 세포, 조직, 장기의 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드, 링커 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 카고를 포함하는 세포 투과용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명의 조성물은 세포 투과 펩티드에 융합되는 카고의 종류, 기능 등에 따라 다양한 효과를 나타낼 수 있다.
예를 들면, 카고가 항암 기능을 갖는 펩티드인 경우 세포 투과용 조성물은 항암제로서 활용될 수 있고, 세포 성장 촉진 기능을 갖는 펩티드인 경우 세포 성장 촉진제로서 활용될 수 있는 바와 같이, 그 효과는 결합되는 카고의 종류에 따라 달라질 수 있으므로, 카고의 종류가 제한되지 않는 바와 같이, 그 역할도 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 세포 투과 펩티드 또는 재조합 카고를 코딩하는 유전자 컨스트럭트, 그리고 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트, 그리고 발현 벡터를 이용하여 세포 투과 펩티드를 반복적으로 양산해낼 수 있다.
뿐만 아니라, 세포 내로 도입되어야 하는 카고가 특히 단백질인 경우, 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)에 상기 카고 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킴으로써, 세포막 투과 도메인과 상기 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 양산할 수 있다. 상기 벡터에 의하여 양산된 재조합 카고 단백질은 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 보다 높은 효율로 세포 내 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 카고 전달 방법은 상기 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
재조합 카고와 세포의 접촉은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 수행될 수 있다. 상기 접촉이 인 비트로(in vitro) 상에서 진행될 경우, 시험관 내의 세포에 재조합 카고가 포함된 배지를 처리하여 세포를 배양시키는 과정에 의해 상기 접촉이 이루어진다. 상기 접촉이 인 비보(in vivo) 상에서 진행될 경우, 상기 재조합 카고는 근육내(intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravein), 경구(oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale) 등의 경로를 통해 생체 내로 주입(injection)되고, 생체 내에서 세포와 재조합 카고의 접촉이 이루어지게 된다.
재조합 카고와 세포의 접촉에 의하여 상기 재조합 카고가 세포 내로 도입되게 된다. 상기 재조합 카고의 도입은 ⅰ) 처리되는 재조합 카고의 농도가 높으면 높을수록 재조합 카고의 도입 양이 증가하고, ⅱ) 재조합 카고가 처리되는 시간이 길면 길수록 재조합 카고의 도입 양이 증가한다.
본 발명의 방법은 인간 또는 인간을 제외한 다양한 동물들에 대해 제한 없이 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
(1)
세럼
및 혈청이 존재하는 환경에서도 세포막 투과 효율이 월등히 높은 세포 투과 펩티드 합성 및 세포 투과 효율 측정
본 발명의 세포 투과 펩티드의 투과 효율을 확인하기 위해 기존에 잘 알려진 세포 투과 펩티드인 Tat-PTD(서열번호 12)를 대조군으로 포함시켜 실험을 수행하였다.
각 세포투과 펩티드들의 세포 투과 효율을 확인하기 위해 각 펩티드들에 형광을 띠는 FITC(fluorescein isothiocyanate, 형광물질)를 붙여 그 투과효율을 알아보았다.
세포 투과 효율을 측정하기 위해 세포막 표면에 붙어 있을 수도 있는 각 세포 투과 펩티드들을 없애기 위해 Keplan group에서 사용한 Heparin & Trypsin washing method를 적용하였다[Kaplan IM, Wadia JS, Dowdy SF (2005) Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis. J Controlled release 102: 247-253]. 요약하자면, 후술하는 실험들에서 세포를 키우는 배지에 1μM의 농도로 각 세포 투과 펩티드들을 넣고 30분 동안 인큐베이션 한 후 헤파린(Heparin)을 사용하여 세포를 3번 세척하고 트립신(Trypsin)에 의해 세포를 떼어내어 FACS 분석을 하였다.
중간엽 줄기세포(MSC)에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드(Ara-27)의 농도별로 세포 내로 유입되는 양을 알아보았다.
Ara-27은 1시간 동안에 단위세포 당 유입되는 펩티드 양이 농도에 비례하여 증가하는 특성이 있었지만, Tat-PTD의 경우에는 5μM의 농도에서도 단위 세포 당 유입되는 펩티드의 양이 현저히 낮음을 알 수 있었다(도 1). 이는 광학 현미경을 사용하여 Tat-PTD와는 다르게 육안으로도 강한 형광 강도를 확인할 수 있을 정도로 높은 형광강도를 나타내었다(도 2).
또한 Ara-27 세포 투과 펩티드가 실제로 세포 내의 핵 안이나 세포질 내에 존재하는지의 여부를 알기 위해 Ara-27 처리 후 공초점 현미경(confocal microscopy)을 사용하여 분석하여 보았다. 인체 유래의 중간엽 줄기세포(human MSC)를 6-well plate에 10% FBS가 함유된 DMEM 세포배양 배지에 넣고 배양한지 3시간 후에 2 μM 농도의 Ara-27 펩티드를 배지에 첨가하였고, Ara-27 펩티드 처리 후 18 시간이 경과한 후 현미경으로 확인한 결과, 대부분의 Ara-27 펩티드가 세포질 내에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 실제로 세포막 안쪽에 존재하는지를 알아보기 위해 membarne marker(FM-64)를 사용하였고, 시약이 세포막에 잘 삽입되게 하기 위해 트립신(trypsin)으로 세포를 떼어낸 후 시약을 처리하여 준 후 분석했을 때 펩티드가 세포막 안쪽 세포질 부분에 대부분이 존재하고 있음을 할 수 있었다. 또한 핵 안에도 일부 펩티드가 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 3).
Ara-27 세포 투과 펩티드가 다른 물질을 세포 안으로 넣어 주는 역할을 하는지 재확인하기 위하여, GFP 형광 단백질을 reporter protein으로 사용하여 세포 안으로의 이동 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. Tat-Ara-19에 GFP(서열번호 13)가 융합되게 발현될 수 있도록 유전자를 합성(Tat-Ara19-GFP)(서열번호 14)하였고, 대조군으로 Tat-PTD에 GFP가 융합되게 발현될 수 있도록 유전자를 합성(Tat-GFP)(서열번호 15)하여 pET11 벡터(pET-11d, Novagen사)에서 발현을 하였고, 두 단백질을 Ni-NTA His tag 레진을 이용하여 정제하였다. 이 두 단백질의 세포 투과도를 알아보기 위하여 피부줄기세포를 사용하였다. 도 4 내지 6에서 보는 바와 같이, 1시간 동안 처리해 주었을 때, Tat-GFP의 경우 5 μM 의 높은 농도에서도 세포 안에 형광을 띠지 않은 반면, Tat-Ara19-GFP의 경우에는 1 μM 농도에서도 세포에 형광을 띠는 모습이 뚜렷하게 관찰되었고, 2 μM 농도에서는 더 밝은 형광 강도를 나타내었다. 이는 단위 세포 당 들어갈 수 있는 Tat-Ara19-GFP 분자수가 농도에 비례하여 더 많이 들어갈 수 있음을 의미한다(도 4, 5). 이러한 결과로 인해, Ara-27 세포 투과 펩티드가 목적하는 물질을 세포 내로 잘 전달할 수 있는 소재로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 단위 세포당 시간이 지날수록, 그리고 농도에 비례하여 더 많은 분자가 하나의 세포 내로 유입되어 효과적으로 세포 안에서 기능적인 특성을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
이번에는, 섬유아세포인 NIH3T3에서의 Ara-27과 서열번호 1(Ara-20), 서열번호 3(R8-Ara-19), 서열번호 11(Ara-8)의 실시예의 세포 투과 펩티드들의 세포 투과 효율을 비교하여 보았다. Ara-27은 세럼이 존재하는 환경 하에 1μM 농도에서 30분 만에도 세포 내로 투과되는 효율이 90% 이상 되는 효율이 매우 높은 세포 투과 펩티드라는 것을 알게 되었고, 나머지 세포 투과 펩티드들 중에 어떤 경우는 더 높은 세포막 투과 효율을 나타내었다. 이와는 반대로, Tat-PTD의 경우 매우 낮은 수준의 투과 효율을 나타내었다(도 6). 또한, 실시예의 세포 투과 펩티드들은 세럼 존재 여부에 상관없이 매우 높은 투과 효율을 보였다.
(2) 세포 투과 펩티드와 융합된
p53C
펩티드의 항암 효능
p53C 펩티드(서열번호 5)는 항암 효과가 있는 p53 단백질의 C-말단 부위의 펩티드로서 이 부분만 세포 내에서 유전자 발현을 했을 때 항암 효과가 나타난다는 여러 논문 보고들이 있다. 이에 근거하여 서열번호 4(Tat-Ara-19)의 세포 투과 펩티드에 p53C 펩티드를 융합한 펩티드(서열번호 6, ICT-53)에 대한 세포 투과능과 항암 효과를 알아보는 실험을 수행하였다.
22개의 아미노산 서열을 가진 p53C와 Tat-Ara-19, 그리고 Tat-Ara-19에 p53C를 융합시킨 펩티드 ICT-53을 합성하였고, C-말단에 FITC(fluorescein isothiocyanate, 형광물질)를 붙여 형광을 띠도록 하였다. 이 펩티드들을 이용하여 NIH3T3 세포주를 대상으로 1μM의 농도로 1시간 동안의 세포 투과 효율을 조사한 결과, p53C는 세포 내로 투과되지 않았고, Tat-Ara-19와 ICT-53이 높은 효율로 세포 내로 자동적으로 유입된다는 것을 알 수 있었다(도 7). 이 실험 또한 세럼이 존재하는 상황에서의 투과 효율을 조사한 것이다.
한편, 위와 같이 세포 투과 효율이 높은 세포 투과성 항암 펩티드를 미생물에서 대량 생산하는 방법을 개발하기 위하여, pET11이라는 E.coli 발현 벡터에 ICT-53을 코딩하는 유전자를 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 정제를 쉽게 하기 위해 단백질에 히스티딘(Histidine)이 여섯 개 붙은 His tag과 정제 후 His tag과의 분리를 위해 thrombin cleavage site를 넣어 함께 발현될 수 있도록 제작하였다(서열번호 7). ICT-53의 세포 투과성 항암 펩티드의 발현 여부를 확인하기 위해, 발현 균주인 E.coli BL21 균주에 transformation하여 발현균주를 선발하였고, 균을 배양하여 OD 0.5 정도로 자랐을 때 IPTG 0.5 mM 의 농도에 의해 induction 하였고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. ICT-53을 발현하는 대장균체를 초음파 파쇄법(sonication)을 이용하여 세포벽을 파쇄하였고, SDS-PAGE에서 확인해 본 결과, 8 kDa 정도의 위치에서 대량 발현된 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. 이에 미루어 ICT-53 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 잘 된다는 것을 SDS-PAGE로 확인한 것이다(도 8). 또한, His tag이 존재하기 때문에 Ni-NTA resin을 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 정제하였고, 암 세포주를 이용하여 항암 효과를 알아보는 실험을 진행하였다.
정제된 ICT-53 펩티드의 항암 효과를 보이는지 확인하기 위해 골수암 세포인 U2OS 암세포주에 농도별로 처리하였다.
ICT-53 펩티드를 처리한 세포군에서 세포가 죽어 나가는 것을 확인하였고(도 9), 정제한 ICT-53 펩티드를 농도별로 처리하였을 때에도 농도에 비례하여 항암 효과가 나타나는 것을 확인하였는데, 특히 7.5μM의 농도에서는 약 70% 정도 암 성장을 저해하는 것을 확인하였다(도 10).
(3)
Ara
-27 유래 펩티드와 융합된 c-
Myc
펩티드의 세포 성장 촉진 효능
또 다른 적용예로, 세포 성장을 촉진시키는 효과가 있는 c-Myc 펩티드와 Ara-27을 융합시켰을 때, 세포 투과에 의한 세포 성장 촉진 효과가 나타나는지의 여부에 대한 실험을 수행하였다.
세포 투과 효율이 높은 세포 투과성 재생 펩티드를 미생물에서 대량생산하는 방법을 개발하기 위하여, pET11이라는 E.coli 발현 벡터에 ICT-Myc을 코딩하는 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제작하였다. 정제를 쉽게 하기 위해 단백질에 히스티딘(Histidine)이 여섯 개 붙은 His tag과 정제 후 His tag과의 분리를 위해 thrombin cleavage site를 넣어 함께 발현될 수 있도록 제작하였다(서열번호 10). ICT-Myc의 세포 투과성 재생 펩티드의 발현 여부를 확인하기 위해, 발현 균주인 E.coli BL21 균주에 transformation하여 발현균주를 선발하였고, 균을 배양하여 OD 0.5 정도로 자랐을 때 IPTG 0.5 mM 의 농도에 의해 induction 하였고 20℃에서 18시간 동안 배양하였다. ICT-Myc을 발현하는 대장균체를 초음파 파쇄법(sonication)을 이용하여 세포벽을 파쇄하였고, SDS-PAGE에서 확인해 본 결과, 17 kDa 정도의 위치에서 발현된 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. 이에 미루어 ICT-Myc 펩티드가 대장균에서 안정적으로 대량 발현이 잘 된다는 것을 SDS-PAGE로 확인한 것이다(도 11). 또한, His tag이 존재하기 때문에 Ni-NTA resin을 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 정제하였고, NIH3T3 세포주를 이용하여 세포 성장 촉진 효과를 알아보는 실험을 진행하였다.
정제된 ICT-Myc 펩티드의 재생 촉진 효과를 보이는지 확인하기 위해 섬유아세포인 NIH3T3 세포주에 농도별로 처리하였다.
ICT-Myc 펩티드를 처리한 세포군에서 정제한 ICT-Myc 펩티드를 농도별로 처리하였을 때 농도에 비례하여 성장 촉진 효과가 나타나는 것을 확인하였는데, 특히 7.5μM의 농도에서는 약 60% 정도 성장 촉진을 유도하는 것을 확인하였다(도 12).
본 발명에서 제시하는 아미노산 서열은 Ara-27 유래 펩티드들로서 세포 내로 유입시키는 능력이 높은 세포 투과 펩티드들이며, 세포 투과 효율이 Tat-PTD 펩티드보다 월등히 높은 세포 투과 효율을 나타내었으며, 세포 투과 효율뿐만 아니라 실제 기능적인 특성을 가진 목적 단백질이나 펩티드 또는 유전자를 세포 내로 전달하여 기능적 특성을 가질 수 있다는 것을 밝힌 것으로, 이는 여러 기능성이 탁월한 소재를 대상으로 한 신약 개발 가능성뿐만 아니라 탁월한 기능성을 보유한 다른 유망한 단백질들을 대상으로 세포 투과가 가능한 단백질로서의 개발이 가능할 것으로 여겨지고 있다.
<110> Neoregen Biotech
<120> Cell-penetrating peptide
<130> 16P08026
<150> KR 10-2016-0042730
<151> 2016-04-07
<160> 15
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Arabidopsis
<400> 1
Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly His Trp Ile Ser Asp Cys Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ser Lys
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> Arabidopsis
<400> 2
Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly
1 5 10 15
His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R8-Ara-19
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly
1 5 10 15
His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-Ara-19
<400> 4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly
1 5 10 15
His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys
20 25
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p53C
<400> 5
Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ser Arg His Lys Lys
20
<210> 6
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICT-53
<400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly
1 5 10 15
His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys Gly Ser Arg Ala His
20 25 30
Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys
35 40 45
Lys
<210> 7
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-ICT-53
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Cys Phe Arg Cys
20 25 30
Arg Gln Ala Gly His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys Gly
35 40 45
Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr
50 55 60
Ser Arg His Lys Lys
65
<210> 8
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of c-Myc
<400> 8
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
1 5 10 15
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
20 25 30
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
35 40 45
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
50 55 60
Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
65 70 75 80
Leu Arg Asn Ser Cys Ala
85
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ICT-Myc
<400> 9
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Cys Phe Arg Cys Arg Gln Ala Gly
1 5 10 15
His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys Val Lys Arg Arg Thr
20 25 30
His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe
35 40 45
Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val
65 70 75 80
Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys
85 90 95
Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys
100 105 110
Ala
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-ICT-Myc
<400> 10
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Cys Phe Arg Cys
20 25 30
Arg Gln Ala Gly His Trp Ile Ser Asp Cys Arg Leu Lys Ser Lys Val
35 40 45
Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu
50 55 60
Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn
65 70 75 80
Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala Tyr
85 90 95
Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
100 105 110
Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu
115 120 125
Arg Asn Ser Cys Ala
130
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Arabidopsis
<400> 11
Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Arg
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-PTD
<400> 12
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP derived from pEGFP-1(Clontech)
<400> 13
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctgggc 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagaag 720
cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactga 759
<210> 14
<211> 855
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-Ara19-GFP
<400> 14
catatgcgta aaaaacgtcg ccagcgtcgc tgctttcgtt gccgtcaggc gggccattgg 60
attagcgatt gccgtctgaa aagcaaatta tccggaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 120
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctgggcggcg acgtaaacgg ccacaagttc 180
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 240
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 300
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 360
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 420
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 480
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 540
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 600
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 660
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 720
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 780
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagaagcttg cggccgcact cgagcaccac 840
caccaccacc actga 855
<210> 15
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-GFP
<400> 15
catatgcgta aaaaacgtcg ccagcgtcgc ttatccggaa tggtgagcaa gggcgaggag 60
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctgggcg gcgacgtaaa cggccacaag 120
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 180
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 240
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 300
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 360
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 420
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 480
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 540
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 600
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 660
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 720
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagaagc ttgcggccgc actcgagcac 780
caccaccacc accactga 798
Claims (11)
- 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1의 세포 투과 펩티드; 및 그 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는 재조합 카고.
- 청구항 5에 있어서, 상기 카고는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 p53C 펩티드인 재조합 카고.
- 청구항 6에 있어서, 상기 재조합 카고는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 카고.
- 청구항 5에 있어서, 상기 카고는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 재조합 카고.
- 청구항 5에 있어서, 상기 재조합 카고는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 카고.
- 청구항 5의 재조합 카고를 포함하는 세포 투과용 조성물.
- 청구항 5의 재조합 카고를 포함하는 재조합 발현벡터.
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